UNIVERSIDAD DEL BIO BIO

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPTO. DE CIENCIAS BASICAS







BIOQUMICA GENERAL



GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
INGENIERIA EN RECURSOS NATURALES











2012

INTRODUCCION


La historia del desarrollo del hombre est plena de logros que son notables en
diferentes reas, tanto de la ciencia, tecnologa, arte, entre otras. En este
contexto, estn los hallazgos que tienen relacin con la interrogante acerca del
funcionamiento de un organismo en trminos de las molculas que la
componen, el centro de esta interrogante es la Bioqumica.


Qu es bioqumica? una pregunta simple, pero difcil de responder en
trminos sencillos ya que es muy diversa en su enfoque y prctica.
Bsicamente el trmino bioqumica significa estudio de la qumica de la vida,
esta es una definicin en apariencia sencilla que oculta la profundidad de su
significado

En bioqumica se estudian una gran variedad de temas que pueden referirse
a organismos multicelulares como unicelulares, a sistemas celulares completos
o fraccionados, o bien referirse a agregados moleculares como a molculas
aisladas, es decir, la bioqumica est relacionada con cualquier fenmeno que
se produzca en un organismo. Ya que las cualidades de un ser viviente, sus
actividades, su desarrollo, son el resultado de las interacciones que se
establecen entre sus constituyentes.


De lo que expresado se ve que no es fcil dar una definicin clara y concisa
de lo que es bioqumica. En todo caso se debe tener presente que: su tema
de estudio es todo fenmeno biolgico, a nivel celular, subcelular o molecular y
que trata de responder a una pregunta que ha hechizado a la humanidad a
travs de los tiempos Qu es la vida?


En otro aspecto, es importante mencionar adems que la bioqumica es
fundamentalmente una ciencia de laboratorio, debido a ello, es indispensable
que en toda asignatura en que se estudien aspectos de la bioqumica se
desarrollen actividades prcticas en paralelo con las actividades tericas.


El propsito de los trabajos de laboratorio es familiarizar al alumno con
situaciones experimentales que deben abordarse con metodologa cientfica.
Entre sus objetivos se pueden mencionar los siguientes:

1.- Ejercitar al alumno en el mtodo cientfico, por medio de tcnicas generales.

2.- Desarrollar destreza en el manejo del material de laboratorio.

3.- Acrecentar habilidad para realizar mediciones y observaciones.

4. Desarrollar capacidad para expresar resultados y conclusiones.

5.- Procurar el desarrollo de iniciativa personal frente a problemas que se
planteen

6.- Dar impulso a las actitudes de orden y cooperacin que permitan al alumno,
la
planificacin de sus actividades y la capacidad de trabajar en equipo.

7.- Promover en el alumno una actitud crtica permanente que le permita
analizar
sus propias experiencias.

Por la naturaleza del curso y para poder cumplir con sus objetivos, es
necesario que el alumno llegue al laboratorio con cierta informacin, necesaria
para realizar satisfactoriamente el trabajo prctico.



































TRABAJO PRACTICO N 1

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS Y
PROTEINAS


Las protenas son compuestos orgnicos de elevado peso molecular. Ej.:
insulina bovina PM= 5733, seroalbmina humana PM=68500. Las composicin
elemental de la mayora de las protenas es muy parecida, los porcentajes
aproximados son: C = 50 55; H = 6 8; O = 20 23; N = 15 - 18 y S = 0 - 4.

Las protenas estn constituidas por un nmero variable de molculas ms
pequeas llamadas aminocidos.

Los aminocidos son cidos carboxlicos en que uno de sus hidrgenos ha sido
reemplazado por un grupo amino, su frmula general es:

R

NH
2
CH COOH


Desde las protenas se aslan alrededor de 20 aminocidos y todos
corresponden a o aminocidos, que son aquellos en que el grupo amino
reemplaza a un hidrgeno perteneciente al carbono o, es decir, el carbono
adyacente al grupo carboxilo.

Los aminocidos naturales pueden clasificarse en subclases de acuerdo con la
naturaleza qumica (aliftica, aromtica, heterocclica) de sus grupos R.
Tambin hay otra clasificacin que se basa en la polaridad del grupo R, en este
caso los veinte aminocidos que por lo comn se obtienen de las protenas se
clasifican de la manera siguiente:



1. Aminocidos con grupos R no polares o hidrofbicos

Este grupo contiene aminocidos con residuos alifticos: alanina, valina,
leucina, isoleucina y metionina. Tambin, aminocidos con residuos
aromticos: fenilalanina y triptfano que son hidrofbicos. Adems, en este
grupo est la prolina, cuyo tomo de nitrgeno aparece en forma de amina
secundaria en vez de la amina primaria usual.







2. Aminocidos con grupos R polares pero sin carga elctrica.

La mayora de estos aminocidos contienen residuos R polares. Algunos de
ellos poseen un grupo hidroxlico: serina, treonina y tirosina o bien grupos
sulfhidrilo: cistena. Se incluyen en este grupo a la glicina ya que, an cuando
carece de grupo R, presenta una naturaleza polar, esto se debe a que los
grupos amino y carboxilo cargados constituyen una gran parte de la masa de la
molcula. Tambin se incluyen en esta divisin a los compuestos como:
tirosina. (asparagina y glutamina).


3. Aminocidos con grupos R cargados positivamente

Aqu se incluyen tres aminocidos; lisina, que posee un segundo grupo amino
en la posicin c de la cadena aliftica; arginina, que tiene un grupo quanidinio
cargado positivamente y la histina, que tiene la funcin imidazol, dbilmente
bsica.


4. Aminocidos con grupos R cargados negativamente.


En esta divisin se incluye a los dos aminocidos dicarboxlicos: cido
asprtico y cido glutmico.

Los aminocidos pueden condensarse entre s, unindose por el carbono de su
grupo carboxilo al nitrgeno del grupo amino de otro aminocido lo que se
denomina enlace peptdico.

R
1
R
2
R
1
R
2



NH
3
+
-CH-COO
-
+ NH
3
+
-CH-COO
-
NH
3
+
-CH-CO-NH-CH-COO
-


+H
2
O


Los pptidos se forman por uniones de aminocidos a travs de los enlaces
peptdicos, segn el nmero de aminocidos que componen el pptido
existen: dipptidos, tripptidos, etc.
Si un pptido posee menos de 10 aminocidos se conoce como oligopptido;
los que exceden de este tamao son polipptidos. Una unidad de aminocido
en un pptido se denomina residuo Las cadenas peptdicas tienen direccin
ya que sus extremos son diferentes amino terminal y carboxilo terminal. Por
convencin, el inicio de cadena corresponde al extremo amino, de modo que la
sucuencia de aminocidos se escribe comenzando con el residuo amino
terminal. As por ejemplo en el tripptido: Ala Gly Trp (AGW), alanina es el
residuo amino terminal y el triptfano es el residuo carboxilo terminal.

Las protenas estn constituidas por largas cadenas polipeptdicas, en donde
los aminocidos estn ubicados en una determinada secuencia y esto
corresponde a la estructura primaria de una protena.

La estructura secundaria se refiere a la distribucin espacial de los residuos
de aminocidos que constituyen la cadena polipeptdica. Algunas de estas
relaciones estricas son de tipo regular, dando origen a una estructura
peridica, como es el caso de o-hlice y estructura | en hoja plegada.

La estructura terciaria se refiere al modo como la cadena se curva para
formar la estructura estrechamente plegada y compacta de las protenas
glubulares, la estabilizacin de esta estructura se atribuye a las diferentes
reactividades asociadas a los grupos R de los residuos de aminocidos tales
como: interaccin electrosttica; enlaces de hidrgeno; interaccin hidrofbica;
unin disulfuro.

Las protenas que poseen ms de una cadena polipeptdica (cada cadena se
denomina subunidad), presentan un nivel adicional de organizacin estructural
que se denomina estructura cuaternaria que pone de manifiesto como se
disponen en el espacio las cadenas polipeptdicas individuales. Ej.: la enzima
fosforilasa contiene dos subunidades idnticas que por separado son
catalticamente inactivas, pero que cuando se unen para formar un dmero,
constituyen la enzima activa.

Estudios ms recientemente de conformacin y funcin de protenas han
revelado la importancia de niveles adicionales de organizacin como: la
estructura super-secundaria que se refiere a agrupaciones de estructura
secundaria, tales como la unidad alfa alfa, la unidad beta beta y la unidad
beta alfa beta. Otro nivel adicional corresponde a los dominios que
corresponde a regiones globulares compactas (2 o ms) unidas por segmentos
flexibles de cadena polipeptdica.








Reacciones para el reconocimiento de aminocidos y protenas


1. Reaccin de la ninhidrina: Sirve para reconocer y valorar
cuantitativamente a los aminocidos.

Los aminocidos reaccionan con la ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno)
formando un compuesto coloreado, que generalmente es azul - violeta, excepto
con los aminocidos prolina e hidroxiprolina en que se obtiene una coloracin
amarilla.
El grupo amino de los aminocidos se oxida por accin de la ninhidrina
formando amonaco ms dixido de carbono y el aldehido (se obtiene por
prdida de un carbono del aminocido original).
O

R C OH
I
NH
2
-CH-COOH + C
C C OH
||
ninhidrina O
oxidada

O

C OH

R-CHO + NH
3
+ CO
2
+ C
C H

ninhidrina O
reducida


Luego un segundo equivalente de ninhidrina reacciona con la ninhidrina
reducida y el amonaco, formndose un producto muy coloreado que tiene la
siguiente estructura:
O O

c OH OH c
c
c +NH
3

c OH H c

O O


O O

C C

C N = C
C C
||
O O

+ 3 H
2
O

La reaccin de la ninhidrina es positiva con todos los compuestos que
contienen un grupo amino primario. La coloracin de la ninhidrina con las
protenas es muy dbil, debido a la escasa presencia de NH
2
libres, por lo cual
se le considera negativa.

2. Reaccin del Biuret

La prueba de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) es positiva para todos
los compuestos que contenga dos o ms uniones peptdicas. La coloracin
prpura de una reaccin positiva se debe a un complejo de coordinacin entre
el Cu
2+
y cuatro tomos de nitrgeno provenientes de enlaces peptdicos.



O = C H
2
O C = O



NH NH



R CH CH -
R


Cu
2+

O = C C =
O



NH NH


R CH H
2
O CH - R



3. Reaccin xantoproteica o reaccin del cido ntrico

En esta reaccin se obtiene una coloracin amarilla (griego
XANTHOS=amarillo). El ensayo es positivo para las protenas con aminocidos
que llevan el anillo bencnico (aromtico) como tirosina, triptfano y
fenilalanina. El color amarillo, se debe a la formacin de un compuesto
aromtico nitrado. Esta reaccin explica la aparicin de una coloracin amarilla
al caer gotas de cido ntrico sobre la piel.



4. Reaccin de Millon

El reactivo de Millon es una mezcla de nitrato y nitrito mercrico, que se obtiene
al disolver mercurio en cido ntrico. Al agregar el reactivo a una solucin de
protena, sta precipita y al calentar, el precipitado toma una coloracin rojiza.
Este color desarrollado en la reaccin positiva se debe a los grupos fenlicos
del aminocido tirosina.

5. Reaccin de Sakaguchi

La argina presenta un grupo reactivo guanidino, por lo tanto, los mtodos
qumicos de estimacin de las guanidinas se aplican a la determinacin de
argina en forma libre o peptdica.

La base de esta prueba es la reaccin colorimtrica que se produce entre
argina y o-naftol. En general las sustancias que dan color en la reaccin de
Sakaguchi tienen la siguiente frmula:

NH-X

En donde X es un cido graso o un
radical
C alquilo.

HN NH
2


. CH
2
-NH-C-NH
2

I II
CH
2
NH aminocido arginina
I
CH
2
I
NH
2
-CH-COOH

Aunque se ha dicho que las protenas dan positiva la reaccin debido al grupo
guanidino libre de la arginina, la intensidad de esta coloracin es mucho menor
del que cabra esperar basndose en su contenido en arginina.

6. Reaccin de los aminocidos azufrados

El azufre de la cistena, cistina y metionina, puede ser mineralizado por
calentamiento en medio alcalino. En estas condiciones se les reconoce
agregando una sal de plomo con la que reacciona para formar PbS precipitado
de color negro.

R-SH + 2 NaOH ROH + Na
2
S

Na
2
S

+ (CH
3
COO)
2
Pb 2CH
3
COONa + PbS





Parte Experimental


1. Identificacin de aminocidos con ninhidrina y su diferenciacin de
protena.
Esquema de Trabajo:

Reactivos
N Tubos
I II III IV V VI

Sol. de aminocidos (ml)

5

-

-

-

-

-
Sol. de prolina (ml) - 5 - - - -
Sol. de arginina (ml) - - 5 - - -
Sol. de tirosina (ml) - - - 5 - -
Sol. de protena (ml) - - - - 5 -
Agua destilada (ml) - - - - - 5
Ninhidrina (ml)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5


Ponga los tubos en B.M. hirviendo por dos minutos y deje enfriar. Se desarrolla
un color azul o azul violeta.

Anote los resultados obtenidos, para las soluciones de aminocidos, protena y
blanco.


2. Reaccin Xantoproteica

Esquema de Trabajo


Reactivos

N Tubos
I II III
Sol. de protena (ml) 2 - -
Sol. de aa aromtico (ml) - 2 -
Agua destilada (ml) - - 2
Acido ntrico conc. (ml) 1 1 1

Agite los tubos

Caliente los tubos suavemente hasta ebullicin en B.M. por 1minuto

Anote los resultados obtenidos para cada tubo.
3. Reaccin de Biuret

Esquema de Trabajo


Reactivos
N Tubos
I II III
Sol de aminocidos (ml) . 3 - -
Sol. de protenas (ml) - 3 -
Agua destilada (ml) - - 3
Reactivo de Biuret (ml) 1 1 1

Ponga los tubos a 37C por dos minutos
Observe la coloracin


4. Reaccin de Millon

Esquema de Trabajo
Reactivos
N Tubos
I II III
Sol. de protena (ml) 2 - -
Sol. de aa aromtico (ml) - 2 -
Agua destilada (ml) - - 2
Reactivo de Millon (ml) 1 1 1
Calentar a B.M. hasta aparicin de color


5. Reaccin de Sakaguchi

Esquema de Trabajo:

Reactivos
N Tubos
I II III IV
Sol. de aminocidos (ml) 3 - - -
Sol. de arginina (ml) - 3 - -
Sol. de protena (ml) - - 3 -
Agua destilada (ml) - - - 3
NaOH 5% (ml) 1 1 1 1
o-naftol 1% (gotas) 2 2 2 2
Hipodromito de Sodio (gotas) 1 1 1 1

6. Reaccin de aminocidos azufrados
Esquema de Trabajo

Reactivos
N Tubos
I II
Cistena pta. esptula --
Agua destilada -- 2
Hidrxido de sodio 5% (ml) 2 2
Acetato de plomo 10% (ml) 1 1

Caliente suavemente hasta ebullicin

6. Identificacin de una muestra problema

Con su muestra problema proceda a efectuar las reacciones que usted estime
conveniente para lograr su identificacin. En el mismo laboratorio entregue el
informe correspondiente.

Modelo hoja informe:
a) Nombre del prctico
b) Nombre del alumno/s
c) N de muestra
d) Reaccin color resultado (+/-)
e) Conclusiones



Cuestionario


1. Qu mtodos se utilizan para romper un enlace peptdico?

2. Qu significa que la unin peptdica o grupo amida CONH- sea coplanar?

3. Qu efecto tiene un agente oxidante como cido perfrmico sobre los
enlaces disulfuro de las cadenas polippticas de una protena?

4. Cules son los productos de la hidrlisis completa de una protena? Qu
reaccin qumica le permitir identificarlos?

5. Cul es el significado de una reaccin xantoproteica positiva para protena?

6. Cul es el nmero mnimo de aminocidos que necesita tener un pptido
para dar la reaccin de Biuret




TRABAJO PRACTICO N2

PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS

Las propiedades biolgicas de una protena, as como parte de sus
propiedades fsico-qumicas, dependen de su estructura. Cuando estas
estructuras se alteran o se destruyen, aunque no haya ruptura de las cadenas
polipeptdicas, la protena pierde sus caractersticas funcionales y se alteran
sus propiedades fsico-qumicas; este proceso se denomina
desnaturalizacin.

El trmino desnaturalizado tiene una variedad de significados, segn: la
protena sea o no oligomrica, la prdida de la conformacin sea parcial o
completa y la actividad biolgica se pierda o no. En algunos casos el proceso
es reversible, se puede restaurar la conformacin nativa y la actividad
biolgica.

Los agentes desnaturalizantes actan esencialmente destruyendo los
enlaces puente hidrgeno y las uniones disulfuro, lo que altera las estructuras
secundarias y terciarias de las protenas. Los agentes desnaturalizantes ms
comunes son cidos fuertes, bases fuertes, calor y agitacin mecnica. El
aspecto ms visible en la desnaturalizacin es el descenso de la solubilidad
proteica.

Una protena desnaturalizada es atacada ms fcilmente por las enzimas
proteolticas , lo que puede evidenciarse en su mayor digestibilidad (coccin de
alimentos, batido de claras de huevos, accin del limn sobre la carne o
huevos crudos).

La prdida de la estructura primaria, es decir, ruptura de los enlaces
peptdicos constituye la proteolisis y se puede obtener por accin de cidos o
bases fuertes concentrados por tiempos prolongados y elevadas temperaturas
(Ej.: hidrlisis cida: HCI 6N, 18 hrs,110C) (Ej.: hidrlisis bsica: NaOH 5N,
10hrs, 121C).
Tambin puede lograrse con enzimas proteolticas (hidrlisis enzimtica) tales
como: pepsina, tripsina y peptidasas en general que actan rpidamente a
37C.

Por tales causas, los manejos de protenas se hacen a temperatura reducida
para evitar la desnaturalizacin trmica, se emplean tampones para mantener
el carcter poli-inico natural de la protena y se evita el trauma fsico como la
agitacin o se mantiene al mnimo. Las investigaciones que tratan del
aislamiento, purificacin y anlisis de las protenas, son verdaderamente
representativas del arte del anlisis bioqumico.









Precipitacin por solventes orgnicos

La adicin de solventes orgnicos neutros miscibles con el agua, tales como:
metanol, etanol o acetona, disminuye la solubilidad en agua de la mayor parte
de las protenas globulares de tal manera que precipitan de la solucin. La
solubilidad de una protena a un pH y fuerza inica determinados est en
funcin de la constante dielctrica del medio.

La constante dielctrica (D) esta definida por la relacin:

e
1
x e
2

F = __________
Dr
2


F = Fuerza de atraccin entre dos iones de carga opuesta

e
1
y e
2
= Cargas de los iones

r = Distancia entre los iones.

El agua tiene constante dielctrica relativamente alta (D=80 a 20C) por lo cual
en solucin acuosa disminuye la interaccin entre las molculas proteicas
(debido a sus grupos cargados) mientras aumenta la interaccin entre
protenas y el agua, esto favorece la solubilidad de las protenas.

Los solventes orgnicos tales como metanol, etanol, acetona tienen constantes
dielctricas bajas (32, 25 y 19 respectivamente a 20) de modo que al
agregarlos a una solucin acuosa de protenas baja la constante dielctrica del
medio, lo que favorece la interaccin de los grupos con carga elctrica de las
protenas y por lo tanto su precipitacin.

La precipitacin proteica por los solventes no solo se explica en funcin de la
constante dielctrica, tambin hay que considerar la deshidratacin de las
protenas. Las molculas del solvente no acuoso forman hidratos compitiendo
por el agua con las molculas proteicas. Los solventes pueden llegar a
distorsionar la estructura de las protenas, posiblemente por accin a nivel de
los enlaces hidrofbicos, determinando la desnaturalizacin de las protenas.
Este fenmeno disminuye a bajas temperaturas ya que el calor por si mismo es
un agente desnaturalizante.

Cuando el procedimiento de precipitacin no altera sensiblemente la estructura
de las protenas, stas se pueden recuperar como precipitado mediante
filtracin o centrifugacin y luego redisolverse en un solvente adecuado, sin
que pierdan sus propiedades.



Precipitacin de protenas por formacin de sales insolubles

Las protenas precipitan por la accin de ciertos cidos como el cido
tricloroactico, cido tngstico, cido molbidico y otros; tambin las protenas
pueden precipitar por la accin de ciertos iones de metales pesados como Hg,
Zn, Cd, Fe, Cu y Pb. Todos estos agentes hacen precipitar las protenas
porque forman con ellas sales insolubles.

El mecanismo de accin de estos agentes es el siguiente: los precipitantes
cidos forman sales insolubles con las formas catinicas (+) de la protena ,
siendo necesario efectuar el proceso a un pH ms cido que el punto
isoelctrico. A su vez los metales pesados forman sales insolubles con
las formas aninicas de la protena necesitndose entonces un pH ms
alcalino que el punto isoelctrico.




Efecto de la temperatura.

Dentro de un intervalo de temperatura entre 0C y 40C aumenta la solubilidad
de las protenas con el aumento de temperatura. Por sobre 40C a 50C la
mayor parte de las protenas son cada vez ms inestables y comienzan a
desnaturalizarse, por lo comn con prdida de solubilidad.

La desnaturalizacin puede conducir a la coagulacin de la protena, es decir, a
su agregacin precipitacin irreversible. La coagulacin es un criterio para
reconocer la desnaturalizacin de una protena. La formacin de un cogulo
blanco, insoluble, cuando se hierve la clara de huevo es un ejemplo comn de
desnaturalizacin trmica.

Los fraccionamientos de protenas por lo general se realizan a 0C ya que la
mayor parte de las protenas son estables a bajas temperaturas.


Punto isoelctrico de las protenas

Las molculas proteicas son polivalentes, es decir, llevan varias cargas en
forma simultnea. Aparte de los grupos carboxilo (COO
-
) y amino terminales
(NH
3
+
) la molcula proteica puede tener otras cargas positivas provenientes de
aminocidos diaminados. Otras cargas negativas pueden provenir de
aminocidos dicarboxlicos, aminocidos con grupos SH y aminocidos de
carcter fenlico.


Se denomina carga neta de la protena a la diferencia absoluta entre el nmero
de cargas positivas y el nmero de cargas negativas. Una misma molcula
proteica puede presentar cualquiera de los tres estados electrostticos (+, 0, -
) dependiendo del pH del medio en el cual se encuentra disuelta.


El pH al que una protena muestra un mnimo de solubilidad es su punto
isoelctrico, definido como aquel valor de pH al que la molcula no posee
carga elctrica ya que hay igualdad de cargas positivas y negativas y es
incapaz de desplazarse en un campo elctrico.


Cada protena y aminocido tiene un punto isoelctrico (pHi) caracterstico que
depende del nmero de grupos ionizables y de sus constantes de disociacin.


La menor solubilidad en el pHi se debe a que como la molcula no tiene carga
elctrica, no existen repulsiones electrosttica entre molculas de protena
vecinas lo cual conduce a la formacin de agregados insoluble.


Puesto que las diferentes protenas poseen valores de pHi tambin diferentes,
con frecuencia pueden separarse, una de otras, mediante precipitacin
isoelctrica.


La menor solubilidad de una protena en su punto isoelctrico puede ser
utilizado como un mtodo conveniente para determinar este punto. Basndose
en esta caracterstica se determinar en el prctico, el punto isoelctrico de la
caseina.


La casena ( proteina presente en la leche) a menudo se clasifica como una
fosfoprotena, dado su alto contenido de fsforo, se trata de protenas
conjugadas con grupos fosfato esterificados a residuos de serina. Representa
alrededor del 80% del total de protenas de la leche. Esta casena est
presente bajo la forma de una suspencin coloidal al estado de caseinato de
calcio y potasio, el pH del medio es prximo a 6,6 de tal manera que para
lograr su precipitacin se debe acidificar hasta llegar al punto isoelctrico.
Todas las casenas se caracterizan por su baja solubilidad a pH = 4,6.
Electroforesis


















Es un trmino que en general se refiere al movimiento de partculas
cargadas (iones) en un campo elctrico. Esta tcnica es ampliamente
utilizada en Bioqumica, para la separacin y caracterizacin de protenas, ADN
y otras molculas con carga elctrica.

Bajo la influencia de un campo elctrico, molculas con carga positiva migrarn
hacia el ctodo (-), molculas con carga negativa migrarn hacia el nodo (+) y
molculas sin carga no migrarn.

La electroforesis ha sido muy valiosa en el aislamiento y separacin de
protenas esto se debe a que los mtodos electrorticos se pueden realizar en
condiciones muy suaves protegiendo a las protenas de cualquier modificacin
estructural.

En la actualidad han adquirido gran desarrollo las tcnicas electroforticas de
zona en que las protenas se mueven a travs de un soporte uniforme del tipo
de un gel, almidn, etc. En el gel la movilidad de las molculas est
determinada por su carga, su peso molecular, tamao del poro del gel y por el
campo elctrico. Geles de poliacrilamida son el medio de soporte de eleccin
para electroforesis porque son qumicamente inertes y se forman rpidamente
por polimerizacin de la acrilamida.



H O
I II
H
2
C= C - C - NH
2
acrilamida

Adems el tamao de los poros puede controlarse utilizando diferentes
concentraciones de acrilamida y metilenbisacrilamida.

H O
I II
(CH
2
= C - C - NH)
2
- CH
2
metilenbisacrilamina

CONH
2
CONH
2

I I
CH
2
-CH-CH
2
-CH-CH
2
-CH-
I
CONH
I
CH2

Formacin de gel de
poliacrilamida
|
CONH
l
CH
2
-CH-CH
2
-CH-CH
2
-CH-
| |

CONH
2
CONH
2


Un tipo de electroforesis empleada para las protenas es la electroforesis en
gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS page) . El
dodecilsulfato de sodio (SDS) es un detergente que tiene una carga negativa
por molcula y que al unirse a las protenas les confiere dicha carga,
determinando que, al aplicar un campo elctrico stas migren al polo + La
migracin de los derivados de protenaSDS hacia el nodo es inversamente
proporcional al logaritmo de su PM.


Propiedades tampn de las protenas

El carcter de cido dbil de las protenas en presencia de sus bases
conjugadas les permite funcionar como soluciones tampones, es decir, que
pueden agregarse cantidades relativamente grandes de cido o de lcali sin
que vare apreciablemente el pH. Esta propiedad es de gran importancia en los
sistemas biolgicos, donde se ha visto que las protenas constituyen el principal
sistema tampn. Por ejemplo, aproximadamente el 80% del poder
amortiguador de la sangre de los mamferos se debe a las protenas.
PARTE EXPERIMENTAL

1. Accin de solventes orgnicos

Esquema de trabajo

Tubos 1 2 3
Solucin de albmina (mL) 2 2 2
Metanol (mL) 2 - -
Etanol (mL) - 2 -
Acetona (mL) - - 2

Observe y anote sus resultados.


2. Precipitacin por formacin de sales

Esquema de trabajo

Tubos 1 2 3 4
Solucin de albmina (mL) 3 1 1 1
TCA (cido Tricloroactico) (mL) 1 - - -
Hidrxido de sodio NaOH
(gotas)
- 2 2 2
Hg
2
Cl
2
(gotas) - 5 - -
AgNO
3
(gotas) - - 5 -
Pb(NO
3
)
2
(gotas) - - - 5

Observe lo que pasa en cada tubo.

3. Accin del calor sobre las protenas

En un tubo de ensayo colocar 5 mL de solucin de albmina y calentar
con cuidado la parte superior hasta que hierva; comparar con la parte
inferior.

4. Determinacin del punto isoelctrico de la casena

Una serie de tubos que contienen una cantidad estndar de solucin de
protena se tratan con cantidades variables de cido actico. Los pH
obtenidos en cada uno de los tubos aparecen en el esquema de trabajo.

El pH del tubo que tenga la mayor precipitacin se toma como punto
isoelctrico.






Esquema de trabajo

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua destilada (mL) 6,8 5 5 5 5 5 5 5 5
cido actico 1M (mL) 3,2 - - - - - - - -
Sacar 5 mL de tubo
anterior
- 5 5 5 5 5 5 5 5 descarta
r
Sol. de protena casena
(mL)
1 1 1 1 1 1 1 1 1
pH de cada tubo 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9

NOTA
a) La solucin de casena se debe agregar a cada tubo rpidamente y
mezclar.
b) Anotar el efecto inmediato que se produce en los diferentes tubos y el
que se observa despus de 15 minutos.


Cuestionario

1. Utilizando la ecuacin de Henderson-Hasselbach: pH=pK + log |sal |
|cido]
Compruebe los valores de pH dados en el esquema de trabajo
correspondiente a la determinacin del pHi de la casena (pKa=4,7 ac. actico)

2. Cul sera el mnimo de grupos disociables que se puede encontrar en una
cadena polipeptdica lineal?

3. En un tetrapptico cuya secuencia es: glicil - glutamil aspartil leucina.
Cuntos grupos disociables existen?

4. Algunas veces los aminocidos son utilizados como amortiguadores. Un
amortiguador es una solucin que resiste los cambios de pH cuando se le
agrega un cido o una base. El intervalo de pH en el cual es efectivo un
amortiguador se denomina intervalo amortiguador, generalmente definido como
pKa + 1 a pKa 1.

a) Indique intervalo (s) amortiguador para Gly, Asp y Lys.
b) Escoja un aminocido que sirva para amortiguar a pH = 4,0 y a pH = 9.0.


5. Por qu precipita la casena en su punto isoelctrico? Este
comportamiento es reversible?


6. Hay diferencia entre hidrlisis proteica y desnaturalizacin proteica?


7. Qu influencia tiene la constante dielctrica (D) sobre la atraccin de iones
con carga opuesta en una solucin?
TRABAJO PRACTICO N3

PROPIEDADES ACIDO-BASICAS DE LOS AMINOACIDOS

El conocimiento de las propiedades cido-bsicas de los aminocidos es de
gran importancia en la comprensin y el anlisis de las propiedades de las
protenas.

En el estado slido y en solucin los aminocidos manifiestan dos propiedades
fciles de observar y que proporcionan informacin acerca de su estructura.
Los aminocidos, con ciertas excepciones, son solubles en agua y bastante
insolubles en solventes orgnicos no polares. Esta observacin est en
contradiccin con las propiedades conocidas de los cidos carboxlicos y de las
aminas orgnicas.

La otra propiedad fsica de los aminocidos que se relaciona con su estructura
es su elevado punto de fusin, que con frecuencia determina su
descomposicin. En cambio los puntos de fusin de los cidos carboxlicos y
de las aminas por lo general son bajos.

Las solubilidades y los puntos de fusin sugieren claramente que los
aminocidos tienen grupos cargados y altamente polares.

Estos y otros datos llevaron a la conclusin que los amincidos se encuentran y
cristalizan a partir de las disoluciones acuosas neutras en forma de iones
dipolares, llamados tambin iones hbridos en vez de hacerlo en forma de
molculas no disociadas.

R R

I I
NH
+
3
- C - COO
-
NH
+
3
- C - COOH

I I
H H

Forma dipolar Forma no disociada

Cuando un ion hbrido cristalizado se disuelve en agua, puede actuar como
cido o bien como base, es decir, se trata de sustancias anfteras. Todos los
aminocidos tienen al menos un grupo cido (carboxilo) y un grupo bsico
(amino), se trata entonces de anfolitos (electrolitos anfteros). Algunos
aminocidos contienen adems otros grupos fcilmente ionizables, como por
ejemplo: amino libre en la lisina, carboxilo libre en el cido asprtico,
hidroxifenilo en la tirosina, sulfhidrilo en la cistena, guanidina en la arginina y el
imidazol en la histidina.

El comportamiento cido-bsico de los aminocidos corrientes puede
explicarse en base a la teora de cidos y bases de Brnsted-Lowry (cido =
dador H
+
) y (base = aceptor H
+
). Una reaccin cido-bsica comprende
siempre un par cido base conjugado, constituido por un dador de protones y el
correspondiente aceptor.

Ejemplo: CH
3
COOH CH
3
COO
-
+ H
+

dador aceptor

Cada cido posee una afinidad caracterstica para su protn. Los que tienen
una afinidad elevada por el protn son cidos dbiles, por lo tanto, se disocian
muy ligeramente, los cidos que muestran una pequea afinidad por el protn
son cidos fuertes y los pierden con facilidad. La tendencia de cualquier cido
a disociarse est dada por su constante de disociacin (Ka) Ej.: Para un cido
HA:

HA H
+
+ A
-
Ka = [ H
+
] [ A
-
]
[HA]

pKa = -log
10
Ka

Los cidos fuertes tienen bajos valores de pKa.

Todos los aminocidos tienen al menos dos constantes de disociacin, una
para el grupo o - carboxilo, (K
1
o K
o
- COOH).


O O
- C - C + H
+

OH O
-



(HA) (A
-
)


y otra para el grupo o - amino (K
2
o K
o
- NH
3
+
)

-NH
3
+
-NH
2
+ H
+


(HA) (A
-
)

Adems algunos aminocidos tienen una cadena lateral ionizable con una
tercera constante de disociacin. Ej.: el cido asprtico y el cido glutmico
tiene un segundo grupo carboxilo y la lisina un grupo amino adicional.








Valores de pK para la disociacin de los grupos de algunos aminocidos
(25C)

Aminocido pK
o
- COOH pK
o
- NH
3
+
pK R

Gly 2,3 9,6
Ala 2,3 9,7
Val 2,3 9,6
Leu 2,4 9,6
Ser 2,2 9,2
Thr 2,6 10,4
Cys 1,7 10,8 8,3 (SH)
Lys 2,2 9,0 10,5 (c-amino)
Arg 2,2 9,0 12,5 (Guanidino)
Asp 2,1 9,8 3,9 (|-carboxilo)
Glu 2,2 9,7 4,3 (-carboxilo)
Phe 1,8 9,1
Tyr 2,2 9,1 10,1 (hidroxifenol)
His 1,8 9,2 6,0 (imidazol)


El pH de una solucin y la constante de disociacin, Ka, de un grupo
ionizable en la solucin estn relacionadas por la ecuacin de Henderson
Hasselbalch.


pH = pK
a
+ log [A
-
]
[HA]


Al hacer una valoracin, el valor del pH en el punto medio de la valoracin
es numricamente igual al pK del cido valorado. En el punto medio se
encuentran presentes concentraciones equimolares de la especie dadora de
protones (HA) y de al especie aceptora de protones (A
-
).

Como ya se mencion los aminocidos se encuentran como ion dipolar o
Zwitterion, en donde el grupo carboxilo est ionizado y el grupo amino se
encuentra protonado. Ej.: estructura dipolar de la alanina:



CH
3
|
NH
3
+
- CH COO
-






La valoracin de un ion dipolar se efecta en la siguiente forma: cuando
se agrega el lcali a la solucin neutra del aminocido, es el protn del NH
3
+
el
que reacciona:


CH
3

I
OH
-
NH
2
CH COO
-
+ H
2
O
CH
3

|
NH
3
+
- CH COO
-
CH
3

I
H
+
NH
3
+
- CH COOH

Al agregar cido a la solucin neutra del aminocido, el grupo carboxilo
disociado acepta el protn para formar la especie protonada del aminocido. Si
se considera al aminocido en forma inica como in dipolar el grupo amino es
el dador de H
+
para la neutralizacin con lcalis. En forma similar, el grupo
carboxilo disociado es el grupo valorado por los cidos.

pH
Curva de titulacin para alanina
14

12

10 pK
3
= 9,7

8

6 pHI = 6,02

4
pK
1
= 2,3
2



20 10 0 10 20
ml HCl ml NaOH

Los valores de pK se numeran generalmente siguiendo la direccin de la
regin cida a la bsica Ej.: alanina tiene un pK
1
= 2,3 que corresponde a la
semineutralizacin del grupo amino protonado.

Las curvas de valoracin de los aminocidos con grupos R que se ionizan
(tales como lisina, cido glutmico, etc.) son ms complejas, puesto que son
una combinacin de curva correspondiente a la disociacin del grupo R y las
curvas de valoracin de los grupos o - amino y o - carboxilo.

Parte Experimental

En este prctico se estudiar el comportamiento de los aminocidos frente
a diferentes concentraciones de iones hidrgeno. Observndose el cambio de
pH de la solucin de aminocido cuando se le agrega una solucin de un cido
o de una base.

Pese 200 mg. de un aminocido y disuelva en 20 mL de agua destilada.
Mida el pH inicial con peachmetro.

En una bureta coloque H
2
SO
4
2N y titule el aminocido disuelto agregando
cada vez 0,1 mL de la solucin del cido. Mezcle agitando con bagueta y mida
cada vez el pH de la solucin hasta alcanzar pH = 1,2. Anote los volmenes de
cido gastados en cada titulacin.

Disuelva una segunda muestra de 200 mg de aminocido en 20 mL de
agua destilada y titule con NaOH 2N en la misma forma que se titul con cido
hasta alcanzar esta vez pH = 12.


PAUTA INFORME:

Con los datos experimentales obtenidos y en base a la pauta que se indica a
continuacin, confeccione un informe que deber entregar en la prxima sesin
de laboratorio.

1. INTRODUCCION ( Debe ser breve y en relacin a las propiedades cido
base de los aminocidos)

2. MATERIALES Y METODOS

3. DATOS EXPERIMENTALES
a. Presentarlos como tabla de datos: Tabla I
pH vol.H
2
SO
4
2N

(mL) meq H
2
SO
4


Tabla ll
pH vol NaOH 2N (mL) meq NaOH




b. Con los datos de las tablas confeccionar el grfico de titulacin del
aminocido.

Ponga los valores de pH en las ordenadas y en las abscisas los
miliequivalentes de cido o base necesarios para titular la muestra del
aminocido.



4. RESULTADOS

a. A partir del grfico determinar : pK
1,
pK
2
y pH
i

b. Clculo % error relativo para pK
1
, pK
2
y pH
i :
Compare los valores obtenidos
por usted, con los de bibliografa , calculando el % de error relativo en cada
caso.


% error relativo = (valor observado valor verdadero) x 100
valor verdadero


5. DISCUSION


6. BIBLIOGRAFIA




CUESTIONARIO


1. Para aminocidos monoamino monocarboxlicos el pHi (punto isoelctrico)
est definido por la relacin pHi = pK1+pK2 en base a esto calcule los valores
de punto
2
isoelctrico para alanina y leucina.


1. a) Escriba todos los estados posibles de ionizacin del aminocido Ser.
b) Indique cual estado de ionizacin predomina a:
pH = 10; pH = 7.0 y pH = 11.0


2. En base a los valores de pK, indique la carga neta: negativa (-), cero (0),
positivo (+) para los aminocidos: glicina y cido asprtico a: pH = 1.0; pH
= 2.1; pH=4,0 y pH = 10.


4. Escriba las formas inicas del aminocido Val presentes a un pH = pk
2
.










TRABAJO PRACTICO N 4

ENZIMAS

Una caracterstica especial de las clulas es su capacidad para realizar
reacciones qumicas rpidas a temperatura ambiente. Fuera de la clula, esas
reacciones slo se pueden realizar muy lentamente. La compleja actividad
metablica de la clula no podra realizarse a velocidades tan bajas. Los
agentes bsicos de las transformaciones celulares son un grupo de sustancias
proteicas llamadas enzimas.

Enzima es una protena sintetizada en la clula, que cataliza una reaccin,
de tal forma que la velocidad de esa reaccin sea compatible con los procesos
bioqumicos esenciales para la vida celular. Concentraciones sumamente
bajas son suficientes para actuar. Su naturaleza proteica les confiere
especificidad; esto significa que cada enzima cataliza una reaccin; por lo
tanto, son necesarias miles de ellas para acelerar las diferentes reacciones que
se producen en la clula. Por su naturaleza proteica una enzima perder sus
propiedades catalticas por accin del calor, cidos o bases fuertes, solventes
orgnicos u otros agentes capaces de desnaturalizar proteinas.

Las enzimas intervienen en las reacciones qumicas aumentando su
velocidad, porque disminuyen la energa de activacin y por lo tanto, permiten
que stas ocurran a bajas temperaturas; pero no alteran el equilibrio de las
reacciones, lo que significa que la cantidad total de reaccionantes
transformados al final de la reaccin es igual con o sin enzima.

Para ejercer su actividad muchas enzimas necesitan que est presnte una
molcula orgnica, de carcter no proteico, que se denomina coenzima,
adems las enzimas requieren a veces de algunos iones tales: Mg
+2
, Mn
+2
,
Ca
+2
, etc. que favorecen la actividad enzimtica por lo que se denomina
activadores.

La actividad de las enzimas depende de una serie de factores tales como:
temperatura, pH, concentracin de sustrato, concentracin de enzimas,
inhibidores, activadores y otros. Las condiciones ptimas de trabajo varan de
acuerdo a la enzima considerada. En la prctica es importante mantener en
forma adecuada el pH y la temperatura.


pH: Una enzima es activa como catalizador dentro de un margen relativamente
estrecho de pH, siendo generalmente ms activa a un pH especfico,
denominado pH ptimo. A valores de pH distintos del ptimo la enzima es
inestable y experimenta alteraciones en su estructura terciaria, lo cual afecta la
parte activa.
Temperatura: Las reacciones enzimticas son afectadas por los cambios de
temperatura. En un comienzo, partiendo de bajas temperaturas, se observa un
aumento en la velocidad de reaccin, ya que se aumenta la energa del sistema
y ms molculas obtienen la energa de activacin necesaria para que ocurra la
reaccin. Si no existieran otros factores que considerar,este incremento en la
velocidad de reaccin con la temperatura podra continuar hasta el infinito . Sin
embargo, si se incrementa la temperatura ms all de un cierto lmite, la
energa del sistema es suficiente para causar la ruptura de los puentes de
hidrgeno y de algunas otras fuerzas que dan lugar a la estructura terciaria. La
enzima empieza a perder actividad y puede llegar a inactivarse totalmente.


Concentracin de sustrato: La ecuacin de Michaelis- Menten es la
expresin matemtica que define la relacin cuantitativa entre la velocidad de
una reaccin enzimtica y la concentracin de sustrato. Esta ecuacin
corresponde a una curva hiperblica.

v

Cintica de orden cero
v= Vmax x [S]
Km +| S | Vmax -------------------------------------------------------


Cintica de orden 0 y primer

Orden (mezcla)
Vmax
2 - Cintica de 1 er. orden



Km
[S]


En dicha ecuacin, v es la velocidad que se observa a una concentracin de
sustrato dada [S]; Km es la constante de Michaelis, expresada en unidades de
concentracin (moles/litro) y V max es la velocidad mxima al punto de
saturacin en la concentracin de sustrato.


Cuando [S] es de gran magnitud, Km se transforma en insignificante y la
ecuacin de Michaelis-Menten queda convertida en: v = Vmax, es decir, una
reaccin de orden cero, en la que v es independiente de la concentracin de
sustrato.


Si se escoge un valor de v = 1 Vmax la ecuacin de Michaelis-Menten
puede
2



anotarse de la siguiente forma:


Vmax = Vmax [S]
2 Km+ [S]

Km + [S] = 2 [S]

Km = [S]

Si Km es grande en comparacin a [S], la ecuacin se convierte en:

V = V max [S]
Km

Es decir, v depende de S, por lo que la reaccin es de primer orden.


Concentracin de enzima: La velocidad de una reaccin catalizada por
enzimas es directamente proporcional a la concentracin de enzima presente.
La validez de esta relacin lineal es absolutamnete esencial para la medida
cuidadosa de la actividad enzimtica. Esta relacin es vlida bajo ciertas
condiciones rigurosamente definidas. El pH y la temperatura del sistema deben
ser constantes y el sustrato debe estar presente en exceso.

La relacin directa es especialmente efectiva en los primeros instantes de la
reaccin. Algunas enzimas son inhibidas por productos, inhibicion que
aumenta a medida que transcurre el tiempo.

Inhibidores. Existen sustancias que sin ser sustratos de la enzima son
capaces de combinarse con ella, pero en esta caso no se forman productos
estas sustancias interfieren la actividad enzimtica al impedir que el sustrato
original forme el complejo.
Se considera que un inhibidor es competitivo cuando puede unirse al sitio
activo compitiendo con el sustrato enzimtico. Esto determina la disminucin
de la actividad cataltica. La proporcin de la inhibicin de este tipo se
relaciona con: la concentracin de inhibidor,la concentracin del sustrato y
con las afinidades relativas del inhibidor y del sustrato.En este tipo de inhibicin
la Km se altera por efecto del inhibidor , pero no la Vmax.

El inhibidor es no competitivo cuando se une irreversiblemente con un sitio
de la enzima y una vez que esto sucede no puede ser desplazado por el
sustrato, aunque la concentracin de ste ltimo se aumente de manera
significativa. La proporcin de este tipo de inhibicin se relaciona con: La
concentracin del inhibidor y la afinidad del inhibidor con la enzima. La Km no
se altera por el inhibidor, pero si la Vmax.

Para determinar la actividad de una enzima se mide la cantidad de sustrato
consumido o la cantidad de producto formado por un tiempo determinado
mediante mtodos qumicos, tales como las reacciones de coloracin o bien
por mtodos fsicos tales como viscosidad o espectrofotometra.

Unidades de actividad enzimtica. La actividad de una enzima se puede
expresar en unidades de actividad enzimtica, aquella empleada ms
corrientemente se define como: la cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de un micromol (10
-6
mol) de sustrato por un minuto a 25C.
La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por milgramo
de protena, constituye una medida de la pureza de una enzima que aumenta
durante el proceso de purificacin y llega a ser mxima y constante cuando
sta se encuentra en estado puro.

Valoracin de la actividad amilasa. En el trabajo prctico se utilizar la
enzima amilasa salival esta enzima hidroliza al amidn transformndolo en
dextrinas y maltosa, ya que cataliza la ruptura de los enlaces alfa glucosdicos
situados en el centro de la molcula. Se caracteriza por presentar actividad en
el rango de pH de 3,8 a 9,4 y su pH ptimo es 6,9. Es activada principalmente
por cloruros y en menor grado por otros aniones tales como: bromuro, ntrito,
yoduro, etc. Su punto isoelctrico es cercano a 5,3.

El reactivo de yodo da un color azul con el almidn, pero no con los productos
de degradacin. La intensidad del color es directamente proporcional a la
concentracin de almidn.La actividad enzimtica se determina midiendo la
disminucin en color, durante la incubacin de la enzima con el almidn en un
cierto perodo.

La siguiente pauta ilustra el proceso de degradacin:

Almidn

Amilasa

Amilodextrina + maltosa

Amilasa

Eritrodextrina + maltosa



Acrodextrina + maltosa

Amilasa

Maltosa








Actividad de catalasa

La catalasa es una enzima que acta sobre el perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) y
produce su descomposicin en la siguiente forma:

Catalasa
2 H
2
O
2
2H
2
O + O
2


Una molcula de catalasa descompone alrededor de 5.000.000 de molculas
de H
2
O
2
por minuto.

El rol metablico de esta enzima es de gran importancia ya que evita la
acumulacin de perxido de hidrgeno (un producto habitual del metabolismo
oxidativo).

La catalasa es una protena compleja cuyo grupo prosttico es la forma frrica
de la protoporfirina. Esta enzima se encuentra tanto en tejidos animales como
vegetales y es abundante especialmente en estructuras de almacenamiento de
las plantas tales como: tubrculos(como el de la papa), granos y frutos.

En el prctico se trabajar con catalasa de tubrculo de papa, observando su
actividad bajo diferentes condiciones.



Parte Experimental


1. Cintica de la reaccin amilsica


Disponga de 6 tubos de ensayo con 1 mL de H
2
SO
4
1N cada uno.
En otro tubo de ensayo coloque lo siguiente:

Almidn 0,1M ___________________________ 0,9 ml

Tampn pH = 6,9 ________________ _______ 0,1 ml

KCI 0,1M ______________________________ 0,9 ml

Agua destilada __________________________ 5,6 ml

Enzima diluda __________________________ 0,5 ml 1/10 en S.F.

El ltimo componente que debe agregar, es la dilucin de saliva.
Luego agite y saque rpidamente una alcuota de 1 mL. Vierta en uno de los
tubos que contiene H
2
SO
4
1N (Este corresponde al tiempo cero)

Incube los 7 mL restantes a 37C y saque alcuotas de 1 mL a los siguientes
tiempos: 1
,
, 2
,
, 4

, 8

, 16

. Vierta las alcuotas en cada uno de los tubos con

H
2
SO
4
1N ( el cido desnaturaliza a la protena y por lo tanto detiene la
reaccin enzimtica)

A cada uno de los tubos agregue 1 gota del reactivo de yodo.Observe y
anote lo ocurrido.


2. Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa

Disponga de 6 tubos de ensayo y adicione los siguientes reactivos segn el
esquema:


REACTIVOS


N Tubos
1 2 3 4 5 6
Tampn pH = 4,9 (ml) 1 1 - - - -
Tampn pH = 6,9 (ml) - - 1 1 - -
Tampn pH = 9,6 (ml) - - - - 1 1
Almidn (ml) 1 1 1 1 1 1
KCI 0,1 M (ml) 1 1 1 1 1 1
Acido sulfrico IN (ml) - 0,5 - 0,5 - 0,5
Enzima diluida 1/10 en S.F. (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Incube a 37 por 15los tubos 1, 3 y 5


Detenga la reaccin con H
2
SO
4
1N (ml) 0,5 -- 0,5 -- 0,5 --
Reactivo de yodo (gotas) 1 1 1 1 1 1


Los tubos 2, 4 y 6 corresponden a lo que se conoce como tiempo cero de la
reaccin, es decir, tiene por objeto conocer la composicin qumica del medio
antes que se inicie la reaccin enzimtica




3. Efecto de cloruros sobre la actividad de amilasa salival

Para estudiar el efecto de cloruros se utilizar saliva dializada. Para esto se
coloca la saliva en una bolsa de dilisis lo cual elimina sustancias de peso
molecular bajo 10.000, la dilisis se realiza contra agua destilada,durante 16 a
18 hrs. a 4C.

Una parte de la saliva dializada se diluye 1/10 en agua destilada y otra parte
se diluye 1/10 en suero fisiolgico.

Disponga de 6 tubos de ensayo y adicione los siguientes reactivos segn el
esquema:


REACTIVOS


N Tubos
1 2 3 4 5 6
Tampn pH = 6,9 (ml) 1 1 1 1 1 1
Almidn (ml) 1 1 1 1 1 1
Acido sulfrico 1N (ml) - 0,5 - 0,5 - 0,5
Enzima diluida 1/10 en S.F. (ml) 0,5 0,5 - - - -
Enzima dial. y dil. 1/10 en S.F. (ml) - - 0,5 0,5 - -
Enzima dial. y dil. 1/10 en agua (ml) - - - - 0,5 0,5
Incube a 37 por 15los tubos 1, 3 y 5


Detenga la reaccin con H
2
SO
4
1N (ml) 0,5 -- 0,5 -- 0,5 --
Reactivo de yodo (gotas) 1 1 1 1 1 1



Los tubos 2,4 y 6 corresponden al tiempo cero de la reaccin.




4. Deteccin de catalasa


En el prctico se trabajar con catalasa de tubrculo de papa, observando su
actividad bajo diferentes condiciones.








Procedimiento:

Disponga de 4 tubos de ensayo y proceda como se indica en el esquema que
aparece a continuacin.




N Tubo
1 2 3 4
Macerado papas(ml) 2 2 2 --
Macerado papas calentado a
100C
-- -- -- 2
KCN 5%(gotas) -- 5 -- --
Agua oxigenada(gotas) 5 5 5 5



Cuestionario:

1. Qu diferencia existe entre los catalizadores inorgnicos y las enzimas?

2. Qu se entiende por velocidad mxima (Vmax) de una reaccin
enzimtica?

3. La ecuacin final obtenida por Michaelis al desarrollar matemticamente su
hiptesis es:

V = V max x [S]
Km +[S]

Despeje Km en funcin de la otras variables.

4. En qu unidades se expresa Km?

5. Por qu al medir una actividad enzimtica es necesario aadir al medio de
incubacin una solucin amortiguadora de pH?

6. Qu se entiende por coeficiente de temperatura Q
10
?

7. Son sinnimos inactivacin y desnaturalizacin de una enzima?

8. Por sobre cierta temperatura la actividad de un sistema enzimtico
disminuye. Cul es el mecanismo predominante que determina la
disminucin?

9. Qu efecto tiene el aumento de la concentracin de sustrato sobre
inhibicin competitiva de una reaccin enzimtica?

10. Cuando en una reaccin enzimtica la [S] no es saturante En qu forma
se puede encontrar la enzima?
TRABAJO PRCTICO N 5

IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS


Los carbohidratos se definen qumicamente como derivados aldehdicos o
cetnicos de alcoholes superiores polivales (con ms de un grupo OH) o
como compuestos, que por hidrlisis dan estos derivados. Constituyen un
grupo importantsimo de compuestos orgnicos, no slo desde el punto de vista
bilogico, sino muchos de ellos en el campo industrial.


1. Los carbohidratos sirven como: almacenadores de energa, combustible
e intermediarios metablicos. Es el caso del almidn en las plantas y
glicgeno en los animales, los cuales pueden ser movilizados rpidamente
y convertidos en glucosa, principal combustible para la generacin de
energa.

2. Algunos carbohidratos son componentes estructurales del DNA y RNA
es el caso de la ribosa y desoxirribosa.

3. Tambin hay carbohidratos que son elementos estructurales de las
paredes celulares en bacterias, plantas y exoesqueleto de artrpodos. Por
ejemplo, la celulosa, es el constituyente principal de las paredes celulares
de las plantas.

4. Adems, los carbohidratos tienen un gran valor industrial, especialmente
la celulosa y sus derivados.


Clasificacin: Los carbohidratos pueden clasificarse en tres grupos
principales: monosacridos, oligosacridos y polisacridos.



Monosacridos

Son aquellos carbohidratos que no pueden ser hidrolizados en formas ms
simples. Su frmula emprica es (CH
2
O)
n
. Considerando el nmero de
carbonos que constituyen su molcula se clasifican en: triosas, tetrosas,
pentosas, hexosas, etc. que tienen 3, 4, 5 y 6 tomos de carbono
respectivamente. Entre los monosacridos ms simples con n = 3 estn el
gliceraldehido (aldosa) y la dihidroxiacetona (cetosa).

El gliceraldehido tiene un tomo de carbono asimtrico de modo que existen
dos estereoismeros: D gliceraldehido y L- gliceraldehido.




CHO CHO CH
2
OH
I I I
H C OH HO C H C = O
I I I
CH
2
OH CH
2
OH CH
2
OH

D gliceraldehido L gliceraldehido dihidroxiacetona


Entre las pentosas estn por ejemplo la ribosa


CHO HOCH
2

I O
H C OH OH
I
H C OH 4 1
I
H C OH H H
I H 3 2 H
CH
2
OH
OH OH
D ribosa
| - D ribosa
(| - D ribofuranosa)



Entre las hexosas estn entre otras: glucosa, galactosa y fructosa.


CHO CHO CHO
I I I
H C OH H C OH C = O
I I I
HO C H HO C - H HO C - H
I I I
H C OH HO C H H C -O H
I I I
H C OH H C OH H C - O H
I I I
CH
2
OH CH
2
OH CH
2
OH

D glucosa D galactosa D fructosa







Las hexosas se ciclan formando anillos de furanosa o piranosa Ej.:

6 CH
2
OH
5 O H 6 O 1
H HOCH
2

CH
2
OH
H
4 1 5 H OH 2
OH H
OH 3 2 OH H OH
H OH
4 3

OH H

o - D glucosa o - D - fructosa
(o - D glucopiranosa) (o - D fructofuranosa)



Oligosacridos

Dan por hidrlisis dos a seis molculas de monosacridos. Estn aqu los
disacridos que al ser hidrolizados dan como producto final dos molculas de
monosacridos. Los disacridos de mayor importancia son: sacarosa, lactosa
y maltosa que por hidrlisis dan origen a:

Sacarosa = glucosa + fructosa
Lactosa = glucosa + galactosa
Maltosa = glucosa + glucosa

En su mayor parte, los monosacaridos y oligosacridos son compuestos
cristalinos, solubles en agua, con frecuencia de sabor dulce.


Polisacridos

Son cadenas largas o polimeros de los monosacridos, que pueden presentar
una estructura lineal o ramificada. Los polisacridos ms importantes son:
almidn, glucgeno y celulosa. Por hidrlisis del polisacrido se obtienen los
monosacridos que constituyen y derivados sencillos de monosacridos.
Los polisacridos difieren en la naturaleza de sus unidades monosacridas. Se
dividen en homopolisacridos, constituidos por un solo tipo de unidad
monomrica y heteropolisacridos, que contienen dos o ms unidades
monmeras diferentes. Por lo general, los polisacridos son inspidos,
insolubles y de peso molecular elevado.




Almidn

Es el reservorio nutricional que poseen las plantas, el cual existe en dos
formas: amilosa, tipo de almidn no ramificado, constitudo por molculas de
glucosa unidas mediante enlaces glucosdos o - 1,4. Amilopectina, forma
ramificada de almidn, dichas ramificaciones se forman por unin de glucosa
con enlace glucosdico o - 1,6 en la parte no ramificada, las uniones son las
mismas de amilosa. Ms de la mitad de los carbohidratos ingeridos por el ser
humano coresponde a almidn, que es rpidamente hidrolizado por o -
amilasa, secretada por las glndulas salivales y el pncreas.

Glucgeno

Es la forma de almacenamiento de glucosa de las clulas animales. Es un
polmero ramificado de glucosa, la mayora de las cuales estn unidas por
enlaces glucosdicos o - 1,4. La ramificaciones se forman por enlaces
glucosdicos o - 1,6.

Celulosa

Polisacrido estructural presente en las plantas. Es el compuesto orgnico
ms abundante en la bisfera. Se trata de un polmetro no ramificado de
molculas de glucosa unidas por enlaces | - 1,4. Los mamferos no tienen
celulasa y por lo tanto no pueden digerir fibras vegetales. Sin embargo,
algunos rumiantes almacenan celulasa producida por bacterias en su tracto
digestivo y as pueden digerir celulosa.


Reacciones de Identificacin de Carbohidratos

Existen diversas reacciones para los carbohidratos, que son importantes, ya
que constituyen la base de la mayora de las pruebas para el anlisis de estos
compuestos.


Reaccin de Molish

Es el test ms general para carbohidratos. Si la solucin de carbohidrato se
trata con una solucin de o - naftol y se aade cido sulfrico concentrado, se
obtiene en la unin de los dos lquidos, un anillo color violeta. La reaccin se
debe a que al actuar el H
2
SO
4
sobre el hidrato de carbono, produce su
deshidratacin generndose furfural aldehido o derivados los cuales al
condensarse con el o - naftol dan productos coloreados.







CHO
I
CH OH
I H
+

CH OH
I
CH OH CHO
I O
CH
2
OH furfural


CHO
I
CH OH
I
CH OH
I H
+

CH OH
I
CH OH HOCH
CHO
I O
CH
2
OH

5- hidrometil
OH furfural
OH



+ 2
H
2
SO
4

CHO
O
o-naftol HOCH
2
O CH









OH



O





H
2
SO
4




HOCH
2
C
O


HO
3
S SO
3
H


Reaccin de Fehling

Esta reaccin se basa en el poder reductor del grupo carbonilo (aldehido o
cetona) de un carbohidrato que pasa a cido, reduciendo las sales cpricas en
medio alcalino (reactivo de Fehling) a xido cuproso. El reactivo de Fehling es
de color azul intenso (debido al complejo cprico) se agrega a la solucin de
carbohidrato y se hierve.

CHO COONa

H C OH H C OH
React. Fehling
HO C H OH C H + Cu
2
O

H C OH calor H C OH pp xido
cuproso

H C OH H C OH

CH
2
OH CH
2
OH

glucosa gluconato de sodio


Si el carbohidrato posee un grupo aldehido o cetona libre, se forma un
precipitado amarillo de xido cuproso hidratado que pasa a un color rojo de
xido cuproso anhidro al continuar la ebullicin. Esta reaccin sirve para
identificar azcares reductores y cuantificarlos.





Reaccin de Seliwanoff


Esta reaccin permite diferenciar entre cetosas y aldosas. Se basa en la
conversin ( por accin del HCl) de la cetona a 5 hidroximetil furfural, el cual
se condensa con resorcinol (reactivo de Seliwanoff) formando un producto de
color rojo. Durante el mismo intervalo en que, con la fructosa (cetohexosa)
aparece un color rojo intenso, con la glucosa (aldohexosa) se origina un ligero
color rosa.


Reaccin del yodo con los polisacridos


Algunos polisacridos como almidn, glicgeno y dextrinas dan colores
caractersticos con el yodo. Se acepta que las cadenas de polisacridos estn
enrrolladas sobre si mismas formando hlices dentro de las cuales hay espacio
suficiente para incluir cadenas lineales de tomos de yodo. El color de la
reaccin se debe a que, el yodo as atrapado absorbe ms luz e incluso cambia
su espectro de absorcin de la luz.

La reaccin depende de la temperatura, ya que el color desaparece por
calentamiento y reaparece al enfriar la solucin; la desaparicin del color se
intepreta como desenrollamiento de las hlices con exclusin del yodo a
medida que se aumenta la temperatura.

La reaccin coloreada se produce en medio neutro y cido; en medio alcalino
no se produce el color debido a que desaparece el yodo libre, por
transformacin en yoduro e hipoyodito.


Hidrlisis cida de almidn


La hidrlisis de los enlaces glucosidicos del almidn es catalizada tanto por
cidos como por enzimas. En la hidrlisis cida los enlaces se rompen al azar,
formndose inicialmente, adems de glucosa, polisacridos de menor tamao
molecular (dextrinas) y oligosacridos, los cuales finalmente se convierten en
glucosa. La velocidad de la hidrlisis depende de la naturaleza y concentracin
de cido, as como de la temperatura.
La naturaleza polisacrida del almidn puede verificarse demostrando la
aparicin y aumento de los grupos reductores, a medida que progresa la
hidrlisis.







PARTE EXPERIMENTAL

1. Reaccin de Molish: :
1 2 3 4 5
Glucosa (mL) 2
Fructosa (mL) 2
Lactosa (mL) 2
Sacarosa (mL) 2
Agua (mL) 2
o-Naftol 5% (gotas) 2 2 2 2 2
H
2
SO
4
conc. (mL) 1 1 1 1 1

IMPORTANTE
- Luego de agregar o-Naftol agitar vigorosamente
- Agregar con cuidado el H
2
SO
4
concentrado por las paredes del
tubo inclinado de modo que el cido forme una capa sin
mezclarse con la solucin de carbohidrato. En unos pocos
segundos aparecer un anillo violeta en la zona de contacto.

2. Reaccin de Fehling:

1 2 3 4 5
Fehling A (ml) 1 1 1 1 1
Fehling B (mL) 1 1 1 1 1
Glucosa (mL) 1
Fructosa (mL) 1
Lactasa (mL) 1
Sacarosa (mL) 1
Agua (mL) 1


IMPORTANTE
Agitar bien cada uno de los tubos y calentar en un bao de agua
hirviendo.
Reaccin positiva es la aparicin de un color rojo ladrillo.

3. Reaccin de Seliwanoff: En 3 tubos de ensayo numerados, colocar
respectivamente: 1 mL de solucin fructosa, 1 mL de solucin de
glucosa y 1 mL de agua. Agregar a cada tubo 5 mL del reactivo de
Seliwanoff recientemente preparado.

(Reactivo de Seliwanoff: tomar 3,5 ml de solucin de resorcina al 0,5% y
agregarle 12 mL de HCl concentrado y diluir con agua hasta 35 mL).

4. Reaccin del yodo: Disponer de 6 tubos de ensayo y agregar
respectivamente: 1 mL de solucin de glucgeno, 1 mL de solucin de
almidn, 1 mL de solucin de dextrina, 1 mL solucin de maltosa, 1 mL
solucin de glucosa y 1 mL de agua.

Agregar a cada tubo 1 gota del reactivo de yodo.

5. Hidrlisis cida del almidn: A dos tubos de ensayo agregar 1 mL de
solucin de almidn al 5%. Luego a uno de los tubos agregar 2 mL de
H
2
SO
4
2N, al otro agregar 2 mL de agua. Agitar el contenido de cada tubo.

Colocar los tubos en un bao de agua hirviendo por 30 minutos.
Enfriar los tubos y agregar al que corresponde 2 mL de NaOH 2N (para
neutralizar el hidrolizado). Con el contenido de los tubos repetir el test
de Fehling como lo efectu en la parte 2.

1. Identificacin de una muestra problema

Con su muestra problema proceda a efectuar las reacciones que usted estime
conveniente para lograr su identificacin. En el mismo laboratorio entregue el
informe correspondiente.


Modelo hoja informe

a. Nombre del prctico
b. Nombre del alumno(s)
c. Nmero muestra
d. Reaccin color resultado (+/-)



e. Conclusiones



















Cuestionario


1. Qu significa que un carbohidrato sea dextrgiro o levgiro?

2. Qu se entiende por configuracin D y L de los azcares?

3. Qu tomo de carbono de un monosacrido determina que este tenga la
configuracin D L?

4. Qu se entiende por ismetros o y | de la glucosa?

5.Qu grupos funcionales son responsables del poder reductor de un
monosacrido?

6. Por qu solo algunos disacridos tienen poder reductor? De ejemplos
concretos de disacridos reductores y no reductores.

7. Qu enzima pueden usarse para hidrolizar el almidn ?

8.Qu enzimas se necesitan para hidrolizar totalmente el glicgeno?

9. Haga un esquema de la molcula de glucgeno. Indicando claramente los
tipos de enlace que se establecen entre sus unidades constituyentes.

10.Cmo se explica la reaccin de los polisacridos con el yodo?
























TRABAJO PRACTICO N 6

LIPIDOS

El trmino lpido, se refiere a cualquier sustancia apolar que se encuentra en la
naturaleza y que es casi o totalmente insoluble en agua, pero es soluble en
solventes apolares, tales como cloroformo, ter, benceno, entre otros. Debido
a la diversidad estructural y biofuncional de los lpidos, este enunciado es
bastante vago y muy general, sin embargo, se basa en una propiedad
fisicoqumica particular relacionada con la estructura lipdica, es decir, su
naturaleza apolar es la base para la funcin biolgica de los lpidos. En la
mayora de los casos, la apolaridad de los lpidos se debe a la presencia de
uno o ms residuos de cidos grasos que contienen largas cadenas
hidrocarbonadas alifticas.

Como ya se mencion los lpidos presentan una gran diversidad funcional
como por ejemplo:

a.- Asociados con protenas y carbohidratos, sirven como unidad estructural de
la membranas celulares.

b.- Como componentes de las membranas, ayudan al establecimiento y
preservacin de una disposicin ordenada de las protenas funcionalmente
activas, localizadas en la membrana.

c.- A nivel metablico, constituyen una de las principales formas de
almacenamiento de energa qumica.

d.- Sirven como principal sistema de transporte de los materiales apolares a
travs de fludos biolgicos.

Entre los lpidos se distinguen principalmente:

a.- Acidos grasos d.- Fosfolpidos
b.- Acilglicridos e.- Esteroides
c.- Ceras f.- Terpenos

Acidos grasos

Son cidos carboxlicos de cadena aliftica larga. La mayora son
monocarboxlicos y con nmero par de tomos de carbono. En algunos cidos
grasos esta cadena est completamente saturada, otros tienen uno o ms
dobles enlaces.

Los cidos grasos ms abundantes tienen nmero par de tomos de carbono.
Con cadenas carbonadas con ramificaciones y que tienen entre 12 a 24
carbonos. Algunos de ellos son:



Estructura Esqueleto carbonado Nombre Comn

CH
3
(CH
2
)
14
COOH 16:0 Acido palmtico
(del griego palma=palmera)

CH
3
(CH
2
)
16
COOH 18:0 Acido esterico
(del griego stear=grasa dura)

CH
3
(CH
2
)
5
CH=CH(CH
2
)
7
COHH 16:1(
9
) Acido palmitoleico


CH
3
(CH
2
)
7
CH=CH(CH
2
)
7
COOH 18:1(
9
) Acido oleico
(del griego oleum=aceite)


La importancia de los cidos grasos radica en que son componentes
fundamentales de muchos lpidos.

Las propiedades fsicas de los cidos grasos y de los compuestos que los
contienen estan determinadas en gran parte por la longitud y grado de
insaturacin de la cadena hidrocarbonada.

Los cidos grasos pueden ser saturados o no saturados. Una reaccin que
permite su diferenciacin es la absorcin de halgeno. La adicin de
halgeno a los dobles enlaces de los cidos grasos no saturados, constituyen
el fundamento de su separacin respecto de los cidos grasos saturados. El
principal empleo de este mtodo es la determinacin del grado de
inasaturacin de los cidos grasos.

Si un halgeno (Cl
2
, Br
2
, I
2
) se designa por X
2
, la adicin del mismo a un enlace
etilnico puede ocurrir as:

Mecanismo 1:

CH
2
: :CH
2
+ X : X CH
2
: CH
2
: X : X
-
X : CH
2
: CH
2
X

L a velocidad de incorporacin del halgeno a los enlaces etilnicos de los
cidos grasos no saturados depende de la estructura del cido, del tipo de
halgeno y de los disolventes y catalizadores empleados.

Otra teora de la reaccin de halogenacin sostiene que la molcula de
halgeno se polariza:

X
2
X
+
X
-


El catin halogenado reaccionara entonces con la olefina para formar un
grupo polarizado; inmediatamente tendra lugar una rpida adicin del anin
que completara la reaccin.
Mecanismo 2:

CH
2
: : CH
2
+ X
+
X
-
CH
2
: CH
2
: X
+
CH
2
: CH
2
X + X
-
X : CH
2
: CH
2
:
X

Adems de las reacciones de adicin ya descritas el cloro y el bromo pueden
intervenir en reacciones de sustitucin. El yodo en cambio reacciona
lentamente, pero normalmente no origina productos de sustitucin; este
reactivo tiene la ventaja de ser especfico para la reaccin de adicin y el
inconveniente de su lenta velocidad de reaccin. Se emplear este halgeno
en forma de reactivo de Hbl.

Para la identificacin de los cidos grasos es de gran utilidad la formacin de
complejos con urea. Los complejos de urea con los cidos grasos constituyen
derivados tiles para la identificacin, preparacin y aislamiento de los cidos
grasos de mezclas sencillas o complejas. La reaccin no puede expresarse
con una ecuacin a causa de sus proporciones macromoleculares, si bien,
pueden formularse las reacciones entre el nmero de molculas de cido graso
y de urea.

Acilglicridos

Corresponden a steres de cido graso y del trihidroxialcohol glicerol, segn
el nmero de grupos hidroxilo esterficados, se tienen: monoacilglicridos,
diacilglicridos y triacilglicridos, estos ltimos son los ms abundantes en la
naturaleza. Segn su estado fsico a temperatura ambiente los triacilglicridos
se llaman grasas neutras si son slidos y aceites neutros si son lquidos.





Debido a que en estos compuestos los hidroxilos polares del glicerol y los
carboxilatos polares de los cidos grasos estn unidos en enlaces ster, los
triacilglicridos son molculas apolares, hidrofbicas, prcticamente insolubles
en agua.

Los triacilglicridos constituyen los depsitos de grasa, que es la forma
principal de almacenamiento de material lipdico. Las semillas tambin
almacenan triacilglicridos, proporcionando energa y precursores cuando
germinan las semillas.

En ciertos animales polares de sangre caliente, los triacilglicridos no slo
sirven para almacenar energa sino tambin como aislamiento para las
temperaturas muy bajas.

Por otra parte, una gran cantidad de alimentos contienen triacilglicridos, es as
como la mayora de los aceites vegetales, los productos lcteos y las grasas
animales son mezclas complejas de triacilglicridos sencillos y mixtos. Los
aceites vegetales como el aceite de maz y el de oliva estn compuestos
mayoritariamente de triacilglicridos con cidos grasos no saturados. Pueden
ser convertidos en grasas slidad por hidrogenacin cataltica que reduce
algunos de sus dobles enlaces a enlaces simples. Los triacilglicridos que slo
contienen cidos grasos saturados, tales como la triestearina, componente
principal de la grasa de vacuno, son slidos a temperatura ambiente.

En general los acilglicridos se hidrolizan cuando se hierven con cidos y con
bases, o tambin se hidrolizan por accin de las lipasas: Las hidrlisis en
presencia de alcalis se denomina saponificacin y da como producto una
mezcla de jabones y glicerina.

CH
2
O - COR
1
CH
2
OH R
1
COOK
+ ,

,


CHO COR
2
CHOH +
R
2
COOK
+


, Saponificacin ,
CH
2
O COR
3
CH
2
OH
R
3
COOK
+
3KOH
triacilglicrido glicerol jabones
(sales de ac.
grasos

Ceras

Son steres de alcohol y cidos grasos, en que ambos tienen cadenas
hidrocarbonadas largas. Su punto de fusin es generalmente ms elevados
que los de los triacilglicridos.

En la naturaleza, las ceras son generalmente productos metablicos finales
cuyo papel biolgico ms importante es servir de cubierta qumica protectora
en la superficie de animales y plantas.



Fosfolpidos

Pueden derivar del glicerol (fosfoglicridos) o de la esfingosina
(fosfoesfingsidos)


En los fosfoglicridos uno de los grupos hidroxilo primario del glicerol se halla
esterificado por el cido fosfrico, los dems grupos hidroxilo estn
esterificados por cidos grasos. Se les encuentra en las membranas de todos
los tipos de clulas. Los cidos grasos de los fosfoglicridos son variados,
diferentes en las distintas especies, como tambin en tejidos diferentes de la
misma especie y en los diversos fosfoglicridos de un mismo tejido. En general
contienen un cido saturado en C-1 y un cido graso no saturado en C-2 y sus
longitudes de cadena son habitualmente 16 y 18 carbonos.

Los fosfoesfingsidos derivan de la molcula de esfingosina o 4
esfingenina (aminoalcohol de cadena larga), tienen un cido graso de cadena
larga, grupo fosfato y un alcohol de cabeza polar. Como ejemplo de este tipo
de compuestos estn las esfingomielinas que tienen colina o etanol amina
como grupo de cabeza polar. Las esfingomielinas son componentes
importantes de las membranas celulares.

Esteroides

Su estructura bsica corresponde al ciclopentano perhidrofenantreno. Los
esteroides se encuentran en todos los organismos, donde estan asociados con
diversas funciones. La presencia de una cadena lateral en la posicin 17 y de
un grupo hidroxilo en la posicin 3 caracterizan a un gran nmero de esteroides
llamados esteroles

El colesterol es el principal esterol en los tejidos animales. En otros eucariotas
se encuentran esteroles similares como el estigmasterol en plantas y el
ergosterol en hongos.







Los esteroles son constituyentes de membranas, y tambin sirven como
precursores de diversos productos con actividades biolgicas especficas como
es el caso de hormonas esteroidales y cidos biliares.

Para la determinacin de esteroles se dispone de diferentes reacciones
coloreadas. Algunas se basan en el tratamiento de los esteroles con cidos
fuertes o con Br
2
en condiciones anhidras. Los esteroles no saturados en el
anillo A o B o en ambos originan cromforos. Los que no reaccionan bajo
estas condiciones contienen anillos saturados.

La reaccin de Lieberman-Burchard es una de las ms usadas. En esta
reaccin una solucin clorofrmica de esterol se trata con anhdrido actico,
adicionndole inmediatamente gotas de cido sulfrico concentrado, originando
un color rosa, que cambia a prpura y finalmente a azul verdoso y verde. El
cromforo obtenido puede utilizarse para la estimacin cuantitativa del
colesterol. El mecanismo de reaccin es desconocido debido a las dificultades
existentes para aislar productos cromofricos. Esta reaccin puede
representarse:

CH
3
-CO

Esterol + O + H
2
SO
4
Deshidratacin, condensacin e
Isomerizacin de sales halocr-
CH
3
-CO micas (verde)


Terpenos

Estn constitudos por mltiples unidades de isopreno (2-metil-1,3 butadieno).
Los terpenos con dos unidades de isopreno corresponden a monoterpenos,
con tres unidades es un sesquiterpeno, los que tienen cuatro, seis y ocho
unidades reciben el nombre de diterpenos, triterpenos y tetraterpenos,
respectivamente.

Los terpenos pueden presentar estructura lineal o cclica y algunos los dos
tipos. En los vegetales se ha identificado un nmero bastante grande de
terpenos y son componentes de los aceites esenciales obtenidos de plantas,
como es el caso de los monoterpenos, geraniol, limoneno, mentol, pineno,
alcanfor, entre otros.


CH
3

|
CH=C-CH=CH
2
Isopreno

Entre los diterpenos, se encuentra el fitol, componente de la clorofila. Existen
terpenos superiores como los carotenoides, entre ellos se encuentra el B-
caroteno, hidrocarburo precursor de la vitamina A. Las vitaminas E y K tambin
son de naturaleza terpenoide.








PARTE EXPERIMENTAL

1. Solubilidad de lpidos: En cada uno de 3 tubos de ensayo, coloque 1 ml
de aceite y agregue los siguientes solventes: tubos N1, 3 ml de agua, tubo
N2, 3ml de etanol y tubo N 3,3 ml de CCi
4
. Agite los tubos vigorosamente
y filtre a travs de papel filtro humedecido con el solvente respectivo.

Los lquidos que pueden ser considerados como solventes de grasa disolveran
una cantidad suficiente de ella como para dejar un depsito al evaporarse.
Para observar esto, marque 3 puntos en un papel filtro y deposite una gota de
cada uno de los filtrados. Espere que el solvente se evapore, examine en que
puntos quedan manchas de grasa. Cul de los solventes usados disuelve las
grasas?

2. Identificacin de glicerol

2.a. Caractersticas. Examine una muestra (aproximadamente 1 mL) de
glicerol puro. Describa su color, olor y estado fsico. Agregue 5 mL de agua,
agite. Es soluble? Fundamente su observacin.

2.b. Test de acrolena. En el fondo de un tubo de ensayo seco coloque 4
gotas de glicerol, agregue unos cristales de bisulfato de potasio. Caliente
cuidadosamente el fondo del tubo a la llama note el olor irritante de la
acrolena. La acrolena se forma por deshidratacin del glicerol en presencia
de bisulfato. Es un test especfico para glicerol; tanto en forma libre como
combinada. La acroleina, formada puede reconocerse por las caractersticas
reductoras de su grupo CHO. En la boca del tubo del cual se estarn
desprendiendo los vapores de acrelena, coloque un papel filtro impregnado en
una solucin al 5% de AgNO
3
amonacal. Observe la coloracin del papel en la
parte expuesta a los vapores.

Glicerol a) color=

b) estado fsico=

c) solubilidad en agua=

d)ecuacin de formacin de acrolena=


3. Absorcin de halgeno (Reaccin de Hubl)

En 4 tubos de ensayo limpios y secos, coloque 5 ml de CHCl
3
y a continuacin
agregue 2,5 ml de reactivos de Hbl. Luego adicione respectivamente 0,2 ml
de aceite; 0,2g de cido palmtico; 0,2 ml de cido oleico y 0,2 ml de agua.
Agitar los tubos por 2. Observar a los 10.




4. Complejos de urea

Disponga de 2 tubos de ensayo, en uno coloque 0,2g. de cido palmtico y en
el otro 0,2 ml de cido oleico. Disuelva cada cido graso en 4 ml de metanol
absoluto que contiene 0,6 g de urea; calentar si fuera necesario. Enfriar al
chorro de agua y observar los cristales con lupa.

5. Identificacin de grasas

a. Saponificacin
Coloque 2 mL de aceite en un tubo de ensayo, agregue 1 mL de solucin al 5%
de cloruro de calcio y gotas de NaOH 1N, con lo que se obtiene un precipitado
insoluble de jabones de calcio, si en el medio de reaccin existen grasas.

b. Reaccin con Sudn III
Disponga de 2 tubos de ensayo y coloque 2 mL de agua y 2 mL de aceite
respectivamente. Agregue 5 gotas de Sudn III a cada uno de los tubos Qu
observa?

6. Identificacin de colesterol. Reaccin de Lieberman Burchard

En un tubo de ensayo limpio y seco coloque 2 mL de colesterol al 0,1%. Luego
aada 10 gotas de anhdrido actico, mezcle bien y agregue lentamente por las
paredes del tubo 2 gotas de H
2
SO
4
concentrado. Dejar en la oscuridad 5 a 10
minutos. Se obtiene una gama de colores que se estabiliza en el verde.

























Cuestionario


1. Cules son los productos de la hidrlisis enzimtica y de la hidrlisis
alcalina de un triacil glicridos?

2. Dibuje la estructura del lpido intacto que corresponde a cada una de las
siguientes mezclas de productos obtenidos de la hidrlisis completa del lpido:

a.- glicerol y 3 molculas de cido palmtico

b.- glicerol, cido palmtico, cido esterico y fosfato inorgnico

3. Una mezcla de un triacilglicrido y de cido fosfatdico en benceno se agita
con
un volumen igual de agua.Despus de dejar que se separen las dos fases.
Cul ser el lpido que se encuentra en mayor concentracin en la fase
acuosa? Por qu?

7. Qu productos se obtienen al hidrolizar con NaOH el triacilglicrido: 1
estearil, 2, 3 dipalmitoil-glicrido?

8. Si una membrana contiene 60% en peso de protenas y un 40% de
fosfoglicridos, calcular la relacin molar de fosfoglicrido a protenas.
Suponga que la molculas de lpido posee un peso molecular medio de 800
y que las protenas tienen peso molecular medio de 50.000

Rp.: 41,7