El ratn (GM)

Tras la publicacin de la secuencia y el anlisis de una variedad de ratn en diciembre de

20021 el ratn se convirti en el modelo de animal preferido para la mayora de los
experimentos de laboratorio. El potencial de los ratones para la manipulacin gentica aora
ace !ue se prefieran estos a las ratas y a otros roedores" tanto en las pruebas de seguridad
como en la investigacin fundamental. #os ratones genticamente modificados $%&'"
transgnicos y (noc()out" son aora valiosas erramientas en la mayora de los campos de la
investigacin mdica.
El ratn representa un excelente modelo para la enfermedad umana" por!ue la organi*acin de
su +,- y la forma en la !ue se expresan sus genes son muy similares a las de los seres
umanos. .us sistemas reproductores y nerviosos son como los de los umanos y padecen
mucas de las mismas enfermedades" como el cncer" la diabetes e incluso la ansiedad. #a
manipulacin de sus genes puede llevarlos a desarrollar otras enfermedades !ue naturalmente
no les afectan y" como resultado" la investigacin con ratones a ayudado a comprender tanto la
fisiologa umana como las causas de la enfermedad.
-ntes de la tecnologa gentica" los ratones se sometan a cra consangunea para producir
variedades de laboratorio con caractersticas particulares. Estas variedades consanguneas eran
genticamente muy similares" lo !ue ace !ue resulten ideales para estudiar los cambios
producidos por la modificacin gentica.
Qu es un ratn transgnico?
/n ratn transgnico es a!uel cuyos cromosomas an sido alterados" de forma !ue sus genes
contienen -+, extra0o. Estos genes se encuentran en el n1cleo de todas las clulas del cuerpo"
por lo !ue todas las clulas del ratn contienen el nuevo -+,. El -+, extra0o puede proceder
de cual!uier fuente y puede ser umano" de otro animal o de otro ratn.
El cambio del -+, normalmente ace !ue las clulas ad!uieran una funcin" como la
produccin de una nueva protena. 2or e3emplo" algunos ratones transgnicos producen
protenas reconocidas por las clulas inmunolgicas umanas y se pueden utili*ar para
modeli*ar determinados aspectos de una enfermedad. En ocasiones el -+, extra0o puede
significar una prdida" en lugar de la ad!uisicin" de una funcin" dado !ue el nuevo -+,
podra interferir en una va bio!umica o impedir la produccin de una determinada protena.
#os ratones transgnicos son modelos 1tiles para entender cmo los genes regulan los procesos
en el cuerpo" por!ue el efecto !ue cambia un determinado gen se puede ver en todo el
organismo. Tambin se utili*an para estudiar enfermedades umanas !ue son causadas por
4errores4 en la forma en !ue el organismo produce determinadas protenas. 2or e3emplo" en la
emofilia -" el gen crucial codifica una protena conocida como factor 5666" necesaria para la
coagulacin de la sangre.
Produccin de ratones transgnicos
#as dos tcnicas principales para introducir el -+, extra0o en el ratn son a travs de la
inyeccin pronuclear o mediante el uso de clulas madre embrinicas.
En la inyeccin pronuclear" el -+, extra0o es inyectado en el pron1cleo de un ovocito de
ratn" !ue se forma inmediatamente despus de !ue aya sido fertili*ado. El -+, extra0o se
integra en el genoma en una posicin aleatoria" normalmente despus de !ue se aya producido
la primera o la segunda divisin celular. Esto significa !ue el ratn no portar -+, transgnico
en todas sus clulas y" por lo tanto" solamente ser parcialmente transgnico. El esperma o los
ovocitos transgnicos de estos ratones son posteriormente utili*ados para crear la siguiente
generacin de ratones completamente transgnicos.
7uando se introduce el -+, en las clulas madre embrinicas" normalmente se integra
aleatoriamente en el genoma" pero si tiene una estructura similar a una parte existente del
genoma puede ser 8reconocido9 por el -+, $de forma !ue se somete a una recombinacin
omloga' y se integra una 1nica copia en el genoma" en una ubicacin especfica. -
continuacin" estas clulas embrinicas necesitan crecer y son inyectadas en un embrin
ospedador" convirtindose en parte del ratn !ue crece a partir de ese embrin. El ratn
crecido del embrin ospedador es conocido como !uimera y se forma de las clulas
embrinicas de dos ratones diferentes. 2arte del esperma producido por la !uimera ser
transgnico $conteniendo el -+, extra0o' y cuando ese esperma fertilice un ovocito normal" el
ratn !ue crecer del mismo ser completamente transgnico" con -+, extra0o en todas las
clulas.
Ratn knock-out
El desarrollo ms reciente de las variedades de ratn (noc()out $o (noc()in' durante la dcada
de los ocenta supuso un importante avance para la gentica. Esta tecnologa permite alterar
determinados genes de la cadena de -+," normalmente retirados" aun!ue tambin pueden ser
inactivados o insertados. Esto permite a los investigadores determinar la funcin exacta de un
determinado gen y estos ratones %& an proporcionado excelentes modelos para numerosas
enfermedades umanas" !ue no se podran aber estudiado con animales anteriormente. #a
secuenciacin y el anlisis del genoma del ratn an permitido seleccionar y estudiar mucos
genes empleando esta tecnologa. #os creadores del primer ratn (noc(out obtuvieron el
2remio ,obel de &edicina en 200:.
Creacin del ratn knock-out
#os ratones (noc()out y (noc()in se producen mediante la seleccin de genes. Esta tcnica
permite alterar un determinado gen del genoma del ratn" sustituyndolo por una secuencia
gentica similar !ue a sido modificada para !ue contenga una mutacin. - mutacin a menudo
evita !ue el gen funcione. 7uando los genes estn 8inactivados9 $(noc(ed)in'" un gen de ratn
normalmente se sustituye por un gen similar del genoma umano.
El gen mutante se crea en un plsmido bacteriano" !ue se inyecta en las clulas madre
embrinicas del ratn" normalmente de un ratn maco. Estas clulas son de un embrin de
ratn muy temprano y se dividirn para formar todos los tipos de clulas en el organismo. El
ob3etivo es !ue el material gentico mutante del plsmido forme -+, en el esperma del ratn
cuando ste se aya desarrollado por completo. /na ve* !ue el plsmido se encuentra en el
interior de una clula madre" las dos secuencias de -+, similares intercambian material
gentico mediante la recombinacin omloga" !ue cambia el nuevo gen mutante en el genoma
del ratn. Estas clulas madre son despus implantadas en un embrin ospedador para !ue se
desarrollen. ,ormalmente se seleccionan ratones con el pela3e de diferentes colores como
ospedadores" para !ue est claro !u ratn es el !ue tiene los genes mutantes.
7uando nace el ratn es una !uimera" dado !ue solamente algunas de sus clulas estarn
modificadas. Este ratn tendr el pelo de ambos colores. 7uando el esperma del ratn !uimera
fertilice un ovocito normal" parte de su descendencia portar una 1nica copia del gen mutante.
Estos ratones tendrn el pela3e del mismo color !ue el ratn cuyo -+, fue alterado
originalmente.
Knock-in
En clonacin molecular y biologa" un ;noc()in se refiere a un mtodo de ingeniera
gentica !ue involucra la introduccin de un DNA en un locus particular del cromosoma del
organismo. ,ormalmente" ese es eco usando un ratn modelo ya !ue son fciles de criar y
muestran un corto desarrollo. +e esta manera un ratn (noc()in es a!uel al !ue se le a
sustituido una secuencia gnica por otra diferente o modificada. Es una tcnica en la cual los
cientficos pueden estudiar el funcionamiento de la ma!uinaria regulatoria $un e3emplo sera el
promotor' !ue gobierna la expresin del gen natural siendo rempla*ado. Esto es logrado
observando el nuevo fenotipo del organismo en cuestin. Esta tcnica es bsicamente lo
opuesto de un Knockout de genes
Knockouts condicionales
#os (noc(out son ratones a los !ue se a inactivado o eliminado experimentalmente uno o ms
genes. Estos (noc(out son valiosos aliados para averiguar la funcin del gen !ue les falta. .in
embargo" cuando el investigador <toca< un gen especialmente importante para el desarrollo o el
metabolismo del organismo" a veces acaba consiguiendo ratones !ue mueren antes de nacer o
tras unos pocos das de vida. 2ara el investigador esto es bueno a priori" ya !ue este resultado le
indica !ue el gen es esencial" uno de esos !ue se encuentran una ve* en la vida= pero al
mismo tiempo" su modelo animal no le permite ir muco ms all" ya !ue se !ueda sin material
con el !ue seguir estudiando los efectos del gen !ue acaba de descubrir.
2ara lograr salvar este inconveniente fueron desarrollados los (noc(out condicionales. Este tipo
de ratones poseen una modificacin en el gen de inters !ue podramos denominar silenciosa.
+ica modificacin consiste en un mecanismo interruptor !ue provoca la inactivacin del gen
!ue se est estudiando slo en un te3ido o en un tipo celular concreto. +e esta forma" el
investigador puede mantener el gen funcional en el resto del animal" al mismo tiempo !ue
puede estudiar su funcin de manera muco ms especfica.
En la actualidad los sistemas de (noc(out condicional estn basados en la recombinacin
especfica de sitio" !ue en realidad no es sino una forma ms por la !ue el material gentico se
las arregla para reordenarse en mucos organismos de forma natural. En el caso de los
(noc(outs condicionales" el sistema de recombinacin ms conocido y utili*ado es el llamado
7re>lox2.
Este sistema de recombinacin procede de un virus !ue infecta bacterias" en este caso el
bacterifago 21. #a belle*a del sistema radica $como casi siempre suele ocurrir' en su
simplicidad? una recombinasa llamada 7re" !ue reconoce dos secuencias cortas iguales !ue
flan!uean el fragmento gentico a recombinar" llamadas sitios lox2. /tili*ando un smil
familiar" la recombinasa sera el e!uivalente a una ti3era y un pegamento al mismo tiempo"
mientras !ue los sitios lox2 seran las se0ales donde ay !ue cortar y pegar en la secuencia
gentica" algo asi como <corte a!u y a!u y pegue los extremos" desecando el tro*o
intermedio<.
El sistema no necesita re!uerimientos especiales ni otros factores !ue deban incluirse en la
reaccin. Esta es la ra*n por la cual un sistema evolucionado en procariotas pudo adaptarse sin
problemas a eucariotas y ms concretamente a animales superiores.
#a estrategia !ue sigue nuestro investigador es doble? por un lado" mediante tecnicas de
biologa molecular sit1a el gen !ue codifica la recombinasa 7re ba3o el control de un promotor
especifico de te3ido y utili*a esta construccin para generar un ratn transgnico. @ sea" !ue
continuando con nuestro e3emplo" este ratn expresa las ti3eras y el pegamento en el te3ido
elegido.
2ara la segunda parte de la tcnica genera otra construccin" esta ve* una copia casi exacta del
gen !ue !uiere estudiar" pero en la !ue una parte o toda su secuencia est flan!ueada por dos
sitios lox2. Esta construccin es tambin utili*ada para generar otro ratn transgnico"
seleccionado para llevar esta modalidad del gen de inters en lugar de la original. +igamos !ue
en nuestro ratn" el gen incluye las dos marcas donde cortar" puestas all de manera !ue no
interfieran con la expresin del gen. - este ratn se le llama en la 3erga cientfica <floxed<" !ue
podramos traducir $bastante libremente' como <floxeado<.
En resumen" disponemos de dos lneas de transgnicos !ue aora podemos cru*ar para obtener
lo !ue se llama un doble transgnico" o sea un ratn !ue lleva las dos construcciones insertadas
en su genoma. 2ero" A!u ocurre en el te3ido !ue expresa la recombinasaB 2ues !ue esta <ti3era
molecular< aora puede reconocer las marcas !ue pusimos en nuestro gen" efectuar los cortes y
reali*ar el empalme. 7omo resultado" en ese te3ido $y slo en se'" el gen perder un tro*o de su
secuencia y la protena !ue codifica no podr expresarse.
El sistema 7re>lox2 no solo puede controlarse en un te3ido" sino !ue el control puede refinarse
mediante el uso de promotores inducibles !ue por e3emplo" permitan la expresin de 7re
1nicamente cuando se suministra un determinado compuesto !umico o una ormona. -s" en la
actualidad es posible controlar espaciotemporalmente cual!uier modificacin gentica
experimental.
El uso de recominasas sitio-es!ec"#icas !ara generar ratones K$ condicionales
#a llegada de las recombinasas sitio)especficas a dado un giro drstico en la manipula) cin
experimental del genoma del ratn gracias a la posibilidad de crear ratones ;@ en for) ma
condicionada a un te3ido $;@ condicional)tisular'" o a un momento del desarrollo es) pecfico
$;@ condicional)temporal'. #os traba3os de C. .auer y .. @D%orman a fines de la dcada de
1EF0 y principios de 1EE0" fueron cardinales para el desarrollo de este sistema. En particular"
estamos ablando de las en*imas 7re $del virus bacterifago 21' y Glp $obte) nida de un
plsmido de la levadura .accaromyces cerevisiae'. -mbas reconocen una se) cuencia
especfica de HI pb" conocida como lox2 $en el caso de 7re' y frt $en el caso de la en*ima Glp'.
Estas recombinasas reali*an un traba3o de Jcorte y pegadoK siempre !ue se encuentren con
estas secuencias especficas. Es por eso !ue se pens en incorporarlas a las construcciones de
ratones ;@ como Jti3eras molecularesK especficas de te3ido y con la po) sibilidad de activarlas
a voluntad $el sistema 7re)lox2 se encuentra patentado por la empre) sa +u2ont'.
Csicamente" el tipo de recombinacin depender de la orientacin y locali*acin de los sitios
lox2 o frt? $i' 7uando ambas secuencias se encuentran en la misma molcula lineal de -+, y
con la misma orientacin" el segmento de -+, entre los sitios ser eliminado. $ii' .i los sitios
especficos de corte estn en la misma molcula pero con orientacin invertida" se produce una
inversin del segmento intermedio. $iii' 7uando las secuencias se encuentran en molcu) las de
-+, separadas el resultado es una translocacin $Gigura F.10'. Todas estas reacciones
en*imticas son reversibles y las recombinasas funcionan tanto in vitro como in vivo $y no re)
!uieren de ning1n co)factor para activarse'.
#a estrategia para crear ;@ condicionales est fundada en el control espacial y>o temporal de
las recombinasas sitio)especficas. Esto es posible gracias a la insercin de la secuencia
especfica $generalmente lox2' en las regiones flan!ueantes Lo en los intronesL del gen !ue
!ueremos no!uear. +e este modo" la funcin del gen blanco no se ve alterada" o sea !ue el gen
se expresa normalmente a pesar de la integracin de la secuencia lox2" mientras no interaccione
con la recombinasa 7re. - este nuevo alelo artificial del gen diana $generado in vitro por
recombinacin omloga en clulas E.' se lo llama" en la 3erga del laboratorio" alelo
JfloxeadoK.
El e3e de la tcnica se encuentra en poder manipular el lugar $te3ido' y el tiempo $momento del
desarrollo' para la expresin de la en*ima 7re. En el primer caso" se producen ratones
transgnicos $por la tcnica clsica de microinyeccin pronuclear' !ue expresan la en*ima 7re
slo en un te3ido predeterminado $por medio del uso de promotores especficos de te3i) do'. El
paso final consiste en cru*ar estos ratones transgnicos 7re $referidos en ingls como ratones
JdeletersK' con las lneas de ratones !ue acarrean los sitios lox2 en el gen blanco $Gi) gura
F.11'. #uego de esta cru*a" obtendremos una determinada proporcin de ratones big) nicos
$del ingls" bigenic' o dobles mutantes $7re ms gen floxeado'" dependiendo del geno) tipo de
las lneas parentales $si son ambas emicigotas" 7re>M y lox2>M" obtendremos un 2NO de
ratones ;@ condicionales'. #a expresin de la en*ima 7re en el te3ido especfico $determi)
nado por el promotor elegido' ar !ue los sitios lox2 realicen una recombinacin de3ando atrs
una delecin" y por lo tanto un alelo nulo $;@' del gen en cuestin.
En el caso del ;@ condicional)temporal" se recurre al empleo de promotores JinduciblesK.
Entre los ms destacados se encuentran los promotores inducibles por antibiticos $por e3emplo
tetraciclina o su derivado doxiciclina' y a!uellos inducidos por ormonas. En el pri) mer caso"
el sistema de expresin controlada por tetraciclina se conoce como TET)system y su uso se
encuentra regulado por patentes comerciales. En el segundo caso" se traba3a con protenas de
fusin entre la en*ima 7re y un receptor incompleto de estrgenos $slo la por) cin EC+"
estrogen binding domain'. Esta protena de fusin es inactiva" pero la administracin de la
droga tamoxifeno $por va intraperitoneal' la libera y activa el sistema 7re. 2or lo tanto" tendr
como resultado la accin de la recombinasa sobre los sitios especficos y la consiguien) te
recombinacin de -+, con alteracin del gen diana en los ratones 7re>lox2 positivos. Es
lgico pensar !ue la combinacin de estas dos tcnicas de ;@ condicionales $tisular)tempo)
ral' puede ser de gran proveco" como lo an demostrado usando promotores especficos de
linfocitos C. En este caso" cru*aron ratones con una alelo floxeado de la polimerasa P con una
lnea de ratones transgnicos para la construccin 7re)EC+ con un promotor especfico de
linfocitos C. El resultado es la expresin de la protena de fusin slo en este lina3e celular. El
agregado de la droga tamoxifeno libera la en*ima 7re y produce la consiguiente delecin del
gen de la polimerasa P en los linfocitos C.
E3emplo ;noc(out
-ccelerated regeneration of te s(eletal muscle in Q,G1H)(noc(out mice is mediated by
macropage)secreted 6#)I>6#)R.
2rotena de dedo de -,6##@ 1H $ Q,G1H ' es una ligasa EH recientemente identificado
notificado a ser funcionalmente importante en la regulacin del desarrollo del cncer " el
crecimiento de las clulas musculares " y el desarrollo neuronal . En este estudio" la funcin de
Q,G1H en la regeneracin del m1sculo es!ueltico inducida cardiotoxina ) se investig el uso
de ratones (noc(out Q,G1H ) . Q,G1H ) > ) ratones mostraron una mayor regeneracin
muscular ) !ue se caracteri*a por la proliferacin acelerada de clulas satlite ) en comparacin
con los ratones de tipo salva3e. #a expresin de Q,G1H fue inducida en macrfagos
notablemente ms !ue en las clulas satlite de los ratones de tipo salva3e en la etapa muy
temprana del da0o muscular. Este resultado indic !ue las clulas inflamatorias son importantes
en las funciones celulares por satlite Q,G1H ) mediada . Gueron anali*ados los niveles de
cito!uinas en los m1sculos es!uelticos y demostraron !ue Q,G1H ) > ) ratones produce
mayores cantidades de diversas cito!uinas !ue los ratones de tipo salva3e. Entre stos " 6# ) I e
6# ) R niveles aumentaron significativamente en Q,G1H ) > ) ratones. El fenotipo regeneracin
muscular acelerada fue derogada mediante la inibicin de la accin en 6#)I>6#)R Q,G1H ) > )
ratones con anticuerpos blo!ueadores . Estos resultados indican !ue la deficiencia de Q,G1H
promueve la regeneracin del m1sculo es!ueltico a travs de los efectos sobre el nico de
clulas satlite mediada por 6# ) I e 6# ) R .
ttp?>>SSS.ncbi.nlm.ni.gov>pubmed>2INRH21R
E3emplo de (noc()in
T-#E, construction via </nit -ssembly< metod and targeted genome modifications in
*ebrafis.
Transcripcin activador de nucleasas efectoras $Talens' estn dise0ados endonucleasas
compuestos por una transcripcin activador de efector personali*ado $T-#E' dominio de unin
al -+, y un dominio de la divisin del -+, Go(6. Talens inducir roturas de doble ebra de
-+, $+.Cs' en sus lugares de destino en el cromosoma y se an utili*ado con xito para la
ingeniera del genoma de mucas especies y clulas cultivadas. El pe* cebra es un organismo
modelo muy popular en la investigacin bsica y clnica. - continuacin" describimos los
detalles de construccin de Talens personali*ado utili*ando el <con3unto de la unidad< $/-'
mtodo" as como tres aplicaciones de las manipulaciones del genoma pe* cebra utili*ando
Talens? genes (noc()out" gran delecin cromosmica" y el gen (noc()in por omlogos
recombinacin.
ttp?>>SSS.ncbi.nlm.ni.gov>pubmed>2INNRNNN
E3emplo del (noc(out M recombinasa 7ree
Generation and anal%sis o# serine !rotease in&iitor ka'al t%!e (-cre dri)er mice*
6nibidor de serina proteasa de tipo ;a*al 1 $ .26,;1 T omlogo de ratn .26,;H ' se
descubri inicialmente como un inibidor de tripsina especfica en el pncreas . .in embargo "
estudios previos an sugerido !ue .26,;1>.pin(H se expresa en una amplia gama de te3idos
normales y tumores " aun!ue la caracteri*acin precisa de su expresin gnica no se a descrito
en la edad adulta . - fin de anali*ar la expresin .26,;H " emos generado dos lneas de
ratones en los !ue sea lacU o genes de recombinasa 7re se insertan en el locus .26,;H por la
tecnologa 7re )lox2 . En .26,;H $ lacU' de los ratones " la actividad P ) galactosidasa se
encontr en las clulas acinares del pncreas y ri0n " as como clulas epiteliales de los
bron!uios en el pulmn " pero no en el tracto gastrointestinal o del gado . .26,;H $ cre'
(noc() en ratones se cru*aron con el reportero Qosa2R $ Q2RQ ' ratones para monitori*ar la
actividad del promotor .26,;H . En .26,;H $ 7QE ' T ratones Q2RQ " la actividad P )
galactosidasa se encuentra en las clulas acinares del pncreas " ri0n" pulmn" y una pe!ue0a
proporcin de clulas en el tracto gastrointestinal y el gado . Estos datos sugieren !ue
.26,;H se expresa ampliamente en te3idos derivados del endodermo " y !ue .26,;H $7QE'
ratones (noc( )in son una erramienta 1til para el establecimiento de un condicional ratones
(noc(out para anali*ar la funcin .26,;H no slo en los te3idos normales " sino tambin en los
tumores !ue expresar .26,;1>.pin(H
ttp?>>SSS.ncbi.nlm.ni.gov>pubmed>2IN21FR2