UNIVERSIDAD AUTNOMA DE YUCATN FACULTAD DE INGENIERA QUMICA INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PRCTICA 2:

PRODUCCIN DE CIDO LCTICO

TRABAJO QUE PRESENTAN:

TANA HERNNDEZ BARRUETA MELISSA DIANELA MERCADO RUBIO THOMAS RAMOS SOSA MARVIN TAMAYO AZCORRA

CURSO ESCOLAR ENERO-JUNIO 2014

MRIDA, YUCATN A MARTES 18 DE FEBRERO DE 2014

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CONTENIDO
Introduccin ........................................................................................................................................ 1 Produccin de cido lctico............................................................................................................. 1 Bacterias cido lcticas ................................................................................................................... 1 Lactobacillus acidophilus ............................................................................................................... 1 Lactobacillus plantarum ................................................................................................................. 2 Objetivos ............................................................................................................................................. 2 Objetivos especficos....................................................................................................................... 2 Materiales ............................................................................................................................................ 2 Metodologa ........................................................................................................................................ 3 Cintica de produccin de cido lctico .......................................................................................... 3 Muestreos ........................................................................................................................................ 3 Conteo directo con cmara de Neubauer ......................................................................................... 4 Determinacin del crecimiento por turbidimetra ........................................................................... 4 Monitoreo de la pureza de la cepa ................................................................................................... 4 Determinacin de cido lctico producido ...................................................................................... 5 Evaluacin del consume de azcares .............................................................................................. 5 Resultados ........................................................................................................................................... 6 Conteo directo con cmara de Neubauer ......................................................................................... 6 Determinacin del crecimiento por turbidimetra ........................................................................... 7 Monitoreo de la pureza de la cepa ................................................................................................... 8 Determinacin de cido lctico producido ...................................................................................... 9 Evaluacin del consume de azcares ............................................................................................ 11 Discusin ........................................................................................................................................... 12 Conteo directo con cmara de Neubauer ....................................................................................... 12 Determinacin del crecimiento por turbidimetra ......................................................................... 13 Monitoreo de la pureza de la cepa ................................................................................................. 12 Determinacin de cido lctico producido .................................................................................... 14 Evaluacin del consume de azcares ............................................................................................ 15 Conclusin......................................................................................................................................... 16 Bibliografa ....................................................................................................................................... 17 2

INTRODUCCIN Produccin de cido lctico. El cido lctico es un compuesto muy verstil que es usado en la industrial para aplicaciones farmacuticas como electrolito y fuente de minerales; en la industria cosmtica como pH buffer, antimicrobiano y rejuvenecedor de la piel; como neutralizante, solvente y agente limpiador en la industria qumica y en la industria alimentaria como acidulante, preservante y antimicrobiano, se utiliza en una gran variedad de alimentos procesados como caramelos, productos de panadera, sopas, lcteos, cerveza, jaleas, mermeladas, mayonesas y huevos procesados. (Gndz, 2005) El cido lctico puede ser obtenido por va qumica o biotecnolgica. La produccin biotecnolgica est basada en la fermentacin de sustratos ricos en carbohidratos por bacterias u hongos; depende del tipo de microorganismo utilizado, la inmovilizacin o recirculacin del mismo, el pH, la temperatura, la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno, el modo de fermentacin empleado y la formacin de subproductos. Este tipo de produccin ha adquirido gran importancia debido a los beneficios ambientales y al uso de recursos renovables en lugar de los petroqumicos. Ofrece varias ventajas como el bajo costo de los sustratos, bajas temperaturas de produccin y bajo consumo de energa (Rojan, et al., 2007). Bacterias cido lcticas. Las caractersticas de las bacterias cido lcticas es que son Gram positivos, microaeroflicos y catalasa negativos, forman cido lctico como producto principal de la fermentacin de los azcares y pueden ser homofermentativos o heterofermentativos segn la cantidad y la presencia del cido. La mayora de las especies pertenecientes a estos gneros tienen alta tolerancia a pH por debajo de 5, lo que les da la ventaja competitiva sobre otras bacterias; la temperatura optima de crecimiento sta en un rango de 20C a 40C y vara entre gneros Son microorganismos de rpido crecimiento con pequeos genomas, metabolismo simple y relevancia industrial (Hofvendahl & Hahn-Hgerdal, 2000). Lactobacillus acidophilus. Ha sido aislado del intestino de casi todos los mamferos, muchos otros vertebrados y algunos invertebrados. Estos bacilos, bastante gruesos y de longitud variable, se disponen aislados, a pares frecuentemente algo flexionados en la unin, y en empalizadas. Las cadenas largas, las formas filamentosas y las formas en maza no son raras. Los cultivos jvenes se tien uniformemente grampositivos; los cultivos viejos, a menudo muestran coloracin listada o bipolar y pueden decolorarse fcilmente. Son homofermentativas. A las bacterias probiticas como el L.acidophilus se les atribuyen propiedades teraputicas, por lo que se pueden adicionar al yogurt con objeto de proporcionarle propiedades adicionales (Ramrez P et al., 2006). 1

Lactobacillus plantarum. Es una bacteria anaerobia facultativa lo que significa que puede crecer tanto en presencia o ausencia de oxgeno, sin embargo, en ausencia de oxigeno es capaz de convertir los azcares en cido lctico (University of Ottawa, 2009). As mismo son bacilos Gram positivos heterofermentativos con forma de bastoncillos regulares. Su genoma es el ms grande entre todas las bacterias cido lcticas y ha sido secuenciado completamente (Rosa, 1997). ste gnero se utiliza comnmente para la fermentacin de alimentos tales como yogurt, queso, bacalao, pepinillos, entre otros. El amplio uso de L. plantarum en los alimentos hace que sea adecuado para su uso como probitico (University of Ottawa, 2009). Esta especie ha sido objeto de inters durante las ltimas dcadas por producir una amplia gama de compuestos activos contra bacterias patgenas y hongos que pueden ser utilizados como bioconservantes muy efectivos en la industria alimentaria y adicionalmente estas cepas pudieran ejercer antibiosis contra bacterias indeseables en el tracto intestinal del consumidor de estos alimentos (Alvarado, 2009).

OBJETIVO Estudiar la produccin de cido lctico en un cultivo lquido.

OBJETIVOS ESPECFICOS Determinar y cuantificar la produccin de cido lctico. Identificar la correlacin entre el crecimiento microbiano y la produccin de un metabolito. Evaluacin del consumo del sustrato respecto a la produccin de cido lctico. Comparar la produccin de cido lctico entre dos cepas de microorganismos.

MATERIAL Y EQUIPO 1 matraz Erlenmeyer de 500 mL 10 tubos para centrfuga de 15 mL 35 tubos para microcentrfuga estriles 1 gradilla para tubos de microcentrfuga 1 probeta graduada de 25 mL estril 1 vaso de precipitados de 30 mL 1 micropipeta de 1000 L 1 micropipeta de 10 L Puntas de 1000L estriles Puntas de 10L estriles 2 mecheros bunsen Vortex Espectrmetro Celda para espectrofotometro Microscopio Cmara de Neubauer

SOLUCIONES Y REACTIVOS 250 mL de medio de glucosa, estril 250 mL de medio de suero, estril Solucin de NaOH 0.1 N valorada 50 mL de cultivo de Lactobacillus plantarum en medio MRS 3 mL de glucosa 1.5g/L 50 mL de cultivo con Lactobacillus acidophilus en medio MRS Reactivos para tincin de Gram: lugol, safranina, alcohol-cetona. Solucin de Fenolftalena Reactivo de DNS

METODOLOGIA Cintica de produccin de cido lctico________________________________________________ 1. En condiciones aspticas se tom el matraz que contiene 250 mL de medio estril y con la ayuda de la probeta estril se tomaron 25 mL del matraz semilla que contena el cultivo del Lactobacillus plantarum y Lactobacillus acidophilus los cuales se adicionaron al matraz estril. 2. El matraz inoculado se llev a incubacin a 37 C sin agitacin. Se dej incubando 5 minutos antes de tomar la primera muestra.

Muestreos _______________________________________________________________________ 1. En condiciones aspticas, se tomaron muestras de 15 mL a las 0, 5.44, 26.17, 48.17 y 72.17 horas. Se guardaron en un tubo para centrfuga y se conservaron en congelacin. 2. De los 15 mL de cada muestra, se distribuyeron de la siguiente forma: - 1 mL para el monitoreo de la pureza por tincin de Gram (primera y ltima muestra) - 1 mL para la cuenta directa en cmara de Neubauer - 3 mL para la determinacin del crecimiento por turbidimetra - 1 mL para la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS -10 mL para la determinacin de produccin de cido lctico

Conteo directo con la cmara de Neubauer_____________________________________________ 1. Se coloc sobre la cmara de Neubauer el cubreobjetos, de modo que cubri las dos cmaras de conteo. 2. Se colocaron 10L de muestra entre la cmara y el cubreobjetos. 3. Se enfoc con el lente de 40 X y se contabilizaron las clulas que se observaron en toda la cuadricula central. 4. Se calcul el nmero de clulas totales por mL de cultivo, siguiendo la frmula: ( )

5. Se retir el cubreobjetos con un algodn con alcohol. 6. Se limpi la cmara

Determinacin del crecimiento por turbidimetra_________________________________________ 1. Se encendi el espectrofotmetro y se ajust a 540 nm. 2. Se tomaron 1.5 mL del medio de cultivo sin microorganismos y se colocaron en la celda para espectrofotmetro y se ajustaron a cero de absorbancia para realizar el blanco. 3. Se tomaron 1.5 mL de cada una de las muestras y se colocaron en la celda, se taparon las celdas con parafilm y se leyeron las absorbancias. 4. Despus de cada lectura, las celdas fueron enjuagadas con benzal y alcohol

Monitoreo de la pureza de la cepa____________________________________________________ 1. Con ayuda la pipeta de 10 L se tom una gota de las muestras obtenidas del cultivo y se colocaron en un portaobjetos limpio y seco. 2. Se fij la muestra con calor, pasando varias veces el portaobjetos por el mechero. 3. Se realiz una tincin de Gram de acuerdo a lo siguiente:

Se agreg una gota de colorante de cristal violeta y se dej actuar por 1 minuto. Se enjuag con agua Se agreg una gota de lugol, se dej actuar por 1 minuto y se enjuag Se agreg una gota de alcohol-acetona y se enjuag inmediatamente Se agreg una gota de colorante safranina, se dej reposar por 1 minuto y enjuag 4. Se observ al microscopio usando el objetivo de 100 C

Determinacin del cido lctico producido_____________________________________________ 1. Se verific el pH antes de comenzar la titulacin 2. 10 mL de muestra fueron filtrados, el filtrado se recolect en un vaso de precipitado de 30 mL 4. Se adicionaron de 3 a 5 gotas de fenolftalena, mezclando perfectamente. 5. Se titul con NaOH 0.1 N gota a gota hasta el viraje del indicador. 6. Se registrar el volumen de gasto para calcular los moles de cido orgnico lctico.

Evaluacin del consumo de los azcares reductores______________________________________ 1. Se realiz una curva de calibracin 2. Se tom 1 mL del medio de cultivo en un tubo para microcentrfuga 3. Se centrifug el tubo por 10 min a 13000 rpm 4. Se tomaron 100 L del medio de cultivo y se adicionar 100 L del reactivo de DNS 5. Se calent a 94C por 5 min en bao trmico. 6. Se enfriaron los tubos en bao de hielo. 7. Se adicion 1 mL de agua destilada y se midi la absorbancia a 540 nm.

RESULTADOS Conteo directo en cmara de Neubauer________________________________________________ Todas las muestras para ambos tipos de microorganismos (Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus plantarum) fueron analizadas por duplicado con la finalidad de disminuir los errores humanos. En la Tabla 1 y 2 se muestran los resultados para L. plantarum y L. acidophilus respectivamente.

Tabla 1. Resultados de la cuenta directa con cmara de Neubauer. Lactobacillus plantarum

Muestra 1 Tiempo (h) 0 5.44 26.17 48.17 72.17 Clulas Clulas/mL 09.00 09.75 11.25 22.25 25.00 2250000 2437500 2812500 5562500 6250000 Log (Clulas/mL) 6.35 6.38 6.44 6.74 6.79 Clulas 08.00 08.50 09.00 21.75 24.00

Muestra 2 Clulas/mL 2000000 2125000 2250000 5437500 6000000 Log (Clulas/mL) 6.30 6.32 6.35 6.73 6.77 Promedio Log (Clulas/mL) 6.32 6.35 6.40 6.74 6.78 Desviacin estndar 0.036 0.042 0.068 0.006 0.012

Tabla 2. Resultados de la cuenta directa con cmara de Neubauer. Lactobacillus acidophilus

Muestra 1 Tiempo 0 5.44 26.17 48.17 72.17 Clulas 11.20 12.25 13.20 23.50 25.00 Clulas/mL 2800000 3062500 3300000 5875000 6250000 Log (Clulas/mL) 6.44 6.48 6.51 6.76 6.79 Clulas 10.5 11 12.4 22.5 24

Muestra 2 Clulas/mL 2625000 2750000 3100000 5625000 6000000 Log (Clulas/mL) 6.41 6.43 6.49 6.75 6.77 Promedio Log (Clulas/mL) 6.43 6.46 6.50 6.75 6.78 Desviacin estndar 0.019 0.011 0.019 0.013 0.012

Para Lactobacillus plantarum se obtuvo un conteo inicial promedio de 2125000 clulas/mL; luego de las 72.17 horas que dur el experimento se obtuvo un valor de 6125000 lo que represent un incremento del 288.24%. Lactobacillus acidophilus obtuvo un conteo inicial de 2712500 clulas/mL; transcurridas las 72.17 horas el conteo fue de 6125000 (al igual que L. plantarum) que porcentualmente es un incremento del 225.80%. Aunque el crecimiento porcentual de clulas/mL de L. acidophilus fue menor que el de L. plantarum, los valores del primero estuvieron siempre por encima exceptuando el ltimo punto en donde se equilibran.

Cintica de crecimiento
6.8 6.75 6.7 6.65 6.6 6.55 6.5 6.45 6.4 6.35 6.3 0 10 20 30 40 Tiempo (h) 50 60 70

Figura 1. Cintica de crecimiento de dos cultivos de Lactobacillus en medio glucosa L. acidophilus L. plantarum

Determinacin del crecimiento por turbidimetra_________________________________________ En la Figura 2 y 3 se muestras las correlaciones entre las absorbancias medidas por turbidimetra y el nmero de clulas/mL obtenido mediante el conteo directo en cmara de Neubauer para L. plantarum y L. acidophilus respectivamente. En ambos casos se observa una baja linealidad, siendo los Coeficientes de Correlacin de Pearson de 0.569 y 0.5538.

log (clulas/mL)

Correlacin del crecimiento celular de L. plantarum

6.8 6.75 6.7 6.65 6.6 6.55 6.5 6.45 6.4 6.35 6.3 0.6 0.8 1 Absorbancia 1.2

log (clulas/mL)

R = 0.5699

1.4

Figura 2. Correlacin del log(clulas/mL) vs Absorbancia de un cultivo de L. plantarum en medio glucosa

Correlacin del crecimiento celular de L. acidophilus

6.8 6.75 log (clulas/mL) 6.7 6.65 6.6 6.55 6.5 6.45 6.4 0.6 0.8 1 Tiempo (h) 1.2 1.4 R = 0.5538

Figura 3. Correlacin del log(clulas/mL) vs Absorbancia de un cultivo de L. acidophilus en medio glucosa

Monitoreo de la pureza_____________________________________________________________ En la Figura 4 se observan las tinciones de Gram realizadas para ambos microorganismos, al inicio y al final de la fermentacin. Ambos cultivos al inicio y al final de la fermentacin, son bacilos, grampositivos, aislados, unidos a pares frecuentemente o en empalizadas. No se muestra contaminacin con otros microorganismos.

Figura 4. Tincin de Gram. Arriba izquierda: L. acidophilus a las 0 horas. Arriba derecha: L. acidophilus a las 72 horas. Abajo izquierda: L. plantarum a las 0 horas. Abajo derecha: L. plantarum a las 72 horas.

Determinacin de cido lctico_______________________________________________________ En la Tabla 3 y 4 se presentan los resultados de determinacin de cido lctico producido

Tabla 3. Resultados de la determinacin de cido lctico. Lactobacillus plantarum

Tiempo (h) 0 5.44 26.17 48.17 72.17

pH 4.01 4.01 3.04 2.98 2.93

mL de Moles de Lactato NaOH 0.1 N Lactato (mol) NaOH 0.1 N (g) gastados 2.7 0.00027 0.018 1.62 4.3 8.1 10.6 9 0.00043 0.00081 0.00106 0.00090 0.028 0.054 0.070 0.06 2.58 4.86 6.36 5.40

Tabla 4. Resultados de la determinacin de cido lctico. Lactobacillus acidophilus

Tiempo (h) 0 5.44 26.17 48.17 72.17

pH 4.27 4.07 4 2.99 2.97

mL de NaOH 0.1 N gastados 2.2 2.3 7.9 9.2 6

Moles de NaOH 0.1 N 0.00022 0.00023 0.00079 0.00092 0.0006

Moles de lactato 0.0146 0.0153 0.0526 0.0613 0.0400

En la Figura 5 se ilustran los resultados de la determinacin de cido lctico como moles de cido lctico producidos y pH con respecto al tiempo. Se observ que a medida que los moles de cido lctico en el medio de ambos cultivos fueron aumentando, el pH del mismo fue disminuyendo. Es importante mencionar que el pH del cultivo de L. plantarum fue siempre menor que el de L. acidophilus. As mismo, L. plantarum obtuvo siempre los valores ms elevados de moles de lactado en comparacin con L. acidophilus. Una disminucin de los moles de cido producido se present entre las 48.17 y las 72.17 horas para los cultivos de ambos microorganismos.

Relacin en la produccin de cido lctico y el pH del medio

4.3 4.1 3.9 pH 3.7 3.5 3.3 3.1 2.9 0 10 20 30 40 Tiempo (h) 50 60 70 0.062 0.052 0.042 0.032 0.022 0.012 Moles de lactato Producto (g/L)

Figura 5. Determinacin de cido lctico. pH del cultivo de L. acidophilus pH del cultivo de L. plantarum ----- Moles de lactato de L. acidophilus ----- Moles de lactato de L. plantarum

El rendimiento de biomasa respecto al sustrato fue mayor para L. plantarum. Por cada clula nueva de L. plantarum, se generaron 9.4584E-10 gramos de lactato en un litro de cultivo mientras que por cada clula nueva de L. acidophilus se generaron 6.68726E-10 gramos de lactato.

Rendimiento de biomasa respecto al producto

6100000 5600000 Biomasa (clulas/mL) 5100000 4600000 4100000 3600000 3100000 2600000 2100000 0 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo (h)
Figura 6. Rendimiento de biomasa respecto al producto. Biomasa de L. acidophilus Biomasa de L. plantarum ----- Lactato producido por L. acidophilus ----- Lactato producido por L. plantarum

6.2 5.2 4.2 3.2 2.2 1.2

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Determinacin de azcares reductores_________________________________________________ En las Tablas 5 y 6 se muestran los resultados obtenidos de la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS, ilustrados en la Figura 6. Durante las primeras 40 horas, el consumo de glucosa ms rpido se observ en Lactobacillus plantarum el cual se mantuvo con una tendencia estable hasta el final de la fermentacin mientras que durante las ltimas 24 horas fue Lactobacillus acidophilus quien present el mayor consumo de glucosa.

Tabla 5. Resultados de la determinacin de azcares reductores en el cultivo de Lactobacillus plantarum

Muestra 1 Tiempo (h) 0 5.44 26.17 48.17 72.17 Absorbancia 0.259 0.222 0.182 0.118 0.538 Dilucin 15 10 10 10 1 Concentracin glucosa (g/L) 8.726 5.114 4.355 3.139 1.111 Absorbancia 0.251 0.244 0.164 0.119 0.54

Muestra 2 Dilucin 15 10 10 10 1 Concentracin glucosa (g/L) 8.498 5.532 4.013 3.158 1.115 Concentracin glucosa (g/L) promedio 8.612 5.323 4.184 3.149 1.113

Tabla 6. Resultados de la determinacin de azcares reductores en el cultivo de Lactobacillus acidophilus

Muestra 1 Tiempo (h) 0 5.44 26.17 48.17 72.17 Absorbancia 0.267 0.305 0.235 0.118 0.49 Dilucin 15 10 10 10 1 Concentracin glucosa (g/L) 8.954 6.691 5.361 3.139 1.020 Absorbancia 0.268 0.325 0.241 0.062 0.38

Muestra 2 Dilucin 15 10 10 10 1 Concentracin glucosa (g/L) 8.982 7.071 5.475 2.075 0.811 Concentracin glucosa (g/L) promedio 8.968 6.881 5.418 2.607 0.916

El rendimiento de sustrato con respecto al producto fue mayor para L. plantarum que produjo 0.63 gramos de lactato por cada gramo de glucosa consumido mientras que L. acidophilus produjo tan slo 0.52 gramos de lactato por cada gramo de glucosa. 11

Rendimiento de sustrato con respecto al producto

8.8 7.8 Sustrato (g/L) 6.8 5.8 4.8 3.8 2.8 1.8 0.8 0 10 20 30 40 Tiempo (h) 50 60 70 1.3 3.3 2.3 4.3 6.3 5.3 Producto (g/L)

Figura 7. Determinacin de azcares reductores. L. acidophilus L. plantarum

DISCUSION Conteo directo con cmara de Neubauer_______________________________________________ Para el conteo en cmara de Neubauer no fue necesario realizar ninguna dilucin, las muestras fueron tratadas directamente como se tomaron del cultivo. El conteo se realiz con cierta dificultad debido a la morfologa de los Lactobacillus que se encuentran en forma de varillas que pueden hallarse solas, en parejas o en conglomerados de cadenas cortas, inmviles y flajelados (Kandler & Weiss, 1992). Sin embargo, los resultados presentaron pequeas barras de error lo que reflej bajo error de muestreo o humano. En la cintica de crecimiento se observa que L. plantarum y L. acidophilus fueron tomadas durante su fase exponencial, donde las bacterias ya estaban adaptadas al medio. Pese a que la cuenta de L. acidophilus fue siempre mayor, su crecimiento porcentual fue menor que el de L. plantarum. El medio contena como nica fuente de carbono a la glucosa. L. acidophilus pertenecen a un primer grupo de bacterias denominadas homofermentadores obligados, fermentan la glucosa a cido lctico y no fermentan pentosas ni gluconato. Por el contrario los L. plantarum pertenecen a un segundo grupo denominado heterofermentadores facultativos, fermentan hexosas a 12

lactato, utilizan gluconato con produccin de gas; tambin fermentan pentosas por una fosfocetolasa inducible por pentosas produciendo lactato y cido actico (Kandler y Weiss, 1986) por lo que es posible que L. plantarum utilizara tambin parte de los nutrientes presentes en el medio de Man Rogosa y Sharpe (MRS) que se adicionaron al cultivo junto con el inculo, y debido a su gran capacidad adaptativa, presentaron un crecimiento porcentual mayor.

Determinacin del crecimiento por turbidimetra_________________________________________ En la Figura 2 y 3 se observ que no hubo una correlacin lineal entre los datos obtenidos mediante la cuenta directa con cmara de Neubauer y la determinacin del crecimiento por turbidimetra. Para ambos gneros de Lactobacillus, en la muestra que correspondi a las 5.44 horas de la fermentacin, los datos se alejan de la linealidad, obteniendo un valor de absorbancia muy grande. Esto pudo deberse a que cuando se tomaron dichas muestras, el matraz no fue homogenizado de manera correcta generando una zona de alta concentracin celular al fondo del mismo, as, al tomar la muestra en esta zona del cultivo, los datos pudieron no corresponder a una concentracin real de clulas/mL en dicho tiempo. La determinacin de la turbidez (turbidimetra) es un mtodo prctico para determinar el crecimiento bacteriano debido a que es fcil de visualizar en un medio lquido la multiplicacin de las bacterias pues el medio se vuelve turbio por la cantidad de clulas suspendidas en l (Tortora & Bunke, 2007) ms sin embargo no es muy utilizado para predecir recuentos viables por s solo y esta limitacin est dada porque en el umbral de deteccin, que corresponde a una concentracin en un rango de 106 107 clulas/mL, se pueden tener estimaciones errneas debido a factores como que el mtodo no diferencia entre clulas vivas de muertas. (Eduardo, 2007).

Monitoreo de la pureza_____________________________________________________________ La primera tincin de Gram permiti visualizar, para ambos Lactobacillus, bacterias en forma de bacilo, aisladas, en parejas o conglomerados; para ambos casos grampositivas y sin la presencia de otro microorganismo. Al cabo de las 72 horas que dur el experimento, se volvi a realizar la tincin de Gram lo que mostr microorganismos con las mismas caractersticas y sin presencia de contaminacin por otros microorganismos. Esto signific un buen manejo de los materiales en condiciones aspticas y garantiz que los resultados obtenidos fueron generados nicamente por los microorganismos inoculados y que eran los de inters.

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Determinacin de cido lctico_______________________________________________________ Se realiz una titulacin acidimetra, es decir, se determin la cantidad de cido lctico, empleando una base fuerte, en esta caso hidrxido de sodio (Harris, 2007). Este mtodo nos ayud a conocer la concentracin de cido lctico presente en las muestras tomadas en los diferentes tiempos. Los resultados obtenidos mostraron un aumento en el gasto de NaOH 0.1 N, es decir que hubo un aumento gradual de la concentracin de cido lctico en el tiempo transcurrido, y de igual manera este tuvo una relacin sobre el pH medido en el medio, el cual decreci con el tiempo. L. acidophilus crece fcilmente en medios cidos (pH 4.5 o menores) y produce exclusivamente cido lctico por su carcter homofermentativa (Jhones, 2001). El pH del medio, durante las 72.17 horas que dur el experimento, disminuy de 4.27 hasta 2.97, de igual manera en la concentracin de cido lctico la cul aument de 0.014 moles/L hasta una concentracin final de 0.040 mol/L. Pese a que el medio de cultivo contena nicamente glucosa, al inicio hubo 0.014 mol/L de cido lctico, los cuales fueron producidos por los microorganismos durante el precultivo en medio MRS. L. plantarum es una bacteria anaerbica facultativa y en ausencia de oxgeno es heterofermentativa, es decir, puede producir cido lctico D- y L- o etanol. Se observ un pH inicial de 4.01 en el cual haba una concentracin inicial de 0.018 mol/L de cido lctico (provenientes, al igual que en el caso de L. acidophilus, del precultivo) y una final de 0.06 moles/L; sus valores fueron siempre mayores que los de L. acidophilus, esto se debe a que a diferencia de estas, que presentan un comportamiento homofermentativo, la L. plantarum tiene una gran capacidad biosinttica y una perfecta adaptacin en medios abundantes en nutrientes y fuentes energticas, gracias al tamao de su genoma, el cual es 50% ms grande que la mayora de bacterias cido lcticas presentando una gran capacidad metablica (Aguilar, 2008), adems, posiblemente las condiciones de temperatura y pH no fueron las ptimas (37C y pH 5-6) por lo que esto pudo ocasionar una lentitud en el metabolismo celular de L. acidophilus (Hernandez, 2000). A pesar de las diferencias en las concentraciones determinadas por medio de la titulacin, ambos microorganismos produjeron el cido lctico a partir del piruvato generado por la gliclisis, en un solo paso; todo esto conocido como la va de EmbdenMeyerhof. Las diferencias radican en qu fuente de carbono utilizan para generar piruvato y en cules son los productos finales de la fermentacin (Eduardo, 2007). Todas estas ventajas de L. plantarum sobre L. acidophilus justifican el mayor rendimiento de biomasa con respecto al producto del primero.

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Figura 8. Rutas metablicas de las bacterias cido lcticas

La disminucin de la cantidad de cido lctico que se observ al final de la fermentacin se debi a que cuando las bacterias crecen sobre lactato, piruvato, acetato u otro compuesto, se desarrollan rutas adicionales (rutas anaplerticas) para mantener funcionando el ciclo de los cidos tricarboxlicos y proveer molculas intermediarias para la sntesis de los azcares por lo que los microorganismos del gnero Lactobacillus utilizan el cido lctico para convertirlo en piruvato (Figura 7) y consecuentemente como fuente energtica para su desarrollo, reduciendo de esta forma la cantidad de producto generado. (Agudelo, 2010)

Determinacin de azcares reductores_________________________________________________ L. plantarum obtuvo un rendimiento de sustrato con respecto al producto de 0.63; Agudelo y colaboradores (2010) reportaron un rendimiento de 0.34 mientras que Fu, Wenge y Mathews (1999),
Rao (2004) y Georgieva y colaboradores (2009), reportaron valores que variaron entre 0.7 y 0.9 con

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lactosa como fuente de carbono; as mismo Srenath (2001) report rendimientos que variaban entre 0.354-0.606 cuando se usaba fibra de alfalfa como sustrato. L. acidophilus produjo tan slo 0.52 gramos de lactato por cada gramo de glucosa. Goncalvez y colaboradores reportaron rendimientos para este microorganismo que variaron entre 0.56 y 0.86 siendo la fuente de carbono glucosa. L. plantarum fue el microorganismo que tuvo un mayor rendimiento de producto respecto al sustrato. Es capaz de convertir 1 mol de glucosa en 2 moles de cido lctico (Tseng & Montville, 1992) de ese modo los resultados obtenidos en la determinacin de cido lctico son lgicos: fue este mismo cultivo el que obtuvo los valores de pH ms bajos y los de cido lctico ms alto. Al consumir ms glucosa, pudo producir ms cido lctico y de este modo el pH del medio fue el ms cido. Todo esto pudo deberse al buen nmero de genes involucrados en el transporte y utilizacin del azcar, y su verstil metabolismo del piruvato (Agudelo, et al., 2010). Incluso una vez agotada la fuente energtica es capaz de aprovechar otros nutrientes como protenas y grasas presentes en el medio (Agudelo, et al., 2010). Aunque la cuenta de L. acidophilus fue siempre mayor que la de L. plantarum, en realidad su crecimiento neto fue menor: 225.80% contra 288.24%. Estos datos concuerdan con el hecho de que L. acidophilus consumi menos glucosa, generando menor cido lctico y obteniendo pH no tan cido como L. plantarum.

CONCLUSIN Se logr una correcta comparacin en la produccin del cido lctico de ambos Lactobacillus y la causa del mismo. El mtodo permiti la evaluacin de la relacin entre el consumo de sustrato y la produccin de cido lctico aunque una determinacin de protenas como mtodo de cuantificacin de biomasa hubiera servido mejor para determinar los rendimientos de ambos microorganismos. La titulacin funcion correctamente para determinar la cantidad de cido lctico.

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TRABAJOS CITADOS
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