Caracterização de Aeromonas SPP PDF

CARACTERIZAO DE AEROMONAS SPP.
ISOLADAS DE GUAS NO TRATADAS PARA

CONSUMO HUMANO

Dissertao de Mestrado em
Biologia Clnica Laboratorial

Maria Ermelinda de Aguiar Ribeiro

Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro

Vila Real, 2008

Instituio Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro
Curso Mestrado em Biologia Clnica Laboratorial
Titulo Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo
Humano
Autor Maria Ermelinda Aguiar Ribeiro
Orientadores
Prof. Doutora Maria Jos Flix Saavedra
Prof. Doutor Antnio Jos Martnez - Murcia

As Doutrinas espostas no presente trabalho
so da exclusiva responsabilidade do autor

Este trabalho foi expressamente elaborado como
dissertao original para o efeito de obteno do
grau de Mestre em Biologia Clnica Laboratorial.
v

AGRADECIMENTOS
Ao Magnifico Reitor da Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro, Professor
Doutor Armando Mascarenhas Ferreira, a minha especial gratido pela compreenso e
condies proporcionadas, sem as quais no teria sido possvel a realizao deste
trabalho.
Professora Doutora Maria Jos Saavedra, o meu muito obrigada por se ter
disponibilizado para a orientao cientfica deste trabalho, pelo apoio imprescindvel
que sempre me dispensou, bem como pela amizade e compreenso manifestadas.
Ao Professor Antnio Martnez-Murcia, Director do Laboratrio de I&D Molecular
Diagnostic Center (MDC), Alicante, Espanha, o meu profundo reconhecimento por ter
aceite a co-orientao deste trabalho, pela compreenso e incentivo demonstrado em
todos os momentos e disponibilidade para realizao da sequenciao dos isolados
bacterianos.
s colegas de Mestrado, Dr. Anabela Borges e Dr.Carla Dias, pela amizade,
cumplicidade demonstradas no decorrer do trabalho analtico, pelo apoio informtico, o
meu mais sincero e reconhecido agradecimento.
Ao Departamento de Cincias Veterinrias, pela disponibilizao dos meios necessrios
para a realizao deste trabalho.
Ao meu marido Jos Joo, que nos momentos mais difceis conseguiu sempre apoiar-me
e incentivar-me mostrando uma total dedicao e disponibilidade, pelo que expresso a
minha mais reconhecida gratido.
Aos meus filhos, Joo e Ana Filipa, por todos os momentos que deixei de partilhar com
eles.
A todos, familiares, colegas e amigos, por todo o seu apoio demonstrado na realizao
deste trabalho.
vi

FINANCIAMENTOS
A realizao deste trabalho foi possvel mediante o apoio das seguintes
entidades:
CECAV- Centro de Estudos de Cincia Animal e Veterinria, Universidade de
Trs-os Montes e Alto Douro.

vii

TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE

CONGRESSOS INTERNACIONAIS
Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., and Martnez-Murcia A., 2008. Antimicrobial
resistance patterns of Aeromonas spp. in drinking water from Portugal. Proceedings of the 9
th

I nternational Symposium on Aeromonas and Plesiomonas, 10
th _
12
th
September, UTAD,
Vila Real.

JORNADAS NACIONAIS
Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., e Martnez-Murcia A., 2008. Perfil de
resistncia a antibiticos de Aeromonas spp. isoladas de guas de consumo no tratadas em
Portugal. Livro de resumos das 2
as
J ornadas de Biologia, 7 e 8 de Outubro, UTAD, Vila Real.

viii

RESUMO
____________________________________________________________

O gnero Aeromonas forma uma unidade monofiltica dentro do sub-grupo gama -3 das
Proteobactrias. Bactrias do grupo das Aeromonas surgem em diversos ambientes
aquticos. Est tambm comprovada a presena de Aeromonas spp. em guas para
consumo humano, tratadas e no tratadas. Os organismos deste grupo so
frequentemente referidos como patognicos emergentes sendo pesquisados
obrigatriamente no Canad, Itlia e Holanda. Assim, pretende-se com este estudo,
fazer uma avaliao da presena de organismos do gnero Aeromonas em guas no
tratadas de fontes, poos e nascentes, para consumo humano em dois concelhos do
Distrito de Vila Real. Pela sua importncia, diversidade gentica, e o seu nvel de
resistncia a antibiticos foi o gnero seleccionado para a elaborao deste trabalho. A
identificao das estirpes foi realizada por sequenciao dos genes 16S rRNA, gyrB,
gyrA e rpoD. Foram obtidos um total de 34 isolados agrupados em sete espcies
distintas A. hydrophila, A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veroni, A. bestiarum e
A. encheleia e um grupo distinto dos actualmente identificados, que pela sua distncia
filogentica poder corresponder a uma espcie ainda no descrita. Foi efectuada a
determinao da susceptibilidade para um total de 27 antibiticos sendo utilizados
-lactmicos como as penicilinas (aminopenicilinas), cefalosporinas (1, 2, 3 e 4
gerao), monobactmicos e carbapenemos. Adicionalmente outros antibiticos foram
testados como: tetraciclinas, quinolonas, aminoglicosdeos, sulfamidas e cloranfenicol.
Dos antibiogramas realizados verificou-se que todas as estirpes apresentaram
multiresistncia. Para a amoxicilina e cefalotina obtiveram-se ndices de resistncia de
100%. Para o carbapenemo testado (imipenemo) 3% das estirpes apresentaram
resistncia e 13% foram consideradas intermdias. Todas as estirpes foram sensveis
para a piperaciclina/tazobactan, aminoglicosdeos, aztreonamo e tetraciclina.

ix

ABSTRACT
____________________________________________________________
The genus Aeromonas forms a monophyletic unit within the gamma-3 subgroup of the
class Proteobacteria. Bacteria of Aeromonas spp. are widely spread in aquatic
environments. They also occur in untreated and treated drinking water. Members of this
genus are considered as emerging pathogens and have been the focus of studies in
Canada, Italy and Holland. Thus, it is intended with this study, to evaluate the presence
of organisms of the genus Aeromonas in untreated water sources, wells and springs, for
human consumption in two counties of the District of Vila Real. The reason for the
selection of this genus for study is its clear importance in terms of health, genetic
diversity, and its level of resistance to antibiotics. The identification of strains was
performed by sequencing of 16S rRNA, gyrB, rpoD and gyrA. A total of 34 isolates
were obtained which were clustered into seven distinct species - A. hydrophila,
A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veronii, A. bestiarum and A. encheleia- and a
distinct group not identified, which by their phylogenetic relationship may correspond
to a new species of Aeromonas. The antibiotic susceptibilities of these species were
determined using 27 antibiotics including -lactams such as penicillins
(aminopenicillins), cephalosporins (1st, 2nd, 3rd and 4 generation), monobactams and
carbapenems. Additionally other classes of antibiotics were also tested e.g.
tetracyclines, quinolones, aminoglycosides, sulphonamides and chloramphenicol. From
antibiograms performed it was found that the strains showed multidrug-resistance. To
amoxicillin and cephalothin rates of resistance were 100%. For the carbapenems tested
(imipenem) 3% of the isolates showed resistance and 13% were considered as having
intermediate resistance. All isolates were sensitive to piperaciclina/tazobactan,
aminoglycosides, tetracycline and aztreonam.

x

NDICE

AGRADECIMENTOS v
FINANCIAMENTOS vi
TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE vii
RESUMO viii
ABSTRACT ix
NDICE x
NDICE DE FIGURAS xiii
NDICE DE QUADROS xiv
NDICE DE TABELAS xv

1. INTRODUO 1
1.1. A qualidade da gua para consumo 2
1.2. O gnero Aeromonas 6
1.2.1. Ecologia e Patogenicidade 7
1.2.2. Taxonomia e Filogenia 9
1.2.3. Mtodos de Identificao 12
1.2.3.1. Mtodos microbiolgicos convencionais 12
1.2.3.2. Mtodos genticos 13
1.2.3.3. Sequenciao do gene que codifica para o rRNA 16S 14
1.2.3.4. Sequenciao de genes Housekeeping 14
1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA 16
1.2.3.4.2. Gene rpoD 18
1.3. Agentes antimicrobianos 18
1.3.1. Principais mecanismos de resistncia 19
1.3.2. Antibiticos antiparietais 20
1.3.2.1. -lactmicos 21
1.3.3. Inibidores de -lactmicos 22
xi

1.3.4. Antibiticos inibidores da sntese proteica 23
1.3.4.1. Aminoglicosdeos 23
1.3.4.2. Tetraciclinas 24
1.3.4.3. Cloranfenicol 24
1.3.4.4. Macrlidos 25
1.3.5. Antibiticos inibidores da sntese dos cidos nucleicos 25
1.3.5.1. Quinolonas 26
1.3.6. Antibiticos antimetabolitos 26
1.3.6.1. Sulfonamidas/Trimetropim 26
1.3.7. Antibioresistncia no gnero Aeromonas 27

2. OBJECTIVOS 31

3. MATERIAL E MTODOS 32
3.1. Origem das amostras 33
3.1.1. Mtodo de recolha das amostras 34
3.1.2. Isolamento pela tcnica de filtrao por membrana 34
3.1.3. Conservao das estirpes 35
3.2. Caracterizao preliminar dos isolados 35
3.2.1. Colorao diferencial de Gram 35
3.2.2. Prova da citromo-oxidase 36
3.2.3. Prova da catalase 36
3.3. Identificao das estirpes bacterianas 37
3.3.1. Extraco de DNA de culturas puras 37
3.3.2. Amplificao de DNA por reaco de PCR 38
3.3.3. Purificao dos produtos de PCR 38
3.3.4. Sequenciao 39
3.3.5. Anlise de sequncias e construo dos dendogramas 41
3.4. Caracterizao bioqumica pelo API 20NE 41
3.5. Perfil de susceptibilidade a agentes antimicrobianos 42

4. RESULTADOS E DISCUSSO 44
4.1. Estirpes isoladas 45
4.2. Identificao por sequenciao de isolados bacterianos 47
xii

4.2.1. Identificao dos isolados por sequnciao do gene 16S rRNA 47
4.2.1. Identificao dos isolados bacterianos por sequnciao do gene gyrB 48
4.2.2. Identificao dos isolados bacterianos por sequnciao do gene gyrA 52
4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp. 53
4.4. Caracterizao fenotpica da estirpe MDC 2464 55
4.4.1. Mtodos bioqumicos 55
4.4.2. Sistema de biotipificao numrico API 20NE 55
4.5.Caracterizao bioqumica da espcie Aeromonas spp. 57
4.5.1. Sistema de biotipificao numrico API 20NE 57
4.6. Perfil de susceptibilidade a antibiticos 59

5. CONSIDERAES FINAIS 66

6. BIBLIOGRAFIA 68

ANEXOS
AnexoI-Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por
16s RNA
Anexo II-Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por gyrB,
gyrA e rpoD

xiii

N ND DI IC CE E D DE E F FI IG GU UR RA AS S

Figura 1 - Fotografia de microscopia electrnica de bacilos de Aeromonas hydrophila
colonizando o tecido epitelial de intestino humano 7

Figura 2 - Estrutura da DNA girase. Indicao das subunidades funcionais, GyrA e GyrB 17

Figura 3 - Representao dos locais de actuao dos diferentes grupos de antibiticos 19

Figura 4 - Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a regio do gene que foi
amplificada e, em negrito, as posies do primer, e primeiro e ltimo nucletido amplificado
segundo a numerao de E. coli (Huang, 1996) 49

Figura 5 - rvore filogentica baseada na sequncia do gene gyrB dos isolados obtidos neste
trabalho 50

Figura 6 - rvore filogentica baseada na sequncia do gene rpoD. Est representada nesta
figura a estirpe representativa do grupo Aeromonas spp. 54

Figura 7 - Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE do isolado F9 (MDC 2464)57

Figura 8 - Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE dos isolados F1BCa1 (MDC
2510) e F1BC1a2 58

Figura 9 - Perfil de susceptibilidade a diferentes antibiticos dos isolados de Aeromonas em
estudo 59

xiv

N ND DI IC CE E D DE E Q QU UA AD DR RO OS S

Quadro 1 - Estirpes actualmente aceite no gnero Aeromonas 11
Quadro 2 - Tcnica de filtrao por membrana 32
Quadro 3 - Procedimento de Colorao pelo mtodo de Gram 35
Quadro 4 - Metodologia de execuo da prova da oxidase 35
Quadro 5 - Metodologia de execuo da prova da catalase 36
Quadro 6 - Metodologia de extraco do DNA de estirpes bacterianas 37
Quadro 7 - Oligonucleotidos utilizados para reaco de PCR 38
Quadro 8 - Protocolo de Purificao de produtos de PCR 39
Quadro 9 - Oligonucleotidos utilizados em reaco de sequenciao 40
Quadro 10 - Protocolo de precipitao dos produtos de sequenciao 40
Quadro 11 - Procedimento para a realizao do sistema API 20 NE 41
Quadro 12 - Tcnica de difuso em agar com discos de antibiticos 43

xv

N ND DI IC CE E D DA AS S T TA AB BE EL LA AS S

Tabela 1 - Locais de amostragem e nmero de amostras 33
Tabela 2 - Identificao da amostra, origem, localizao e referncia atribuda 46
Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene 16s RNA 47
Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene por gyrB 51
Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene por gyrA 53
Tabela 6 Perfil bioqumico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC2464 56
Tabela 7- Resistncia a mltiplos antibiticos das espcies de Aeromonas 63

1. INTRODUO
________________________________________________________

Introduo

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano Pgina 2

1.1. Qualidade da gua para consumo

Desde a poca do Imprio Romano que se sabe que a gua um potencial
transportador de doenas. O controlo microbiolgico das guas de consumo humano
tem sido praticado desde o inicio do sculo XX. Sendo a gua um dos elementos
essenciais para o Homem, necessrio que esta seja utilizada em condies de
potabilidade. Em Portugal, cerca de 1 milho de pessoas no possui gua canalizada,
recorrendo a gua de diversas origens, nomeadamente poos, minas, furos e fontes.
Nestes casos, sobretudo no interior do pas, a contaminao representa um perigo para a
sade pblica, nomeadamente no que se refere aos perigos microbiolgicos (Saavedra,
2000).
De entre os microrganismos presentes na gua, destacam-se os de natureza
exgena, como os oriundos de matria fecal humana e animal, tais como os coliformes
totais, coliformes fecais e enterococos. Os coliformes pertencem famlia das
Enterobacteriaceae e incluem vrios membros dos gneros Escherichia, Enterobacter,
Citrobacter e Klebsiella. Existem ainda os de natureza autctone, que englobam
diversas espcies e fazem parte da microbiota natural da gua, entre elas as bactrias
mveis dos gneros Aeromonas e Pseudomonas (Palumo et al., 1996).
A Organizao Mundial de Sade refere a utilizao de microrganismos
intestinais como indicadores de poluio fecal, sendo estes microrganismos
universalmente aceites para a monitorizao e avaliao da qualidade microbiolgica da
gua. A existncia de enteropatognicos em amostras de gua para consumo humano
indica potencial contaminao, requerendo ateno imediata e alertam-nos para a
necessidade do seu tratamento (OMS, 2003).
Na Europa so vrias as directivas relativas a esta anlise, nomeadamente a
directiva n 98/83/CE que refere os critrios e normas de qualidade da gua. Em
Portugal, o Decreto-Lei n 306/2007, de 27 de Agosto, estabelece o regime da qualidade
da gua destinada ao consumo humano, tendo por objectivo proteger a sade humana
dos efeitos nocivos resultantes da eventual contaminao dessa gua e assegurar a
Introduo


disponibilizao tendencialmente universal de gua salubre, limpa e desejavelmente
equilibrada na sua composio. A qualidade da gua para consumo humano,
estabelecida por parmetros microbiolgicos e baseada em valores paramtricos de
microrganismos patognicos indicadores de poluio fecal, fixados nas partes I e II do
decreto-lei. Nos pases em vias de desenvolvimento as condies socioeconmicas
favorecem a incidncia e prevalncia de quadros diarreicos, pelo que a preocupao dos
microbiologistas clnicos, incide essencialmente na identificao dos patognicos
clssicos como a Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter e
Yersinia (Payment et al., 1991; Lund, 1994; Asmat e Gires, 2002; Castro- Escarpulli et
al., 2003; Schets et al., 2008). Actualmente E. coli utilizada como sendo a principal
indicadora de monitorizao da poluio da gua potvel (OMS, 2003), sendo mesmo
considerada um indicador superior (Edberg et al., 2000) e est associada a
contaminao fecal recente (APHA, 2005).

Cada vez mais existem estudos em que outros gneros so considerados como
patognicos emergentes, e possveis de ser objecto de monitorizao (Asmat e Gires,
2002). Nos pases industrializados a circulao de muitos patognicos tem vindo
progressivamente a diminuir nos ltimos anos, pelo contrrio, infeces causadas por
patognicos emergentes (i) bacterianos como: Pseudomonas, Legionella, Arcobacter e
Aeromonas; (ii) parasitas como: Cryptosporodium e Giardia; e (iii) vrus: norovrus,
rotavrus, enterovrus, e astrovrus tm vindo a aumentar (Aulicino, et al., 2005;
Sansebastiano et al., 2008; Schets et al., 2008). Alguns autores referem que se deveria
considerar o gnero Aeromonas como um indicador na monitorizao do funcionamento
do sistema de tratamento e potabilizao das guas (Szewezyk et al., 2000; Asmat e
Gires, 2002).
Assim, na Holanda, Itlia e Canad as autoridades de sude pblica, na
sequncia do aumento do isolamento de Aeromonas spp. estabeleceram o valor mximo
de 200 UFC/100ml em guas para consumo (Carnahan e Josephh, 2005). Em Itlia
limites provisrios e cautelar foram estabelecidos em 1997 para guas minerais naturais
na sua origem (10 UFC/100ml) e (100 UFC/100ml) depois de serem engarrafadas.
Contudo o papel da gua de consumo nas infeces causadas por Aeromonas spp. ainda
no est claro (Kirov 1997; Edberg et al., 2007). Fuzihara e colaboradores (1995)
Introduo


verificaram a ocorrncia de Aeromonas spp. em amostras de gua tratada e no tratada
concluindo estes autores que o consumo dessas guas representam um risco para a
sude dos consumidores. Estudos referem que a espcie de Aeromonas hydrophila tem
maior prevalncia em guas no poludas, enquanto Aeromonas caviae est associada a
guas com um elevado grau de poluio (Hanninen et al., 1995). A frequncia de outras
fenoespcies deste gnero parece no estar relacionada com condies ambientais
(Fiorentini et al., 1998).
Em 1998, Borrel e colaboradores, isolaram Aeromonas de diferentes espcies
em guas para consumo onde no foram detectados coliformes mostrando que no
existe uma correlao com estes indicadores. O gnero Aeromonas foi reconhecido
como um enteropatognico em humanos, e desde 1970 tem ocorrido um maior interesse
na investigao do mesmo. Desde 1995 que este gnero foi indicado pela EPA
(Environmental Protection Agency) como organismo patognico emergente (Merino
et al., 1995), e a espcie Aeromonas hydrophila como indicadora desse organismo,
tendo sido proposta a Candidata Lista dos Contaminantes nos Estados Unidos por
esta agncia.
A biodiversidade de habitats onde estes agentes patognicos tm sido isolados,
e o crescente nmero de infeces associadas a este gnero nas ltimas dcadas tem
despertado interesse na comunidade cientfica de forma a estabelecer o risco que este
gnero representa para a sade pblica. Em 1954 na Jamaica, descrito o primeiro caso
de infeco, miosite aguda, em humanos por Aeromonas (Hill et al., 1954),
posteriormente numerosos casos de infeces foram publicadas (Von Graevenitz, 1968).
As doenas infecciosas so um dos principais problemas que os pases em vias de
desenvolvimento enfrentam.
Estudos revelam que a gua desempenha um importante papel na transmisso
do gnero Aeromonas para humanos e animais (Joseph e Martin-Carnahan, 2000;
Crivelli et al., 2001; Figueras, 2005). importante saber que os isolados ambientais so
potenciais patognicos para o ser humano, havendo subpopulaes ou subespcies de
Introduo


Aeromonas com maior virulncia e que representam um risco para a sade humana
(Daily et al., 1981; Bin Kingombe et al., 1999; Figueras, 2005).
Em humanos o quadro clnico mais comum est relacionado com
gastroenterites ou com uma condio conhecida como a diarreia do viajante. Infeces
gastrointestinais foram observadas em doentes immunodeprimidos, com doenas
intestinais malignas, doenas hepatobiliares e baixa acidez gstrica aps a ingesto de
alimentos e gua contaminada (Janda, 1991; Braddour, 1992, Harf-Monteil, 2008).
Numerosos casos tm sido relatados descrevendo o isolamento de Aeromonas spp. em
doentes com diarreia, mas o papel destas bactrias em processos de gastroenterite
continua a ser controverso (Kirov,1993; Janda e Abbott, 1998, Von Gravaenitz, 2007)
mesmo depois de serem isoladas em doentes saudveis (Janda, 2001; Albert et al.,
2000; Tsai et al., 2006; Figueras, 2005).
Em 1986, Holmberg e colaboradores num estudo que visava avaliarem
aspectos clnicos e epidemiolgicos de gastroenterites associadas a Aeromonas spp.
concluram que o consumo de gua no tratada constitui um factor de risco para o
Homem. As trs espcies consideradas patognicas de maior importncia para o
Homem so Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii (com 2 biotipos sobria e
veronii), Aeromonas caviae, e constituem assim 85% de todos os isolados clnicos
envolvidos em infeces gastrointestinais como tambm em infeces extra-intestinais
(Janda, 1991; Braddour, 1992; Abbott, 1998; Janda e Abbott, 1998; Kirov, 2001;
Figueras, 2005; Miana-Galbis et al., 2007;Von Gravaenitz, 2007). Em contrapartida,
Aeromonas schubertii, Aeromonas jandaei e Aeromonas trota, so consideradas
patognicos de menor relevncia (Sen e Rodgers, 2004; Donohue et al., 2007; Tena et
al., 2008), mas tambm esto implicadas em doenas nos humanos. Segundo Edberg e
colaboradores (2007) somente trs espcies A. hydrophila, A. caviae e A. veronii biovar
sobria, so clnicamente importantes.
Balotescu e colaboradores (2003) referem uma alta mortalidade por infeces
de estirpes do gnero Aeromonas nomeadamente de certas fenoespcies (A. hydrophila
e A. veronii) em pacientes imunocomprometidos. Para os microbiologistas essa alta
Introduo


taxa de mortalidade provavelmente devida ao pouco conhecimento no que respeita
aos aspectos de antibioresistncia em estirpes de Aeromonas, pois tratamentos com
antibiticos para bactrias que apresentam resistncia constitutiva levam a resultados
sem sucesso, como tambm, a crescente tendncia de multiresistncia que as espcies de
Aeromonas apresentam a alguns grupos de antibiticos (Levy et al., 2005).
claramente necessrio, que intervenes preventivas e programas de monitorizao
eficazes, relativamente a guas destinadas ao consumo humano, a actividades
recreativas de lazer e qualidade ambiental, sejam aplicados (Sansebastiano et al., 2008),
de modo a serem conhecidos outros bioindicadores assim como o seu potencial de
resistncia.

1.2. O gnero Aeromonas

O termo Aeromonas, que deriva das palavras gregas aer que significa ar ou
gs e monas que significa unidade, ou seja unidades produtoras de gs (Martin-
Carnahan e Joseph, 2005). Aeromonas um gnero da famlia Aeromonadaceae.
Actualmente esta famlia inclui ainda os gneros Oceanimonas, Tolumonas,
Oceanisphaera e Zobellella (Euzby, 2008). So organismos autctones do meio
ambiente aqutico considerados patognicos no s para os peixes e anfibios, tendo
actualmente uma importncia crescente em humanos.
O gnero Aeromonas inclui um grupo de bactrias Gram negativo, anarobias
facultativas, no esporuladas, normalmente oxidade e catalase positiva, capazes de
degradar os nitratos a nitritos, fermentam a D-glucose como fonte principal de carbono
e energia. Estes bacilos no so haloflicos e so resistentes ao agente vibriosttico
O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridina) a concentraes de 10 e 150 g (Martin-
Carnahan e Joseph, 2005). Todas as espcies com excepo de Aeromonas salmonicida
e Aeromonas media so mveis e geralmente movimentam-se por um flagelo polar
(Figura 1). O tamanho varia de 0,3 a 1,0 m de dimetro e de 1,0 a 3,5 m de longitude.
Podem aparecer como bacilos ou cocobacilos independentes, aos pares ou em cadeias
curtas (Popoff, 1984), a sua temperatura mnima de crescimento de 4 C, a mxima de
Introduo


45C. O seu crescimento ptimo a 30 C. A sua tolerncia ao pH varia entre 4.5 a 9.0.
Estas espcies produzem exoenximas como amilase, fosfolipase, protease e DNAse
(Popoff, 1984; Kirov, 1997; Kirov et al 2004; Carnahan e Joseph, 2005).

Figura 1 Micrografa electrnica de bacilos de Aeromonas hydrophila colonizando o tejido epitelial intestinal humano
(Northwest Fisheries science Center, NOAA).

1.2.1. Ecologia e patogenicidade
Aeromonas spp. so microrganismos de ocorrncia amplamente difundida no
ambiente aqutico nomeadamente gua doce, gua potvel, guas contaminadas, gua
do mar, sistemas de distribuio de gua para consumo, guas termais, lagos, rios, mar,
esgotos, e solos (Hazen et al., 1978; Borrel et al., 1998; Saavedra, 2000; Biscardi et
al., 2002; Abbott, 2003; Pal et al., 2006; Libisch et al., 2008; Sepe et al., 2008).
Existem poucos dados relativamente presena de Aeromonas spp. no solo, contudo
estudos referem que estas podem persistir e mesmo multiplicar-se, mantendo as suas
caractersticas de virulncia, o que sugere a importncia do solo como reservatrio deste
microrganismo (Brandi et al., 1996). A incidncia de Aeromonas spp. nos sistemas de
distribuio de guas para consumo tem sido alvo de interesse, dada a sua importncia
em termos de sude pblica. A concentrao destes microrganismos varia com as
estaes do ano, e quando a temperatura ambiente superior a 20 C, verifica-se um
aumento, correspondendo poca de maior incidncia de quadros diarreicos, o que
apoia a hiptese de considerar que a gua e alimentos so os principais veculos de
transmisso deste gnero (Schubert, 1991; Kirov, 1993; Chopra e Houston, 1999;
Hernould, 2008).
Introduo


Estes microrganismos tm tambm sido isolados numa grande variedade de
alimentos tais como carnes, pescado, mariscos, alimentos preparados, produtos de
pastelaria, leite, derivados lcteos e verduras (Palumo et al., 1989; Knochel e Jeppesen,
1990; Kirov et al., 1993; Hnninen e Siitonen, 1995; Castro - Escarpulli et al., 2003;
Bin Kingombe et al., 2004; Ottaviani et al., 2006). Por este motivo alguns autores
consideram que Aeromonas deveria incluir-se na lista de microrganismos que podem
actuar como causadores de toxoinfeces alimentares (Kirov, 1993). As fontes de
infeco em humanos podem ser agrupadas em duas grandes categorias: a primeira
devida ao complexo ambiente - gua - animais; e a outra ser mediante a ingesto de
comida contaminada, sendo este gnero cada vez mais referenciado como o principal
causador de diversas infeces ao nvel da clnica humana (Joseph e Martin-Carnahan,
2000; Ko et al., 2000; Hsiu-Tsun et al., 2003; Figueras, 2005).

medida que a diversidade do gnero Aeromonas foi sendo descrita aumentou
a sua importncia como agente patognico (Carson et al., 2001). Algumas espcies tm
sido reconhecidas como patognicas para o Homem causando infeces intestinais e
extraintestinais, incluindo septicmia, feridas, infeces da pele, tecidos moles e no
sangue (Janda 1991; Chang et al., 1997; Krzyminska et al., 2008), como tambm nos
animais especialmente em peixes, anfbios e repteis (Martin-Carnahan e Joseph, 2005;
Figueras, 2005; Tena et al., 2007).

Vrios estudos referem que as Aeromonas constituem um grupo de
organismos patognicos primrios, sendo a primeira causa de doenas extraintestinais, e
esto fortemente associadas a infeces gastrointestinais em humanos (Janda, 1991;
Braddour, 1992; Subashkumar et al., 2006). O facto de no se conseguir reproduzir em
animais de laboratrio os sintomas diarreicos observados no Homem, tambm no tem
permitido demonstrar a capacidade enteropatognica desta bactria (Janda e Abbott,
1998; Von Graevenitz, 2007). Assim o papel de Aeromonas spp. como agente causador
de gastroenterite continua a ser objecto de investigao e mesmo especulao.
Bardhan e colaboradores em 1998 consideraram Aeromonas spp., Escherichia coli e
Klebsiella spp. como os agentes mais importantes de diarreia infantil no Bangladesh.

Introduo


Estudos recentes tm demonstrado que a presena de Aeromonas spp. na gua
um potencial risco para a sade pblica, uma vez que estes microrganismos
produzem uma ampla gama de factores de virulncia, deste modo a patogenicidade das
infeces associadas a estes microrganismos considerada complexa e multifactorial
(Chopra et al., 2000). A presena de factores de virulncia nas espcies de Aeromonas
spp. um facto comprovado, sendo referido tanto componentes estruturais como
produtos extracelulares (Cahill,1990; Thornley et al., 1997; Chacn et al., 2003; Harf-
Monteil et al., 2004a; Ardi, 2005).
Os componentes estruturais mais estudados e que esto esto associados ao
processo de invaso e patogenicidade so flagelos; cpsula; pli; a camada S; os
lipopolissacarideos e as protenas de membrana externa (Merino et al., 1998; Gavn et
al., 2002; Gavn et al 2003; Kirov et al., 2004). Aeromonas spp. produzem ainda uma
grande variedade de substncias extracelulares , tais como, enterotoxinas, hemolisinas,
citotoxinas, DNAses, RNAses, elastases, lecitinases, amilases, proteases e lipases,
substncias envolvidas nos processos de patogenicidade (Nord et al., 1975; Popoff,
1984; Cahill,1990; Kirov, 1997; Schiavano et al., 1998; Chopra e Houston, 1999;
Santos et al., 1999; Fivaz et al., 2001; Asmat e Gires, 2002; Gonzlez- Serrano et al.,
2002; Kirov et al., 2004; Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Os factores de virulncia
referidos no gnero Aeromonas tm sido descritos quer em estirpes clnicas, estirpes
isoladas em guas e tambm em alimentos (Bin Kingombe et al., 1999; Martins et al.,
2002; Gonzlez- Serrano et al., 2002; Sen e Rodgers, 2004).

1.2.2. Taxonomia e Filogenia

A taxonomia do gnero Aeromonas um pouco complexa e por vezes confusa,
devido falta de congruncia entre as caractersticas fenotpicas e genotpicas das
espcies que constituem este gnero (Hasan et al., 2006). A caracterizao fenotpica
extremamente difcil e ambgua (Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Ao longo dos
ltimos anos, o gnero Aeromonas foi sujeito a numerosas revises ao nvel da
taxonomia e da nomenclatura. Bacillus punctatus foi o primeiro nome atribudo a um
isolado deste gnero (Zimmerman, 1890). Na stima edio do Manual de Bergeys
(Snieszko, 1957) este gnero foi includo na famlia Pseudomonadaceae, englobando
Introduo


quatro espcies, trs espcies mesfilas mveis (A. hydrophila, A. punctata, A.
liquefaciens), e uma psicrfila imvel (A. salmonicida). Nos finais dos anos sessenta,
Schubert (1969) props a classificao do gnero em trs espcies com oito
subespcies: duas espcies mveis, A. hydrophila com as subespcies A. hydrophila
subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp. anaerognes e A. hydrophila subsp.
proteolytica, A. punctata com as subespcies A. punctata subsp. punctata e A. punctata
subsp. caviae; e uma espcie imvel, A. salmonicida com as subespcies A. salmonicida
subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp. achromogenes e A. salmonicida subsp.
mausocida. Esta proposta foi a publicada na oitava edio do Manual de Bergeys
(Schubert, 1974), sendo este gnero includo na famlia Vibrionacaeae.
Colwell e colaboradores (1986) atravs de estudos moleculares de Aeromonas
baseados na anlise da sequncia do rRNA 5S demonstraram que o gnero Aeromonas
apresentava uma posio filogentica suficientemente distante das famlias
Enterobacteriaceae e Vibrionaceae constituindo uma familia independente, propondo
elevar este gnero categoria de famlia com o nome taxonmico de Aeromonadaceae.
Em 1994 na edio do Manual de Bacteriologia de Bergeys o gnero
Aeromonas segue ainda includo na famlia Vibrionaceae (Holt et al., 1994). Martnez-
Murcia e colaboradores em 1992a realizam o primeiro estudo filogentico baseado na
anlise do rRNA 16S em Aeromonas. Neste estudo foi ratificada a proposta de elevar o
gnero Aeromonas categoria de famlia, demonstrando que forma uma linha diferente
dento da sub classe gamma-Proteobacteria. Esta proposta foi aceite, e assim aparece na
nova edio do Manual de Bergeys 2001, mantendo-se assim na nova edio deste
manual (Martin-Carnahan e Joseph, 2006). No mesmo trabalho foi tambm ratificado
que o gnero Aeromonas engloba um grupo de espcies muito parecidas, com uma
similitude de sequncia que varia de 97,8% a 100%, e os resultados deste estudo esto
em concordncia com os obtidos com a hibridao DNA-DNA. Este gnero encontra-se
em constante evoluo no somente pela descrio de novas espcies mas tambm pela
sua reclassificao (Martnez- Murcia et al., 1992b;Yez et al., 2003; Miana-Galbis
et al., 2004, 2007; Huys et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2008).
Introduo


Recentemente foi proposta a espcie Aeromonas sharmana, com base num
nico isolado obtido de guas termais, GPTSA-6T, (Saha e Chakrabarti, 2006), no
entanto Martnez-Murcia e colaboradores em 2007, esta espcie no foi considerada
como um membro do gnero Aeromonas. Em 2005 eram 18 as espcies descritas
(Martin- Carnahan e Joseph, 2005; Saavedra et al., 2006) mas em 2009 esse valor
aumentou para 22 (Quadro 1), com a descrio de uma nova espcie, Aeromonas
fluvialis (Alperi et al., 2009).

Quadro 1. Espcies actualmente aceitem no gnero Aeromonas

Espcie Estirpe tipo Origem
Autores

A. hydrophila ATCC 7966
T
Leite Stainer, 1943
A. bestiarum ATCC 51108
T
Peixe doente Ali et al., 1996
A. salmonicida NCIMB 1102
T
Salmo Griffin et al., 1953
A. caviae ATCC 15468
T
Cobaia Schubert e Hegazi, 1988
A. media ATCC 33907
T
gua de piscicultura Allen et al., 1983
A. eucrenophila NCIMB 74
T
Peixe da gua doce Schubert e Hegazi, 1988
A. sobria NCIMB 12065
T
Peixe Popoff et al., 1981
A. veronii ATCC 35624
T
Muco Hickman-Brenner et al., 1987
A. jandaei ATCC 49568
T
Fezes humanas Carnahan et al., 1991a
A. schubertii ATCC 43700
T
Abcesso cutneo Hickman-Brenner et al., 1988
A. trota ATCC 49657
T
Fezes humanas Carnahan et al., 1991b
A. allosaccharophila CECT 4199
T
Enguia Martnez-Murcia et al., 1992b
A. encheleia CECT 4342
T
Enguia Esteve et al., 1995b
A. popoffii LMG 17541
T
gua potvel Huys et al., 1997
A. culicicola MTC 3249
T
Mosquito Pidiyar et al., 2002
A. simiae IBS S6874
T
Fezes de macaco Harf-Monteil et al., 2004
A.molluscorum CECT 5864 Molusco bivalve Miana-Galagis et al., 2004
A.bivalvium

CECT 7113 Bivalve Miana-Galagis et al., 2007

A. aquariorium MDC47
T/
DSM 18362
T
Aqurio Martnez-Murcia et al., 2008
A. tecta CETC7082
T
MDC91
T
Isolado clnico e ambiental Demarta et al., 2008
A. piscicola
S1.2
T
Peixe
Hidalgo et al., 2008

A. fluvialis
CECT 7401=LMG 24681 gua (Rio)
Alperi et al., 2009

Introduo


No sentido da resoluo de algumas ambiguidades, obtidas mediante a
sequnciao de genes 16S rRNA, tm sido pesquisados outros marcadores
filogenticos que correspondem s sequncias dos genes denominados,
Housekeeping, aqueles que esto envolvidos em manter as suas funes vitais na
clula. Estudos baseados na sequenciao do gene gyrB e do gene rpoD (Yez et al.,
2003, Soler et al., 2004; Martnez-Murcia et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2007)
revelaram uma boa correlao com as metodologias anteriormente utilizadas,
nomeadamente a hibridao DNA-DNA e a sequenciao do gene 16S rRNA, assim
mostrou-se capaz de solucionar, com maior clareza certas ambiguidades existentes
(Martnez- Murcia et al., 2005).

1.2.3. Mtodos de Identificao
1.2.3.1. Mtodos microbiolgicos convencionais
O gnero Aeromonas em geral de difcil identificao laboratorial. A elevada
variabilidade de caractersticas bioqumicas dos elementos deste gnero faz com que as
tcnicas habitualmente usadas baseadas no fenotpo por vezes aportam resultados
ambguos e muitas vezes incorrectos. Os mtodos convencionais de identificao
baseiam-se nas propriedades fentipicas dos microrganismos, isto , um conjunto de
marcadores fentipicos como fisiolgicos, bioqumicos, estruturais, e todas as
caractersticas que porpocionam o aspecto global do individuo (Roman-Aravena et al.,
2008). A falta de concordncia entre os mtodos de identificao bioqumica e gentica,
especialmente nos isolados de origem ambiental, baseiam-se no facto dos esquemas de
identificao bioqumica utilizados no distinguirem as espcies de Aeromonas
existentes (rmen et al., 2005), como tambm a descoberta de novas espcies que no
esto contempladas nos esquemas de identificao frequentemente utilizados (Abbout et
al., 2003).
As bases de dados para a identificao de Gram negativo aerbios ou
anaerbios facultativos at pouco tempo incluam apenas A. hydrophila ou Aeromonas
spp.. Actualmente existem pelo menos 14 sistemas comerciais que contm na sua base
de dados diversas espcies pertencentes a este gnero, mas a sua utilidade em
Introduo


determinados casos duvidosa (Joseph e Carnahan, 1994; Vivas et al., 2000). Um
problema geralmente associado a elementos deste gnero a confuso com algumas das
espcies do gnero Vibrio (Vivas et al., 2000; Park et al., 2003). Estudos de Abbott e
seus colaboradores (1998) referem um caso concreto da identificao de duas estirpes
de Aeromonas, identificadas pelo sistema de biotipificao numerica (API 20NE), como
membros do gnero Vibrio.
Deste modo, o uso sistemas de biotipificao numrica no diagnstico no so
aconselhveis quando se pretende uma identificao precisa (Valera e Esteve, 2002). O
de metodologias capazes de identificar todas as espcies de Aeromonas crucial. A sub
identificao dos elementos deste gnero poder gerar consequncias ao nvel da sade
pblica. Por este motivo desde a dcada de oitenta tem vindo a ser desenvolvidas
diferentes tcnicas baseadas na anlise de DNA que se tm mostrado mais estveis e
fiveis.
1.2.3.2. Mtodos genticos

A poro do gentipo que se expressa em cada estirpe portanto o fentipo,
estas propriedades so muito variveis pela capacidade de adaptao das bactrias a
qualquer ecossistema, e por outro lado apresentam uma interpretao subjectiva e
complicada. A aplicao de mtodos genticos abre novas perspectivas aos
microbiologistas para a identificao ou tipificao de alguns gneros fastidiosos na
determinao da taxonomia e filgenia (Castro-Escarpulli et al., 2003). O
desenvolvimento das tcnicas de biologia molecular nos ltimos anos tornou possvel a
identificao de espcies bacterianas directamente atravs da anlise gentica do seu
DNA (mtodos genotpicos). O DNA bacteriano contm toda a informao biolgica da
clula, quer se expresse ou no e de uma forma geral o gentipo mais estvel durante a
sua evoluo. Apesar da introduo de novos mtodos de identificao de espcies, no
somente para o gnero Aeromonas, mas tambm para outros, o mtodo DNA-DNA
hibridao considerado por alguns autores como a gold standard para a identificao
taxonmica de novas espcies (Stackebrandt et al., 2006; Janda e Abbott, 2007).

Introduo


1.2.3.3. Sequnciao do gene que codifica para o 16S rRNA

A sequncia nucleotdica do genoma bacteriano a impresso digital de cada
bactria. O estudo da sequncia do 16S rRNA um dos mtodos mais discriminativos e
precisos para determinar o nvel de relao filogentica entre bactrias (Woese, 1987).
A sua utilizao permitiu a identificao de quase todas as espcies no entanto quando
se pretende estudar relaes filogenticas prximas, como o caso de espcies de um
mesmo gnero, esta tcnica apresenta algumas limitaes (Martnez-Murcia et al., 1992;
Martnez-Murcia et al., 1999; Janda e Abbott, 2007), visto ser uma molcula
extremamente conservada, verificando-se frequentemente situaes em que espcies
distintas apresentam poucas diferenas nucleotdicas (Janda e Abbott, 2007).
A anlise do gene 16sRNA (com aproximadamente 1500pb) pode ser
potencialmente aplicada a todas as bactrias. Este gene, o 16S rRNA, que codifica a
unidade de rRNA altamente conservado, mas ao mesmo tempo possui uma zona
hipervariavel com cerca de 138 pb na regio 5 terminal que permite a identificao da
maior parte das espcies (Mendes et al., 2003), sendo normalmente usado para a
classificao taxonmica, e considerado um bom marcador molecular (Woese, 1990;
Amann et al., 1995).
Ainda que, a maioria destes resultados estejam em concordncia com os
obtidos com a tcnica de hibridao DNA-DNA, tambm se encontram sequncias de
16S rRNA idnticas para espcies que apresentam grupos de hibridao distintos, como
o caso de A. salmonicida e A. bestiarum que representando duas espcies distintas
deste gnero ao nvel da sequncia de rDNA 16S no se verifica nenhuma diferena
nucleotidica (Martnez-Murcia et al., 2005). Por esta razo foi necessrio pesquisar
outros mtodos eficazes para a identificao das estirpes deste gnero.

1.2.3.4. Sequenciao de genes Housekeeping
A sequenciao um mtodo simples e preciso que permite a identificao da
maioria das espcies bacterianas, sendo til quando impossvel obter um resultado
fidedigno pelos mtodos fentipicos convencionais usados habitualmente pelos
Introduo


laboratrios de rotina. Nos ltimos anos tm aparecido cada vez mais estudos
taxonmicos e filogenticos baseados em genes Housekeeping, genes que codificam
para protenas de funo vital na clula. A utilizao de genes alternativos para a
identificao molecular de certas espcies aumenta ainda as potencialidades da
sequenciao. Deste modo estes genes apresentam um conjunto de qualidades que
permitem a sua utilizao em filogenia.
Estas vantagens de forma simplificada e objectiva so defenidas em trs pontos
principais:
i) So protenas com uma funo vital na clula logo representam uma funo
ancestral e encontram-se em todas as clulas;
ii ) So protenas sobre as quais j existem estudos cientficos que estudaram a
correlao com os estudos de hibridao DNA-DNA e as concluses
filogenticas das duas tcnicas so semelhantes o que demonstra que na
maioria dos casos no existe transferncia horizontal destas protenas ou que
caso exista baixa;

iii ) O facto de se tratar de uma sequncia que codifica para uma protena a
percentagem de substituio nucleotdica superior encontrada no rDNA
16S, o que se torna til para o esclarecimento de relaes filogenticas mais
prximas.

A utilizao de genes alternativos para a identificao molecular de certas
espcies aumenta ainda as potencialidades da sequenciao. Diferentes genes tm vindo
a ser utilizados para a classificao de bactrias ao nvel intra-genrico tais como os
genes recA (Kullen et al., 1997), groEL (Haake et al., 1997), hps 75 (Pai et al., 1997),
tuf (Chavagnat et al., 2002), rpoD (Yamamoto et al., 2000; e gyrB (Kasai et al., 2000;
Yez et al., 2003; Soler et al., 2004).
Actualmente existem estudos a demonstrar que estes genes esclarecem de
forma mais objectiva as relaes filogenticas interespcies no gnero Aeromonas
(Yez, 2003; Soler et al., 2004; Kupfer et al., 2006) e caracterizao de novas espcies
Introduo


(Pidiyar et al., 2002). O estudo das sequncias nucleotdicas e de aminocidos destes
genes tem permitido esclarecer os pontos controversos das rvores filogenticas
elaboradas com base na sequenciao dos genes ribossmicos (Feng et al., 1997;
Doolitle, 1999).

O gene gyrB e rpoD parecem bons indicadores da evoluo do genoma, pelo que
podem ser utilizados como marcadores filogenticos para a sistemtica bacteriana (Kim
et al., 1999; Watanabe et al., 2001). Apenas existe uma cpia do gene e no sofre
transferncia horinzontal (Sawada et al., 1999). Estes dois genes housekeeping tm sido
os mais utilizados como uma ferramenta filogentica, dada a sua aplicao j
anteriormente descrita, no gnero Aeromonas (Soler et al., 2004).
1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA
A DNA girase pertence famlia das topoisomerases de tipo II. As DNA
topoisomerases intervm em processos biolgicos to essenciais como a replicao,
transcrio e recombinao das molculas de DNA, atravs do controlo que exercem
sobre o grau de superenrolamento da molcula de DNA numa reaco que no requer
energia (Huang, 1996). Estas enzimas classificam-se atendendo sua funo em tipo I,
tipo II, tipo III ou Tipo IV. A primeira toipomerase do tipo II a ser descoberta foi a
DNA girase em Escherichia coli que constituda por duas subunidades, GyrA e GyrB
de 97 kDa e 90 kDa respectivamente (Figura 2), e que se integram numa holoenzima de
estequiometria A
2
B
2
(Cove et al., 1997).
A sua funcionalidade est dividida pelos seus domnios. Esta diviso apoiada
por anlises bioqumicas e pela determinao cristalogrfica da estrutura da protena
(Wigley, 1995). A protena GyrB apresenta o extremo N-terminal, onde ocorre a
hidrlise do ATP (domnio ATPase), necessria ao superenrolamento negativo da
molcula de DNA circular. Este processo endoenergtico, desfavorecido
termodinamicamente, pelo que a energia necessria obtm-se a partir da hidrlise de
uma molcula de ATP. O extremo C-terminal, zona de unio protena A (GyrA), a
zona da molcula de enrolamento do DNA (Cabral et al., 1997). O extremo N-terminal
Introduo


da protena GyrA contm o centro activo para a tirosina (Tyr 122) necessria para o
reconhecimento do DNA, aqui que ocorre a ligao covalente protena-DNA e se
ligam tambm as quinolonas. O extremo C-terminal a zona de enrolamento do DNA
(Huang, 1996; Cove et al., 1997).

Figura 2- Estrutura da DNA girase. Com indicao das subunidades funcionais, gyrA (A) e gyrB (B)
Apenas existe uma variao de 40 resduos entre as classes de proteobacterias
gamma e psilon, a sub unidade A da DNA girase tem 850 aminocidos em todas as
espcies bacterianas estudadas. A classe epsilon, aparece separada do resto dos grupos
de proteobacterias devido insero dos 40 resduos, sendo que esta diferena de
aminocidos se localiza no extremo C-terminal da protena. A subunidade B da DNA
girase em bactrias pode apresentar dois tamanhos diferentes, num grupo representado
pela E. coli, esta enzima tem aproximadamente 800 aminocidos e todas as
proteobacterias conhecidas pertencem a este grupo.
O outro grupo, representado pelo Bacillus subtilis apresenta cerca de 650
aminocidos. Os 150 aminocidos extra das girases do grupo de E. coli formam um
bloco no domnio II da protena. A ausncia desta regio nas DNA girases de B. subtilis
sugere que este fragmento no necessrio para a reaco enzimtica da
topoisomerizao. Deste modo, a insero destes 150 aminocidos (450 nucletidos) a
que permite separar o grupo de proteobacterias do grupo de Gram positivo. A sequncia
nucleotdica do gene gyrB permitiu estudar as relaes filogenticas de gneros como:
Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999); Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000);
Salmonella, Shigella e Escherichia (Fukshima et al., 2002) e Aeromonas (Yanez et al.,
2003). Todos os trabalhos realizados demonstram a fiabilidade e versatilidade da
Introduo


utilizao deste gene marcador molecular. Yanez e colaboradores em 2003
demonstraram que a sequenciao deste gene em estudos moleculares de elementos do
gnero Aeromonas era coerente com as outras tcnicas antes utilizadas.

1.2.3.4.2. Gene rpoD
O gene rpoD uma ferramenta til para o reconhecimento de novas linhas
filogenticas no gnero Aeromonas (Alperi et al., 2008). A RNA polimerase a enzima
responsvel pela sntese de RNA dirigida pelo DNA.Todas as clulas tm RNA
polimerase e nas bactrias uma variedade destas enzimas sintetiza todos os RNAs
celulares, com excepo dos primers utilizados na replicao do DNA. A RNA
polimerase de E. coli uma protena de 480 KD composta por quatro subunidades
2
`; duas subunidades (encoded by the rpoA gene), uma subunidade (rpoB), uma
subunidade `(rpoC) e ainda a subunidade (Kupfer et al., 2006). A subunidade
tambm chamada de factor separa-se do ncleo da enzima aps a iniciao da sntese
do DNA e continua isoladamente o processo de polimerizao (Ishihama, 2000;
Borukhov e Nudler, 2003). Nas bactrias expressam-se diferentes tipos de factores
70
.
O factor
70
responsvel por 99% da transcrio celular, codificado pelo gene rpoD
(Borukhov e Nudler, 2003). Dependendo das necessidades da clula e das condies do
meio so utilizados outros factores de transcrio. A sequncia nucleotdica do rpoD foi
utilizada no estudo taxonmico dos gneros Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999);
Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000) e Aeromonas (Soler et al., 2004).

1.3. Agentes antimicrobianos
____________________________________________________________________________________
Cada grupo de antibiticos tem um alvo especfico na clula bacteriana
(Figura 3). Dependendo da zona de actuao, e de algumas caractersticas dos agentes
antimicrobianos como a estrutura qumica e o peso molecular a sua actividade ser
varivel, devendo encarar-se cada antibitico em particular e no como um todo.
Segundo Sousa (2002) para que as molculas de antibiticos possam exercer uma
eficiente actividade, sem que existam problemas de toxicidade para com os animais
Introduo


(includo o Homem), so investigadas as diferenas entre a clula bacteriana
(procariotica) e as clulas dos animais (eucariota).

Figura 3 Representao dos locais de actuao dos diferentes grupos de antibiticos. Adaptado de
Sousa, 2006.
Um agente antibacteriano poder eventualmente no actuar sobre um
determinado agente patognico por causas intrnsecas (por ex. elevado peso molecular
para atravessar as membranas celulares), nestas situaes esse agente patognico
apresenta resistncia inata a esse antibitico no fazendo parte do seu espectro de aco.
Apesar disso, sabe-se que molculas inicialmente activas contra determinadas espcies
bacterianas hoje j no o so (Lipsitch e Levin, 1997). A resistncia bacteriana aos
antibiticos vai evoluindo dada a presso selectiva exercida pela antibioterapia, gerando
mutaes espontneas ou a transmisso horizontal de genes de resistncia por
transferncia de outras estirpes. Pois o fluxo de genes de resistncia entre o cromossoma
e elementos genticos mveis, como plasmdeos, transposes ou integres, leva a que a
ecologia gentica de resistncia se propague facilmente (Kummerer, 2004).

1.3.1. Principais mecanismos de resistncia
A resistncia aos antibiticos um problema global, com implicaes em
sade pblica. O uso generalizado de antibiticos permitiu s bactrias sobreviver e
multiplicar-se sob a presso dos antibiticos devido sua flexibilidade gentica (Cohen,
1997; Kapil, 2005; Levy, 2005). A resistncia aos antibiticos pode ser intrnseca ou
Introduo


adquirida (Courvalin, 1996; Sousa, 2001; Kapil, 2005; Sousa, 2006). Os mecanismos de
resistncia que se podem observar esto relacionados com a forma de aco dos
antibiticos, existindo quatro mecanismos principais (Gilman et al., 1996; Ferreira e
Sousa, 1998; Sousa, 2006). A adopo de determinado mecanismo de resistncia por
parte das bactrias est intimamente relacionada com o seu modo de aco e
mecanismos de aquisio de resistncia dos antibiticos. As bactrias por vezes
combinam diferentes mecanismos de resistncia, o que as torna multiresistntes.
Pseudomonas aeruginosa apresenta resistncia aos carbapenemos e poder dever-se
combinao da produo de -lactamases, aumento das bombas de efluxo e alteraes
na parede celular da bactria (Sousa, 2001).
A emergncia da resistncia antimicrobiana pode ser uma ameaa para o
ambiente e sade pblica, maior que o aparecimento de novos agentes patognicos ou o
reaparecimento de antigos. Compreender e reconhecer os problemas da resistncia
antimicrobiana e usar os agentes qumicos apropriadamente da maior importncia para
a preveno da sua propagao (Levy, 1990; Cohen, 1997). As bactrias so melhores
engenheiros genticos que o Homem e vo continuar a escapar ao efeito dos
antibiticos. A melhor soluo usar os antibiticos quando necessrios, evitar a
antibioterapia sem conhecimento do agente patognico em questo e o cumprimento de
regras rgidas com fins profilticos.

1.3.2. Antibiticos antiparietais
Os antibiticos antiparietais so inibidores na fase de sntese do peptidoglicano
(molcula caracterstica da parede celular bacteriana) e actuam nas diferentes fases da
biossntese desta macromolcula. Apenas iremos abordar os antibiticos -lactmicos, e
fosfomicina. Os -lactmicos constituem um grupo muito importante, uma vez que so
amplamente utilizados na clnica, devido sua baixa toxicidade e boa eficcia
teraputica (Essack, 2001; Sousa, 2006). Os restantes compostos englobados neste
grupo apenas manifestam aco sobre organismos Gram positivo.

Introduo


1.3.2.1. -lactmicos
Os antibiticos -lactmicos englobam na sua totalidade quatro grupos de
antibiticos distintos, como as penicilinas, as cefalosporinas, os monobactmicos e os
carbapenemos. As penicilinas foram o primeiro grupo de antibiticos a ser
comercializado, a sua descoberta em 1928 por Alexander Fleming revolucionou a
teraputica das doenas infecciosas. Os antibiticos -lactmicos no so homogneos
na sua composio, nem nos seus efeitos. Entre si apresentam um anel -lactmico
constitudo por 3 tomos de carbono e um de nitrognio com radicais substituintes. Este
anel encontra-se fundido com um anel tiazolidina nas penicilinas enquanto nas
cefalosporinas com um anel dihidrotiazina. Relativamente aos monobactmicos apenas
temos o anel -lactmico, nos carbapenemos observa-se a presena de um C a substituir
o S no anel tiazolidina (Sousa, 2006).
Este grupo de antibiticos inibem irreversivelmente as D-D-
carboxitranspeptidases, conhecidas como PBPs (Penicillin-Binding-Proteins),
impedindo assim o establecimento das pontes interpeptdicas entre as cadeias peptdicas
vizinhas. Estes antibiticos s so activos sobre bactrias em crescimento (Essack,
2001; Sousa, 2005; Sousa, 2006). Existem vrias molculas de caractersticas distintas
que foram desenvolvidas para rebater certas limitaes destes compostos, como
reaces alrgicas e elevada resistncia microbiana (carboxipenicilinas,
ureidopenicilinas, aminopenicilinas (Sousa, 2001; Sousa, 2006)). So exemplos deste
grupo a penicilina, a ampicilina, a carbenicilina, a piperacilina e a amoxicilina.
As cefalosporinas actualmente comercializadas podem ser classificadas em
primeira, segunda, terceira e quarta gerao, de acordo com o seu espectro de
actividade. medida que se avana nas diferenas de geraes, o espectro para as
bactrias Gram negativo amplia-se, perdendo-se actividade contra as Gram positivo. A
ceftazidima, a cefotaxima, a cefoxitina e o cefepime so exemplos de Cefalosporinas
(Sousa, 2001, Sousa, 2006). Tm sido desenvolvidos outros -lactmicos no clssicos,
os monobactmicos e os carbapenemos.
Introduo


O aztreonamo a nica molcula actualmente comercializada no grupo dos
monobactmicos. Este antibitico muito activo para bactrias aerbias Gram negativo,
e dotado de grande estabilidade para as -lactamases de largo espectro. Os
carbapenemos dentro dos -lactmicos, so o grupo com maior actividade - antibiticos
de largo espectro que resistem hidrlise de grande parte das -lactamases existentes
(Sousa, 2001; Sousa, 2006). No mercado nacional existem trs molculas a ser
comercializadas (imipenemo, meropenemo e ertapenemo), porm este grupo est
reservado ao uso hospitalar como ltimo recurso para estirpes multiresistentes. O
mecanismo de resistncia mais importante para esta famlia a hidrlise enzimtica por
-lactamases. Estas enzimas plasmdicas ou cromssomicas catalizam a hidrlise do
anel -lactmico (ligao CO-N) inactivando o antibitico (Bonomo, 2003). Em
Pseusomonas aeruginosa a ausncia de porinas justifica a sua resistncia aos
carbapenemos (Essack, 2001; Sousa, 2006).
Actualmente existem centenas de -lactamases descritas. As -lactamases
dependendo da sua especificidade so muitas vezes chamadas penicilases,
cefalosporinases e carbapenemases. Outra forma de classificao em relao ao centro
activo, as serino--lactamases tm a serina no seu centro activo e as metalo-
-lactamases que tm zinco no centro activo.

1.3.3. Inibidores de -lactmicos
Com a finalidade de expandir o espectro destes compostos usual a sua
associao com compostos inibidores de -lactamases. As substncias inibidoras devem
ser estruturalmente semelhantes ao antibitico. O sulbactam, cido clavulnico e o
tazobactam, tm estruturas parecidas com o anel -lactmico que a enzima o hidrolisa
ficando unida, irreversivelmente, no podendo voltar a actuar sobre outras molculas
-lactmicas (Poole, 2004), ao contrrio do que sucede com os antibiticos
convencionais.

Introduo


1.3.4. Antibiticos inibidores da sntese proteica
Os antibiticos inibidores da sntese proteica actuam no complexo ribossomal
70S. Este complexo formado pela associao das subunidades 30S e 50S). A
subunidade 30S composta de rRNA 16S (aproximadamente 1.500 nucletidos) e 21
protena, enquanto a unidade 50S constituida por rRNA 5S (aproximadamente 120
nucletidos), rRNA 23S (aproximadamente 2.900 nucletidos) e por 31 proteinas. As
mitocondrias presentes nas clulas eucariotas, possuem ribossomas do tipo bacteriano
70S, assim podem ser vulnerveis aos efeitos destes antibiticos se estivermos perante
molculas lipfilas (cloranfenicol) que com grande facilidade atravessam as membranas
mitocondriais inibindo a sua sntese proteica. Este grupo de antibiticos inclui os
aminoglicosdeos, as tetraciclinas o cloranfenicol, macrlidos lincosamidas e o cido
fusdico (Sousa, 2006)
1.3.4.1. Aminoglicosdeos
Os antibiticos aminoglicosdeos juntamente com os -lactmicos so
considerados os principais agentes na terapia de infeces severas provocadas por
bacilos Gram negativo e cocos Gram positivo (Sousa, 2006). Os elementos deste grupo
so bastante heterogneos quanto sua composio qumica, propriedades
antibacterianas e propriedades farmacolgicas. A gentamicina, a canamicina, a
neomicina, a estreptomicina a tobramicina, a amicacina, e a netilmicina so alguns dos
elementos deste grupo. Estes antibiticos apresentam um anel aminoclitol, derivado do
inositol, unido a acares aminados, atravs de ligaes glicosdicas. Tm marcada
actividade contra bacilos Gram negativo aerbios (Kotra et al., 2000).
As estirpes produtoras de aminoglicosdeos desenvolveram um mecanismo de
auto-defesa, a fim de escaparem ao suicdio produzem metilases para o rRNA 16S,
impedindo a aco dos antibiticos na subunidade 30S. Recentemente no Japo foram
detectados plasmdeos codificadores destas metilases (gene armA e rmtB). Estes genes
tm-se disseminado rapidamente para outras espcies representando j um mecanismo
de relevncia neste grupo (Yamane et al., 2004; Gonzlez-Zorn et al., 2005).
Introduo


1.3.4.2. Tetraciclinas
As tetraciclinas constituem uma famlia de antibiticos contendo um ncleo
hidroxinaftaceno, formado por quatro anis benznicos fundidos. A tetraciclina o
prottipo do grupo e os restantes elementos possuem caractersticas bastante
semelhantes a esta. Estes antibiticos inibem a sntese proteica, actuando ao nvel da
subunidade 30S dos ribossomas. Inibem a ligao dos aminoacil- tRNA(s) aos
ribossomas, impedindo estericamente a ligao codo anticodo ente o tRNA e o local
A dos ribossomas (Chopra et al., 2001). As bombas de efluxo so o principal
mecanismo de resistncia bacteriana aos antibiticos desta famlia. O sistema de efluxo
especificado por diferentes determinantes genticos, os genes tet, que codificam as
protenas TET (Orth et al., 2000).
Estes antibiticos so considerados de largo espectro, activos contra bacilos
Gram positivo e Gram negativo, aerbios e anaerbios (Chopra e Roberts, 2002), no
entanto tem se vindo a observar uma elevada prevalncia de resistncias s tetraciclinas.

1.3.4.3. Cloranfenicol
Trata-se de um antibitico de largo espectro abrangendo bactrias Gram
positivo e Gram negativo, inibidor da sntese proteica, bacteriosttico, actuando na
subunidade 50S, impedindo a actuao da transpeptidase. O cloranfenicol liga-se
subunidade 50S do ribossoma, impedindo portanto a transpeptidase durante a fase de
alongamento (Sousa, 2006). Dada a sua lipofilia atravessa a dupla membrana
mitocondrial, inibe a sntese proteica em mitocondrias na medula ssea provocando
alteraes hemticas graves (aplasia medular) (Sousa, 2006). O mecanismo de
resistncia mais comum a inactivao enzimtica do cloranfenicol por
acetiltransferases bacterianas. O gene cat codifica as O-acetiltransferases bacterianas
que promovem a acetilao da molcula de cloranfenicol em C3 originando derivados
acetoxi, destitudos de propriedades antibiticas (Yoo et al., 2003). Estes genes podem
ter localizao plasmdica ou cromossmica.

Introduo


1.3.4.4. Macrlidos
Os macrlidos tm um espectro bacteriano alargado, sendo activos contra
bactrias Gram positivo. Englobam compostos como a eritromicina, e so inibidores da
sntese proteica. Bactrias Gram negativo so intrinsecamente resistentes eritromicina
com excepo de Neisseria spp., Haemophilus spp., Legionella spp., Campylobacter
spp., Mycoplasma spp., Chlamydia spp. (Sousa, 2006).
Este grupo apresentam uma apetncia reversvel para as subunidades 50S dos
ribossomas e bloqueiam o local P, prejudicando a transpetidao e/ou a translocao,
exercendo deste modo uma aco bacteriosttica. Estas molculas anfilticas
moderadamente lipfilas so incompatveis com os canais de porina (via hidrfila) e
com a superfcie predominantemente hidrfila de muitas bactrias Gram negativo. A
difuso atravs das regies fosfolipdicas da membrana externa assim a principal via
de entrada destes compostos.
A mais frequente forma de resistncia deste grupo a resistncia cruzada aos
Macrlidos-Lincosamidas-Sptreptogramina B (resistncia MLS
B
). Esta resistncia deve-
se N.N-dimetilao da adenina na posio 2058 no rRNA 23S, mediada por uma
metilase, produto do gene erm (Schwarz et al., 2002). Estes genes podem ter localizao
cromossmica ou plasmdica e podem se exprimir constitutivamente ou por induo. As
bombas de efluxo, geradas por produtos do gene mef, tm tambm importncia na
resistncia bacteriana dos macrlidos no entanto, este mecanismo no eficaz em todas
as molculas do grupo (Wierzbowski et al., 2005).

1.3.5. Antibiticos inibidores da sntese dos cidos nucleicos
Fazem parte deste grupo de antibiticos a rifampicina, o metronizadol e as
quinolonas. Actuam sobre a sntese dos cidos nucleicos provocando a morte celular
(Sousa et al., 1998).

Introduo


1.3.5.1.Quinolonas
As quinolonas so antibiticos de sntese, derivados do cido naladxico sendo
que este foi a primeira quinolona a ser utilizada em 1962 no tratamento da cistite
causada por bactrias Gram negativo (Oliphant e Green 2002; Sousa, 2006).
Actualmente esta famlia de antimicrobianos tem sofrido grande evoluo, pelo que
classificada, tal como as cefalosporinas, em quatro geraes com base na sua actividade
antimicrobiana. Ao longo das geraes estes antibiticos vo aumentando
sucessivamente o seu espectro de aco. As quinolonas so inibidores directos da
sntese do DNA e actuam mediante a inibio da DNA girase (Topoisomerase II)
codificada pelos genes gyrA e gyrB (principal alvo nas bactrias Gram negativo) e a
toipomerase IV codificada pelos genes parC e parE. Ao actuarem contra as
topoisomerases, as quinolonas interferem com o enrolamento do DNA, impedindo a
replicao e a transcrio do DNA. Assim sendo, a forma de resistncia mais comum
a mutao das enzimas alvo (Topoisomerase II e IV). So exemplos desta famlia de
antibiticos o cido naladxico, a ciprofloxacina, a norfloxacina, a ofloxacina e a
levofloxacina.

1.3.6. Antibiticos antimetabolitos
1.3.6.1. Sulfonamidas / Trimetopim
O cido para-aminobenzoico (PABA) um factor indispensvel para o
crescimento celular, pois sem ele no h sntese dos cidos nucleicos. Todas as
molculas que inibam esta cadeia metablica, como as sulfamidas, sulfonas, PAS e
Trimethopim so conhecidas como anti-metabolitos ou como inibidores da sntese dos
cidos nucleicos. As sulfamidas, PAS e sulfonas competem com o PABA impedindo a
sua adio pteridina, bloqueando assim a sntese de cido dihidropteroico. O enzima
dihidropteroato sintetase tem mais afinidade para as sulfonamidas do que para o se
substrato natural (PABA). Trimetopim inibe competitivamente a dihidro-folato
redutase, o enzima que reduz dihidrofolato a tetrahidrofolato (tambm conhecido como
co-factor folato, indispensvel sntese de timidina, purinas e N-formilmetionina).
Introduo


Trimetopim, um anti-metabolito, siner-geticamente associado a sulfametoxazol,
largamente utilizado na teraputica. As sulfamidas inibem portanto a sntese de DNA,
RNA e sntese proteica.Tm efeito bacteriosttico

1.3.7. Antibioresistncia no gnero Aeromonas
O aparecimento de resistncias uma estratgia dos procariotas prpria da sua
evoluo natural, ocorre na natureza, mas ns temos acelerado este curso natural com
a sua sobre-presso selectiva que torna mais rpido o aparecimento de uma grande
variedade de respostas (Levy, 2005). A transferncia da resistncia ocorre entre
bactrias patognicas e comensais, mas tambm nas presentes no solo, gua, esgotos,
estrume, efluentes e plantas.
A emergncia de isolados clnicos e isolados ambientais resistentes a
antibiticos constitui um srio problema a nvel mundial, principalmente a ocorrncia
de bactrias resistentes a antibiticos provenientes de ambientes naturais, dado que estes
microrganismos no so expostos directamente aos antibiticos (Blasco et al., 2008).
Considerando as crescentes evidncias de que a resistncia clnica est intimamente
associada ambiental (Prabhul et al., 2007; Abriouel et al., 2008), a presena de
resistncia a diferentes grupos de antibiticos em microrganismos no patognicos,
isolados de ambientes aparentemente incuos como o caso das guas de consumo,
um procedimento promissor e emergente, relativamente disseminao dos genes
responsveis por este tipo de resistncia, s quais a investigao deve responder (Sayah
et al., 2005).
No mbito de determinar o perfil de susceptibilidade aos agentes
antimicrobianos comercializados actualmente, vrios estudos tm sido efectuados com
isolados de Aeromonas. Apesar disso, a maioria dos trabalhos que estudam a
sensibilidade in vitro a antimicrobianos incide apenas sobre as espcies fenotpicas
A. hydrophila, A. caviae e A. sobria, porque a identificao habitual das estirpes
realizada mediante testes bioqumicos, que segundo o anteriormente descrito, no
Introduo


identificam com exactido os elementos deste gnero ao nvel de espcie. As estirpes de
Aeromonas hydrophila isoladas de ambientes aquticos no Bengladehs por McNicol e
colaboradores em 1980 revelaram sensibilidade gentamicina, canamicina e cido
naladxico, contudo apresentaram um fntipo de resistncia mltiplo estreptomicina e
tetraciclina.
Num trabalho realizado por Kampfer e colaboradores (1999) testou a
sensibilidade de 217 estirpes, representativas das 14 espcies descritas at aquele
momento, a 69 agentes antimicrobianos. Estes autores verificaram que no existiam
diferenas significativas entre as espcies. No entanto, o trabalho de Overman e Janda
(1999) em que foi testado o efeito de 18 antibiticos em 56 estirpes, compara a
susceptibilidade de estirpes pertencentes s espcies: A. jandaei, A. schubertii, A. trota e
A. veronii, tendo verificado que A. jandaei era a espcie que apresentava maior nvel de
resistncia aos antibiticos testados e A. trota seria a espcie mais susceptvel.
De uma forma geral admite-se que os indivduos deste gnero so resistentes
penicilina, ampicilina e carbenicilina (-lactmicos - penicilinas). Em vrios trabalhos
referido que estas estirpes so intrinsecamente resistentes ampicilina de tal forma
que, para o seu isolamento foi generalizada a adio deste antibitico ao meio de cultivo
(Ceylana et al., 2003; Vila et al., 2003; Vivekanandhana et al., 2005). Estudos
descrevem que 100% dos isolados apresentam resistncia ampicilina (Vila et al.,
2002).
Contudo, outros estudos tm vindo a descrever estirpes com sensibilidade a
este antibitico (Goi-Urriza et al., 2000a; Saavedra et al., 2004). Num trabalho de
Saavedra e seus colaboradores (2004), realizado com estirpes de Aeromonas isoladas de
trutas de aquacultura, concluiu-se que 35% das estirpes testadas apresentaram
susceptibilidade ampicilina, referindo que o facto de se considerar estas estirpes
intrinsecamente resistentes ampicilina foi baseado em estirpes clnicas, nas estirpes
ambientais, em que a presso selectiva significativamente diferente, os resultados
podem ser diferentes.
Introduo


Relativamente ao perfil de susceptibilidade em estirpes de origem alimentar
existem tambm diferentes estudos (Radu et al., 2003; Vivekanandhan et al., 2005; Pal
et al., 2006; Akinbowale et al., 2007). Em 2006, Pal e colaboradores verificaram que
todas as estirpes de Aeromonas spp.de origem alimentar (alfaces), eram sensveis
cefotaxima, ceftazidima, imipenemo, amicacina, gentamicina, tobramicina,
ciprofloxacina, cloranfenicol e trimetropim- sulfametoxazol. No entanto h estudos em
que para o trimetropim- sulfametoxazol os valores de resistncia variam entre os 18,8%
em Aeromonas isoladas de trutas e os 100% em estirpes obtidas de tilapia e pacu
(Belm-Costa e Cyrino, 2006; Akinbowale et al., 2007)
No tratamento de infeces por Aeromonas, aconselha-se, como primeira
escolha, as fluoroquinolonas, e como alternativa o trimetropim-sulfametoxazole,
aminoglicosdeos, carbapenemos, cefalosporinas de segunda e terceira gerao, e as
tetraciclinas (Overman e Janda, 1999,Vila et al., 2003; Otaviani et al., 2006).
Diferenas no perfil de susceptibilidade a antibiticos em estirpes de origem
ambiental esto associadas a zonas de elevado impacto humano (Ko et al., 1996; Goi-
Urriza et al., 2000a). Assim, podemos inferir pelos diferentes trabalhos que o perfil de
susceptibilidade para este gnero pode ser bastante diversificado e continua por
clarificar.

2. OBJECTIVOS
____________________________________________________________
Objectivos

Este trabalho tem como objectivo avaliar a presena, as espcies e a incidncia
de membros do gnero Aeromonas em guas para consumo humano, tratadas e no
tratadas. Contribuir tambm para aumentar o conhecimento sobre a ecologa deste
grupo de microorganismos e no futuro poder contribuir para evitar processos
infecciosos em humanos e em animais.
Para a concretizao deste estudo estabeleceram-se objectivos especficos:
Obter de uma coleco de estirpes bacterianas do gnero Aeromonas;
Determinar o perfil de susceptibilidade a diferentes grupos de
antibiticos dos isolados de Aeromonas;
Caracterizar, os isolados obtidos, por mtodos genticos e identific-los
filogeneticamente, recorrendo anlise de genes housekeeping. Estes
mtodos sero usados para uma identificao inequvoca especie.

Pretende-se, assim, com os resultados deste trabalho, alertar para a presena de
resistncia a diferentes grupos de antibiticos em microrganismos no patognicos,
isolados de ambientes aparentemente incuos como o caso das guas de consumo, que
no s preocupante, como coloca questes importantes, relativamente disseminao
dos genes responsveis por este tipo de resistncia, s quais a investigao deve
responder.

3. MATERIAL E MTODOS
___________________________________________________________________________________

Material e Mtodos

3.1. Origem das amostras
____________________________________________________________________________________
Neste estudo foram analisadas amostras de guas no tratadas, provenientes de
fontes, poos e nascentes, localizadas em dois Concelhos do Distrito de Vila Real de
acordo com a tabela 1.
Tabela 1 - Locais de amostragem e nmero de amostras
Concelho Localizao N de Amostras
Vila Real Agarz 3
Vila Real Constantim 2
Vila Real Escariz 1
Vila Real Estao 1
Vila Real Fonteita 2
Vila Real Guies 3
Vila Real Nascente do Hospital 1
Vila Real Nascente do Maro 1
Vila Real S. Mamede 1
Vila Real S. Cibro 2
Vila Real Lordelo 3
Vila Real Parada de Cunhos 3
Vila Real F. Piscinas 1
Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar 1
Vila Pouca de Aguiar Capelos 1
Vila Pouca de Aguiar Soutelo de Aguiar 1
Vila Pouca de Aguiar Cerdeira de Jales 1
Vila Pouca de Aguiar Vreia de Jales 1
Vila Pouca de Aguiar Campo de Jales 2
Vila Pouca de Aguiar Alfarela de Jales 1
Vila Pouca de Aguiar Jales 2
Total 34

As amostras foram analisadas na Universidade de Trs-os-Montes e Alto
Douro no Departamento de Cincias Veterinrias nos laboratrios de Microbiologia
Alimentar e Microbiologia Mdica. O estudo filogentico ocorreu nas instalaes do
laboratrio Molecular Diagnostics Center (MDC) com sede em Orihuela (Alicante
Espanha).

Material e Mtodos

3.1.2. Mtodo de recolha das amostras

As amostras de gua foram recolhidas para frascos de polipropileno estreis e o
tempo mximo decorrido entre a colheita da amostra de gua e a sua anlise
laboratorial. A recolha foi realizada seguindo as regras estabelecidas pela ISO 5667-2
(1991) aprovada como Norma Portuguesa NP EN 25 667-1 (1997), que se reporta
norma europeia EN 25 667 (1993).

3.1.3. Isolamento pela tcnica de filtrao por membrana

O mtodo de isolamento utilizado foi o mtodo de filtrao por membrana
(ISO 9308-1,1990) que permite determinar o nmero de microrganismos presentes na
gua, quando se filtra um determinado volume de amostra de gua atravs de uma
membrana de nitrocelulose com uma porosidade de 0.45m de dimetro (Quadro 2).

Quadro 2- Tcnica de filtrao por membrana
1. De cada amostra de gua, depois de homogeneizada, passar 100 ml, por uma membrana de nitrocelulose
(Gelman) de 0.45m de porosidade;
2. Retirar com a ajuda de uma pina estril a membrana de filtrao, e colocar superfcie do meio de
GSP, (Meio 1- Anexo I);
3. Incubar a 30C, durante 24horas.

Dado este estudo incidir apenas sobre o gnero Aeromonas, o meio de cultura
utilizado foi o G. S. P. (Glutamato Amido Vermelho de Fenol) MERCK 10230 que
segundo especificao da empresa fabricante selectivo e diferencial para
Pseudomonas spp. e Aeromonas spp..
A cultura pura das colnias presuntivas de Aeromonas, colnias amarelas, foi
obtida por expanso clonal, seguida de diversas provas morfofisiolgicas, bioqumicas e
identificao por mtodos fenotpicos e genotipicos.

Material e Mtodos

3. 1. 3. 1. Conservao das estirpes
De colnias isoladas, procedeu-se inoculao da cultura em meio lquido de
B.H.I-Oxoid CM 0225- e foi a incubar a 30 C, durante 24 horas. Foram conservadas
alquotas de B.H.I. com glicerol a 15% a -70 C.

3.2. Caracterizao preliminar dos isolados
____________________________________________________________________________________
3.2.1. Colorao diferencial de GRAM
A colorao de Gram um dos primeiros passos para a caracterizao
morfofisiolgica dos isolados, o gnero Aeromonas so Gram negativo. O procedimento
para a realizao desta colorao encontra-se no quadro 3.
Quadro 3 Colorao pelo mtodo de Gram
1.

Esfregao;
Laminas microscpicas limpas e desengorduradas;
Ansa esterilizada;
Deixa-se arrefecer;

Espalha-se em camada muito fina;
Secar ao ar ou suavemente chama.
2.
Fixao;
Coloca-se a lmina acima da chama, a uma altura que a mo possa suportar o calor;
Passa-se duas a trs vezes a lmina pela chama;
Deixa-se arrefecer
3. Corante inicial Violeta de metilo (1minuto);
4. Mordente- Lugol (30 segundos);
5. Diferenciao- alcool/acetona at se tornar incolor;
6. 2 Lavagem- gua;
7. Corante de contraste- Vermelho neutro (1

a 2 minutos),
8. 3 Lavagem- gua;
9. Secagem- entre duas folhas de papel de filtro;
10. Observao- objectiva de X 100 (com leo de emerso).

Material e Mtodos

3.2.2. Prova da citromo-oxidase

A prova da oxidase utiliza-se na identificao de bactrias aerbias Gram
negativo, apesar de muitas bactrias Gram positivo apresentarem um sistema citocromo
dectetvel.
O sistema de citocromos possui hemoprotenas que contm ferro que
transferem electres ou hidrognio at ao oxignio com a formao de gua. As
bactrias com reaco positiva possuem um sistema citocromo oxidase de transporte de
electres, as negativas no possuem este sistema, embora estas possam ter outros
citocromos.
As reaces lentas ou mesmo negativas esto relacionadas com nveis baixos
de citocromo oxidase. O gnero Aeromonas geralmente oxidase positivo.
Para a realizao desta prova foi preparada uma soluo de tetrametil p-fenileno de
amina. As colnias suspeitas foram inoculadas com umas gotas deste reagente seguindo
a metodologia descrita no quadro 4.

Quadro 4 Prova da Oxidase
1.
Colocar uma tira de papel de filtro sobre uma tampa de uma placa de petri, colocando duas a trs gotas
do reagente oxidase sobre a tira;
2.
Com uma pipeta de Pasteur retira-se uma pequena poro de colnia e coloca-se sobre a tira de papel
de filtro;
3.
Se houver mudana de cor. (Azul prpura junto zona em que se colocou a poro de colnia) a
reaco positiva.

3.2.3. Prova da catalase

A catalase uma enzima hemoproteica que contm ferro, decompe o perxido
de hidrognio (H
2
O
2
) em gua e oxignio. A actividade da catalase manifesta-se na
maior parte das bactrias aerbias, mas apenas em algumas anaerbias. O gnero
Aeromonas catalase positivo. Esta prova realiza-se inoculando uma poro de cultura
da estirpe em estudo em perxido de hidrognio, a metodologia utilizada encontra-se
descrita no quadro 5.
Material e Mtodos

Quadro 5 - Prova da catalase
1. Numa lmina desengordurada e passada previamente ao bico de Busen, colocar uma gota de gua
oxigenada;
2. De um meio sem sangue, recolher um de uma colnia sobre a gota de gua oxigenada;
3. Ao verificar efervescncia diz-se que a reaco positiva, ou seja, revela-se a produo de catalase.

3.3. Identificao das estirpes bacterianas
____________________________________________________________________________________

A identificao dos isolados foi realizada atravs da sequenciao do gene
gyrB que codifica para a subunidade da DNA girase, atravs da metodologia validada
por Yez e colaboradores (2003). Em ocasies que o justifica-se, foi sequenciado o
16S rRNA, gyrA e o rpoD gene que codifica para o factor
70
da RNA polimerase.

3.3.1. Extraco de DNA
Antes de proceder sequenciao dos genes necessrio efectuar a extraco
do DNA a partir de cultura pura. A metodologia seguida est descrita no quadro 6.

Quadro 6 Metodologia de extraco do DNA de estirpes bacterianas
1. Suspender num tubo de 1,5 ml contendo 100 l de TE, uma colnia de cultura recente.
2.

Adicionar 200 l de chelex, previamente preparado na concentrao de 20% (Bio-Rad).
3. Agitar no vortex durante cerca de 1 minuto.
4.
Submeter a mistura a uma sucesso de trs ciclos de choques trmicos, alterando 10 minutos de
aquecimento a 95 C com um perodo de 10 minutos de congelao a -20 C.
5. Agitar novamente o tubo no vortex.
6. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 r.p.m.
7. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e armazenar a -20 C.

Material e Mtodos

3.3.2. Amplificao de DNA por reaco de PCR

Para a amplificao dos genes 16S rRNA, gyrB, rpoD e gyrA utilizaram-se os
oligonucletidos descritos no quadro 7.

Quadro 7 Oligonucletidos utilizados em reaco de PCR
Posio Sequncia (5`--- 3`) Referncia
gyrB 3F 334/354 TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT Yez et al., 2003
gyrB 14R 1464/1444 TTG TCC GGG TTG TAC TCG TC Yez et al., 2003
rpoD 70F 280/302 ACG ACT GAC CCG GTA CGC ATG TA Yamammoto et al., 2000
rpoD 70R 1139/1117 ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT Yamammoto et al., 2000
gyrA MLPA analysis of the genus Aeromonas Martnez-Murcia et al. (MS submitted)
16S 0F 8/27 AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG Martnez-Murcia et al., 1999
16S 15R 1492/1510 GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Martnez-Murcia et al., 1999
Nota: * posio segundo numerao de E. coli (Huang, 1996).

A mistura da PCR foi realizada para um volume final de 50 l, contendo
75mM de Tris HCl (pH 9.0), 2mM de MgCl
2
, 50mM de KCl, 20mM de (NH
4
)
2
SO
4
, 1
l de DNA genmico, 2,5mM de cada dNTP, 10 pmol de cada oligonucletido e 1 U
Taq polimerase (BIOTOOLS).
As condies de amplificao a que se submeteram as misturas, foram
diferentes conforme os genes a amplificar. Para a amplificao dos genes gyrB e rpoD
foram utilizadas as seguintes condies: desnaturao inicial durante 5 minutos
temperatura de 94C, 35 ciclos de amplificao (desnaturao a 94c durante 15
segundos, hibridao a 55C durante 30 segundos e extenso a 72c durante 45
segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extenso final a 72C por
um perodo de 5 minutos.

Para a amplificao do 16S rRNA a mistura foi submetida inicialmente a um
perodo de 5 minutos temperatura de 94 C para a desnaturao, de seguida foi
submetida a 35 ciclos de amplificao (desnaturao a 94 C durante 15 segundos,
hibridao a 55 C durante 30 segundos e extenso a 72 C durante 1 minuto e 30
Material e Mtodos

segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extenso final a 72 C por
um perodo de 5 minutos.
Para amplificao do gene gyrA foram utilizadas a seguintes condies:
desnaturao inicial durante 5 minutos temperatura de 94 C, 35 ciclos de
amplificao (desnaturao a 94 C durante 15 segundos, hibridao a 55 C durante 30
segundos e extenso a 72 C durante 45 segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura
a um ciclo de extenso final a 72 C por um perodo de 5 minutos.

3.3.3. Purificao dos produtos de PCR

A purificao dos produtos de PCR foi realizada com o Kit QIAquick PCR
Purification Kit (Qiagen), seguindo o procedimento aconselhado pelo fabricante, cujos
passos esto indicados no quadro 8.

Quadro 8 Protocolo de purificao dos produtos de PCR
1. Colocar 250 l de Buffer PB num tubo de 1,5 ml e adicionar o produto da PCR (50 l).
2. Colocar a mistura numa coluna QIAquick.
3. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m.
4. Rejeitar o que passa para o tubo colector.
5. Adicionar 750 l de Buffer PE coluna, para lavar.
6. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m.
7. Rejeitar e centrifugar novamente durante 1 minuto a 13000 r.p.m.
8. Colocar a coluna num tubo de 1,5 ml.
9. Adicionar 30 l de H
2
O M.Q. para eluir o DNA.
10. Centrifugar novamente.
11 Guardar a -20 C.

3.3.4. Sequenciao

Os produtos de amplificao purificados foram preparados com o Kit Big
Dye

Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), segundo recomendaes do
fabricante, sendo a reaco de sequenciao preparada para um volume final de 10 l,
Material e Mtodos

adicionando-se 4 l da soluo Premix; 4 l de DNA genmico e 2 l de primer a 2
M. Os oligonucletidos utilizados esto descritos no quadro 10. A mistura foi
submetida a uma sucesso de 25 ciclos. As condies para cada ciclo foram:
desnaturao a 96 C durante 10 segundos, hibridao a 50 C durante 5 segundos e
extenso a 60 C durante 4 minutos.

Quadro 9 Oligonucletidos utilizados nas reaces de sequenciao
Posio Sequncia (5`--- 3`) Referncia
gyrB 3F 334/354* TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT Yez et al., 2003
gyrB 7F 792/812* GGG GTC TAC TCG TTC ACC AA Yez et al., 2003
rpoD 8F 740/757# GT CAA TTC CGC CTG ATG C Soler et al., 2004
rpoD 9R 800/782# ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT Soler et al., 2004
gyrA MLPA analysis of the genus Aeromonas Martnez-Murcia et al. (MS submitted)
16S 0F 8/27 AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG Martnez-Murcia et al., 1999
16S 9R 926/908 CCG TCA ATT CAT TTG AGT TT Martnez-Murcia et al., 1999
16S15R 1492/1510 GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Martnez-Murcia et al., 1999

Nota: * posio segundo numerao de E. coli (Huang, 1996).
# posio segundo numerao de E. coli
posio segundo numerao de E. coli (Stern et al., 1988).

Os produtos da reaco de sequenciao foram precipitados conforme a
metodologia descrita no quadro 10.

Quadro 10 Protocolo de precipitao dos produtos de sequenciao
1. Colocar num tubo de 1,5 ml: 2,5 l de EDTA (125 mM) e 30 l de Etanol a 100%.
2.

Adicionar os 10 l da reaco de sequenciao e misturar por inverso, deixando temperatura
ambiente durante 15 minutos.
3. Centrifugar durante 20 minutos a 14000 r.p.m. temperatura de 4 C.
4. Eliminar a soluo de etanol e EDTA
5. Adicionar 100 l de etanol a 70%.
6. Centrifugar durante 2 minutos a 14000 r.p.m a 4 C e eliminar na totalidade a soluo de etanol.
7. Secar o pellet (10 minutos no Concentrator-Vacufuge Eppendorf).
8. Armazenar o pellet seco a -20 C.

Material e Mtodos

Para a ressuspenso do pellet, adiciona-se 20 l de formamida desionizada e
deixa-se repousar 5 a 10 minutos temperatura ambiente. Centrifuga-se brevemente
durante alguns minutos. Por fim, carrega-se a placa do sequenciador automtico ABI
3100 Avant Genetic Analiser (Applied Biosystems).

3.3.5. Anlise de sequncias e construo de dendogramas

As sequncias nucleotdicas obtidas foram analisadas pelo programa Chromas
lite verso 2.0. O alinhamento foi realizado com o programa Clustal X, verso 1.8
(Tompson et al., 1997). As rvores evolutivas construram-se pelo mtodo de
Neighbour-Joining (Saitou e Nei, 1987) com o programa MEGA Molecular
Evolutionary Genetics Analysis - verso 2.1 (Kumar et al., 2001).

3.4. Caracterizao bioqumica pelo API 20NE
____________________________________________________________________________________
As provas bioqumicas convencionais e o sistema de biotipificao numrico
so mtodos de identificao que se baseiam nas caractersticas fentipicas dos
microrganismos isto , os caracteres fisiolgicos, bioqumicos e estruturais que o
microrganismo apresenta. O sistema de identificao utilizado foi o sistema de
biotipificao nmerico API 20NE, que um sistema padronizado para identificao de
bacilos Gram negativos no enterobacterias e no fastidiosos como Pseudomonas,
Acinectobacter, Vibrio e Aeromonas. Este sistema composto por 8 testes
convencionais, 12 testes de assimilao e uma base de dados. Para a realizao do
sistema da bioMerieux API 20NE foi seguida a metodologia fornecida pelo fabricante,
cujos passos esto indicados no quadro 11.
Quadro 11 Procedimento para a realizao do sistema API 20NE

1. Preparar a cmara de incubao, colocando aproximadamente 5ml de gua destilada nos alvolos para
criar uma atmosfera hmida. Aps retirar a galeria do invlucro hermtico, coloca-la na cmara;

2. Preparao do inculo abrir uma ampola de meio de auxiliar (API 20/NE Mdium).
Material e Mtodos

3.Preparar uma suspenso com opacidade superior a 4 da escala de McFarland. Transferir 1 ml desta
suspenso para o meio auxiliar;

4. Homogeneizar; e distribuir o meio nas galerias enchendo at cpula;
5. Vedar com parafina lquida;
6 Inocular a 30 C durante 48 h;
7. Observar os resultados s 24 e 48h.

3.5. Perfil de Susceptibilidade a agentes antibacterianos
____________________________________________________________________________________

O perfil de resistncia aos agentes antibacterianos foi efectuado pelo mtodo de difuso
em disco em Agar Muller-Hinton seguindo o procedimento do quadro 12. Foram
testados vinte e sete antibiticos (Oxoid) pertencendo a diferentes grupos:

-lactmicos: (i) Penicilinas- Amoxicilina (AML
10
); Amoxicilina / cido Clavulnico
(AMC
30
); Piperacilina (PRL
100
); Piperacilina / Tazobactan (TZP
110
); Ticarcilina (TIC
75
);
Ticarcilina / cido Clavulnico (TIM
85
); (ii) Cefalosporinas - Cefalotina (KF
30
);
Cefoxitina (FOX
30
); Cefoperazona (CFP
30
); Ceftazidime (CAZ
30
); Cefepime (FEP
30
);
Cefotaxime (CTX
30
); Ceftriaxona (CRO
30
); (iii) Monobactmicos- Aztreonamo
(ATM
30
); (iv) Carbapenemos (IMP
10
);
Aminoglicosdeos- Gentamicina (CN
10
;) Canamicina (K
30
); Tobramicina (TOB10);
Amicacina (AK30); Estreptomicina (S)
Quinolonas- Ciprofloxacina (CIP
5
); cido nalidixico (NA)
Macrlidos- Eritromicina (E
15
);
Cloranfenicol (C30);
Tetraciclina (TE
30
);
Sulfamidas- Co trimoxazol (SxT
25
);
Fosfomicina (FOS).
Material e Mtodos

Quadro 12 Protocolo da tcnica de difuso em agar com discos de antibiticos

1. Preparar uma suspenso bacteriana de cada estirpe em estudo a partir de 3 4 colnias em soro fisiolgico
estril. A suspenso deve ter uma turvao equivalente a metade do grau 1 da escala de McFarland;
2. Mergulhar uma zaragatoa na suspenso bacteriana retirando o excesso e semear em placas de agar Mueller-
Hinton;
3. Aplicar os discos dos antibiticos sobre a superfcie do meio de cultura, aps a secagem do inoculo e vai
incubar a 37 C, durante 18 horas;
4. Com uma craveira medir os dimetros dos halos de inibio de crescimento para cada antibitico.

Os resultados foram analisados segundo as normas do Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI, 2007) que segundo o dimetro do halo formado
pela aco dos antibiticos classifica as estirpes em sensvel, resistente ou intermdio.

4. RESULTADOS E DISCUSSO
___________________________________________________________

Resultados e Discusso


4.1. Estirpes isoladas
____________________________________________________________________________________
Para a obteno das estirpes necessrias elaborao deste trabalho, foram
realizadas 34 amostras de gua para consumo humano no tratadas, provenientes de
dois Concelhos do Distrito de Vila Real, nomeadamente o Concelho de Vila Real e
Vila Pouca de Aguiar, j referidas no captulo de Material e Mtodos. A sementeira
realizou-se em meio de G.S.P (Glutamato Amido Vermelho Fenol) - MERCK 10230-
que segundo especificao do fabricante selectivo e diferencial para Pseudomonas
spp. e Aeromonas spp.
Das 34 amostras de gua no tratadas para consumo humano, utilizadas neste
estudo com origem em fontes, poos e nascentes. No total foram obtidos 87 isolados,
sendo que 43 destes revelaram oxidase e catalase positiva. Os restantes isolados (n=44),
referem-se a bactrias com oxidase e catalase negativa, que no foram objecto de estudo
neste trabalho.
s estirpes isoladas foi atribuda uma codificao constituda por uma letra e
um nmero. A letra faz referncia origem da amostra (F- Fonte, P- Poo e N -
Nascente), e o nmero corresponde colnia isolada.
As estirpes foram depositadas na coleco de Aeromonas da Universidade de
Trs-os-Montes e Alto Douro, no Departamento de Cincias Veterinrias e as amostras
que foram seleccionadas para sequenciao, nas instalaes do Molecular Diagnstics
Center (MDC), foi atribuda uma referncia dessa coleco.
Na tabela 2 encontram-se os isolados (n=43), obtidos por amostra como
tambm a sua origem. Pela anlise desta tabela verifica-se que o nmero de isolados
obtidos nas fontes superior ao obtido nos poos. Este facto no significa
obrigatoriamente que exista maior incidncia de isolados do gnero Aeromonas nas
fontes.



Tabela 2- Identificao da amostra, origem, localizao e referncia atribuda.

Amostra Origem Localizao Referncia dos Isolados
F1 Fonte Centro Povo Guies F1 AL; F1b
F1B Fonte do Senhor Guies F1BC 1a 1(MDC 2510); F1BC 1a2; F1BC2;
F1BA1; F1BA2.1; F1BA2.2;F1BA3

F2 Fonte do Corgo Piscinas F2.1; F2. 2a2;
F4 Fonte da Estrada Escariz F4A
F5B Fonte da Aldeia Parada de Cunhos F5.B1; F5.B2
F7 Fonte do Mouco V. Pouca de Aguiar F7A; F7 R
F8 Fonte Capelos F8
F9 Fonte do Largo Soutelo de Aguiar F9 (MDC2464) ; F9Ap
F10 Fonte da Cerdeira Cerdeira de Jales F10AA
F11 Fonte da Igreja Vreia de Jales F11 B; F11 R
F12 Fonte Nova Campo de Jales F12
F13 Fonte de Reguenga Alfarela de Jales F13
F24 Fonte do Cruzeiro Andres F24. 2
F25 Fonte Central S. Cibro F25. 1; F25. 2.1; F25. 3
F27 Fonte do Pao Torneiros Arroios F27. 1a; F27. 1b; F27. 2
F28 Fonte Constantim F28 1a; F28 1b
P1 Poo Lordelo P1. a1
P2 Poo Jales P2. 1a; P2.1b
P3 Poo Fonteita P3. 1a; P3. 1aa; P3.1b1
P4 Poo Jales P4. 2
P5 Poo Estao P5. 1.1;
P6 Poo Constantim P6
Nascente
1
N. do Hospital Lordelo N1.1


4.2. Identificao por sequnciao de isolados bacterianos
____________________________________________________________________________________
4.2.1. Identificao de isolados por sequnciao do gene 16S rRNA
A sequenciao por 16S rRNA permite determinar as relaes filogenticas
entre bactrias, sendo que este mtodo considerado o mais correcto na identificao
dos microrganismos.
Nove isolados foram seleccionados por apresentarem caractersticas
morfolgicas distintas; (i) colnias rosa ou laranja em GSP; (ii) Gram negativo; (iii)
oxidase positiva; (iv) catalase positiva - presuntivas de Pseudomonas/ Plesiomonas.
De referir ainda que no estudo do perfil de susceptibilidade, quatro dos
isolados apresentaram resistncia ao imipenemo. Os resultados da identificao por
sequenciao do gene 16sRNA para os nove isolados encontram-se na tabela 3.

Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene 16S rRNA

Pela anlise desta tabela verifica-se que todos os isolados foram obtidos de
fontes. Os quatro isolados seleccionados (F281a, F281b, F1AL e F10AA) apresentavam
Referncia dos isolados Identificao das estirpes
F1AL Chryseobacterium spp.
F1b Pseudomonas costantinii
F10AA Chryseobacterium spp.
F11Bp Pseudomonas brenneri
F11R Pseudomonas brenneri
F12 Pseudomonas savastanoi
F13 Pseudomonas veronii
F281a Pseudomonas fluorescens
F281b Pseudomonas fluorescens


um fentipo de resistncia ao imipenemo, contudo em GSP a morfologia das colnias
era diferente entre eles, tendo os isolados (F281a, F281b) cor rosa e os isolados (F1AL,
F10AA) cor laranja. Com estas caractersticas fentipicas e aps a sequenciao do
gene 16sRNA dois dos isolados foram identificados como Pseudomonas fluorescens e
os outros dois como pertencentes ao gnero Cryseobacterium spp.. De referir que os
isolados (F1AL, F10AA) revelaram perfis de susceptibilidade diferentes aos
antibioticos testados (Anexo I).
O imipememo um carbapenemo de uso hospitalar e referido em vrios
estudos (Chin-Chen Lai et al., 2007) como ltimo recurso para estirpes multiresistentes
nosocomiais. Relativamente amostra F11 os isolados obtidos (F11Bp e F11R)
apresentavam caractersticas morfolgicas distintas, e perfil de susceptibilidade
idntico, no entanto a identificao dos isolados bacterianos foi a mesma (Pseudomonas
brenneri). Este facto refora a necessidade da utilizao de mtodos gentipicos para a
correcta identificao.
Da tabela anlise da tabela 3 observa-se que as sequncias obtidas pertencem a
5 espcies do gnero Pseudomonas - P. costantinni, P. brenneri, P. savastonoi,
P.veronni e P. fluorescens. Algumas espcies de Pseudomonas so patgenicas para os
animais, incluindo o Homem. A espcie Pseudomonas aeruginosa considerada um
importante patognico nosocomial em doentes com fibrose quistica (Spilker et al.,
2004), e em queimaduras e feridas (Muller et al., 2009).

4.2.1. Identificao de isolados bacterianos por sequenciao do gene
gyrB
Algumas espcies de bactrias no podem ser diferenciadas entre si apenas
pela sequenciao do gene 16S rRNA. A utilizao de genes alternativos para a
identificao molecular de certas espcies aumenta as potencialidades da sequenciao.
A identificao da espcie a que pertencem as 34 estirpes foi realizada por
sequenciao de genes housekeeping. Amplificou-se e determinou-se a sequncia
nucleotdica do gene gyrB em 29 isolados presuntivos de Aeromonas: i) colnias
amarelas em GSP, ii) Gram negativo, iii) oxidase e catalase positivam.


O fragmento de gyrB amplificado foi de 1100 nucleotidos (Figura 4), dos
quais se sequenciaram entre 989 e 1100 pares de bases. Este fragmento representa
aproximadamente 40% da sequncia completa (seguindo como referncia a sequncia
de gyrB da E. coli, que apresenta 2415 nucletidos; Huang, 1996) e contm 70% dos
nucletidos correspondentes ao domnio ATPase da protena.
Foi comparado um fragmento contnuo de 989 pares debases, desde a posio
393 at posio1389. O nmero de posies variveis no fragmento de, gyrB
analisado foi de 241 pb que corresponde a 24,4% do total comparado, ou seja, o nmero
de posies conservadas (isto , com idntica composio) corresponde a 75% dos
nucletidos sequenciados.

Figura 4 Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a regio do gene que foi amplificada, as setas
indicam a localizao dos primers utilizados e em negrito encontram-se as posies do primeiro e ltimo nucletido
amplificado seguindo a numerao de E. coli (Huang, 1996).

Estas sequncias foram comparadas com as da base de dados do MDC para
poder inferir acerca de quais as espcies representadas. A rvore filogentica obtida
dessa anlise encontra-se na figura 4.
Desta anlise observa-se que as sequncias obtidas pertencem a 6 espcies do
gnero Aeromonas - Aeromonas hydrophila, Aeromonas bestiarum, Aeromonas
eucrenophila, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii e Aeromonas encheleia. Verifica-se
ainda, a formao um cluster filogentico independente dos grupos pertencentes a todas
as espcies actualmente reconhecidas neste gnero, pelo que poder representar uma
espcie ainda no descrita. A estirpe deste grupo ser denominada de Aeromonas spp.
gyrB14R
gyrB3F
5 3 334 1464


Figura 5- rvore filogentica obtida com a sequnciao do gene gyrB das estirpes isoladas neste estudo
Aeromonas spp.
A. hydrophila
A. aquariorum
A. trota
A. jandaei
A. caviae
A.schubertii
A. bivalvium
A. eucrenophila
A. tecta
A. encheleia
A. salmonicida
A. bestiarum
A. popoffii
A. media
A. allosacharophila
MDC181
P5 1.1
MDC57
MDC41
MDC260
MDC39T
MDC28T
MDC100
MDC561
MDC1TA
MDC12
MDC45
MDC99
MDC17T
MDC105
MDC103
MDC104
MDC10T
MDC219
MDC241
MDC250
MDC273
MDC149T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
F27.1b
F27.1a
MDC165
MDC162
P6
N1.1
F5B1
MDC34
MDC11T
MDC4
MDC26
MDC19T
MDC148
MDC25
MDC44
MDC5
MDC24
MDC64
MDC16T-A.HG11
MDC63
MDC37T
MDC14
MDC93
F9=MDC2464
MDC91T
MDC92
MDC94
MDC95
MDC20T
MDC74
MDC72
MDC73
MDC43
F1BC1a1
F7R
MDC256
P2.1b
F7A
MDC147
P2.1a
MDC32T
MDC21
MDC146
F8
MDC87T
MDC88
MDC574
MDC575
MDC2T
MDC18-A.G501
MDC2374
MDC54T
MDC55
MDC51
MDC52
MDC33
MDC40T
MDC49
MDC48
MDC2475
F4A
MDC240
P3.1b1
MDC27
F25.2.1
MDC231
P4.2
MDC35T
MDC13T
MDC578
MDC582
MDC580
MDC579
MDC581
MDC38T
MDC36
MDC90
MDC89
MDC576
MDC577
MDC317
MDC573
MDC442
MDC259
MDC2406
MDC310
MDC47
MDC318
100
100
47
52
100
92
99
99
81
52
99
99
99
67
83
99
41
25
98
98
52
32
68
60
32
99
47
55
70
27
99
24
29
52
98
67
55
39
52
55
58
67
38
37
96
55
36
45
46
36
54
23
5
51
72
63
53
75
38
84
99
45
23
40
54
59
99
37
86
43
43
13
99
51
86
81
73
96
37
61
66
81
30
42
40
53
32
55
18
38
25
31
26
9
20
50
42
50
55
87
53
32
58
63
82
36
29
30
30
25
0.02
A. veronii /culicicola
A. sobria
A. simiae
A. molluscorum
Aeromonas spp.
A. hydrophila
A. aquariorum
A. trota
A. jandaei
A. caviae
A.schubertii
A. bivalvium
A. eucrenophila
A. tecta
A. encheleia
A. salmonicida
A. bestiarum
A. popoffii
A. media
A. allosacharophila
MDC181
P5 1.1
MDC57
MDC41
MDC260
MDC39T
MDC28T
MDC100
MDC561
MDC1TA
MDC12
MDC45
MDC99
MDC17T
MDC105
MDC103
MDC104
MDC10T
MDC219
MDC241
MDC250
MDC273
MDC149T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
F27.1b
F27.1a
MDC165
MDC162
P6
N1.1
F5B1
MDC34
MDC11T
MDC4
MDC26
MDC19T
MDC148
MDC25
MDC44
MDC5
MDC24
MDC64
MDC16T-A.HG11
MDC63
MDC37T
MDC14
MDC93
F9=MDC2464
MDC91T
MDC92
MDC94
MDC95
MDC20T
MDC74
MDC72
MDC73
MDC43
F1BC1a1
F7R
MDC256
P2.1b
F7A
MDC147
P2.1a
MDC32T
MDC21
MDC146
MDC181
P5 1.1
MDC57
MDC41
MDC260
MDC39T
MDC28T
MDC100
MDC561
MDC1TA
MDC12
MDC45
MDC99
MDC17T
MDC105
MDC103
MDC104
MDC10T
MDC219
MDC241
MDC250
MDC273
MDC149T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
F27.1b
F27.1a
MDC165
MDC162
P6
N1.1
F5B1
MDC34
MDC11T
MDC4
MDC26
MDC19T
MDC148
MDC25
MDC44
MDC5
MDC24
MDC64
MDC16T-A.HG11
MDC63
MDC37T
MDC14
MDC93
F9=MDC2464
MDC91T
MDC92
MDC94
MDC95
MDC20T
MDC74
MDC72
MDC73
MDC43
F1BC1a1
F7R
MDC256
P2.1b
F7A
MDC147
P2.1a
MDC32T
MDC21
MDC146
F8
MDC87T
MDC88
MDC574
MDC575
MDC2T
MDC18-A.G501
MDC2374
MDC54T
MDC55
MDC51
MDC52
MDC33
MDC40T
MDC49
MDC48
MDC2475
F4A
MDC240
P3.1b1
MDC27
F25.2.1
MDC231
P4.2
MDC35T
MDC13T
MDC578
MDC582
MDC580
MDC579
MDC581
MDC38T
MDC36
MDC90
MDC89
MDC576
MDC577
MDC317
MDC573
MDC442
MDC259
MDC2406
MDC310
MDC47
MDC318
100
100
47
52
100
92
99
99
81
52
99
99
99
67
83
99
41
25
98
98
52
32
68
60
32
99
47
55
70
27
99
24
29
52
98
67
55
39
52
55
58
67
38
37
96
55
36
45
46
36
54
23
5
51
72
63
53
F8
MDC87T
MDC88
MDC574
MDC575
MDC2T
MDC18-A.G501
MDC2374
MDC54T
MDC55
MDC51
MDC52
MDC33
MDC40T
MDC49
MDC48
MDC2475
F4A
MDC240
P3.1b1
MDC27
F25.2.1
MDC231
P4.2
MDC35T
MDC13T
MDC578
MDC582
MDC580
MDC579
MDC581
MDC38T
MDC36
MDC90
MDC89
MDC576
MDC577
MDC317
MDC573
MDC442
MDC259
MDC2406
MDC310
MDC47
MDC318
100
100
47
52
100
92
99
99
81
52
99
99
99
67
83
99
41
25
98
98
52
32
68
60
32
99
47
55
70
27
99
24
29
52
98
67
55
39
52
55
58
67
38
37
96
55
36
45
46
36
54
23
5
51
72
63
53
75
38
84
99
45
23
40
54
59
99
37
86
43
43
13
99
51
86
81
73
96
37
61
66
81
30
42
40
53
32
55
18
38
25
31
26
9
20
50
42
50
55
87
53
32
58
63
82
36
29
30
30
25
0.02
A. veronii /culicicola
A. sobria
A. simiae
A. molluscorum


Na tabela 4 esto representadas as espcies de Aeromonas identificadas por
sequenciao do gene gyrB, bem como a referncia dos isolados.

Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene gyrB

Neste estudo e de acordo com a tabela 4 e 5 a espcie com maior incidncia foi
a espcie Aeromonas hydrophila (n=10), com uma percentagem de 29,4%. Estes
Referncia dos isolados Identificao das espcies por gyrB
F1BC1a1 (MDC2510); F1BC1a2; F1BC2;
F1BA1; F1BA3
Aeromonas spp.
F1BA2.1; F1BA2.1 Aeromonas encheleia
F9 (MDC2464); F9Ap Aeromonas tecta
P5. 1.1 Aeromonas veronii
F4A
Aeromonas hydrophila

P3. 1b1 Aeromonas hydrophila
P4. 2 Aeromonas hydrophila
F25. 1; F25. 2.1; F25. 3; F24. 2 Aeromonas hydrophila
F7R Aeromonas eucrenophila
F7A Aeromonas eucrenophila
F8 Aeromonas eucrenophila
P2. 1a Aeromonas eucrenophila
P2. 1b Aeromonas eucrenophila
P6 Aeromonas bestiarum
F5.B1; F5.B2 Aeromonas bestiarum
F27. 1a; F27. 2 Aeromonas bestiarum
F27. 1b Aeromonas bestiarum
N1.1 Aeromonas bestiarum


resultados so semelhantes aos obtidos por Villari e colaboradores em 2003 num estudo
realizado a partir de guas naturais minerais.
No Mxico, Castro-Escarpulli e colaboradores (2003), a partir de guas de
diferentes origens referem percentagens semelhantes para a espcie de Aeromonas
hydrophila, e os mesmos resultados foram referenciados por Tequianes-Bravo et al.,
2005 em amostras de gua potvel. Para estes autores a alta frequncia de Aeromonas
hydrophila sugere que guas contaminadas por estes microrganismos apresentam um
potencial risco de infeces ao Homem, dado que algumas estirpes de Aeromonas
possuem um vasto conjunto de factores de virulncia como enterotoxinas, citotoxinas e
aerolisinas (Nzeako et al., 1991; Gonzlez-Serrano et al., 2002). Num trabalho de Kosal
e colaboradores (2007) a prevalncia desta espcie foi de 46%, no entanto num estudo
efectuado por Razzolini e colaboradores (2008) com o intuito de detectar Aeromonas e
suas toxinas em guas de reservatrios e fontanrios os valores obtidos foram de 15,7%.
Neste trabalho e relativamente s espcies Aeromonas bestiarum, Aeromonas
eucrenophila e Aeromonas caviae (n=2), a percentagem obtida foi de 21%, 15% e 6%
respectivamente. De Aeromonas encheleia, Aeromonas veronii, Aeromonas tecta apenas
foi isolada 1 estirpe pertentente a cada uma das espcies.
Uma particularidade dos resultados deste estudo reside no facto de todas as
espcies consideradas patognicas para o Homem (Aeromonas hydrophila, Aeromonas
veronii biotype sobria e Aeromonas caviae), foram por ns identificadas o que de
extrema importncia quando se considera a sua ampla distribuio ambiental, tendo
como origem poos. Clnicamente estas espcies so as mais importantes (Figueras,
2005; Edberg et al., 2007

4.2.2. Identificao de isolados bacterianos por sequnciao do gene
gyrA
A sequenciao nucleotdica do gene gyrA (Martnez-Murcia et al. (MS
submitted) foi realizada a 5 estirpes bacterianas presuntivas de Aeromonas e os
resultados da sequenciao esto representadas na tabela 5.


Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene gyrA

Da anlise da tabela 5 podemos referir que a espcie Aeromonas hydrophila foi
isolada tanto em Fontes como em Poos, o que bem demonstrativo da sua ubiquidade.
A espcie Aeromonas caviae foi tambm por ns identificada. de salientar que ambas
as espcies A. hydrophila e A. caviae pertencem a uma das trs espcies consideradas
clinicamente patognicas para o Homem (Borchardt et al., 2003; Tsai et al., 2006),
sendo que A. hydrophila est intimamente associada a septicmia em doentes
queimados (Chin-Cheng Lai et al., 2007).

4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp.
________________________________________________________

Os resultados da anlise filogentica pela sequenciao do gene gyrB
revelaram a presena de um grupo de estirpes distinta de todos os grupos filogenticos
que representam as espcies de Aeromonas descritas e/ou dos grupos de homologia
DNA-DNA formados dentro deste gnero.
Como forma de confirmar a formao desse grupo independente constituido
pelos isolados de Aeromonas spp., foi realizada a sequenciao do gene rpoD para a
estirpe MDC 2510. O fragmento de rpoD amplificado foi de 859 pb, dos quais foram
sequenciados entre 722 a 850 nucletidos, o que representa cerca de 45% da protena
no englobando o centro activo da protena.
Quando se realizou o alinhamento desta estirpe com as sequncias da base de
dados do MDC foi comparado um fragmento contnuo de 683 pb, este apresenta 252
posies variveis, o que corresponde a 36,9% da sequncia total comparada.
A rvore filogentica obtida dessa anlise encontra-se na figura 6.
Referncia dos isolados Identificao das estirpes gyrA
F2.1 Aeromonas hydrophila
F2.2a2 Aeromonas hydrophila
P1.a1 Aeromonas hydrophila
P3.1a Aeromonas caviae
P3.1aa Aeromonas caviae


Figura 6. Arvore filogentica baseada na sequncia do gene rpoD.
A. bivalbium
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
MDC149T
MDC165
MDC34
MDC4
MDC11T
MDC162
MDC26
MDC148
MDC25
MDC44
MDC19T
MDC5
MDC27
MDC240
MDC48
MDC231
MDC35T
MDC2475
MDC317
MDC259
MDC318
MDC573
MDC310
MDC47T
MDC442
MDC2406
MDC105
MDC104
MDC17T
MDC103
MDC-579
MDC581
MDC13T
MDC580
MDC578
MDC582
MDC577
MDC8
MDC90
MDC38T
MDC576
MDC3
MDC1T
MDC99
MDC45
MDC100
MDC12
MDC561
MDC28T
MDC181
MDC41T
MDC57
MDC39T
MDC260
MDC51
MDC52
MDC33
MDC49
MDC40T
MDC250
MDC273
MDC241
MDC219
MDC10T
MDC24-HG11
MDC63-encheleia-HG11
MDC16-HG11
MDC37T
MDC14
MDC64
MDC94
MDC95
MDC92
MDC91T
MDC93
F1BC1a1
MDC147
MDC256
MDC146
MDC32T
MDC21
MDC87
MDC88
MDC72
MDC74
MDC73
MDC20T
MDC43
MDC55
MDC54T
MDC2374
MDC18-HG13
MDC574
MDC575
MDC2T
70
100
45
100
100
97
60
63
100
100
100
53
76
81
100
74
36
99
78
46
61
100
100
76
57
39
38
100
66
68
93
89
100
98
85
34
46
57
28
36
100
55
34
39
100
100
34
56
100
100
100
100
99
100
62
45
63
100
98
34
60
100
34
24
100
40
39
97
100
43
53
91
100
46
81
100
79
55
55
32
52
22
58
48
42
65
71
48
14
100
39
42
17
24
19
45
0.02
A. popoffii
A. jandaei
A. bestiarum
A. salmonicida
A. hydrophila
A. aquariorum
A. sobria
A. media
A. trota
A. allosaccharophila
A. culicicola/ A. veronii
A. caviae
A. encheleia
A. simiae
A. tecta
A. molluscorum
A. schubertii
Aeromonas sp. (HG11)
A. eucrenophila
Aeromonas sp.
A. bivalbium
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
MDC149T
MDC165
MDC34
MDC4
MDC11T
MDC162
MDC26
MDC148
MDC25
MDC44
MDC19T
MDC5
MDC27
MDC240
MDC48
MDC231
MDC35T
MDC2475
MDC317
MDC259
MDC318
MDC573
MDC310
MDC47T
MDC442
MDC2406
MDC105
MDC104
MDC17T
MDC103
MDC-579
MDC581
MDC13T
MDC580
MDC578
MDC582
MDC577
MDC8
MDC90
MDC38T
MDC576
MDC3
MDC1T
MDC99
MDC45
MDC100
MDC12
MDC561
MDC28T
MDC181
MDC41T
MDC57
MDC39T
MDC260
MDC51
MDC52
MDC33
MDC49
MDC40T
MDC250
MDC273
MDC241
MDC219
MDC10T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
MDC149T
MDC165
MDC34
MDC4
MDC11T
MDC162
MDC26
MDC148
MDC25
MDC44
MDC19T
MDC5
MDC27
MDC240
MDC48
MDC231
MDC35T
MDC2475
MDC317
MDC259
MDC318
MDC573
MDC310
MDC47T
MDC442
MDC2406
MDC105
MDC104
MDC17T
MDC103
MDC-579
MDC581
MDC13T
MDC580
MDC578
MDC582
MDC577
MDC8
MDC90
MDC38T
MDC576
MDC3
MDC1T
MDC99
MDC45
MDC100
MDC12
MDC561
MDC28T
MDC181
MDC41T
MDC57
MDC39T
MDC260
MDC51
MDC52
MDC33
MDC49
MDC40T
MDC250
MDC273
MDC241
MDC219
MDC10T
MDC24-HG11
MDC63-encheleia-HG11
MDC16-HG11
MDC37T
MDC14
MDC64
MDC94
MDC95
MDC92
MDC91T
MDC93
F1BC1a1
MDC147
MDC256
MDC146
MDC32T
MDC21
MDC87
MDC88
MDC72
MDC74
MDC73
MDC20T
MDC43
MDC55
MDC54T
MDC2374
MDC18-HG13
MDC574
MDC575
MDC2T
70
100
45
100
100
97
60
63
100
100
100
53
76
81
100
74
36
99
78
46
61
100
100
76
57
39
38
100
66
68
93
89
100
98
85
34
46
57
28
36
100
55
34
39
100
100
34
56
100
100
100
100
99
100
62
45
63
100
98
34
60
100
34
24
100
40
39
97
100
43
53
91
100
46
81
100
79
55
55
32
52
22
58
48
42
65
71
48
14
100
39
42
17
24
19
45
0.02
A. popoffii
A. jandaei
A. bestiarum
A. salmonicida
A. hydrophila
A. aquariorum
A. sobria
A. media
A. trota
A. allosaccharophila
A. culicicola/ A. veronii
A. caviae
A. encheleia
A. simiae
A. tecta
A. molluscorum
A. schubertii
Aeromonas sp. (HG11)
A. eucrenophila
Aeromonas sp.


Os resultados obtidos indicam que os isolados de Aeromonas spp. representam
linhas figenticas independentes das descritas at ao momento. A utilizao de
diversos genes que codificam funes essenciais (housekeeping) como gyrB, gyrA e
rpoD, graas a sua maior variabilidade intra e interespecfica, tm demonstrado ser
ferramentas teis para a diferenciao da taxonomia do gnero Aeromonas (Martnez-
Murcia, 2008). As espcies de Aeromonas mais relacionadas com este novo grupo
formado so Aeromonas tecta e Aeromonas eucrenophila.

4.4. Caracterizao fenotpica da estirpe MDC 2464

4.4.1 Mtodos bioqumicos
Procedeu-se caracterizao fentipica da estirpe com a referncia MDC 2464
por mtodos bioqumicos, por se tratar de uma espcie ainda no descrita em isolados
ambientais ao contrrio do descrito por Demarta e colaboradores (2008) a espcie
Aeromonas tecta foi descrita em isolados clnicos, mediante utilizao de genes
housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia. Os perfis bioqumicos foram
comparados com a espcie tipo F518
T
(MDC 91)

obtida de amostras de fezes de criana
com diarreia em 1992,

e outras estirpes de Aeromonas (MDC92, MDC93, MDC94,
MDC95).
Os resultados da caracterizao fenotpica esto representados na tabela 6. O
isolado F9Ap que corresponde estirpe com a referncia MCD 2464 oxidase e
catalase positiva, resistente ao agente vibriosttico O/129 (150g), apresenta
crescimento nas concentraes de 0 e 3% de NaCl. Fermenta a glucose com produo
de cido e gs, e outros carboidratos como a maltose, manose e trealose. negativa para
a lactose, sacarose, xilose celobiose e rafinose. Para as provas bioqumicas
complementares ser de referir, que a estirpe analizada reduz os nitratos a nitritos, no
degrada o aminocido triptofano, e revelou reaco negativa para a urease e Voges-
Proskaeur. Constata-se tambm a hidrlise da gelatina, esculina (48 horas), e lisina
descarboxilase (LDC). Relativamente ao teste da ornitina descarboxilase (ODC)
obtivemos um resultado positivo na estirpe tipo (MDC 91), como tambm para o
isolado deste estudo (MDC 2464). O resultado desta prova difere do descrito por
Demarta e colaboradores (2008) que referem poder ser varivel. Todas as provas
bioqumicas no apresentaram diferenas.


Tabela 6. Perfil bioqumico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC 2464

Legenda: ODC (Ornitina descarboxilase); LDC (Lisina descarboxilase); TSI (Triple Iron Sugar); + =
positivo; - = negativo
Nota: K/A- Acidez da Glucose e alcalinizao da Lactose e Sacarose
Estirpes
Provas

MDC91 MDC92 MDC93 MDC94 MDC95 MCD2464

Ferm/Gs Ferm/Gs Ferm/Gs Ferm/Gs Ferm/Gs Ferm/Gs
Glucose + / + + / + + / - + / + + / + + / +
Lactose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Manose + / + + / - + / - + / + + / + + / +
Maltose + / + + / + + / - + / + + / + + / +
Sacarose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Xilose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Celobiose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Trealose + / + + / - + / - + / + + / + + / +
Rafinose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Inositol - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Sorbitol - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Manitol + / + + / - + / - + / - + / + + / -
Esculina - + + - - -
(+ 48h)

ODC + + + + + +
LDC + + + + + +
Indol - - - - - -
Metil Red + + + + + +
Voges-Proskaeur

- - - - - -
Urease - - - - - -
Nitratos + + + + + +
Gelatina + + + + + +
Citrato + + + + + +
TSI K/A K/A K/A K/A K/A K/A


4.4.2. Sistema de biotipificao numrico API 20NE
Procedeu-se tambm caracterizao bioqumica do isolado MDC 2464,
recorrendo-se utilizao de um sistema miniaturizado sob a forma de kit, o API 20NE
(bioMerieux) (figura 7). A metodologia est descrita no quadro 11 (Material e
Mtodos). Este procedimento justifica-se por se tratar de uma espcie ainda no descrita
em isolados ambientais ao contrrio do descrito por Demarta e colaboradores (2008),
em que a espcie Aeromonas tecta foi descrita em isolados clnicos, mediante utilizao
de genes housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia.

Figura 7- Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE do isolado MDC 2464

Pela figura 7 acima referida, possvel observar que o isolado de Aeromonas
tecta caracterizado bioquimicamente por API 20NE, revela pelo perfil de resultados a
ocorrncia da degradao do aminocido triptofano, ao contrrio do verificado quando
se caracterizou fenotipicamente esta estirpe, o que bem demonstrativo da contradio
dos resultados obtidos e da ambiguidade da identificao de espcies por mtodos
fenotpicos. Para as restantes provas, os resultados obtidos foram similares aos estudos
realizados com o intuito de caracterizar bioqumicamente a estirpe por mtodos
bioqumicos convencionais.

4.5. Caracterizao bioqumica da espcie de Aeromonas spp.
4.5.1. Sistema de biotipificao numrica API 20NE
A espcie identificada como Aeromonas spp. refere-se aos isolados (F1BC1a1- MDC
2510 e F1BC1a2. Esta caracterizao bioqumica efectuou-se por se tratar de uma


espcie ainda no descrita no gnero Aeromonas. Na figura 8 est representado o perfil
numrico dos isolados anteriormente referidos.

Figura 8- Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE dos isolados FBC1a1- MDC 2510 - e
FBC1a2

Pela figura 8 possvel observar que os resultados dos isolados de Aeromonas
spp., apresentam perfil bioqumico idntico, com excepo da arginina dihidrolase que
para o isolado FBC1a (MDC 2510) deu resultado positivo, ao contrrio do verificado
para o isolado FBC1a2) com reaco negativa s 24 horas, mas s 48 horas o resultado
desta prova foi positivo. Em ambos os isolados ocorreu a reduo dos nitratos, indol e
urease positiva, hidrlise da esculina e gelatina, fermentao da glucose. De salientar
que o perfil numrico obtido para os isolados da espcie A. tecta (F9 e F9Ap) e
Aeromonas spp. (F1BC1a1 e F1BC1a2), com leitura s 24 horas no foi possvel obter
qualquer identificao pela consulta no livro ndex do sistema de biotipificao
respectivo. Este facto corrobora a necessidade de se fazer a identificao por mtodos
genticos como referido (Figueras et al., 2000; Castro-Escarpulli et al., 2003; Martnez-
Murcia et al., 2007; Hidalgo et al., 2008).
A caracterizao bioqumica apresenta problemas ao nvel das bactrias do
gnero Aeromonas, dado que o mtodo de biotipificao numrica utilizado tem como
base de dados, resultados de ensaios em estirpes clnicas. Assim e de acordo com Daz e
colaboradores (2006) referido que num laboratrio de anlises microbiolgicas de
guas, Aeromonas hydrophila a espcie mais frequentemente identificada (62,5%),
Aeromonas caviae (20,3%), Aeromonas veronii biovar sobria (9,3%), e Aeromonas spp.
(7,8%). Tal como referido por vrios autores sabe-se que os sistemas comerciais para
identificao bioqumica das espcies de Aeromonas so errneos, existindo mesmo
sistemas que apenas incluem nas suas bases de dados a espcie Aeromonas hydrophila
(Vivas et al., 2000). No nosso trabalho essa dificuldade foi constatada, em ambas as


espcies (Aeromonas tecta e Aeromonas spp.). A escassa coincidncia entre os mtodos
de identificao fenotpica e gentica evidenciada pela falta de provas fenotpicas
claras e concisas para diferenciar entre espcies de Aeromonas. Diferenas entre a
identificao fenotipica/gentica foram reportadas em estudos anteriores (Abbott et al.,
1998; Vivas et al., 2000; Park et al., 2003; Daz et al., 2006), e est de acordo com os
nossos resultados. Hidalgo e colaboradores (2008) referem que 73,5% dos isolados
identificados fenotipicamente como A. hydrophila, mediante identificao gentica
resultaram em A. hydrophila (22,4%), A. sobria (28,6%) e A. bestiarum (22,5%).

4.6. Perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos
_______________________________________________________________________________
Foi realizado o perfil de susceptibilidade, pelo mtodo de difuso em disco
(Quadro 12, Material e Mtodos) a 27 antibioticos de vrios grupos em 34 estirpes. As
tabelas com os perfis individuais das estirpes em estudo encontram-se no anexo II. Os
resultados globais do perfil de susceptibilidade dos isolados obtidos apresentam-se na
figura 9.

Figura 9. Perfil de susceptibilidade a diferentes antibiticos dos isolados de Aeromonas em estudo
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
AML
AMC
TIC
TIM
PRL
TZP
ATM
IPM
KF
FOX
CAZ
CTX
CRO
CFP
FEP
FOS
NA
CIP
AK
CN
TOB
K
S
E
C
STX
TE
Resistente Sensvel Intermdio


Ao longo dos vrios anos, estudos relativos ao perfil de susceptibilidade a
diferentes antibiticos tm sido efectuados com estirpes Aeromonas de origem clnica e
ambiental (Overman e Janda, 1999; Huddleston et al., 2006; Pal et al., 2006). Pela
anlise da figura 9 podemos verificar que as estirpes estudadas apresentaram uma
percentagem elevada de resistncia amoxicilina assim, os ndices obtidos foram de
100%. Estudos anteriores (Vila et al., 2002; Radu et al., 2003) referem 100% de
resistncia a estes antibiticos, referindo que as estirpes do gnero Aeromonas so
intrinsecamente resistentes penicilina (Hatha et al., 2005). No entanto, nos trabalhos
de Saavedra e colaboradores (2004) apresentam-se valores de 35% de sensibilidade a
estes antibiticos. Em relao cefalotina, cefalosporina de primeira gerao, todas as
estirpes foram resistentes a este antibitico, resultados obtidos tambm por Bizani e
Brandelli (2001).
Verificmos ainda que 85% das estirpes testadas eram resistentes ticarcilina,
estando estes resultados em concordncia com os obtidos por Blasco e seus
colaboradores em 2008, num estudo onde foi comparada a multiresistncia de
patognicos (Aeromonas spp., Pseudomonas spp. e Legionella spp.) isolados em gua
de reservatrios, gua engarrafada e sistemas de refrigerao.
Podemos constatar que as estirpes de Aeromonas estudadas apresentaram uma
elevada percentagem de sensibilidade ureidopenicelina (piperaciclina). semelhana
do referido por Vila et al., (2002) e Fosse et al., (2003) verificamos que as
ureidopenicelinas se revelaram mais activas do que as carboxipenicelinas contra as
estirpes testadas, como se pode observar na figura 16, a percentagem de estirpes
sensvel piperaciclina de 100%, enquanto a percentagem de estirpes sensvel
ticarcilina de 5%.
Relativamente s cefalosporinas testadas verificamos que a percentagem de
estirpes resistentes cefalotina (100%), a nica cefalosporina de 1 gerao testada,
estava de acordo com os valores obtidos noutros trabalhos (Bizani e Brandelli, 2001).
No que se refere cefalosporina de 2 gerao testada, a cefoxitina, 9% das estirpes
analisadas eram resistentes. No estudo de Costa e colaboradores em 2002 com estirpes
obtidas num matadouro de frangos e no estudo de Pal e colaboradores em 2006 com
estirpes obtidas de alfaces foram obtidos valores de resistncia cefoxitina (32%)
superiores aos obtidos no nosso estudo. Para as cepalosporinas de 3 e 4 gerao


obtivemos valores de 100% de sensibilidade revelando-se assim efectivas contra
Aeromonas spp.. Estes resultados semelhantes aos obtidos em vrios estudos, (Kmpfer
et al., 1999; Bizanni e Brandelli, 2001; Fosse et al., 2003; Sader e Jones, 2005), em que
todas as estirpes analisadas querem de origem ambiental, quer de origem clnica eram
susceptveis a este subgrupo de antibiticos. Por outro lado os resultados por ns
obtidos de isolados de Aeromonas spp., em guas no tratadas para consumo humano,
esto de acordo com os de Ottaviani e colaboradores (2006) num estudo que visou
pesquisar a presena deste gnero em melhixes no mar Adritico.
Constatamos ainda, que da associao do inibidor de -lactamases, o cido
clavulnico com a aminopenicilina, amoxicilina, permitiu reduzir a resistncia deste
antibitico de 100% para 56% o que revela a sua eficincia. Este inibidor quando
associado carboxipenicilina, ticarcilina, essa diminuio no foi to significativa pois
passou de 85% para 68%, o que corresponde a uma reduo de 17%. Estes resultados
esto de acordo com os obtidos noutros estudos (Vila et al., 2002; Saavedra et al.,
2004). Relativamente ao tazobactam, constatamos que da sua associao
ureidopenicelina (piperaciclina) no houve qualquer eficincia, pois todas as estirpes
eram sensveis.
Os nossos resultados revelaram que 100% das estirpes estudadas eram
sensveis ao aztreonamo o que est de acordo com outros estudos publicados (Ko et al.,
1996; Kmpfer et al., 1999; Sader e Jones, 2005). No entanto, no estudo de Koksal e
colaboradores (2007), com estirpes isoladas de gua para consumo em Istambul-
Turquia, para este antibitico foram obtidos ndices de sensibilidade de 89% e no
trabalho de Daz e colaboradores (2006), com estirpes isoladas de gua apenas 58% das
estirpes eram sensveis ao aztreonamo.
Para o carbapenemo testado, imipenemo, 3% das estirpes apresentaram resistncia, 12%
foram consideradas intermdias e as restantes 84% sensveis. Estes resultados so de
realar pelo facto de este antibitico ser de ltimo recurso em estirpes nosocomiais
multiresistentes, nomeadamente Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni
como referido em vrios trabalhos (Hughes et al., 2002; Hsueh et al., 2005; Poirel e
Nordmann (2006); John e McGowan (2006). Em estudos anteriores obtiveram-se, no
que se refere ao imipenemo, estirpes de origem clnica e ambiental com resistncia a
este carbapenemo (Hughes et al., 2002; Obi et al., 2007; Koksal et al., 2007). De referir


que no nosso estudo a estirpe Aeromonas eucrenophila foi a que apresentou resistncia
a este agente antibacteriano.
No presente trabalho verificou-se que para as quinolonas testadas todas as
estirpes de Aeromonas eram sensveis ciprofloxacina (Penders e Stobberingh, 2008),
enquanto a sensibilidade revelada ao cido naladxico foi de 91%. Castro-Escarpulli e
colaboradores (2003) reportam que 58,5% das estirpes de peixe congelado para
consumo, que analisaram, eram resistentes ciprofloxacina, Koksal e colaboradores
(2007) referem para ambos os antibiticos valores de 1% e 2% respectivamente.
Em vrios estudos referida a susceptibilidade das estirpes de Aeromonas, aos
aminoglicosdeos testados com diferentes origens, (Kmpfer et al., 1999; Vila et al.,
2002; Pal et al., 2006). Neste estudo, a estreptomicina revelou ser o menos efectivo,
com 44% das estirpes analisadas a apresentarem-se resistentes. Em 2007 Akinbowale e
colaboradores obtiveram valores de resistncia semelhantes (33%) em estirpes isoladas
de trutas na Austrlia. Em contrapartida, outros autores, referiram valores de resistncia
para este antibitico superiores, 65% em estirpes isoladas de gua de dois rios Europeus
(Goi-Urriza et al., 2000), e 75% em estirpes isoladas de peixe congelado para
consumo, no Mxico (Castro-Escarpulli et al., 2003). Para os restantes
aminoglicosdeos verificamos que 100% das estirpes estudadas eram sensveis
amicacina, canamicina, gentamicina, e tobramicina, valores comparveis aos obtidos em
outros estudos (Overman e Janda, 1999; Castro-Escarpulli et al., 2003).
No nosso estudo detectamos um elevado nmero de estirpes resistentes
eritromicina (89%) semelhana do reportado noutros trabalhos (Kmpfer et al., 1999;
Blasco et al., 2008), Koksal e colaboradores (2007) obtiveram 48%. Verificamos ainda
que 11% das estirpes revelaram sensibilidade a este antibitico. Alguns autores referem
a existncia de uma resistncia intrnsica do gnero Aeromonas eritromicina (Kmpfer
et al., 1999). Relativamente ao sulfametoxazol-trimetoprim, 97% das estirpes eram
sensveis a este antibitico. Nos estudos de Pal e colaboradores (2006) as estirpes
analisadas de origem alimentar eram todas sensveis, mas segundo Castro-Escarpulli e
colaboradores em 2003 obtiveram valores de resistncia de 49%, valores muito
superiores aos obtidos por ns (3%). No que se refere ao cloranfenicol e tetraciclina
verificou-se que todas as estirpes analisadas, eram sensveis a estes antibiticos o que
est de acordo com (Penders e Stobberingh, 2008). De referir no entanto que Costa e


colaboradores (2002) descrevem que 75% das estirpes obtidas em diferentes pontos da
linha de abate de aves, eram resistentes tetraciclina enquanto Koksal e colaboradores
(2007) num estudo efectuado em guas para consumo obtiveram valores de resistncia
de 12% para este antibitico.
A existncia de multiresistncia tem sido referida em estudos anteriores
(Morita et al., 1994; Radu et al., 2003; Ottaviani et al., 2006) e est de acordo com os
nossos resultados. Neste trabalho todas as estirpes estudadas apresentaram resistncia a
trs ou mais antibiticos.
Tabela 7- Resistncia a mltiplos antibiticos das espcies de Aeromonas
Fnotipo de Resistncia Isolados
AML, KF; E F8; F5B2; F27.2
AML; AMC; KF F7R
AML; TIC; KF; E P6
AML; AMC; KF; S F7A
AML; TIC; TIM; KF; E F2.1; F1BA2.1; F1BA2.2
AML; AMC; TIC; TIM; KF F2.2a2
AML; AMC; TIC; KF; E F5B1
AML; TIC; KF; S; E F27.1b; F1BC1a1; F1BC1a2
AML; AMC; TIC; TIM; KF; E P2.1a; F4A; F24.2; F25.1; F25.2.1; F25.3; N1.1; P31b1
AML; TIC; TIM; KF; S; E; F1BC2; F1BA1; F1BA3
AML; AMC; TIC; TIM; KF; S P5.1.1
AML; TIC; KF; S; E; SXT F27.1a
AML; AMC; TIC; TIM; KF; S; E F9; F9Ap; P4.2
AML; TIC; TIM; KF; FOX; NA; E P1a1
AML; AMC; TIC; TIM; IMP; KF; S; E P2.1b
AML; AMC; TIC; TIM; KF; FOX; NA; S; E P3.1a; P3.1aa

Huddleston e colaboradores (2006) referem no entanto a inexistncia de
estirpes multiresistentes. Dos 34 isolados submetidos ao teste de sensibilidade a
antimicrobianos, 38% apresentaram resistncia a seis antibiticos e 11,7% a sete, em


combinaes diferentes. de referir que em 6% das estirpes analizadas se detectou
multiresistncia a nove antibiticos, sendo que a combinao dos antimicrobianos
verificada a mesma. Estas estirpes foram identificadas como Aeromonas caviae, dados
estes que corroboram com os obtidos para a mesma espcie por Costa e colaboradores
(2003). Apesar da espcie A. caviae ser considerada de menor patogenicidade, quando
comparada A. hydrophila a presena de estirpes dessa espcie, resistente a um amplo
espectro de antimicrobianos, deve ser motivo de preocupao.
A estirpe onde se detectou a ocorrncia de resistncia a oito antibiticos, entre
os quais imipenemo, foi a espcie Aeromonas eucrenophila. A multiresistncia
amoxicilina, cefalotina e eritromicina foi detectada em 9% das estirpes analisadas,
verificando-se a presena de resistncia amoxicilina e cefalotina em 100% das
estirpes.

5. CONSIDERAES FINAIS
____________________________________________________________________________________

Consideraes Finais


As amostras de gua no tratada para consumo humano, utilizadas neste
trabalho so provenientes de fontes, poos e nascentes, cujo controlo e frequncia na
monitorizao da qualidade microbiolgica destas guas dever ser de acordo com o
Decreto-lei 306/2007, sendo esta no entanto escassa ou nula. Pois estas guas no so
distribudas pelas entidades gestoras responsveis por essa distribuio, logo no existe
obrigatoriedade da realizao desta anlise. Desta forma o risco de transmisso de
bactrias patognicas ou comensais elevado.
O isolamento e a identificao de diferentes espcies de Aeromonas nas guas
no tratadas nesta regio, sugerem uma elevada prevalncia destas espcies, e refora a
afirmao dos riscos que estas guas representam para a sade pblica pelo seu
consumo directo ou como veculo de contaminao de alimentos.

A sequenciao dos genes gyrB, gyrA e rpoD utilizados na metodologia para
identificao dos 34 isolados obtidos neste estudo mostraram ser bastante eficazes, o
que possiblitou a identificao de sete espcies distintas Aeromonas hydrophila,
Aeromonas eucrenophila, Aeromonas caviae, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii,
Aeromonas bestiarum e Aeromonas encheleia. de referir que a espcie Aeromonas
tecta ainda no tinha sido descrita em isolados ambientais, tendo sido possvel a sua
deteco neste trabalho pelas ferramentas utilizadas.

A anlise filogentica demonstrou a existncia de um grupo de estirpes que,
com base na sua relao com as restantes espcies do gnero Aeromonas poder
representar uma espcie no descrita deste gnero.

No que se refere aos perfis de susceptibilidade aos antibiticos testados
conclui-se que a piperaciclina, o aztreonamo, as cepalosporinas de 3 e 4 gerao e a
ciprofloxacina apresentavam boa actividade contra Aeromonas spp.
Detectou-se multiresistncia em todos os isolados, sendo de salientar que em
6% das estirpes analisadas foi observada multiresistncia a nove antibiticos.
Os resultados alertam para o facto de que isolados da mesma espcie podem
apresentar comportamentos de susceptibilidade diferente aos grupos de antibiticos.

6. BIBLIOGRAFIA
___________________________________________________________________________

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ANEXOS
_______________________________________________________

Anexo I
Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por 16s RNA

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

AML AMC TIC TIM PRL TZP ATM IMP KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE
F1AA R R
10
R R
10
R
11
S R R R R
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10
S R S S R
14
I
14
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10
S S S S S S S S S S R I16 S S
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17
R
17
R R
11
R S S R R
12
R
15
R R S S R
14
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R
10
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8
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12
S R
9

F11B R R R R S S R S R R S R R S S S S S S S S S S R R
10
S S
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10
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14
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S S
F281a R R R R S S S R
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S S S S S S R R
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S S
F281b R R R R S S S R
11
R R S R
11
I
17
I
18
S R I
17
S S S S S S R R
12
S S

Anexo II
Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por gyrB, gyrA e
rpoD

ND-No determinado

AML AMC TIC

TIM

PRL TZP ATM IPM KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE
F2.1 R S R R
10
S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S
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R
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N1.1 R R R R S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S

AML AMC TIC TIM PRL TZP ATM IMP KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE
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