A.

PROBOTICE
I. Introducere
n ultimii ani, probioticele comercializate sub form de alimente, suplimente alimentare cu
bacterii vii sau produse farmaceutice au atras tot mai mult interesul att al cecettorilor ct i al
consumatorilor. Interesul public general de descoperire a unui stil de via sntos, mpreun cu
preocuparea medicilor de a descoperi terapii neinvazive i lipsite de reacii adverse, au reorientat
atenia pe rolul potenial benefic al microbiotei umane n prevenirea i tratarea diferitelor boli.
Modularea microbiotei intestinale poate fi influenat pozitiv prin consumarea de probiotice
i/sau prebiotice. n cuprinsul acestui articol ne propunem s prezentm structura bacteriilor lactice
cu potenial probiotic, mecanismele de aciune, interaciunile cu celulele corpului uman i cu
bacteriile patogene, precum i tendinele actuale n utilizarea probioticelor pentru prevenirea i
tratarea unor afeciuni dermatologice, care au reprezentat motivaia acestei teze de doctorat.
II. Evoluia conceptului de probiotic

Spre sfritul secolului al XIX-lea, numeroi cercettori descoperiser c o gam larg de
iaurturi au un termen de valabilitate mai extins i un gust mai plcut. Microbiologii au extins
cercetrile de la bacteriile lactice din laptele fermentat la bacterilei lactice specifice organismului
uman. Escherich, n 1885, a fost primul care a recunoscut importana bacteriilor existente n tractul
intestinal i a subliniat rolul acestora n fiziologia digestiei, precum i n patologia i terapia bolilor
intestinale de cauz infecioas. n 1900, doi microbiologi, Tissier i Moro, au prezentat studiul lor
privind prezena anumitor bacterii n fecalele nou-nscuilor hrnii cu lapte. n 1908, au completat
studiul, artnd o predominan a Bacillus bifidus n fecalele sugarilor hrnii la sn, comparativ cu a
celor hrnii cu lapte-formul, unde era predominant Bacillus acidophillus.
Ilia Ilici Mecinikov, laureatul Premiului Nobel pentru Medicin, n 1908, a fost primul care a
formulat ipoteza tinific privind caracterul probiotic (pentru via) al unor bacterii[1], chiar dac
termenul probiotic care descria substane produse de microorganisme, capabile de a iniia i
susine creterea altor microorganisme, fusese inventat de Lilly i Stillwell n 1965[2].
Munca sa se bazeaz pe organisme izolate anterior, n 1905, de Grigoroff, utiliznd culturi
starter pentru iaurtul bulgresc, i denumindu-le Lactobacillus bulgaricus. n timpul procesului,
Grigoroff a identificat un alt microorganism, Streptococcus termophilus, care ns nu a fost cercetat
suficient, fiind considerat pe atunci patogen. Experimentele lui mecinikov l-au condus pe acesta s
afirme c L. Bulgaricus este capabil de a popula flora intestinal i de a preveni multiplicarea
bacteriilor patogene. Urmtoarele experimente, ale lui Herter i Kendall n 1908 au euat n a
demonstra aderena acestui Lactobacil n flora intestinal, dar au subliniat alte aspecte benefice ale
prezenei Lactobacilului n flora intestinal.
Ulterior, numeroi oameni de tiin au ncercat s demonstreze capacitatea de populare a
intestinului cu anumite tulpini de L. acidophyllus, precum i modificrile benefice pe care le poate
produce. Rettger i Horton n 1914 i Rettger i Cheplin n 1920 au prezentat concluzia unor studii
care demonstrau modificare microflorei intestinale, prin obinerea unor culturi predominante de L.
acidophyllus i B. biffidus, prin hrnirea cu lapte sau lactoz a cobailor, apoi in studiu clinic. Acest
studiu a strnit interesul comercial pentru obinerea de produse fermentate coninnd L. acidophyllus
(Burke, 1938). Alte cercetri i-au aparinut lui Minoru Shirota din Japonia, care a subliniat
potenialul caracter terapeutic obinut prin modularea microflorei intestinale. n 1930, el reuete s
izoleze o tulpin de Lactobacillus capabil s reziste pasajului gastro-intestinal. Ulterior, cultura
identificat a fost denumit Lactobacillus casei tulpina Shirota i utilizat cu mare succes n
obinerea produsului Yakult, produsul companiei cu acelai nume, fondat n 1935. Perioada dintre
1930 i 1950 este srac n studii i cercetri din cauza condiiilor neprielnice din timpul rzboiului.
Interesul pentru microflora intestinal uman renate spre nceputul anilor 1960 i conduce spre un
nou concept al termenului probiotic.
Fuller redefinete termenul ca fiind suplimente pentru hrana oragnismelor vii animale, care
afecteaz benefic gazda prin mbuntirea echilibrului florei intestinale.[3] O definiie mai recent,
dar nicidecum ultima, definete probioticele ca microorganisme vii care, administrate oral, n
cantiti adecvate, confer un efect benefic asupra gazdei [4]. n conformitate cu aceast definiie,
care a fost adoptat i de o Comisie de Experi [5,6,101,102] microorganismele probiotice nu trebuie
neaparat s colonizeze intestinul uman, ci trebuie s fie viabile i s se gseasc ntr-o concentraie
suficient pentru a-i exercita efectul dorit, de a spori capacitatea de protecie a florei comensale
mpotriva interaciunilor competiionale, antagonizrii patogenilor i/sau producerii de factori
antimicrobieni bacteriocinele. n alte condiii clinice care presupun infecii cronice sau
imunosupresie, interacinea dintre microflora probiot i imunitatea gazdei poate fi cu mult mai
relevant n demonstrarea eficacitii probioticelor.
Probioticele pot fi comercializate ca suplimente alimentare, aditivi alimentari sau produse
farmaceutice.
Comercializarea unei tulpini probiotice ca i produs farmaceutic necesit demonstrarea unei
inte terapeutice bine definite, utilizndtrialuri clinice bine proiectate, care trebuie s fie controlate,
randomizate i verificate dublu-orb [5-7]. Mai mult dect att, sunt necesare studii care s
demonstreze stabilitatea i sigurana administrrii pe mucoasele diferitelor aparate. [5-8]. Diferite
beneficii atribuite probioticelor sunt raportate n literatura de specialitate, cele mai multe viznd
tulburrile gastro-intestinale[5-14], ns cteva ofer dovezi clare asupra beneficiilor aduse de
probiotice la nivelul altor organe- int, cum este cazul vaginitelor bacteriene.[15]
Scopul acestui articol de documentare este acela de a explora complexitatea multidisciplinar
a cercetrilor desfurate pe probiotice, astfel inct s putem dezvolta o nou posibil aplicaie
farmacologic a bacteriilor lactice n prevenirea i tratarea unor afeciuni dermatologice pentru care
tratamentele consacrate s-au dovedit ineficiente sau a trebuit s se asume riscul efectelor secundare
sau reaciilor adverse inerente.

III. Definiie
Termenul probiotic a fost iniial utilizat ca i antonim al cuvntului antibiotic. Etimologia
cuvntului se afl n limba greac: =pentru i =via (Hamilton-Miller, Gibson & Bruck,
2003). Originea primei utilizri a termenului poate fi detectat n 1953, de ctre Kollath, care l
utilizeaz pentru a descrie restabilirea sntii unor pacieni subnutrii cu diferite suplimente
organice i anorganice. Un an mai trziu, Vergin 1954 susine c dezechilibrul produs n
organism de tratamentul antibiotic poate fi restabilit printr-o diet bogat n probiotice; o sugestie
citat ulterior ca fiind prima referin la probiotice, aa cum sunt ele definite astzi. Similar cu
aceasta, n 1955, Kolb recunoate efectele nedorite postantibiotice i propune terapia profilactic cu
probiotice. Mai trziu, Lilly i Stillwell, n 1965, definesc probioticele ca substane produse de un
microorganism care susin creterea altor microorganisme. Similar cu aceasta, Sperti n 1971 i
Fuji&Cook n 1973 descriu probioticeleca i compui care fie stimuleaz creterea microbian,
fie mbuntesc rspunsul imun al gazdei, fr a inhiba in vitro creterea culturii. O alt
definiie oferit de Parker n 1974 se aseamn cu descrierile recente ale probioticelor organisme
sau substane, care contribuie la meninerea echilibrului microbian intestinal. Aceast definiie
a fost contestat de muli autori , deoarece puteau fi incluse multiple substane n aceast categorie,
inclusiv antibiotice.
Sfritul anilor 1980 i nceputul anilor 1990 a cunoscut un val de noi i diferite definiii ale
probioticelor. O definiie frecvent citat este cea a lui Fuller din 1992, care definete probioticele ca
suplimente pentru hrana oragnismelor vii animale, care au efecte benefice asupra gazdei
animale prin mbuntirea echilibrului florei microbiene intestinale. Aceast definiie prea c
se adreseaz i are aplicabilitate mai mult pe animale dect pe oameni. Ali autori au mers pe aceast
linie, oferind propriile versiuni. Cteva din aceste definiii sunt listate n Tabelul 1.
Dei toi autorii citai au fost de acord c termenul probiotic se refer la microorganisme vii,
Salminen, Ouwehand, Benno i Lee n 1999 i-au prezentat propria versiune, incluznd i bacterii
neviabile n definiie.Urmnd recomandarea FAO/WHO asupra evalurii probioticelor ca aditivi
alimentari, n 2002, definiia sugerat descria probioticele ca microorganisme vii, care
administrate n doze adecvate confer beneficiu asupra sntii gazdei. n consecin, o larg
varietate de specii i genuri pot fi considerate potenial probiotice. (Holzapfel, Haberer, Snel,
Schillinger & Huisint Veld, 1998); din punct de vedere comercial, cele mai importante tulpini sunt
cele de bacterii lactice. (LAB)
Tabel 1.
Definiii i descrieri ale termenului probiotic de-a lungul anilor
Anul Descriere Sursa
1953 Probioticele sunt comune n legume ca vitamine, substane
aromatice, enzime si, eventual, alte substane legate de procese
vitale
Kollath
1954 Probioticele sunt opusul antibioticelor Vergin
1955 Efectele nocive ale antibioticelor pot fi prevenite prin
tratamentul cu probiotice
Kolb
1965 O substan secretat de un microorganism care stimuleaz
creterea alteia
Lilly and Stillwell
1971 Extracte tisulare care stimuleaz creterea microorganismelor Sperti
1973 Compuii care construiesc rezistena la infecii, n gazd, dar nu
inhib creterea microorganismelor in vitro
Fujii and Cook
1974 Organisme i substane care contribuie la echilibrul microbian
intestinal
Parker
1992 Supliment pentru hrana organismelor vii microbiene, care
afecteaz benefic animalul gazd prin mbuntirea echilibrului
microbian
Fuller
1992 Cultur mono-sau mixt de microorganisme viabile care,
aplicate la animale sau la om, au un efect benefic asupra gazdei
prin mbuntirea proprietilor microflorei indigene
Havenaar and
Huis intVeld
1996 Culturi microbiene sau produse lactate avnd culturi lactice care
influeneaz benefic sntatea i nutriia gazdei
Salminen
1996 Microorganisme vii care, la ingerarea n anumite doze, exercit
beneficii pentru sntate, altele dect cele ale hranei de baz
Schaafsma
Anul Descriere Sursa
1999 Preparate de celule microbiene sau componente ale celulelor
microbiene, care au un efect benefic asupra sntii i
bunstrii gazdei
Salminen,
Ouwehand, Benno
and Lee
2001 Un preparat sau un produs care conine microorganisme viabile,
definite n numr suficient, care modifica microflora (de
implantare sau colonizare), ntr-un compartiment al gazdei i
care exercita efect benefic asupra sntii gazdei
Schrezenmeir and
de Vrese
2002 Microorganisme vii care, atunci cnd sunt administrate n
cantiti adecvate confer un beneficiu asupra sntii gazdei.
FAO/WHO


IV. Taxonomie i caracteristicile importante ale bacteriilor lactice
Genurile Lactobacillus i Bifidobacterium sunt cele mai utilizate ca probiotice i de aceea vor
reprezenta genurile la care voi face referire n acest articol. Diferitele specii din genul Lactobacillus
i Bifidobacterium pot include presupuse tulpini probiotice (Tabel 1.), dar numai cteva din aceste
tulpini sunt considerate importante i utilizate n prepararea suplimentelor alimentare i produselor
farmaceutice.

Genul Lactobacillus
Lactobacilii sunt celule Gram+ sub form de bastonae sau cocobacili, bacterii lactice
nesporulate (LAB), specii bacteriene capabile s produc acid lactic ca produs final de fermentaie a
carbohidrailor. n conformitate cu Schema Taxonomic a Procariotelor [Taxonomy and important
features of probiotic microorganisms in food and nutrition], genul Lactobacillus (descris prima dat
de Beijerinck n 1901) aparine:
ncrengturai Firmicutes
Clasa Bacilli
Ordin Lactobacillales
Familia Lactobacillaceae
i este organizat n grupuri filogenetice 8 grupuri dup Dellaglio i Felis. Genul Lactobacillus este
extrem de eterogen coninutul de guanin i citozin din structura ADN-ului variind de la 32% la
54%,incluznd 132 de specii i 27 de subspecii, a cror clasificare este ntr-o continu dinamic.
Cea mai rapid cale de identificarea a unei specii de Lactobacili este combinarea unor teste
fenotipice (teste de carbohidrai) i metode moleculare avansate (secvenierea total sau parial a
genei 16S din ARN, electroforez pe gel n cmp pulsat i hibridizare ADN-ADN).[6,19,31-35]
O identificare i o denumire corect a microorganismelor probiotice este fundamental pentru
urmrirea tulpinilor probiotice i pentru asigurarea securitii unor mrci nregistrate ale unor
produse probiotice.[34]
Lactobacilii sunt aproape ubiquitari, fiind prezeni n mncare, plante, mucoasele
membranelor animale sau umane (respiratorii, gastro-intestinale, genitale, orale) [31,32].

Genul Bifidobacterium

Bifidobacteriile sunt celule Gram+ polimorfe, sub form de bastonae, nesporulate i
anaerobe, cu un metabolism de tip fermentativ (producnd acid, dar nu i gaz din carbohidrai).
Conform Clasificrii Taxonomice a Procariotelor, genul Bifidobacterium aparine:
ncrengtura Actinobacteria
Clasa Actinobacteria
Subclasa Actinobacteridae
Ordinul Bifidobacteriales
Familia Bifidobacteriaceae
Coninutul de guanin-citozin din structura ADN-ului variaz de la 42% la 67% [31]. Genul
Bifidobacterium include 29 de specii i 6 subspecii [31]. Aceleai metode de identificare filogenetic
i molecular care se aplic la Lactobacili, sunt utilizate i pentru identificarea Bifidobacteriilor.
[33,34]. Bifidobacteriile sunt ntlnite att la animale, ct i la om, n special se izoleaz din fecale,
vagin i carii.[31]
Bacteriile lactice sunt microorganisme Gram pozitive, capabile s produc o cantitate mai mare
sau mai mic de acid lactic, prin degradarea diverselor substraturi:
- hexoze: bacteriile care degradeaz 95% din glucoz n acid lactic sunt denumite
homolactice;
- acidul malic: transformarea acidului malic in acid lactic, cunoscut sub numele de fermentaie
malolactic.
Alte substraturi degradate de bacteriile lactice sunt: pentozele, acidul tartric, acidul citric,
glicerolul.


MORFOLOGIA BACTERIILOR LACTICE
Structura general a celulei bacteriene se apropie de aceea a celulei vegetale. Forma
bacteriilor este un caracter destul de stabil, de aceea constituie unul dintre criteriile fundamentale
ale clasificrii acestor microorganisme.
Bacteriile lactice se prezint la microscop de forme variate. Astfel se disting: coci, de form
rotunjit sau oval i bacili sau bastonae, de form cilindric, mai mult sau mai puin groase,
uneori sinuoase. Cocii au diametrul de la 0,4 pana la 1,0m, iar bacilii au grosimea de 0,5 m i
2-5 m sau mai mult n lungime.
Atunci cnd dou celule de coci, rezultate n urma unei diviziuni, se separ imediat, apar la
microscop drept coci izolai; cnd rmn alipite un anumit timp, apar ca grupri celulare
caracteristice: diplococi (celule alipite cte dou), streptococi (celule n irag), sarcini (celule n
aglomerri cubice), stafilococi ( celule n aglomerri neregulate).
Bacilii, ca i cocii, pot rmne alipii dup diviziune, formnd diplobacili sau streptobacili,
nlnuiri prezentnd aspect de filamente mai mult sau mai puin lungi, mai mult sau mai puin
sinuoase. Lungimea filamentelor depinde de condiiile de cultur, n special pH-ul mediului,
temperatur, prezena alcoolului, viteza de multiplicare i agitaia lichidului.
STRUCTURA CELULEI LA BACTERIILE LACTICE
Bacteriile sunt celule procariote. Ele se deosebesc esenial de celulele eucariote (celulele vegetale
i animale) att prin talia net inferioar, ct i prin organizarea lor, caracterizat de absena
membranei ce separ nucleul de citoplasm i prin mecanismul lor de diviziune. Marea varietate a
bacteriilor se datoreaz mai curnd diferenelor n ceea ce privete metabolismul i fiziologia lor
dect deosebirilor morfologice.
Structura tuturor celulelor bacteriene este foarte asemntoare i cuprinde trei elemente
principale: nveliul celular, citoplasma i nucleul.
NVELIUL CELULAR
nveliul celular cuprinde peretele i membrana. Celula este delimitat de membrana
citoplasmatic, dublat spre exterior de perete. Constituia membranei este relativ constant, n
schimb a peretelui este mai variabil i permite diferenierea unor grupe mari de bacterii. ntre perete
i membran, spaiul periplasmic este un gel mai mult sau mai puin fluid n care se deplaseaz
proteina. Peretele care dubleaz membrana citoplasmatic poate fi el nsui nconjurat de un nveli
exterior de natur organic vscoas, ea este perfect delimitat, constituind capsula. Importana sa
este adesea legata de condiiile de cultur. La unele specii sau sue, capsula polizaharidic, adesea
groas, particip la rezistena bacteriei contra unor agresiuni.

PERETELE CELULAR
Peretele este scheletul rigid al celulei; el d celulei forma sa caracteristic sferic sau cilindric.
Foarte solid, el rezist la presiunea osmotic intracelular enorm, care poate varia ntre 5 i 20
atmosfere. Plasat ntr-un mediu hipotonic, far el, celula se sparge; de aceea este un element
esenial.
Comportamentul celulelor n timpul testului colorat se explic prin structura peretelui: la Gram
(+), peptiloglicanul este gros i este singurul constituent, la cele Gram(-), el este mai subire i
acoperit de membrana exterioar.
Substraturile nutritive, ionii minerali, vitaminele, apa traverseaz liber peretele, la fel ca i
produii metabolismului bacterian. De asemenea, peretele asigura alte funcii importante n viaa
celulei: este suportul antigenelor specifice i receptorilor bacteriofagilor.
Constituentul principal i caracteristic al peretelui celulei bacteriene este peptidoglicanul, care
este o macromolecul enorm ce nconjoar celula printr-o reea de lanuri polizaharidice i
peptidice. Lanurile polizaharidice, lineare, paralele sunt reunite ntre ele prin puni peptidice.
MEMBRANA CITOPLASMATIC
Membrana celulei bacteriene are aceeai structur fundamantal ca i celelalte membrane
biologice, fiind un dublu strat fosfolipidic n care sunt inserate proteine.
Membrana citoplasmatic este unul dintre elementele vitale ale celulei bacteriene. Alterarea sa
ncetinete schimbul cu mediul i mpiedic meninerea pH-ului intracelular. n special,
mecanismele generatoare de energie care se deruleaz la nivel membranar sunt inhibate i
viabilitatea celulelor este afectat.
Lipidele membranare constituie totalitatea lipidelor bacteriene (95-99%). Ele cuprind puini acizi
grai liberi dar mai ales glicerofosfolipide. Acizii grai din constituia lipidelor au lanuri carbonate
de 10-20 atomi de carbon. Majoritatea sunt acizi cu 16-18 atomi de carbon, saturai sau nu. La
bacteriile lactice exist i un acid ciclopropanic n C
19
- acidul lactobacilic.
Acizii grai posed o caten lung hidrocarbonat i o funcie acid carboxilic terminal.
Lungimea catenei, nesaturarea ei, conformaia cis- sau trans- a dublelor legturi i, pentru bacteriile
Gram pozitive, ramificarea izo- sau anteizo- caracterizeaz aceste molecule.
Sinteza acizilor grai este realizat prin condensri succesive ale malonil-CoA pe acidul acetic
pentru catenele cu numr par de atomi de carbon i pe acidul propionic pentru catenele cu numr
impar de atomi de carbon. Acizii nesaturai sunt sintetizai la bacteriile anaerobe prin aciunea unei
dehidrataze asupra acidului hidroxidecanoic format prin adiia unei uniti malonil asupra acidului
octanoic. Prelungirea progresiv a acestui acid conduce la acidul cis-vaccenic (C
18
), el nsui
precursor al acidului lactobacilic (C
19
). Aceast ultim trecere de la un acid nesaturat la acidul
ciclopropanic corespunztor se realizeaz prin metilarea dublei legturi.
Fosfolipidele cele mai abundente sunt constituite dintr-o molecul de glicerol la care o funcie
alcool primar i funcia alcool secundar sunt esterificate de acizii grai. Cealalt funcie alcool
primar este esterificat de acidul fosforic, el nsui esterificat de o nou molecul de glicerol.
Bacteriile lactice conin, de asemenea, difosfatidil glicerol i esteri aminai ai fosfatidil glicerolului
cu alanina i lizina. Coninutul n fosfolipide al bacteriilor variaz n funcie de stadiul de cretere i
de condiiile de cultur.
Glicolipidele, n general glicozide ale digliceridelor, se formeaz prin legtur ozidic la nivelul
funciei alcool primare a unei gliceride cu un mono sau dizaharid glucoz, fructoz, ramnoz.
Proteinele sunt de dou feluri: proteine intriseci (70%), care fac parte complet din membran i
proteine periferice (30%). Primele sunt integrate n lipide prin partea lor hidrofob. Partea lor
hidrofil iese la suprafa la interior sau la exterior. Proteinele periferice sunt legate prin interaciuni
slabe de proteinele integrate sau de lipide.
La interiorul dublului strat, proteinele sunt relativ mobile lateral. Fluiditatea membranei este
legat de constituia sa n acizi grai. Astfel, de exemplu, bacteriile se pot adapta la o diminuare a
temperaturii crescnd proporia de acizi grai nesaturai.
CITOPLASMA
Citoplasma conine enzimele metabolismului bacterian, dar reprezint i sediul sintezei
proteinelor. Ansamblul metabolismului, reacii de degradare i de sintez se realizeaz n mod
programat, n funcie de schimburile cu mediul exterior pentru a produce energia necesar creterii.
La microscopul electronic cu transmisie, interiorul unei celule bacteriene apare granulos. Acest
aspect este dat de ribozomi, care au un rol esenial n sinteza proteinelor, ei asigurnd traducerea
codului genetic. Ribozomii sunt formai din dou subuniti de talie diferit, 50 S i 30 S. Ribozomul
asamblat are o constant de sedimentare de 70 S (Svedberg). Subunitatea 30 S conine o molecul de
ARN ribozomal 16 S (1542 nucleotide) i 21 molecule de proteine diferite. Masa molecular a
acestui ansamblu este de 900 Da. Subunitatea 50 S conine dou molecule de ARN ribozomal,
molecula 23 S i molecula 5 S de 2904 i 120 nucleotide. Ea conine, de aemenea, 35 proteine i are
o mas molecular de 1600 kDa.
NUCLEUL I MATERIALUL GENETIC
Cromozomul bacterian este reprezentat de o singur molecul de ADN, de form circular i de
talie diferit, n funcie de specie: 2400 kilobaze la Lactobacillus plantarum, 1400 kilobaze la
Leuconostoc oenos, 1200 kilobaze la Pediococcus pentosaceus. Cromozomul nu este separat de
citoplasm printr-o membran. El este localizat n partea central a celulei dar pare ataat n mai
multe de membrana citoplasmatic, n special la nivelul mezozomului. Pot exista mai multe nuclee n
celul deoarece diviziunea nucleului i a celulei nu sunt sincrone.
Secvena nucleotidic dup care sunt asamblate cele patru nucleotide caracterizate de cele patru
baze A, T, G i C constituie suportul genetic care este decodat n timpul traducerii.
Cromozomul codific majoritatea informaiilor privind funciile vitale ale celulei, dar o serie de
funcii, mai mult sau mai puin vitale, sunt determinate de plasmide, mici molecule de ADN
circulare, complet independente de cromozom. Ele sunt n numr i talie variabile dup speciile i
suele de bacterii i determin, n general, funcii ca alimentaia anumitor zaharuri, hidroliza
proteinelor, rezistena la fagi, la antibiotice, la metale grele etc. Plasmidele se divizeaz dup acelei
principiu de replicare ca i cromozomul sau n moduri mai specifice dar n orice caz n mod total
independent. Una dintre caracteristicile plasmidelor este instabilitatea lor astfel nct anumite
caractere fenotipice pot fi pierdute spontan n cursul generaiilor, dar adesea exist mai multe copii
pe celul ale unor plasmide.
CARACTERISTICI ALE LACTOBACILILOR
Genul Lactobacillus cuprinde specii oarecum asemntoare, dar morfologia i gruparea celulelor
lor permit diferenierea acestora, unele specii prezint numeroase caractere metabolice identice,
precum capacitatea de a asimila numeroase substraturi.
Diferenierea speciilor de bacterii lactice se bazeaz pe morfologia lor i pe caracterul
homofermentativ sau heterofermentativ al acestora. Bacteriile homofermentative produc peste 85%
din acidul lactic pornind de la glucoz. Bacteriile heterofermentative produc, n afar de acid lactic,
CO
2
, alcool etilic i acid acetic.
Lactobacilii pot prezenta ambele componente i sunt mparii n trei grupe:
strict homofermentativi (grupa I);
heterofermentativi facultativ (grupa a II-a);
heterofermentativi obligatoriu (grupa a III-a)
Lactobacilii homofermentativi strict nu fermenteaz pentozele i formeaz, pornind de la o
molecul de glucoz, dou molecule de acid lactic pe calea Embden-Meyerhoff. La
heterofermentativii facultativ, din glucoz rezult, de asemenea, dou molecule de acid lactic, dar
pentozele sunt metabolizate n acid lactic i acid acetic pe calea heterofermentativ a
pentozofosfailor. Bacteriile heterofermentative obligatoriu nu posed fructozo-1,6-difosfat-aldolaza,
caracteristic pentru calea Embden-Meyerhoff. Ele metabolizeaz glucoza pe calea pentozofosfailor
n CO
2
, acid lactic, acid acetic i alcool etilic; pentozele sunt transformate n acid lactic i acid acetic,
ca i n cazul bacteriilor din grupa a II-a.



Tabelul 2.

Bacili Heterofermentativi facultativ
(grupa a II-a)
Lactobacillus casei
Lactobacillus plantarum
Heterofermentativi obligatoriu
(grupa a III-a)
Lactobacillus hilgardii
Lactobacillus fructivorans
Lactobacillus brevis

Determinarea genului bacteriilor lactice din genul Lactobacillus
Morfologie Celule alungite
Bacili
Aranjarea celulelor Perechi sau lnioare
Fermentarea glucozei Heterofermentativ sau
homofermentativ
Izomerul acidului lactic L, D sau D, L

Pentru stabilirea cu rigurozitate a speciei de bacterie probiotic se impun metode fenotipice i
genotipice (bazate pe structura ADN) [6]. Denumirea bacteriei trebuie s fie conform cu Lista
Denumirilor Aprobate pentru Bacterii [6,104] sau lista de validare publicat n Jurnalul Internaional
de Microbiologie Sistematic i Evolutiv [6,105] sau n Codul Internaional al Nomenclaturii
Bacteriilor [5,31]. Pnetru stabilirea cu exactitate a tipului de tulpin, electroforeza pe gel n cmp
pulsat este standardul maxim [6,26]. Tulpina probiotic trebuie depozitat ntr-o colecie de culturi
recunoscute i standardizate genomic.
V. Mecanisme de aciune
Modularea sistemului imunitar
esutul limfoid intestinal este cel mai mare n dimensiuni comparativ cu alte zone ale
corpului. Este binecunoscut faptul c bacteriile sunt extrem de importante pentru dezvoltarea i
funcionarea sistemului imunitar la acest nivel, fiind de fapt mecanismul de aprare mpotriva
infeciei cu ageni patogeni ( Cebra, 1999, Falk et al, 1998 ) . esutul limfoid intestinal are contact cu
componentele alimentare, antigenii i cu bacteriile benefice sau patogene . Antigenele, substane care
pot declana un rspuns imun, intr n organism prin mucoasa intestinal, care are un rol esenial n
controlarea imunitii la invazia bacteriilor patogene . Adaptabilitate la diferite antigene este extrem
de important dac avem n vedere c masa intestinal are o compoziie frecvent schimbat. Cea mai
mare cantitate de antigen este eliberat de la primul contact cu mucoasa intestinal ( Sanderson i
colab., 1993). Dup traversarea barierei epiteliale prin transcitoz, ele sunt restructurate printr-un
proces de degradare lizozomal. Un test suplimentar este prezena celulelor M (celule de epiteliu
folicular asociate cu esutul limfoid ), urmate de celulele T ( celule limfocitare aparinnd grupului de
celule albe din snge ), care sunt apoi difereniate ca celule care mediaz un rspuns imun i
promoveaz diferenierea celular i secretoare de IgA ( imunoglobulina A ) ( Strober i colab.,
1998). IgA este un anticorp care joac un rol crucial n imunitatea mucoaselor. Prin intermediul
receptorilor TLR ( Toll- like receptori ), celule dendritice ( DC) i celule T, probioticele duc la
scderea secreiei de TH-1 ( limfocite implicate ntr-un rspuns imun mbuntit ), IL-12
(interleukina care este produs n mod natural de celulele dendritice ), TNFa ( citokine inflamatorii )
i IFN- ( citokine care sunt vitale pentru imunitatea nnscut i dobndit), toate fiind responsabile
pentru izbucnirea proceselor inflamatorii intestinale.
Mecanismele prin care celulele epiteliale fac diferena dintre microorganisme probiotice i
patogene par s fie diferite. Bacteriile patogene induc un rspuns pro-inflamator n celulele epiteliale
prin activarea factorului de transcripie NF - kB. Comparativ cu aceste bacterii, speciile nepatogene
pot atenua rspunsul pro - inflamator prin blocarea acestui factor ( Neish et al., 2000) .
S-a constatat c administrarea de L. rhamnosus HN001 i Bifidobacterium lactis HN019 stimuleaz
activitatea limfocitelor citotoxice. Stimularea activitii limfocitelor citotoxice este corelat cu
secreia de IL - 12, o alt citokin implicat n activitile probioticelor, asemntor studiului n care
s-a administrat L. casei Shirota ( Takeda i colab., 2006 ) . Aceste studii sugereaz c probioticele
pot juca un rol important n stimularea activitii limfocitelor citotoxice care au un rol direct n
prevenirea dezvoltrii tumorilor maligne. De asemenea, se pare c rolul probioticelor n fagocitoz i
activitatea limfocitelor citotoxice este vital n special la vrstnici, care au un sistem imunitar
compromis ( Arunachalam et al., 2000, Gill et al., 2001, Gill et al., 2001).
Calitatea i cantitatea de probiotic din preparat influeeaz secreia de IL-8 prin intermediul
enterocitelor. IL-8 este asociat cu dezvoltarea inflamaiei intestinale. Date recente arat c atunci
cnd celulele epiteliului intestinal sunt incubate cu L. rhamnosus GG, este redus cantitateade IL-8
produsde enterocite(Zhang et Co., 2005). n multe cazuri, s-a observat c enterocitele produc IL-8 i
alte citokine n prezena probioticelor, precum IL-6 (Ruiz i Co., 2005). Stimularea IL-6 a fost
obinut prin administrarea L. casei CRL431 i a L. helveticus R389 (Vinderola i Co., 2005).
Deci, fiecare probiotic este caracterizat prin prisma influenei sale asupra sistemului imun.
Urmtorul obiectiv ar putea fi determinarea componentelor exacte din fiecare tulpin probiotic, care
ar fi direct implicate n declanarea rspunsului imun. Probioticele pot influena sistemul imunitar
prin diferii metabolii, prin componentele peretelui celular sau prin ADN.
Inhibarea bacteriilor patogene
Mediul gastrointestinal conine o mare varietate de elemente, de la flora benefic alimentar
i microbian la bacteriile patogene duntoare. Organismul mamiferelor lupt mpotriva acestor
bacterii patogene prin diferite moduri:
blocarea efectelor bacteriilor patogene prin producerea de substane bactericide i prin
competiie cu ageni patogeni i toxinele acestora necesare aderrii la epiteliul intestinal,
reglementarea raspunsurile imune prin creterea imunitii nnscute i modularea inflamaia
indus de agentul patogen, prin intermediul cilor semnalizatoare care regleaz rspunsul
receptorilor toll-like;
reglementarea homeostaziei epiteliului intestinal prin stimularea supravieuirii enterocitelor,
mbuntirea funciei de barier i stimularea rspunsurilor protectoare ( Corcionivoschi i
Co., 2009). Strategia se bazeaz pe capacitatea bacteriilor probiotice de a lega patogeni n
esutul epitelial intestinal. Aciunea anti-patogen a probioticelor const n producia de acid
lactic care scade pH-ul, interaciunea cu toxinele produse de agenii patogeni, producerea de
peroxid de hidrogen i sinteza bacteriocinelor.

Figura 1. Schema diferitelor mecanisme de aciune a probioticelor prin care se obin diverse efecte terapeutice
Producerea de substane antimicrobiene (bacteriocine), in situ, n intestin poate fi
mbuntit prin creterea capacitii bacteriilor probiotice de a adera la mucoasa intestinal.
Colostrul bovinelor conine substane care pot tripla capacitatea speciilor de Lactobacillus casei de a
adera la linie de celule intestinale. Cu toate acestea, producia in situ de substane microbiene
afecteaz microflora intestinal benefic a organismului gazd (Sanders, 1993). Studiile in vitro pe
linie de celule umane ajut la nelegerea modului n care probioticele reuesc s adere la epiteliul
intestinal. Ulterior, ele mimeaz bariera intestinal pe care microorganismele patogene trebuie s o
treac pentru a intra n circulaia sistemic i reuesc, cu ajutorul receptorilor, s lege aceste
microorganisme, mpiedicnd adeziunea la epiteliul intestinal i, deci, manifestarea efectelor
duntoare.
Inhibarea aciunii patogenilor se mai realizeaz i prin producerea unor metabolii, de
exemplu acidul lactic sau peroxidul de hidrogen, care creeaz implicit o scdere a pH-ului, la care
patogenii sunt oprii din dezvoltare (Apella & Co., 1992). Supernatantul derivat de la culturi de L.
rhamnosus Lcr35 au efect inhibitor asupra a nou tipuri de bacterii patogene: E. coli (ETEC), E. coli
(EPEC), Klebsiella pneumoniae, Shigella flexnerii, salmonella typhimurium, Enterobacter,
Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis i Clostridium difficile (Forestier & Co., 2001).
Eficacitatea probioticelor a fost demonstrat nu numai n ce privete tulburrile tractului
gastro-intestinal, dar i n prevenirea i tratarea infeciilor tractului uro-genital, fiind testate pe
pacieni sntoi, de sex feminin, diagnosticai cu infecii uro-genitale. Rezultatele testelor au sugerat
efectele benefice ale utilizrii probioticelor n prevenirea infeciilor de tract uro-genital. (Petricevici
& Co., 2008). Studiile ulterioare ar trebui s se axeze pe stabilirea cu o mai mare acuratee a
spectrului de aciune, a tipului de bacterie patogen, asociat cu stabilirea dozei eficace i a timpului
de derulare a tratamentului.
Pn n acest punct am prezentat mai mult sau mai puin exhaustiv mecanismele prin care
probioticele sunt implicate n prevenirea efectelor duntoare ale patogenilor, precum competiia
pentru nutrieni, inhibarea interaciunii patogenilor cu mucoasa intestinal, ocuparea competitiv a
siturilor de adeziune la substrat, producerea de metabolii cu rol inhibitor n multiplicarea bacterian
i stimularea imunitii mucozale (Steer & Co., 2000).

Orientri privind evaluarea microorganismelor probiotice
Tulpinile probiotice umane ar fi de preferat s aib o origine uman. Mai mult, dezvoltarea
unui probiotic include multe etape i stadii intermediare, precum descrierea caracteristicilor
fiziologice i metabolice, evaluarea proprietilor biologice (rezistena la secreiile gastrice, biliare i
pancreatice sau la spermicide pentru probioticele vaginale), producerea de compui antimicrobieni,
adeziunea la celulele epiteliale i colonizarea mucoasei, determinat n general prin teste in vitro, dar
mai ales eficacitatea terapeutic dovedit prin studii in vitro i in vivo preclinice i clinice [5-
14,26,36-38].
Pentru o presupus tulpin probiotic, este important de stabilit mecanismul de aciune. De
fapt, un singur mecanism de aciune pentru toate probioticele poate genera efecte diferite [39]. Dei
nu este esenial, este foarte util, din motive tiinifice, s se stabileasc mecanismul de aciune,
pentru a fi asociat cu orice efect fiziologic aprut. Multiplele interaciuni microb-microb sau microb-
gazd sunt observate pentru a stabili versatilitatea aciunilor probioticului i efectele sale asupra
patogenilor, asupra epiteliului intestinal sau asupra sistemului imunitar al gazdei. [4-6,8,22,39-44].
Multe tulpini probiotice pot produce in vitro una sau mai multe substane antimicrobiene peroxid
de hidrogen, acizi organici, diacetil, bacteriocine sau molecule bacteriocin-like- care pot proteja
gazda de invazia i multiplicarea patogenilor. Multiple mecanisme, altele dect activitatea
antimicrobian, pot fi de asemenea implicate:
adeziunea microbian competitiv la celulele peretelui intestinal prin receptori de legtur
pentru enteropatogeni
stimularea factorilor intrinseci de activare a sistemului imunitar. Oricum, niciunul din aceste
mecanisme de aciune nu s-a dovedit a fi componenta cheie n meninerea sntii umane, de
aceea cerecetrile n acest domeniu continu [9,41].
Pentru a studia proprietile funcionale i principiile de operare a coloniilor microbiene
intestinale, precum i a consecinei administrrii probioticelor, este important s studiem sisteme
model simplificate. Un studiu recent pe un cobai gnotobiotic (ale crui tulpini microbiene sunt
cunoscute) a oferit date despre cum microflora rezident i tulpini ale unor probiotice frecvent
utilizate i pot adapta substratul ca rspuns una alteia i ilustreaz att relaiile generale ct i pe cele
specifice dintre o gazd, un component al microbiotei indigene i o specie microbian administrat
intenionat [45].
Mai mult, tulpinile probiotice pot genera att rspuns imun nespecific, ct i specific la
subieci sntoi sau bolnavi [22,3640,42,46].
Una din cerinele de baz ale unui produs terapeutic este i sigurana terapeutic. De aceea,
tulpinile utilizate ca probiotice trebuie s fie sigure [6,11], dei teoretic, ele pot fi responsabile de
numeroase efecte adverse, incluznd infecii sistemice, efecte metabolice, imunodeprimare sau efecte
mutagene [8,13,26,39]. Corelaii documentate ale unor cazuri de infecii generate de consumul de
probiotice septicemie sau endocardit- sunt extrem de rare i ntlnite numai la pacieni
imunocompromii sau postoperator, unde translocaia bacterian este o cauz major de infecii ce
poate rezulta din multiplicarea bacterian extrem, i care produce creterea permeabilitii sau chiar
distrugerea barierei mucoasei intestinale i prbuirea sistemului imun [6,47]. Tulpina incriminat de
producerea infeciei a fost Lactobacillus rhamnosus GG, dar este foarte posibil ca identificarea la
nivelul genului sau speciei sa fi fost defectuoas [6,32,39,47]. Niciun studiu bine documentat despre
infecii produse de Bifidobacterii nu a fost raportat [6]. Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis,
Bacillus subtilis i Saccharomyces boulardii au fost suspectate i propuse ca poteniale cauze de
infecii clinice, n special septicemie [6,39].
Cteva proprieti intrinseci ale Lactobacillilor i Bifidobacteriilor, asociate sau nu cu
activitatea lor metabolic, au fost incriminate de a fi implicate n tulburri patologice umane. Aceste
proprieti includ deconjugarea i dehidroxilarea excesiv a srurilor biliare, degradarea stratului de
mucus intestinal de ctre glicozidaze i proteaze, alte activiti enzimatice, agregarea trombocitelor,
colonizarea i producerea de metabolii toxici i factori viruleni, precum i mutagenitatea
[6,23,26,32,39]. Mai mult dect att, este ectrem de important s cunoatem contraindicaiile
specifice fiecrui grup. Besselink & Co. Au demonstrat recent c utilizarea profilactic a
probioticelor poate fi asociat cu ischemie intestinal la pacienii cu predispoziie la pancreatit acut
sever [48].
Rezistena la antibiotice a LAB, inclusiv a Lactobacililor, poate aciona ca un rezervor de
gene rezistente la antibiotice, care pot prezenta un posibil risc asupra sntii, prin transferul acestor
gene asupra microbiotei indigene a TGI, i de aici la bacteriile patogene, oferind patogenilor o nou
surs de rezisten antibiotic, alta dect cea intrinsec. Speciile de Lactobacilli i Bifidobacterii pot
afia rezisten intrinsec non transmisibil (specie-dependent) sau o susceptibilitatea variabil la
cteva antibiotice i chimioterapice glicopeptide, aminoglicozide, metronidazol, acid fusidic,
cefalosporine, sulfamide, chinolone sau fluorochinolone. Genele care confer rezisten intrinsec au
fost caracterizate pentru speciile de Lactobacilli, dar sunt necunoscute pentru Bifidobacterii
[32,39,47,49-65,106]
Pentru speciile Lactobacillus i Bifidobacterium, niciun test de sensibilitate standard nu este general
acceptat. Institutul pentru Standarde Clinice i de Laborator a publicat n 2006 liniile directoare
pentru testarea sensibilitii antimicrobiene a bacteriilor izolate rar sau foarte pretenioase, incluznd
aici speciile de Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus, i au oferit puncte de reper interpretative
pentru a putea previziona succesul clinic [66]. Pentru a preveni transferul nedorit al genelor
responsabile de rezistena antibiotic bacteriilor endogene, probioticele umane sau animale nu ar
trebui s prezinte elemente mobile purttoare de rezisten. Evaluarea siguranei probioticelor ar
putea fi limitat la prezena markerilor transmisibili ai rezistenei la antibiotice. Din moment ce nu
exist limitri pentru a distinge tulpini probiotice cu rezisten transmisibil la antibiotice, au fost
definite n mod oficial pentru LAB sau Bifidobacterii, punctele de reper microbiologice sugerate de
Grupul tiinific pentru Aditivii i Produsele sau Substanele utilizate n Hrana Animalelor
(FEEDAP) sunt, n general, utilizate [52].
Un criteriu important pentru evaluarea funciilor probiotice este fundamentarea
funcionalitii acestora, caracterizat prin studii umane i pe animale, dar i prin analiza in vitro
pentru a gsi markeri valizi ai structurii i funciei n corpul uman (de exemplu, nivelurile grupelor
de microorganisme din fecale sau concentraii sanguine de markeri imunitari).
Grupul de lucru al FAO(Food and Agriculture Organization) recomand ca metodele standard pentru
evaluarea clinic s se desfoare n 4 stadii:
Faza I evaluarea siguranei
Faza II evaluarea eficacitii prin studii randomizate, dublu orb, controlate placebo i a
efectelor adverse
Faza III evaluarea eficienei terapeutice prin comparare cu un standard terapeutic (doar
pentru suplimentele alimentare i produsele farmaceutice)
Faza IV farmacovigilena. Rezultatele din trialurile pe indivizi trebuie repetate pentru
confirmare. n unele cazuri, modelele animale exist pentru a oferi fundamentarea efectelor
in vitro i determinarea mecanismelor de aciune ale probioticelor.
Testele ulterioare pentru studierea mecanismelor de aciune ale tulpinilor probiotice i impactul
acestora asupra activitilor metabolice ale microbiotei intestinale, ar putea s se bazeze pe cobai
model gnotobiotic mai elaborat, aa cum a fost propus de Sonnenburg & Co. [45].
n ceea ce privete caracteristicile tehnologice ale potenialelor tulpini probiotice, prezint o
egal importan stabilitatea genetic n timpul creterii, meninerea viabilitii pe perioada
conservrii, transportul i depozitarea [6,11,13,26,69,70].
Studiile diferiilor autori au artat c unele produse comerciale nu dein o identificare
adecvat i nici o cuantificare corect a UFC ale speciilor prezente[56,70-72]. Mai mult, unele
produse folosesc denumire incorect, care nu se regsete n clasificarea Colecia American a
Tipurilor de Culturi, de aceea nu are validitate tiinific. De aceea, produsele care au o utilizare
specific pentru sntatea uman sunt permise numai dup o evaluare atent a probioticelor-
medicamente, care trebuie obligatoriu s treac prin faza III a studiilor clinice [8].

VI. Proprieti ale bacteriilor lactice
LAB sunt, n general, microorganisme Gram+, lipsite de citocrom, care prefer condiii
anaerobe, dar sunt i facultativ aerobe, pretenioase, toleran la pH acid, strict fermentative,
producnd acid lactic ca i component de baz (Stiles&Holzapfel, 1997). Cele mai importante genuri
sunt: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc i
Bifidobacterium. Bazndu-ne pe coninutul de guanin-citozin, bacteriile Gram+ se impart n dou
ramuri filogenetice principale: ramura Actinomycetes, unde sunt incluse bifidobacteriile care au un
coninut crescut de G-C n structura ADN, mai mare de 55-67%, celelalte genuri, cu un coninut mai
mic de 55% fcnd parte din ramura Clostridium. Totui, datorit unor proprieti fiziologice i
biochimice asemntoare cu LAB tipice, bifidobacteriile sunt considerate ca fcand parte din grupul
mare al bacteriilor lactice. (Stiles&Holzapfel, 1997)
Microorganismele ce fac parte din grupul bacteriilor lactice sunt, n general, mprite n dou
grupuri distincte, lund n considerare metabolismul carbohidrailor. Astfel, grupul
homofermentativ constituit din Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus i civa
lactobacili utilizeaz calea glicolitic Embden- Meyerhoff-Parnas pentru a transforma glucoza n
acid lactic. n opoziie cu acest grup, grupul heterofermentativ produce amestecuri echimolare de
acid lactic, CO
2
, etanol i acid acetic din glucoz, pe calea pentozofosfailor. n acest grup includem
genurile Leuconostoc, Weissella i unii lactobacili. Exist ntre acetia i specii care sunt att
homofermentative, ct i facultativ heterofermentative.

VII. Criterii de selectare a Lactobacililor cu proprieti probiotice
Importana cunoaterii aprofundate a caracteristicilor fiziologice, fizico-chimice i biologice
ale tulpinilor de probiotice a fost subliniat n multiple articole, pe ea bazndu-se, de fapt, succesul
terapiei cu Lactobacilli. Pentru aceasta este necesar ca preparatul s ndeplineasc o serie de cerine:
tulpina trebuie s reprezinte un locatar normal al aparatului, non-patogenic, capabil s colonizeze
zona int i s elibereze bacteriile benefice n concentraii mari, de 10
7
-10
9
UFC/mL
-1
. Dei au
existat de-a lungul timpului numeroase criterii sugerate i recunoscute (Mattile-Sandholm,
Myllarinen, Crittenden, Fonden&Saarela, 2002; Ouwehand, Kirjavainen, Shortt&Salminen, 1999;
Reid, 1999), s-a realizat o list de criterii de ctre FAO/WHO, n 2002, expus n Tabelul 2,
Tabelul 2. Criterii de selectare a probioticelor i proprietile vizate

Criteriul Proprietatea
Sigurana Originea
Patogenitatea i capacitatea de infectare
Factori de virulen-toxicitate,activitate metabolic i proprieti intrinseci( rezistena antibiotic)
Tehnologia Tulpini stabile genetic
Viabilitate crescut n timpul procesrii i stocrii
Proprieti senzoriale bune
Rezistena la fagocitoz
Producere pe scar larg
Funcionalitatea Toleran la acid gastric i sruri biliare i pancreatice
Tolerana la aciunea biliar
Adeziunea la suprafaa mucoaselor
Criteriul Proprietatea
Efecte benefice asupra sntii validate i documentate
Proprieti fiziologice
dorite
Imunomodularea
Activitate antagonic mpotriva patogenilor gastrointestinali ( Helicobacter pylori,Candida albicans)
Metabolizarea colesterolului
Metabolizarea lactozei
Proprieti antimutagene, anticancerigene
Primul pas n selectarea probioticului este ncadrarea sa taxonomic, care ne ofer indicii
asupra originii, habitatului normal i caracteristicilor sale fiziologice. Clasificarea bacteriilor lactice
se realizeaz n funcie de structura fenotipic i genotipic. De-a lungul timpului s-au descoperit
metode rapide i de o acuratee crescut care fac posibil clasificarea corecta a tulpinii. Tulpini
nrudite se pot separa utiliznd metode bazate pe investigarea ADN profilul plasmidic, analiza
enzimatic, tipul ribonucleic, electroforeza n cmp pulsat (Holzapfel, Haberer, Geisen,
Bjorkroth&Schillinger, 2001; Vuaghan, Heilig, Ben-Amor& de Vos, 2005). Pn de curnd, era
imperativ specificarea originii tulpinii probiotice, ns noile reglementri ale FAO/WHO consider
c este mai important specificitatea probioticului dect originea sa, avnd n vedere c, la natere,
intestinul uman este, teoretic, steril. Este solicitat, de asemenea, testarea siguranei i a profilului
facultativ patogenic al tulpinilor incluse n uz comercial, dei au existat extrem de puine cazuri
documentate de infecii generate de unele specii de Lactobacili (Salminen & Co., 2006). Un alt
aspect important este rezistena la antibiotice a probioticelor, datorat unor gene codificate de
plasmide, deoarece, n cazul acestora, rezistena poate fi transmis ntre microorganisme, ceea ce ar
duce n timp la crearea rezistenei crescute la antibiotice i a patogenilor. Un studiu a sugerat c
prezena antibioticului poate facilita creterea rezistenei antibiotice a mutanilor (Marteau, 2001). De
aceea, tulpinile probiotice trebuie testate asupra rezistenei antibiotice i, mai mult, asupra capacitii
de a tranfera aceast proprietate, pentru a preveni instalarea unei rezistene antibiotice la bacteriile
endogene sau chiar patogene.

VIII. Tulpini probiotice cu larg utilizare comercial

Plecnd probabil de la teoria lui Mecinikov, conform creia ranii bulgari dovedeau a avea o
rat mai mare de supravieuire datorit consumului de bacterii lactice, industria lactat a nceput s
dezvolte o serie ntreag de noi produse funcionale coninnd bacterii lactice benefice. Se estimeaz
la ora actual c exist peste 70 produse cu coninut probiotic, comercializate n ntreaga lume (Shah,
2004). n mod tradiional, probioticele au fost ncorporate n iaurturi punctul de plecare ulterior s-
a extins utilizarea lor n maionez (Khalil&Mansour, 1998), pine (Arihara&Co., 1998), brnzeturi i
paste de brnz (Henriksson&Shah, 2006). Probioticele se pot ntlni i n lapte, kefir, sucuri de
fructe, ngheat, diverse produse de panificaie. Consumul de produse cu coninut probiotic a crescut
cu 12% din 2005 pn azi, n Europa de Vest, America i Japonia, ultima fiind cea mai prolific,
avnd 53 de produse cu diferite tulpini de Lactobacili pe pia. Produsele conin n general lactobacili
i bifidobacterii, unele neprezentnd importan ca i efecte benefice, ci doar cu rol de aditivi, pentru
a crete perioada de valabilitate a produsului.
Lactobacilii sunt ubiquitari n natur, se gsesc n orice mediu bogat n carbohidrai. Sunt
microorganisme Gram+, nesporulate, non-catalazice-cu unele excepii- cu form de bastonae sau
coci. Sunt organisme fermentative, microaerofilice i chemoorganotropice. Pe baza compoziiei G-C
a structurii ADN, ele au, n general, un coninut <55mol%. Genul Lactobacillus aparine
ncrengturii Firmicutes, clasa Bacilli, ordin Lactobacillales, familia Lactobacillaceae i este nrudit
cu genurile Paralactobacillus i Pediococcus.(Garrity, Bell&Lilburn, 2004). Este genul cel mai
numeros, avnd peste 106 specii, cele mai frecvent utilizate i specifice tractului gastro-intestinal
uman fiind: L. acidophyllus, L. salivarius, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. reuteri i L.
brevis (Mitsuoka, 1992). Tulpinile cu sigurana cea mai crescut i funcionalitate deosebit sunt L.
casei, L. acidophyllus, L.rhamnosus i L. johnsonii, care au fost de altfel intens studiate i bine
documentate.
Tabel 3. Tulpini probiotice utilizate frecvent pentru uz comercial (adaptare dup Holm, 2003; Shah, 2004)
Tulpina Sursa
L. acidophilus LA1/LA5 Chr. Hansen
L. delbrueckii ssp. bulgaricus Lb12
L. paracasei CRL431
B. animalis ssp. lactis Bb12
L. acidophilus NCFM

Danisco
L. acidophilus La
L. paracasei Lpc
B. lactis HOWARU/Bl
L. acidophilus LAFTI

L10 DSM Food Specialties

B. lactis LAFTI

B94
L. paracasei LAFTI

L26
L. johnsonii La1 Nestle
L. acidophilus SBT-20621 Snow Brand Milk Products Co. Ltd.
B. longum SBT-29281
L. rhamnosus R0011 Institute Rosell
L. acidophilus R0052
L. casei Shirota Yakult
B. breve strain Yakult
B. lactis HN019 (DR10) Foneterra
L. rhamnosus HN001 (DR20)
L. plantarum 299V Probi AB
L. rhamnosus 271
L. casei immunitas Danone
B. animalis DN173010 (Bioactiva)
L. rhamnosus LB21 Essum AB
Tulpina Sursa
Lactococcus lactis L1A
L. reuteri SD2112 Biogaia
L. rhamnosus GG1 Valio Dairy
L. salivarius UCC118 University College Cork
B. longum BB536 Morinaga Milk Industry Co. Ltd.
L. acidophilus LB Lacteol Laboratory
L. paracasei F19 Medipharm

IX. Provocri tehnologice n formularea produselor pe baz de Lactobacili
Problema ridicat de procesarea bacteriilor lactice n forma lor comercial ntmpin diferite
probleme legate de eliberarea la locul int a unei cantiti fixe de microorganisme, n form viabil
i activ, cu scopul de a-i ndeplini efectul terapeutic previzionat. Viabilitatea este o cerin de baz,
ns exist studii care au demonstrat exercitarea unor proprieti funcionale, de exemplu
imunomodularea, i de ctre microorganisme non-viabile (Ouwehand & Co., 1999). Nu s-a ajuns la o
concentraie unanim acceptat a microorganismelor pentru a fi eficiente, nivelurile studiate variind
ntre 10
6
i peste 10
8
UFC/ mL
-1
(Lourens-Hattingh&Viljeon, 2001). Aceste concentraii crescute
sunt dorite tocmai pentru a sigura livrarea unei cantiti suficiente la locul vizat, avnd n vedere
scderea concentraiei n timpul procesrii i stocrii, precum i efectul de pasaj prin tractul gastro-
intestinal. Asociaia pentru Lapte Fermentat i Buturi cu Bacterii Lactice a stabilit o concentraie de
10
7
bacterii viabile/gram produs pentru a constitui un aliment probiotic (Ishibashi&Shimamura,
1993). Cu toate acestea, numeroase studii au demonstrat c tulpinile probiotice cresc slab n lapte,
scad la concentraii foarte mici n iaurt sau i pierd total viabilitatea printr-o depozitare prelungit la
rece, mai ales bifidobacteriile (Huys & Co., 2006, Vinderola, Bailo&Reinheimer, 2000;
Tharmaraj&Shah, 2003). Viabilitatea probioticelor este un aspect deosebit de important, ntruct ele
trebuie s-i pstreze proprietile funcionale pe parcursul depozitrii, al tranzitului prin acidul
gastric, al degradrii enzimatice i aciunii srurilor biliare. Cteva medii au fost propuse n 1990
pentru L. acidophyllus, L. casei i Bifidobacterium spp., ns aceste metode erau bazate doar pe
culturi pure ale acestor organisme i, de aceea, au fost considerate inexacte. Mai recent, Tharmaraj &
Shah, 2003 au recomandat anumite medii pentru enumerare selectiv a S. thermophyllus, L.
delbrueckii spp. bulgaricus, L. acidophyllus, L. casei, L. rhamnosus i Bifidobacterium spp,
utilizabile chiar n condiiile unui amestec de bacterii. Descoperirile acestora sunt nsumate n tabelul
4.
Tabel 4. Medii recomandate pentru enumerare selectiv a tulpinilor
Agar Bacteria Condiii de incubare Morfologia coloniilor
S. thermophilus agar S. thermophilus Aerobic, 37 C, 24 h 0.10.5 mm, rotunde, glbui
MRS
a
agar (pH 4.58) L.
delbrueckii ssp.bulgaricus
Anaerobic, 45 C, 72 h 1.0 mm, albe, neregulate, aspre,ca de
bumbac
MRS-sorbitol agar L. acidophilus Anaerobic, 37 C, 72 h Aspre , mici, maronii, terse (0.10.5mm)
Agar Bacteria Condiii de incubare Morfologia coloniilor
MRS-NNLP
b
agar Bifidobacteria Anaerobic, 37 C, 72 h 1 mm,albe, netede, lucioase
MRS-vancomycine
agar
c

L. casei Anaerobic, 37 C, 72 h 1.0 mm, albe, lucioase, netede
MRS-vancomycine
agar
L. rhamnosus Anaerobic, 43 C, 72 h 1.02.0 mm, albe, lucioase, netede
Sodium lactate agar Propionibacteria Anaerobic, 30 C, 79
days
1.02.5 mm, maro ters, margine
luminoas

X. Utilizri terapeutice ale bacteriilor lactice
n general, probioticele au fost studiate i documentate dup administrare oral, sub form de
capsule, coninnd cantiti variate de bacterii lactice, individuale sau n mixturi fie cu alte tulpini de
Lactobacillus, fie cu Bifidobacterii, pentru a trata anumite boli sau disfuncii patologice la nivelul
aparatului gastro-intestinal, cel mai frecvent, i aparatului uro-genital, mai recent. Ulterior, s-a
observat c utilizarea probioticelor poate fi extins pe domenii mai largi de cercetare, inndu-se cont
de mecanismele de aciune imunologice dovedite.
Mai jos, vom expune cteva din utilizrile de pn acum ale probioticelor, n ordinea
cronologic a interesului manifestat i a evoluiei.
Boli gastrointestinale (review pdf)
De obicei, probioticele au fost utilizate pentru prevenirea i tratarea diverselor boli gastro-
intestinale, printre care diareea este cea mai frecvent ntlnit (23). S-a demonstrat eficiena acestora
n:
Diareea asociat tratamentului antibiotic
Probioticele protejeaz gazada de multiplicarea excesiv a unor microorganisme patogene,
precum Clostridium difficile sau Klebsiella oxytoca, prin reducerea modificrilor la nivel intestinal, a
consistenei scaunului sau scderea duratei diareei (24). Bacteriile lactice care i-au demonstrat
eficacitatea includ speciile L. acidophyllus, L. bulgaricus i S. Boulardii. (25)
Gastroenterita
Lactobacillus GG, Enterococcus faecium, S. Boulardii, L. casei i L.reuteri au fost testate i
s-a demonstrat capacitatea lor de a reduce durata infeciei i de a scdea riscul diareei de origine
nosocomial, precum i a infeciei cu rotavirus, care are preponderent origine intraspitaliceasc.
(24,26)
Diareea cltorului
n trecut, pentru a preveni aceast tulburare, se utilizau antibioticele sau sulfamidele
chimioterapice, ns reaciile adverse incriminate, precum i preul de cost crescut au condus la
orientarea spre metode alternative de combatere a acestei tulburri. Astfel, s-a documentat faptul c
microorganisme probiotice, precum L. rhamnosus GG, S. Boulardii reduc riscul invaziei patogenilor
specifici, implicit a producerii diarrei de cltorie.
Diareea acut pediatric
Rotavirusul este cel mai important patogen incriminat n producerea bolii diareice la copil (3).
Reducerea descrcrii patogenului coroborat cu creterea IgA ca rspuns imunitar a fost
demonstrat dup administrarea probioticelor precum L.rhamnosus GG i S. Boulardii. De
asemenea, patogenul Campylobacter jejuni a fost eradicat din scaunele copiilor, prin administrarea
unor produse cu Bifidobacterii (25,27).

Figur 1. Domeniile poteniale de aplicabilitate a tratamentului cu probiotice
Sindromul colonului iritabil
Probiotice precum L. acidophyllus i Bifidobacteria au fost utilizate cu succes pentru
combaterea tuturor simptomelor aprute n cadrul acestui sindrom, pe cand tratamentul cu S.
Boulardii nu a prezentat eficacitate dect pe reducerea gravitii diareei, nu i a celorlalte simptome
(24).
Boal inflamatorie intestinal
Cauza principal a acestei boli este prezena insuficient a microflorei rezidente intestinale.
De aceea, n acest caz s-a tratat direct cauza prin colonizarea normal a intestinului cu
Boli gastro-
intestinale
Prevenirea
carcinogenezei
Imunomodulare
Infecii uro-
genitale
Infecii la nivelul
diferitelor
aparate
Artrit
Tulburri
depresive majore
microorganismele deficitare. Cea mai mare eficacitate a fost demonstrat prin administrarea
L.salivarius UCC118, L. rhamnosus GG, S. Boulardii (7,26).
Intolerana la lactoz
Ea apare ca urmare a reducerii activitii beta-galactozidazei din cauza mbtrnirii. Prin
urmare, tulpini cum ar fi L. bulgaricus, S. thermophilus sunt administrate. Aceste bacterii sunt lizate
prin bila n intestinul subire i elibereaz enzima care degradeaz lactoza, prevenind digestia
defectuoas [7, 25].
Constipaia
Rezultatele n acest domeniu sunt contradictorii. Totui, sunt cteva studii care demonstreaz
c L. rhamnosus, P. Freudenreichii pot ameliora constipaia prin producerea de acid, care stimuleaz
peristaltismul intestinal (28). Probioticele sunt de asemenea recunoscute ca fiind capabile s
normalizeze nivelurile reduse de Bifidobacteria, Bacteroides i Clostridia din intestin la pacienii cu
constipaie cronic (7).
Encefalopatia hepatic
Lactuloza alturi de Clostridium butyricum s-a demonstrat a fi eficient n encefalopatia
hepatic.Mecanismul de aciune sugerat n studii ar fi refacerea florei alterate din colon, cauzat de
scderea pH-ului, dar calea exact nc nu este pe deplin elucidat (17).
Activitatea anti Helicobacter pylori
S-a descoperit c speciile de Lactobacillus i Bifidobacteria ar putea fi benefice n prevenirea
i tratarea infeciei cu H. pylori (29). Ele exercit o activitate bacteriostatic direct, nespecific,
crescnd nivelul de IgA sau mpiedicnd aderarea patogenului la mucoasa intestinal (30). Bacillus
subtilis 3 a demonstrat capacitatea sa de a inhiba aderarea i multiplicarea H. pylori prin producerea
unor compui endogeni antimicrobieni (31).
Carcinogeneza i evoluia tumoral
Probioticele, cu sau fr prebiotice au demonstrat c pot fi eficace n inhibarea dezvoltrii
tumorilor n studii preclinice (32). Specii variate de LAB, de exemplu L. casei, au fost utilizate pe
oricei la care s-a indus cancer de vezic urinar, i au demonstrat inhibarea creterii tumorii induse
chimic. Pe de alt parte, L. rhamnosus GG, B. longum au artat eficacitate n suprimarea
carcinogenezei la nivelul colonului (33). Mecanismul implicat n cancerul de vezic urinar este
legarea mutagenilor i implicit reducerea eliminrii lor urinare (34). De asemenea, diferite tulpini de
probiotice au fost studiate i s-a demonstrat a avea rezultate pozitive n reducerea mutaiei
protooncogenelor i a genelor responsabile de suprimarea tumorilor. Pe de alt parte, este
binecunoscut faptul c probioticele acioneaz i ca reductori ai speciile reactive pro-carcinogene.
Un alt mecanism propus ar fi creterea producerii de acetat, propionat i butirat a SCFA (short-chain-
fat-acids) cu ajutorul LAB, producnd o scdere a pH-ului, nefavorabil pentru carcinogenez.
Butiratul este implicat i n detoxifierea compuilor electrolitici prin creterea exprimrii enzimei
glutation-transferaz (35).
Imunomodulare
Probioticele sunr responsabile de producerea unor proteaze care sunt capabiole s degradeze
antigenele alimentare, producnd astfel o toleran oral la variate substane exogene (36). Ele pot
cauza, de asemenea, maturarea i dezvoltarea rspunsului imun umoral, prin producerea IgA i IgM
la copii. Probioticele controleaz rspunsul imun local i sistemic al esutului limfoid intestinal, cel
mai mare din organism. Promoveaz stimularea mecanismelor de aprare endogene i acioneaz
deopotriv prin imunomodulare specific i nespecific (37,38). Stimuleaz activarea celulelor
dendritice, grupul celulelor prezentatoare de antigen, cu rol important n declanarea rspunsului
imun local (4). n cazul diareei cauzat de rotavirus la copil, L. rhamnosus a fost eficace n
declanarea rspunsului imun umoral, prin creterea secreiei de anticorpi specifici pentru rotavirus.
L. plantarum 299v a fost capabil s stimuleze creterea i dezvoltarea copiilor cu HIV congenital.
Explicaia acestui fenomen s-a bazat pe modularea i stimularea fagocitozein sngele periferic (39).
Utilizarea probioticelor ca ageni imunomodulatori, de generare i optimizare a rspunsului imun,
prezint o serie de avantaje unice. Efectul produs de probiotice nu depinde de starea imunologic a
gazdei, ele fiind eficace, att la persoane imunocompetente, ct i imunocompromise, n care
imunodeficiena a fost indus de virusul leucemic sau de corticosteroizi. De exemplu, n cazul n care
exist un teren alergic, probioticele pot induce down-regularea rspunsului inflamator, iar rspunsul
imunomodulator este stimulat la pacienii sntoi (37). Aadar, se poate observa c, probioticele pot
avea proprieti variate imunomodulatoare i antiinflamatorii, prin imuno-excludere, imuno-
eliminare i imuno-reglare.
Vaccinuri
Att LAB naturale, ct i cele modificate genetic sunt utilizate n ultimii ani pentru
dezvoltarea unor vaccinuri care s influeneze benefic rspunsul imun local i sistemic la animale i
om. Acest aspect ofer multiple avantaje, precum protejarea mpotriva antigenelor digestive,
facilitarea eliberrii la int sau programate n lumenul intestinal, acionnd ca promotoare ale
imunogenitii pentru antigene izolate sau ajutnd la dezvoltarea unor vaccinuri combinate,
constituite din cteva antigebi introduse prin tehnici de recombinare genetic. Avantajul folosirii
bacteriilor vii drept vectori de transport st n faptul c ei se pot replica in vivo pentru a produce mai
multe particule antigen, implicit crescnd i rspunsul imunologic (40). S-a demonstrat c L.
johnsonii LA1 are efect sinergic cu antigen S. Typhi atenuat pentru utilizare mpotriva febrei tifoide
(24). Probioticele recombinate precum Lactoccocus lactis sunt utilizate pentru a produce efecte
imunomodulatoare prin stimularea producerii de IL-10. Studiile au demonstrat o eficacitate de 50%
n tratarea colitei, prin administrarea intragastric (4).
Alergiile
Manifestrile alergice precum intolerana la laptele de vac, hipersensibilitatea alimentar i
dermatitele atopice (41,42) pot fi tratate cu anumite probiotice. Este demonstrat faptul ca L.
rhamnosus GG exercit un efect supresiv asupra proliferrii limfocitare i producerii de IL-4, ceea ce
scade hipersensibilitatea i hiperreactivitatea la anumii factori declanatori (28). Un studiu realizat
n acest scop, demonstreaz scderea incidenei apariiei alergiilor la copiii nscui din mame cu risc
crescut de eczem atopic, rinite alergice sau astm, prin administrarea prenatal de produse cu
probiotice i postnatal, sugarului, timp de 6 luni. (11,44). Exist i cteve aspecte nc neclare, n
ceea ce privete capacitatea probioticelor de a trata orice tip de alergie, independent de vrsta
pacientului.
Efect hipocolesterolemiant
Din studiile realizate, s-a putut emana teoria c L. johnsonii i L. reuteri sunt cteva din
probioticele asociate cu scderea colesterolului n snge. Mecanismul de aciune const n
producerea hidrolazei srurilor biliare prin deconjugarea acestora. Se produce astfel o cretere a
eliminrii acizilor biliari prin fecale, ceea ce implic i o cretere a sintezei de novo a srurilor
biliare, consecina fiind scderea nivelului de colesterol (33).
Artrita reumatic
Cteva studii mai recente au susinut efectele pozitive ale pre- i probioticelor asupra
integritii oaselor i metabolismului calciului. Prin investigarea mecanismului care st la baza
acestor efecte, s-a ajuns la concluzia c pot fi puse pe seama creterii solubilitii mineralelor
datorat producerii SCFA (short-chain-fat-acids), creterii exprimrii proteinelor care leag calciul,
eliberrii factorilor de formare a osului, mririi suprafeei de absorbie, degradrii minerale prin
complexarea acidului fitic i efectului anti-artritic al probioticelor. Oricum, eficacitatea tratamentului
depinde de factori precum vrsta cronologic, vrsta fiziologic, menopauza i capacitatea de
absorbie a calciului (45).
Distrugerea calculilor renali de oxalat de calciu
Recent, a fost identificat o nou bacterie anaerob, Oxalobacter formigenes, responsabil de
degradarea oxalailor n organismul uman. La indivizii luai n studiu, preponderent femei, cu infecii
recurente de tract urinar, prezena oxalailor a fost asociat cu eradicarea O. Formigenes datorat
administrrii frecvente de antibiotice. Astfel, terapia probiotic devine o alternativ demn de luat n
calcul pentru tratamentul optim al tulburrilor urologice (46).
Infecii uro-genitale
Infeciile uro-genitale (infeciile de tract urinar, ITU), vaginitele, micozele vaginale se pare c
afecteaz anual aproximativ 1 mld. de persoane.femeile sunt cele mai expuse acestor infecii, datorit
unor motive evidente, care in de fiziologia acestui aparat. De aceea, studiile s-au orientat spre
gsirea unor modaliti de prevenire i tratare a acestor infecii bacteriene sau micotice ntr-o manier
mai blnd, cu ajutorul unor ageni de nou generaie. S-a ncercat astfel administrarea de probiotice
pentru tratarea acestor infecii, fie pe cale vaginal, fie pe cale oral. Ambele ci s-au dovedit a fi
eficiente, calea intravaginal fiind una direct, ns cea oral pare a fi mai practic i cu un potenial
mai mare de reuit a tratamentului, fiind alternativ i pentru femeile gravide care au vaginit (47).
Cteva studii au demonstrat c tulpini de lactobalili, rezisteni la acid i sruri biliare, pot coloniza
vaginul dup administrare oral. n aceast situaie este foarte important doza administrat, care
trebuie s fie una optim i bine calculat.
Tulburri depresive majore
Stressul, un factor signifiat al tulburrilor depresive, poate cauza alterarea microflorei
rezidente a tractului gastro-intestinal, cu scderea nivelului de lactobacili i bifidobacterii. Tinnd
seam de studii recente, probioticele pot fi un adjuvant util la medicaia standard antidepresiv, ele
acionnd prin scderea nivelului de citokine pro-inflamatorii, reducerea stresului oxidativ,
mbuntirea aspectelor care in de nutriie i prin prevenirea suprainfectrii bacteriene intestinale
(48).
Infecii ale diferitelor aparate
Probioticele i gsesc locul i n cazul acestor infecii prin reabilitarea sistemului imun, care
este atacat n aceste infecii. O soluie salin de streptococi liofilizati, administrat sub form de
aerosoli bucali, poate fi tratamentul unei infecii faringiene (49). De asemenea, tulpini de
Streptococcus sanguis, S. mitis i S. oralis n proporii egale, au fost eficiente pe acelai aparat. Pe
de alt parte, L. casei i L. breve au crescut eliminarea P. aeruginosa i a virusului gripal din plmn,
cu creterea nivelelor de IgA att seric, ct i n fluidul bronho-alveolar (38). Tabelul 4 nsumeaz
diferite tipuri de microorganisme cu tulpinile lor, care sunt admise n uzul uman, precum i
mecanismele lor de aciune.
Tabel 4. Lista probioticelor orale pentru uz uman i utilizarea lor
Genul Specia Tulpina Utilizare Refe
rine
Lactobacillus acidophyllus
LA 5 Diareea asociat tratamentului antibiotic 7
LC1 Echilibrul microflorei intestinale i creterea imunitii 17
NCFO 1748 Constipaie, scderea enzimelor din fecale, diareea asociat
radioterapiei
17
NCFM Imunomodulator 17
LA1 Scderea mutagenitii, constipaie, diareea asociat
radioterapiei
6
NCFB 1748 6
ATCC 4962 34
Lactobacillus bulgaricus
Scderea duratei diareei, intolerana la lactoz 3,25
ATCC
33409
Efect hipocolesterolemiant 34
Lactobacillus bifidus Suprimarea coloniilor de Helicobacter pylori 29
Lactobacillus casei Shirota Producere de citokine, scderea enzimelor n scaun, cancer de
vezic urinar
17,40
Lactobacillus delbrueckii Diareea acut la copil 25
Lactobacillus gasseri KC5b Efecte hipocolesterolemiante in vitro
OLL 2716 Scderea inflamaiei gastrice 101
ADH Scderea enzimelor n scaun 6
Lactobacillus johnsonii La1 Stimularea fagocitozei, adjuvant n vaccinuri 24,40
Lactobacillus plantarum
Ameliorarea sindromului de colon iritabil 17
LP299v Infecie cauzat de C. difficile 24
Lactobacillus reuteri Scderea duratei diareei apoase 40
ING1 Constipaie 28
CRL 1098 Hipercolesterolemie 9
SD2112 Scderea duratei diareei produs de rotavirus 7


XI. Tendine actuale n utilizarea bacteriilor lactice aspecte farmaceutice

Din toate studiile citate i analizate, reiese condiia necesar ca probioticele s prezinte o
eliberare continua pentru a-i manifesta prezena i exercita aciunea dorit. Din cauza faptului c ele
nu colonizeaz permanent tractul gastro-intestinal i alte caviti ale organismului, ci se reduc treptat
i dispar n 8 zile, administrarea lor trebuie fcut regulat (87). Din punct de vedere al cercetrii
farmaceutice, dezvoltarea unor sisteme de eliberare a unei doze propice de microorganisme benefice
la locul vizat este o piatr de ncercare. Pentru dezvoltarea unui asemenea produs trebuie s se in
seama de selecia unei forme farmaceutice adecvate, formulare optima, incluznd aici excipienii,
condiiile de procesare, ambalarea, depozitarea i sistemul de distribuie, toate viznd obinerea unui
produs cu bacterii lactice viabile n concentraia optim pentru manifestarea efectului terapeutic.


Forma farmaceutic adecvat pentru probiotice
Sistemul ideal n care s ncorporm un agent probiotic este acela care poate s-i menin
toate caracteristicile dorite, eseniale exercitrii scopului su, n timpul producerii, transportrii i
depozitrii. Dac produsul este proiectat pentru a fi administrat pe cale oral, el trebuie s reziste
unor condiii dure i ostile pe care le ntlnete n anumite poriuni ale tractului gastro-intestinal, n
special aciditatea crescut i srurile biliare (89). Pentru produsele destinate administrrii vaginale,
forma farmaceutic trebuie astfel proiectat nct s reziste n vagin sufiecient timp ct s poat avea
loc eliberarea coninutului i colonizarea habitatului. Pentru atingerea scopului acestei lucrri, acela
de a crea un produs probiotic cu aplicare topic, forma farmaceutic aleas trebuie s ndeplineasc
dezideratul iniial, acela de a favoriza aderarea pe piele i penetrarea coninutului de lactobacili prin
epiderm. Astfel, pentru orice rut aleas spre administrare, agentul probiotic trebuie s adere i s
colonizeze compartimentul vizat, ntr-o cantitate suficient, astfel nct s evitm administrarea
repetat i supradozajul. Probioticele sunt frecvent ntlnite n produse alimentare, de exemplu iaurt
sau kefir, care sunt plcute ca gust i aspect i au, deci, o complian crescut, ns nu putem
administra sub aceast form medicamentele cu produse probiotice, datorit ratei sczute de
supravieuire a lactobacililor i valabilitii reduse la temperatura camerei a acestor produse (Europa
=20
o
C, U.S.=25
o
C)(90). Ca urmare, tehnicile utilizate n cercetarea i industria farmaceutic vizeaz
obinerea unor forme farmaceutice care s asigure o eliberare a unei cantiti dorite de agent
probiotic, protejndu-l de mediul extern (lumin, aer i umiditate) i asigurnd traversarea mediului
intern pn la locul vizat. De-a lungul timpului s-au ncercat diferite metode i tehnici de protejare a
viabilitii bacteriilor ncorporate n produs, de lrgire a termenului de valabilitate i de livrare a unei
concentraii ct mai mari i posibil controlat spre compartimentul afectat. Aceste tehnici pot fi
mprite n tehnici de procesare primar i tehnici de procesare secundar. Printre tehnicile de
procesare primar se numr ultrafiltrarea i centrifugarea. Aceste metode duc la creterea
concentraiei biomasei prin scderea volumului mediului de cultivare. Centrifugarea are ns
dezavantajul de a afecta unele celule, care vor avea o rezisten mai sczut la mediul ostil gastric i
intestinal. De asemenea, prin nlturarea supernatantului (mediul de cultur), enzimele
antimicrobiene, metaboliii i ali compui importani sunt ndeprtai, scznd astfel capacitatea
natural a probioticelor. Liofilizarea i uscarea prin pulverizare permit supernatantului s se
gseasc n produsul final, meninndu-se astfel toate proprietile probioticelor intacte. Uscarea prin
pulverizare este o metod mult mai economic dect liofilizarea, mai ales pentru producia
industrial, ns nu toate bacteriile probiotice sunt rezistente la temperaturile necesare n acest
proces, de aceea, n anumite cazuri, se recurge la liofilizare (15).
Tehnicile de procesare secundar vin s creasc funcionalitatea produselor. Aplicnd
anumite metode, produsele medicamentoase pe baz de lactobacili pot livra tulpina exact, n
cantitate exact i sub forma dorit astfel nct s ndeplineasc exact scopul vizat n dezvoltare.
Aceste tehnici implic: filmarea, microncapsularea i criocomprimarea. Acoperirea cu
polizaharide asigur o stabilitate crescut a coninutului i o rezisten la acidul gastric, evitndu-se
solubilizarea acestora n acest compartiment. Se poate aplica tehnica PROBIO-TECH a Institutului
Rosell.
Microncapsularea cu diferii ageni ncapsulani a LAB se poate desfura ntr-un singur
proces. n aceast tehnic, se obine nti un cru poros obinut din granule de amidon prin tratare
enzimatic. n final, amilaza, dup solubilizare i rcire, se precipit peste aceste bacterii, umplnd
granulele de amidon (15). Aceast tehnic se bazeaz pe adeziunea dintre bacterii probiotice i
amidon i ofer protecie fa de condiiile ostile din timpul procesrii, depozitrii i pasajului prin
tractul gastro-intestinal superior (62). Cateva din tehnicile de microncapsulare utilizate sunt:
LIVEBAC- dezvoltat de Nutraceutix, confer protecie probioticelor, crete termenul de valabilitate
fr refrigerare;
PROBIOCAP- dezvoltat de Balchem i Institutul Rosell, confer produsului rezisten la aciunea
distructiv a sucului gastric i eliberarea numai n intestin, fiind dependent de pH.
S-a utilizat pentru L. acidophyllus, L. rhamnosus, Bifidobacterium.
Criocomprimarea prezint ca noutate, expunerea rapid la frig a comprimatelor pentru a
pstra viabilitatea microorganismelor. A fost dezvoltat de Nutraceutix i nu necesit depozitare prin
refrigerare.
Tehnologia eliberrii controlate
Aceast tehnologie se refer la obinerea comprimatelor i capsulelor care sunt programate
s elibereze substana activ fie cu o rat constant pe un interval de timp, fie pulsat, la anumite
intervale de timp, fie la un moment dat, ntrzit, toat cantitatea de substan. BIO-TRACT a patentat
de asemenea denumirea de CDT (controlled delivery technology). Prin aceast tehnic, de exemplu,
L. acidophyllus poate fi eliberat n duoden, pe cnd Bifidobacteria poate fi programat s se
elibereze n colon.
Bioadeziunea
Comprimatele vaginele bioadezive sunt constituite din 2 straturi care conin componenete
diferite. Primul strat este unul efervescent, care conine fraciunea din doza de compus activ cu
eliberare imediat, pe cnd cel de-al doilea strat asigur aciunea ulterioar, pentru a crete timpul de
populare a zonei cu microorganismele benefice i pentru a asigura o prelungire a timpului de
eliberare. Pentru aceast tehnic dse utilizeaz hidroxipropil-metil-celuloza ca i agent bioadeziv,
care asigur eliberarea i actiunea ntrziat a Lactobacillus. S-a dovedit c aceste comprimate au
greutate molecular mare, vscozitate, capacitate bun de hidratare i proprieti formatoare de gel,
toate fiind necesare pentrua imprima produsului caracteristicile necesare unei matrici polimerice cu
efect prelungit. S-a mai ncercat, de asemenea, utilizarea carbopolilor n comprimate vaginale ca i
ageni bioadezivi, ns s-a observat c acetia scad proprietile bioadezive ale Lactobacillilor. (91)
Aspecte privind procesul de fabricaie
Probioticele sunt astzi n forme farmaceutice diferite sau suplimente alimentare, n doze
diferite i coninnd una sau mai multe tulpini de bacterii probiotice. Formele farmaceutice obinute
pn acum sunt: comprimate, capsule, supozitoare, ovule, comprimate vaginale, pudr liofilizat,
granulate liofilizate. Tehnicile de obinere a produselor care conin probiotice trebuie s fie alese cu
mare grij pentru a menine viabilitatea microorganismelor, innd cont de faptul c majoritatea
tulpinilor probiotice sunt facultativ anaerobe. Formele farmaceutice cu coninut de bacterii lactice
cele mai stabile sunt capsulele i comprimatele, neavnd nevoie de depozitare la rece, deoarece prin
procesul tehnologic se asigur n interior condiiile de anaerobioz, doar stratul exterior venind n
contact cu aerul. Etapele parcurse n procesul de obinere a acestor forme farmaceutice sunt expuse
n fig. 4. Dei capsulele par a fi la fel de stabile, totui dezavantajul lor ar fi coninutul moale al
nveliului, care poate afecta stabilitatea produsului. Avantajula cestora este c nu includ n etapele
procesului de fabricaie comprimare, ceea ce poate asigura o viabilitate crescut a coninutului de
lactobacili.













Fig.4. Procesul general de fabricaie al produselor cu coninut probiotic
Formele farmaceutice lichide au un termen de valabilitate extrem de scurt, de cteva
sptmni, de aceea se procedeaz la adaosul de antioxidani sau ali aditivi i meninerea la rece
pentru a prelungi perioada de depozitare.
Aspecte privind procesul tehnologic
Alegerea agentului probiotic de ncorporat n forma farmaceutic trebuie s in cont de
aspectele procesului tehnologic, pentru a rezista la toi factorii agresivi din timpul procesrii i pentru
a-i menine efectele terapeutice. S-a dovedit c pudrele obinute prin liofilizare au o capacitate mai
mic de aderare la suprafee comparativ cu cultura, pe cnd formulrile farmaceutice i comprimarea
nu influeneaz capacitatea de adeziune a bacteriilor lactice la suprafee. Motivul scderii capacitii
de adeziune dup liofilizare ar putea fi modificarea conformaiei suprafeei adezinelor bacteriene,
ceea ce afecteaz funcia acestora. (88). O alt problem n procesul de liofilizarea este meninerea
constant a unor parametri de temperatur, pentru a nu afecta viabilitatea lactobacililor. O
temperatura a aerului de admisie de 100
o
C i a aerului de emisie de 45
o
C, a demonstrat a avea cea
mai bun comportare (92). Pudrele liofilizate pot fi caracterizate din punct de vedere al densitii
masei i unghiului de repaus (91).
Alegerea excipienilor reprezint un pas crucial n dezvoltarea formulrii, fiecare dintre
acetia necesitnd o testare asupra influenei lor n aderarea patogenilor (93), deoarece studiile au
dovedit o cretere a adeziunii Gardnerella vaginalis i Candida albicans la DEAE dextran (dietil
aminoetil). Este de preferat utilizarea unei cantiti mai mari de lactobacili viabili n formulare, astfel
nct rata de multiplicare s fie crescut, pentru a crea i o mai bun aderare la suprafee a
lactobacililor (75). Culturilor care urmeaz a fi uscate li se pot aduga protectori, precum: lactoz,
sucroz, glutamat monosodic, ascorbat, pentru a preveni distrugerea celulelor n timpul procesrii i
depozitrii (15).
Farmacocinetica probioticelor
Cunoaterea cantitii de probiotic necesar pentru a-i manifesta efectul terapeutic la locul
int este pasul primordial n nelegerea farmacocineticii probioticelor. n general, pentru
manifestarea unui efect benefic, se consider concentraia optim n jurul valorii de 10
6
UFC/mL n
intestinul subire i >10
8
UFC/mL n colon. Meninerea viabilitii lactobacililor depinde de gazd,
de vehicul, precum i de rezistena intrinsec a tulpinii selectate. Cteva dintre probiotice sunt
distruse de sucul gastric, n timp ce doar cteva ating niveluri crescute n scaun. O mbuntire a
modelelor in vitro, a alegerii tehnicilor de eantionare n intestin i a gsirii unor modaliti de
ncredere pentru identificarea probioticelor n ecosisteme complexe, ar oferi perspective mari pentru
nelegerea mai profund a parametrilor farmacocinetici reali i corelarea corect a relaiei doz-
rspuns farmacologic (94).
Condiionarea i etichetarea produselor cu coninut probiotic
Materialele utilizate pentru condiionarea produselor cu coninut probiotic trebuie, n primul
rnd, s fie impermeabile, rezistente la umiditate, de aceea unul dintre cele mai preferate materiale
este sticla, deoarece este non-toxic, sigur pentru mediu i reciclabil. Plasticul nu se recomand,
deoarece nu este complet impermeabil, uneori producnd i diverse mirosuri neplcute. La aceste
condiionri trebuie adugai desicani, precum silicagelul, n sachete sau miniflacoane (15).
Etichetarea produselor cu coninut probiotic se face conform standardelor NNFA (National
Nutritional Food Association). O etichet convenional a unui produs probiotic trebuie s conin
informaii despre: identificarea microorganismelor dup gen i specie, declaraie a numarului minim
de celule viabile sau UFC/unitate de msur, dat de expirare sau termen de valabilitate i
recomandri privind depozitarea. Produsele probiotice sunt nsoite de un prospect, care conine mai
multe informaii pentru consumator, precum i pentru medic, informaii privind indicaiile
terapeutice, posibilele efecte secundare i avertizarea de ase adresa medicului sau farmacistului n
cazul apariiei oricrei reacii adverse (95).

XII. Caracterizarea proprietilor probioticului
Diversele beneficii nutriionale i terapeutice ale probioticelor pot fi pe deplin exploatate
numai dup acceptarea lor n lumea tiinific i definirea reglementrilor. De aceea sunt necesare
nelegerea mecanismului lor de aciune i validarea complet. Diferitele modele in vitro au fost
concepute pentru a verifica, cuantifica i certifica proprietile probioticelor, precum i mecanismele
care stau la baza activitii lor (6). Dei este dificil s investighezi proprietile bacteriilor in vitro,
aceste modele prezint beneficii din mai multe puncte de vedere (96).
Probiotice orale
Caracteristicile culturii
Trebuie controlate urmtoarele aspecte privind puritatea culturii, procesele de fermentaie i
produii metabolici, deoarece toate acestea pot afecta stabilitatea sau chiar altera caracteristicile
funcionale (97).
Rezistena la aciditatea gastric
Aceast proprietate este asigurat in vitro prin incubarea culturilor alturi de o soluie
tampon, la pH =2-3,4 i numrarea bacteriilor viabile la anumite intervale de timp. Acest aspect nu
s-a realizat i in vivo, deci nu exist o validare a ratei de supravieuire realizabil n stomac (98).
Rezistena la acizi biliari
Plcile sunt analizate ntr-o manier similar testrii de rezisten la aciditatea gastric, fiind
incubate cu bil porcin sau bovin de concentraie 0,3-7,5%, la 37
o
C, n condiii anaerobe, iar
multiplicarea baterian este nregistrat dup 24, apoi 48 de ore (97).
Tolerana la tranzit
Tolerana produsului la tranzit digestiv se realizeaz determinnd cantitatea de lactobacili
viabili, la diferite intervale de timp, dup expunerea la mediu simulat gastric (pH=2) sau suc
pancreatic (pH=8) i NaCl (0,5% m/V) a suspensiei de celule bacteriene (99).
Capacitatea de multiplicare
Acest parametru a fost testat in vivo pe oricei tineri, urmnd o metod validat. Astfel, s-a
determinat greutatea iniial, cantitatea de mncare administrat, cantitatea de ap administrat i
diferena de greutate nregistrat la un anumit interval de timp.
Rezistena in vivo
Tradiional, aceast determinare se realiza prin analiza scaunului unor pacieni sntoi crora
li s-au administrat probiotice trei luni de zile i determinarea cantitii totale de lactobacili, nainte, n
timpul i dup sistarea administrrii produsului (87). Deoarece testele au condus la o subestimare a
capacitii de colonizare, acest parametru este msurat astzi n mucoasa colonului prin colonoscopie
i biopsie (101).
Diverse proprieti ale probioticelor orale
Simulatorul Ecosistemului Intestinal Uman este un model bine caracterizat pentru
probioticele orale, avnd 6 compartimente cu o compoziie microbian diferit, corespunznd
stomacului, duodenului, jejunului, ileonului, colonului ascendent i descendent, expus la o
temperatur normal a organismului uman de 37
o
C. Fiecare compartiment are un timp de remanen
diferit i un volum de lucru diferit, astfel nct efectele pot fi studiate separat. Acest model simuleaz
cu exactitate condiiile in vivo i influena microbiotei intestinale asupra activitii metabolice.
Probiotice vaginale
Capacitatea producerii de biosurfactani
Aceast proprietate poate fi caracterizat fie prin metoda picturii, folosind Analiza
Axisimetric a Formei Picturii, fie prin msurarea capacitii de inhibare a aderrii patogenilor la
suprafaa polimerilor. Ultimele analize utilizate implic aderarea suspensiei de celule la pereii
plcilor de polistiren, urmat de incubare, dup care bacteria aderent este evideniat prin colorare
(107,108).
Capacitatea producerii de peroxid de hidrogen H
2
O
2

Lactobacillus este cultivat ntr-un mediu coninnd tetrametilbenzidin i peroxidaz din
hrean n condiii de anaerobioz. Timpul necesar apariiei coloraiei albastre este o msur a
capacitii de producere a peroxidului de hidrogen.

Parametri de multiplicare intravaginal
Modelul Gompertz este unul dintre modelele statistice utilizate pentru a obine date despre
creterea bacterian. Unul din avantajele acestui model este acela de a permite calcularea ratei
maxime de cretere utiliznd doar un punct de pe curb (numit punctul de maxim ndoire), ceea ce
nu era posibil cu metodele tradiionale (109).
Testul de co-agregare
Suspensia cu lactobacili i uro-patogeni este incubat, apoi proba analizat n microscopie cu
lumin inversat, cu sau fr coloraie Gram, pentru determinarea gradului de agregare, unde 0
reprezint lipsa agregrii, iar 4 reprezint maxim de agregare (75).
Proprieti comune att probioticelor orale ct i celor vaginale
Adeziunea
Aceasta proprietate presupune detrminarea unor proprieti diverse, precum legarea de
suprafee solide ca polistirenul, capacitate de agregare, hemaglutinare i adeziune la straturi
unicelulare de culturi celulare (110,111). Sub acest aspect, exist numeroase rezultate obinute pe
modele in vitro, precum non-mucus/linie celular secretoare de mucus (112); intestinul gros/modelul
colon, esut colonic uman obinut prin rezecie (113) sau mucus din intestinul subire canin (114).
Activitate antimicrobian
Aceast analiz poate fi modificat i aplicat la preparate cu mediu de cultur solid sau
lichid, unde uro-patogenii i lactobacilii sunt adugai n mediu, iar creterea este comparat cu
martorul (115-117.)
Viabilitate i proprieti n timpul procesrii i depozitrii
Tehnica numrrii n plac este cea mai frecvent utilizat metod n acest scop, ns au aprut
i noi tehnici, precum flow cytometry i fluorimetria (36).
XIII. Aspecte privind sigurana probioticelor
Majoritatea utilizrilor iniiale ale lactobacililor au vizat domeniul nutriie muli ani. Faptul c
utilizarea lor ndelungat i originea lor uman, a fcut s nu existe suspiciuni asupra siguranei
utilizrii acestora (6). Totui, s-a ajuns n acest moment la necesitatea de a demonstra sigurana
utilizrii lor, deoarece au existat cteva cazuri documentate de infecii ale unor rni, endocardite
bacteriene i chiar infecii n snge produse prin asocierea Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus
i Bifidobacteria. De asemenea, datorit recentelor descoperiri n domeniul geneticii, tehnicile de
recombinare i nu n ultimul rnd probioticele vectori, demonstrarea siguranei este imperios
necesar, mai ales n cazul pacienilor imunocompromii (118). Acest aspect al siguranei devine cu
att mai important de demonstrat atunci cnd vrem s administrm un produs cu bacterii vii la o
gravid sau la sugari. Nu s-au raportat nc efecte adverse la L. rhamnosus GG (95).
De aceea, probioticele trebuie cercetate i evaluate cu mare atenie, n funcie de urmtorii
factori:
ncadrare taxonomic
Patogenitate i infeciozitate
Activitate metabolic
Activitatea de agregare plachetar i degradarea mucosal
Transferul genelor i rezistena plasmidelor codificate
XIV. Evaluarea i controlul calitii produselor probiotice
XV. Reglementri
XVI. Probioticele viitorului
XVII. Concluzii
XVIII. Referine
1. Metchnikoff, E., The prolongation of life optimistic studies- Lactic acid as inhibiting
intestinal putrefaction, 1907, Ed. Heinemman, London, UK 161- 183.
2. Lilly, D.M.; Stillwell, R.M., Probiotics: growth promoting factors produced by
microorganisms, 1965, Revista Science 147, pg. 747-748.
3. Fller, R., Probiotics in man and animal, 1989, Journal of Applied Bacterilogy 66, pg. 365-
378.
5. Joint FAO/WHO Expert Consultation. Health and Nutritional properties of probiotics in
food including powder milk with live lactic acid bacteria. Joint FAO/WHO Expert
Consultation, Cordoba, Argentina, 1-4 October 2001. *Clear and detailed introduction to the
multidisciplinary aspects of probiotics.
6. Guidelines for the evaluation of probiotics in food: Joint FAO/WHO Working Group
meeting, London, UK, ON, Canada, 30 April-1 May, 2002.
7 Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease. Lancet 361, 512-519 (2003).
8 Saarela M, Mogensen G, Fondn R, MttJ, Mattila-Sandholm T. Probiotic bacteria: safety,
functional and technological properties. J. Biotechnology 84, 197-215 (2000).
9 Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCornick JK. Potential uses of probiotics in clinical practice. Clin.
Microbiol. Rev.16(4), 658-672 (2003).
10 Mercenier A, Pavan S, Pot B. Probiotics as biotherapeutic agents: present knowledge and future
prospects.Curr. Pharm. Des. 9(2), 175-191 (2003). *Stresses the multidisciplinary complexity of the
research field and addresses the existing crossreaction between a number of key issues.
11 O'Hara AM, Shanahan F. Mechanisms of action of probiotics in intestinal
diseases. ScientificWorldJournal 7, 31-46 (2007).
12 Del Piano M, Morelli L, Strozzi GP et al. Probiotics: from research to consumer. Dig. Liver.
Dis. 38(Suppl.2), S248-S255 (2006). *Examines the sequential steps of research, from the
identification of a possible probiotic strain to its production and marketing.
13 Parvez S, Malik KA, Ah Kang S, Kim HY. Probiotics and their fermented food products are
beneficial for health.J. Appl. Microbiol. 100, 1171-1185 (2006). *Objective and up-to-date review of
the health benefits of probiotics.
14 Holzapfel WH, Schillinger U. Introduction to pre- and probiotics. Food Res. Int. 35, 109-116
(2002).
15 Falagas ME, Betsi GI, Athanasiou S. Probiotics for the treatment of women with bacterial
vaginosis. Clin. Microbiol. Infect. 13, 657-664 (2007).
101 Food and Agriculture Organization of the United Nations www.fao.org
102 World Health Organization www.who.int