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ANATOMY, HISTOLOGY AND ULTRASTRUCTURE OF PINEAL GLAND OF THE SAWING CATFISH, Oxydoras sifontesi (SILURIFORMES: DORADIDAE): SOME MORPHOFUNCTIONAL IMPLICATIONS
E.O. Chvez-Aponte 1*, H.Y. Guerrero 2, E. Cardillo 2, D. Marcano 2, G.A. Poleo 3, H.J. Finol 4, B. Bello 4, E. Velasco 5 y E. Meja 5 Postgrado en Ciencias, Mencin Zoologa. Instituto de Zoologa Tropical. Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela. 2 Laboratorio de Neuroendocrinologa Comparada. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela. 3 Estacin de Piscicultura. Decanato de Agronoma. Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Yaracuy. 4 Centro de Microscopa Electrnica Dr. Mitsuo Ogura. Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela. 5 Laboratorio de Microscopa Electrnica. Escuela de Medicina Jos Mara Vargas. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela, Caracas. *Autor de Correspondencia: Edwin Orlando Chvez-Aponte, e-mail: eoyaguar@yahoo.com.ar Recibido: Julio 2008 Aprobado: Mayo 2009 Publicado en lnea: Agosto 2009 ABSTRACT In teleosts, the pineal gland lies in the dorsal surface of the brain and it is composed of photoreceptor cells that release melatonin hormone, whose biosynthesis and secretion is dependent of photoperiod, acting in the regulation of physiological processes such as sexual maturation. Oxydoras sifontesi has an annual reproduction and is a model for studying the biology of other endemic species of commercial interest for human consumption. This work constitutes a morphological, histological and subcellular characterization of the pineal organ of O. sifontesi, using classic protocols of fixation and contrast for light and electron microscopy. Results suggest that pineal organ of O. sifontesi is similar to the same organ in other species. The pineal vesicle is a hollow structure, surrounded by a irrigated neuroepithelium, composed by glial cells, neurons, and photoreceptor cells with an outer segment, with numerous external plates derived from the plasma membrane. Types of cell to cell contacts and highly developed organelar system were also detected. The presence of several myeloid bodies and autofagic vacuoles in the cytoplasm of some basal cells could be associated with mechanisms of continuous renovation of the organelar system. Key words: pineal organ, ultrastructure, fotoreceptor Oxydoras sifontesi. ANATOMA, HISTOLOGA Y ULTRAESTRUCTURA DE LA GLNDULA PINEAL DEL BAGRE SIERRA, Oxydoras sifontesi (SILURIFORMES, DORADIDAE): ALGUNAS IMPLICACIONES MORFOFUNCIONALES RESUMEN En telesteos, la glndula pineal est ubicada en el rea dorsal del cerebro y est compuesta por clulas fotorreceptoras que liberan la hormona melatonina, cuya biosntesis y secrecin es dependiente del fotoperodo, actuando en la regulacin de procesos fisiolgicos tales como la maduracin sexual. Oxydoras sifontesi tiene una reproduccin anual y es un modelo para el estudio de la biologa de otras especies endmicas de inters comercial para el consumo humano. El presente trabajo es una caracterizacin morfolgica, histolgica y subcelular del rgano pineal de O. sifontesi, empleando los protocolos histolgicos clsicos de fijacin y contrastacin para microscopas de luz y electrnica de transmisin. Los resultados revelan un rgano pineal similar al de otros telesteos. La vescula pineal es una estructura hueca, rodeada por un neuroepitelio irrigado, integrado por clulas gliales, neuronas, y clulas fotorreceptoras con un segmento externo, compuesto por numerosas lamelas que derivan de la membrana plasmtica. Se detectaron diferentes uniones intercelulares y un sistema organelar bien desarrollado. La presencia de figuras mielnicas en algunas clulas basales podra asociarse con mecanismos de renovacin continua del sistema organelar. Palabras claves: rgano pineal, ultraestructura, fotorreceptor, Oxydoras sifontesi.
1

INTRODUCCION El rgano pineal (epfisis) es una glndula endocrina situada en la superficie dorsal del cerebro de los

vertebrados, la cual se desarrolla como un pequeo divertculo en la parte posterior del techo del diencfalo, pasando a formar la mayor parte del epitlamo [1, 2]. En

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Chvez-Aponte, et al. los telesteos, el rgano pineal consta de una vescula terminal, localizada por debajo del crneo, y conectada al diencfalo por un delgado pednculo. El epitelio pineal est constituido por ejes neuronales, clulas gliales y clulas fotorreceptoras o pinealocitos [3, 4]. Estas ltimas poseen un segmento externo que consiste en un disco compuesto por un nmero variable de 20 a 70 lamelas que derivan de la membrana plasmtica y que contienen fotopigmentos [5, 6]. Estas clulas son las responsables de secretar melatonina, cuya biosntesis y secrecin es dependiente de los ciclos de luz y oscuridad, siendo bajas durante el da y altas durante la noche. La melatonina participa en el control circadiano y estacional de diferentes procesos fisiolgicos, como el crecimiento [7] y la maduracin sexual [8, 9]. Por ejemplo, en el sigano pintado, Siganus canaliculatus, un pez cuya reproduccin es estacional, las diferentes fases del ciclo sexual estn relacionadas con los cambios anuales que experimenta la concentracin plasmtica de melatonina, donde un decremento de la misma puede prolongar la actividad reproductiva [10]. No obstante, el efecto del fotoperodo en el ciclo reproductivo de los peces dulceacucolas tropicales ha sido poco estudiado. Oxydoras sifontesi pertenece a la familia Doradidae [11], que comprende un importante nmero de especies de inters comercial en acuicultura. Esta especie tiene una reproduccin anual, estrechamente ligada al ciclo de lluvia y sequa. Adems, la glndula pineal y la fontanela estn bien desarrolladas, lo cual sugiere que la fotorrecepcin podra ser clave en la regulacin de la sntesis de melatonina. Este trabajo es una descripcin de la glndula pineal de O. sifontesi a nivel anatmico, microanatmico y microestructural, con nfasis en las caractersticas que sugieran fotosensibilidad. MATERIALES Y MTODOS Se utilizaron 28 ejemplares adultos de O. sifontesi (figura 1), los cuales fueron capturados en el Ro Portuguesa y transportados a la Estacin de Piscicultura del Decanato de Agronoma de la Universidad Centroccidental

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Lisandro

Alvarado

(Municipio

Yaritagua,

Estado

Yaracuy). El 50 % de las muestras se colectaron el primero durante la maana, a partir de las 11:00 a.m., y el segundo 12 horas despus. En cada caso, los animales fueron anestesiados y sacrificados por decapitacin, realizndose un corte coronal a nivel del hueso frontal del neurocrneo, para separar la caja craneoenceflica y aislar la glndula pineal del encfalo (figura 2). Para el montaje de microscopa de luz, las muestras fueron fijadas en formol al 10% por un perodo mnimo de 24 horas. Luego fueron deshidratadas en alcohol en series crecientes y embebidas de parafina slida. Se realizaron cortes histolgicos de 5 a 6 m de espesor y se colorearon por tcnicas clsicas de Hematoxilina y Eosina. Los campos seleccionados fueron fotografiados con una cmara Sony adaptada a un microscopio binocular marca Axiovert 25. Para el montaje de microscopa electrnica, las vesculas fueron fijadas en solucin de Karnovsky (2,5 % de glutaraldehido, 37 % de formaldehdo y 320 mOsm de solucin tampn fosfato de Millonig a pH 7,4) por 45 minutos, y postfijadas en 1 % de tetraxido de osmio disuelto en el mismo buffer por una hora. Las preparaciones fueron deshidratadas en una batera de concentraciones crecientes de etanol y, seguidamente, incluidas con xido de propileno y embebidas en Epon 812 por 48 horas a 60 C. Se realizaron cortes ultrafinos 60 y 90 nm de espesor a partir de las placas escogidas. Las preparaciones se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo [12, 13]. El material fue examinado con un microscopio electrnico de transmisin JEOL1011 (80 kV) y el registro permanente se obtuvo en negativos Kodak de 8,3 x 10,2 cm. RESULTADOS Y DISCUSIN O. sifontesi muestra una subdivisin del rgano pineal en una vescula terminal unida al diencfalo cerebral por un pednculo o tallo muy delgado, de aproximadamente 2 cm de longitud, formado por ejes neuronales que se

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Chvez-Aponte, et al. originan bajo el extremo distal del cerebelo (figura 3), especficamente en la comisura formada entre los lbulos del techo ptico y el telncfalo. La vescula pineal est ubicada en el extremo distal del tallo, justo por debajo de la fontanela o ventana pineal, un foramen situado en la cara dorsal del crneo, que est recubierto por un cartlago pigmentado pero traslcido (figura 4).

Acta Microscpica Vol. 18, No. 2, 2009, pp. 67-75 se forma a partir del plegamiento de las invaginaciones de la membrana plasmtica. Esta estructura constituye el polo fotorreceptor propiamente dicho, el cual contiene fotopigmentos y otros elementos de la fototransduccin. El citoplasma de los pinealocitos muestra un sistema organelar bien desarrollado, caracterizado por presentar abundantes mitocondrias y lisosomas electrn-densos, polirribosomas y numerosas cisternas que forman parte del retculo endoplasmtico rugoso (REr) de tipo vesicular. Estas caractersticas son particularmente evidentes durante la fase diurna del fotoperodo, lo que sugiere una actividad metablica alta, probablemente

4 cm

Fig. 1. Imagen del bagre sierra, O. sifontesi (arriba). Esta especie es endmica de la Cuenca del Ro Orinoco, cuyos afluentes discurren sobre los llanos occidentales y centrales del pas. Al igual que otros peces de importancia comercial para la regin, O. sifontesi presenta un ciclo reproductivo estacional, estrechamente ligado los ciclos de lluvia y sequa.

relacionada

con

la

sntesis

de

intermediarios

metablicos que preceden a la produccin y secrecin de melatonina durante las horas de oscuridad [14]. El parnquima pineal de O. sifontesi est inervado por numerosas fibras aferentes que establecen contacto directo con fotorreceptores y clulas intersticiales (figura 7). Durante la fase oscura, los terminales axnicos presentan mitocondrias ms electrn-densas, un sistema neurotubular prominente y gran densidad de vesculas sinpticas (figura 8). Esto supone una actividad secretora alta que coincide con una mayor liberacin de melatonina. Las clulas gliales a menudo estn rodeadas por una densa red de fibrillas de colgeno, la cual constituye el tejido conectivo que envuelve el neuroepitelio pineal. A lo largo del fotoperodo, el citoplasma de las clulas gliales presenta un REr de tipo tubular, numerosos polirribosomas, gran densidad de vacuolas autofgicas y grnulos de lipofuscina, que son cuerpos residuales de naturaleza lipoprotena (figura 9). La autofagia en clulas intersticiales y pinealocitos se ha relacionado con la fagocitosis del segmento externo por parte de las clulas gliales o la necrosis de los fotorreceptores. En los pinealocitos se ha observado un incremento en el espacio intermembrana de la envoltura nuclear (de 30 a 60 nm), as como la aparicin de lisosomas y vacuolas

2 cm

Fig. 2. Corte transversal de la caja craneoenceflica de O. sifontesi, donde se pueden apreciar la vistas inferior y superior de las capas dorsal (izquierda) y ventral (izquierda), respectivamente. Las flechas roja y azul indican la ubicacin de la fontanela y el encfalo, respectivamente. La microanatoma de la glndula pineal es similar a de otras especies de telesteos. Bajo microscopa de luz, la vescula terminal aparece como una estructura hueca, rodeada por un epitelio neural donde solo se distinguen pinealocitos fotorreceptores (figura 5), cuya porcin apical sobresale del lumen glandular. Estas clulas se asemejan a los conos de la retina de los vertebrados, presentando una organizacin polarizada [4]. A nivel ultraestructural, los pinealocitos de O. sifontesi se distinguen por su segmento externo internalizado (figura 6), compuesto por un sistema multilamelar que

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rgano pineal

250 mm
Fig. 3. Esquema del encfalo del bagre sierra negra O. sifontesi, donde se muestra la ubicacin del rgano pineal con relacin al resto de las estructuras del cerebro.

Fig. 4. Imgenes de la ventana pineal, vista a trasluz en tres (3) ejemplares adultos de O. sifontesi. La primera corresponde a una fontanela observada con iluminacin normal. Las flechas sealan la ubicacin de la vescula pineal, la cual aparece como un cuerpo opaco. autofgicas (figura 10). Estos fenmenos podran asociarse con procesos de renovacin de la maquinaria fotorreceptora durante la vida del organismo [14]. El tejido intersticial del rgano pineal esta irrigado por capilares fenestrados de numerosas vesculas pinocticas (figura 11), alrededor de los cuales se evidenciaron algunos grnulos compactos de secrecin semejantes a melanforos, de hasta 0,6 m de dimetro. Al respecto, Srivastava [15] encontr que la incidencia de la luz es dependiente de la concentracin de grnulos de melanina en la dermis que cubre la fontanela craneana de los bagres indios Clarias batrachus, Hepteropneustes fossilis y Mystus sp. Por consiguiente, la intensidad del estmulo luminoso sobre la glndula pineal en O. sifontesi pudiera ser regulada por la expansin y contraccin de los melanforos durante los ciclo diarios de luz y oscuridad. A nivel general, se evidenciaron dos tipos de uniones intercelulares (figura 12): las uniones comunicantes, que permiten el intercambio de nutrientes y/o segundos mensajeros [16], y los desmosomas de punto, o macula adherens, que fungen como puntos de soldadura entre clulas adyacentes, sirviendo como sitios de anclaje 18]. entre los filamentos intermedios del citoesqueleto para mantener la integridad celular [17,

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200 m Luz

200 m

Luz

1 mm

Luz

Luz

100 m

100 m

Fig. 5. Cortes histolgicos teidos con HE de la glndula pineal de O. sifontesi. El tejido glandular est compuesto por clulas fotorreceptoras (rea punteada), cuyo segmento externo se proyecta hacia el lumen de la vescula (Luz). Aumentos: 200x (arriba, izquierda y derecha) y 400x (abajo, izquierda y derecha).

Se

Se

2 m Figuras 6. Micrografas electrnicas del fotorreceptor en la fase diurna. El segmento externo est internalizado (Se, tringulo). Tambin se observan uniones intercelulares (flechas negras), lisosomas (valo blanco), mitocondrias (mit), polirribosomas (aros), y cisternas de un retculo endoplasmtico rugoso vesicular (flechas blancas). Aumento: 5000x (izquierda) y 8000x (derecha).

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Figura 7: Ultraestructura del neuroepitelio pineal de O. sifontesi durante la fase diurna. Se observan terminales axnicos (TAx) los cuales presentan mitocondrias (mit) y muchas vesculas sinpticas (valos), clulas gliales (CG), delimitadas por sus membranas plasmticas (flechas blancas), y rodeadas por fibrillas de colgeno (Co). Aumento: 6000x.

500 nm
Figura 8. Ultraestructura de los ejes neuronales que inervan el tejido pineal, los cuales presentan mitocondrias electrndensas (mit), algunos neurotbulos (flechas negras) y gran densidad de vesculas sinpticas (valos blancos, detalle en la imagen derecha). Los terminales axnicos estn en contacto con clulas gliales (CG), que presentan numerosas mitocondrias y un retculo endoplasmtico rugoso tubular, con cisternas rodeadas de ribosomas (flechas blancas). Aumento: 8000x.

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Co

Co

Co Co
1 m 1 m

Fig. 9. Microestructura del tejido intersticial de la glndula pineal durante la fase oscura, donde se pueden apreciar fibrillas de colgeno (Co) adyacentes a las clulas gliales, las cuales presentan numerosas figuras mielnicas (tringulos) y grnulos de lipofuscina, que son cuerpos residuales de procesos oxidativos (asteriscos). Aumento: 8000x.

1 m

1 m

Fig. 10. Micrografa de los pinealocitos durante la fase diurna. El ncleo presenta espacios de 30 a 60 nm entre las membranas de la envoltura nuclear (flechas blancas). Tambin se observan mitocondrias (mit) y abundantes figuras mielnicas (tringulos) y. Aumento: 6000x.

Fig. 11. Detalle de los capilares que irrigan el tejido pineal, donde se pueden apreciar eritrocitos nucleados (Er) y clulas endoteliales (Ce). Tambin se observan cuerpos electrn-densos (valos) muy compactos. Aumentos: 6000x (arriba) y 8000x (abajo).

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Fig. 12. Detalle de las uniones intercelulares comunicantes (tringulo) y de adhesin (flecha), que permiten el intercambio de sustancias y mantienen la integridad tisular, respectivamente. Tambin se observan algunos de los filamentos intermedios (fi) que integran el citoesqueleto. Aumentos: 8000x (izquierda) y 6000x (centro y derecha). CONCLUSIN La estructura tisular del rgano pineal de O. sifontesi es similar a la de otras especies de telesteos, con un neuroepitelio constituido por clulas de soporte asociadas a tejido conectivo, ejes neuronales y pinealocitos fotorreceptores caracterizados por un segmento externo internalizado y un retculo 5. endoplasmtico rugoso de tipo vesicular. Estas caractersticas sugieren que la fotorrecepcin de luz a travs de la glndula pineal es un parmetro importante en la regulacin de los ritmos de secrecin circadiana y estacional de la melatonina, la cual a su vez participa en el control de otros procesos fisiolgicos tales como la reproduccin. Adicionalmente, la presencia de figuras mielnicas y cuerpos residuales en el citoplasma observada en algunas clulas basales y pinealocitos podra relacionarse con mecanismos de degradacin y renovacin continua del tejido fotorreceptor durante la vida del individuo. BIBLIOGRAFA 1. Zanuy S. & Carrillo M. (1987). La reproduccin de los telesteos y su aplicacin en acuicultura. En: Espinosa de los Monteros J. y Labarta. U. (eds.) Reproduccin en Acuicultura. Madrid, CAYCIT, pp. 1-31. 9. 8. 7. 6. 4. 3. Ekstrm P. & Meissl H. (2003). Evolution of photorreceptory pineal organs in new light: the fate of neuroendocrine photoreceptors. Philos Trans R Soc Lond B. Biol Sci, 358:1679-1700. Falcn J. (1999). Cellular circadian clocks in the pineal. Prog. Neurobiol, 58: 121-162. Bolliet V., Bgay V., Taragnat C., Ravault J.P., Collin J.P. & Falcn J. (1996). Photoreceptor cells of the pike pineal organ as cellular circadian oscillators. Eur J Neurosci, 9: 643-653. Bowmaker J.K. & Wagner H.J. (2004). Pineal organs of deep-sea fish: photopigments and structure. J Exp Biol, 207: 2379 2387. Falcn J., Besseau L., Fazzari D., Attia J., Gaildrat P., Beauchaud M. & Boeuf G. (2003). Melatonin modulates secretion of growth hormone and prolactin by trout pituitary glands and cells in culture. Endocrinol, 144: 4648-4658. Amano M., Iigo M., Ikuta K., Kitamura S., Yamada H. & Yamamori K. (2000). Roles of melatonin in gonadal maduration of under yearling precocious male masu salmon. Gen Com Endocrinol, 120: 190 197. Chattoraj A., Bhattacharyya S., Basu D., Bhattachaya Sh., Bhattachayra S. & Kumar-Maitra S. (2005). Melatonin accelerates maturation inducing hormone (MIH): induced oocyte maduration in carps. Gen Comp Endocrinol, 140: 145 155. 2. Maksimovich A. (2002). Structure and function of vertebrate pineal gland. J Evol Biochem Physiol, 38: 1 15.

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