Sunteți pe pagina 1din 40

CITOLOGIE ANIMALA

Lucrari de laborator
Lucrarea de laborator 1
Separarea componentelor celulare
Noiunea de component celular are o semnificaie larg, ea desemnnd att
structurile celulare organizate, cu semnificaie funcional (organite celulare), substanele de
rezerv i depozit ale celulei (incluziuni celulare), ct i macromoleculele, micromoleculele i
ionii ce definesc compoziia chimic a celulelor.
Separarea componentelor celulare reprezint att un scop experimental n sine, dar
este i o etap iniial i obligatorie necesar studiului ulterior al acestor componente, prin
variate miloace de investigaie.
!intre diversele metode de separare a componentelor celulare (cu diferite niveluri de
comple"itate) aplicate #n prezent #n diferite laboratoare, se pot enumera$
separarea pe cale chimic%
electroforeza%
cromatografia%
centrifugarea i ultracentrifugarea etc.
&n vederea separrii componentelor celulare, prin oricare dintre metodele enumerate,
este #ns necesar ca, #ntr'o prim instan, integritatea morfostructural a celulelor intacte s
fie alterat, pentru ca aceste componente celulare s fie puse #n libertate% trebuie deci
practicate o serie de tehnici, desemnate global sub numele de omogenizare (omogenare)
celular.
1!1! Omogenizarea "i omogenatele celulare
Simplificat, noiunea de (omogenizare) poate fi definit ca operaia (operaiile) prin
care se obine un omogenat celular.
Omogenatul celular este o suspensie de celule #ntregi (sau de componente
subcelulare), realizat #ntr'un mediu lichid cu dou caracteristici eseniale$ pH fiziologic i
izotonicitate.
*"ist mai multe metode de realizare a omogenatelor celulare, care, #n funcie de
factorul principal ce determin dezorganizarea celulelor (sau detaarea celulelor #ntregi dintr'
un esut), se pot clasifica #n$
1.1.1. Metode mecanice de omogenizare.
*"ist mai multe tipuri de metode mecanice de omogenizare, dintre care se pot
enumera urmtoarele$
omogenizarea cu autorul omogenizatorului Potter, dispozitiv ce prezint
urmtoarele componente (#ig! 1!1)$
!atorit spaiului foarte #ngust dintre peretele interior al cuvei i e"tremitatea
#ngroat a pistilului celulele sunt supuse unei aciuni de triturare mecanic, produs prin
rotaia pistilului% membrana celular cedeaz sub aciunea forei rotative, iar componentele
celulare, chiar de dimensiuni mari, sunt eliberate #n mediul de omogenizare, obinndu'se
astfel un omogenat celular.
G a r n i t u r d e c a u c i u c
( p e n t r u a t a s a r e l a m o t o r u l e l e c t r i c )
P i s t i l ( p i e s r o t a t i v )
C u v ( p i e s f i x )
M e d i u l i c h i d d e o m o g e n i z a r e
C e l u l e d e t a s a t e p r i n t r i t u r a r e
m e c a n i c
#ig! 1!1! Sc%ema unui omogenizator de tip &otter
omogenizarea cu autorul omogenizatorul Warring (cu cuite) (#ig! 1!'!)
P i s t i l ( p a r t e i n f e r i o a r )
C u t i t e ( l a m e ) s e m i c i r c u l a r e
#ig!1!'! (eprezentarea )c%ematic a e*tremit+ii in,erioare a pi)tilului omogenizatorului -arring

!atorit lamelelor semicirculare cu care este prevzut pistilul acestui omogenizator,
se obine o omogenizare mai avansat a celulelor, rezultnd, #n general, suspensii de com'
ponente celulare mai fine dect #n cazul metodei +otter.
prin mojarare. cu sticl pisat (sau nisip de cuar)
,ceast metod este considerat cea mai agresiv variant mecanic de omogeni'
zare, datorit aciunii abrazive a particulelor de sticl asupra celulelor% ea conduce la
eliberarea de agregate moleculare #ntregi, #n mediul de omogenizare, din ansamblul unor
organite celulare.
1.1.2. Metode fizice
!intre acestea, cea mai cunoscut este ultrasonarea (ultrasonicarea), bazat pe u'
tilizarea ultrasunetelor (sunete cu frecven #nalt). -ltrasunetele acioneaz #n primul rnd
asupra membranei celulare, pe care o distrug, coninutul celular fiind eliberat apoi #n mediul
de omogenizare.
metoda ngheului dezgheului alternativ
.onst #n supunerea celulelor la o alternan de ocuri termice succesive (tempera'
turi e"treme), care conduc #n timp la dezorganizarea #n fragmente a acestora, datorit varia'
iilor de volum ale apei intracelulare produse #n timpul #ngheului'dezgheului.
1.1.3. Metode fizico chimice.
.ea mai utilizat dintre acestea este metoda ocurilor osmotice, care const #n in'
troducerea celulelor #ntr'un mediu ce prezint o diferen mare de presiune osmotic #n com'
paraie cu mediul intracelular (mediu hipotonic sau hipoosmotic), actiune care are ca rezultat
liza osmotic a celulelor. / variant frecvent utilizat de liz osmotic este hemoliza
hematiilor, obinut prin introducerea acestor elemente figurate #n ap distilat (sau
bidistilat).
1.1.. Metode chimice.
Se aplic, #n special, in vederea detaarii i separarii unor celule #ntregi din diverse
esuturi.
.onstau #n tratarea fragmentelor tisulare cu diverse enzime, #n special proteolitice (de
e"emplu, tripsina i colagenazele), care atac i diger diferite tipuri de onciuni intercelula'
re.
.omponentele celulare aflate #n suspensie #n mediul de omogenizare, eliberate #n ur'
ma practicrii uneia sau alteia dintre metodele descrise, pot fi supuse #n continuare diferitelor
tehnici de separare.
1!'! Centri,ugarea
.entrifugarea este o metod mecanic clasic de separare a componentelor celula'
re.
Separararea se realizeaz sub aciunea unei fore centrifugale (!), generate #n tim'
pul micrii piesei rotative (rotorului) unui aparat numit centrifug"!
0ora centrifugal este o for derivat din fora de atracie gravitaional, dar de sens
opus, ea determinnd ndeprtarea corpurilor de la centru spre periferie, #n timpul unei rotaii.
*"presia fizic (formula) forei centrifugale se poate deduce cu uurin din urmtoa'
rea schem (#ig! 1!/!)$
r
r
u
T r a i e c t o r i a r o t a t i e i
r o t o r u l u i
#ig! 1!/! (eprezentarea )c%ematic a rota+iei rotorului unei centri,uge. pentru deducerea 0alorii lui G
!in schem se deduce urmtoarea formul$
G 1 1.112 * 13
45
* r * u
'
, unde$
G 1 fora centrifugal, msurat #n uniti g%
1.112 1 constanta de centrifugare%
r 1 raza dispozitivului de rotaie (rotor), msurat #n cm%
u1 viteza unghiular (viteza cu care este acoperit un anumit sector de cerc #n unitatea
de timp% u reprezint, de fapt, viteza de rotaie a rotorului i se msoar #n rotaii2minut 3
rpm)
&n practic, pentru determinarea unora dintre mrimile care fac parte din formula for'
ei centrifugale (G sau u), nu se folosete formula de calcul, ci un dispozitiv grafic cunoscut
sub numele de nomogram (#ig! 1!6!)!
#ig! 1!6! Nomograma
Nomograma este un sistem grafic tria"ial, pe baza cruia, cunoscnd dou valori ale
unor parametri din e"presia forei centrifugale, se poate afla direct valoarea parametrului ne'
cunoscut, unind punctele cunoscute cu autorul unei drepte. +relungind linia trasat #n direc'
ia a"ei cu valoarea necunoscut, se obine un punct de intersecie, care reprezint tocmai
valoarea parametrului cutat.
1.2.1. #i$uri de centrifuge
&n practica de laborator se folosesc, #n general, dou tipuri de centrifuge, ce difer #n
principiu dup construcia rotorului$
centrifuga cu e$ru%ete %alansante (cu rotor orizontal)
&n cazul acestui tip de rotor, eprubetele (tuburile de centrifugare) sunt ataate
mobil la e"tremitatea e"tern a rotorului, fapt care face ca poziia lor s se
modifice pe parcursul rotaiei acestuia (din poziie vertical #n repaus,
eprubetele aung #n poziie orizontal, #n timpul centrifugrii). 4aza rotorului
cu eprubete balansante este egal cu distana de la centrul de rotaie pn
la baza eprubetei, orizontalizat (#ig! 1!5!)7
r r o t o r u l u i
R o t o r
P o z i t i a e p r u b e t e i
n t i m p u l r o t a t i e i
P o z i t i a e p r u b e t e i
n r e p a u s
M o t o r e l e c t r i c
! x u l
r o t o r u l u i
#ig! 1!5! Centri,uga cu eprubete balan)ante
centrifuga cu rotor angular
&n cazul acestei centrifuge, rotorul este un dispozitiv masiv, de form
trapezoidal #n seciune, prezentnd #n interior locauri pentru eprubetele de
centrifugare, dispuse #n poziie oblic fa de a"ul de rotaie. Spre deosebire
de centrifuga cu rotor orizontal, poziia eprubetelor este fi", nemodificat, #n
timpul rotaiei. 4aza acestui tip de rotor este egal cu distana dintre centrul
de rotaie i centrul geometric al eprubetelor (punctul de intersecie al celor
dou mediane imaginare care trec prin eprubete) (#ig! 1!8!)!
R o t o r
M o t o r e l e c t r i c
! x u l
r o t o r u l u i
r
" o c a s u l
e p r u b e t e i
C e n t r u l g e o m e t r i c
a l e p r u b e t e i
#ig! 1!8! Centri,uga cu rotor angular
1.2.2. &actori care condiioneaz" sedimentarea com$onentelor celulare
&n condiiile #n care G i timpul de centrifugare sunt constante, #n timpul centrifugrii
sedimenteaz numai anumite componente celulare, tipul particulelor care se colecteaz, #n
condiiile menionate, depinz#nd #n principal de dou categorii de factori$
a! Caracteri)ticile particulelor. ,ceste caracteristici se refer la$
masa i densitatea particulelor ' care sunt direct proporionale cu viteza de
sedimentare (componentele mai grele i mai dense se depun #ntotdeauna,
sub form de sediment, #naintea celor mai uoare, cu densitate mai mic)%
forma i suprafaa particulelor 3 un component celular, dei greu, se poate
deplasa i depune #n tubul de centrifugare cu o vitez cu att mai mic cu
ct suprafaa sa este mai e"tins i forma mai neregulat.
b!Caracteri)ticile mediului de centri,ugare. Se refer #n principal la densitatea i vscozi
tatea acestui mediu (caracteristici invers proporionale cu viteza de deplasare i sedimentare
a componentelor celulare)
1.2.3. 'entrifugarea celulelor ntregi i a omogenatelor celulare
4eprezint dou variante distincte ale modului #n care G acioneaz asupra separrii
componentelor celulare.
&n cazul centrifugrii celulelor ntregi (variant ce poate fi e"emplificat prin centrifu'
garea unor celule dotate cu remarcabile proprieti de elasticitate i plasticitate, cum este ca'
zul celulelor protozoarului (moe%a $roteus) cu autorul unui dispozitiv numit microscop !
centrifug, se remarc dou evenimente interesante$
o alungire a celulelor pe direcia de aciune a forei centrifugale (ele
cptnd o form tubular)si
o separare intracitoplasmatic i o grupare zonal a structurilor celulare,
de la polul centrifugal spre polul centripetal (#n funcie de dispunerea
celulelor fa de a"ul de rotaie) (#ig! 1!9!)!

C r i s t a l e
C i t o p l a s m
d e n s
# u c l e u
M i t o c o n d r i i
$ a c u o l e
" i p o z o m i
P o l
c e n t r i f u g a l
P o l
c e n t r i p e t a l
#ig! 1!9! :e,ormarea celulei "i di)punerea intern a componentelor ;n cazul centri,ugrii unei )u)pen)ii
de (meo%a $roteus
&n cazul centrifugrii omogenatelor celulare, la sfritul centrifugrii se obin #ntotdea'
una dou componente$ o parte solid, precipitat (sediment) i o parte lichid, dispus
deasupra primei, care conine particulele nesedimentate, aflate #n suspensie (su$ernatant)"
5rind progresiv valoarea lui ! i a timpului de centrifugare, se pot obine practic
principalele componente celulare, #n etape successive, sub form de sediment, motiv pentru
care o astfel de centrifugare mai este cunoscut i sub numele de fracionare difereniat"
sau centrifugare difereniat" a celulelor!
&n schema urmtoare, se prezint parametri specifici (G i timpul de centrifugare) ne'
cesari pentru separarea, sub form de sediment, a principalelor componente celulare, por'
nind de la un omogenat celular$

omogenat
833 < 1333 g. 13min
)ediment I (nuclei) = )upernatant I
)upenatant I
8333 < 9333 g. 13min
)ediment II (mitocondrii) =
)upernatant II
)upernatant II
13333 g. /3min
)ediment III (lizozomi) =
)upernatant III
)upernatant III
133333 g. 83min
)ediment I> (microzomi) =
)upernatant I>
1.2.. 'entrifugarea nucleilor i mitocondriilor eta$e de lucru
+entru a separa prin centrifugare nuclei i mitocondrii, plecnd de la materialul
biologic avut la dispoziie, se parcurg urmtoarele etape e"perimentale (#ig! 1!2!)$
6. se sacrific animalul de laborator (obolan alb din rasa 7istar) prin decapitare total
sau parial%
8. se practic o incizie pe linia medioventral a corpului animalului, din regiunea
suprapubian pn la nivelul rebordului costal (se pot seciona i coastele, paralel cu
sternul, pentru abordarea organelor din cavitatea toracic)%
9. se preleveaz organe, parcurgnd urmtoarele subetape$
se toarn soluie de zaharoz (sucroz) :,8;5 #n cristalizoare i acestea se
depun #n plci +etri, pe cuburi de ghea de mici dimensiuni, pentru rcirea
soluiei%
se decupeaz cu foarfecele fragmente de organe i se introduc cu pensa #n
soluia de zaharoz rcit la ghea%
<. se realizeaz omogenate din organele luate #n lucru$
se cntresc cte :,; g din fiecare organ pe sticle de ceas, fragmentele
cntrite se mrunesc fin cu foarfecele, organul mrunit se transvazeaz
#n cuva omogenizatorului +otter i se adaug, prin pipetare <,; ml soluie
de zaharoz :,8; 5 (astfel #nct diluia omogenatului sa fie 6 2 6:)%
se tritureaz mecanic fragmentele suspendate #n zaharoz, pn cnd o'
mogenatul, privit prin transparen, capt un aspect fin i omogen.
;. se decanteaz omogenatele obinute #n eprubete de centrifugare i se echilibreaz la
balan%
=. se introduc eprubetele #n rotorul centrifugei (fa #n fa) i se realizeaz centrifuga'
rea pentru sedimentarea nucleilor (6: min, la o vitez unghiular corespunztoare la
g 1 6::: g i r 1 ; cm, viteza aflat din nomogram)%
>. la finalul centrifugrii se obine un sediment reprezentativ cantitativ, depus pe fundul
eprubetei i un supernatant opalescent, care se colecteaz #ntr'un alt tub de centrifu'
gare, #n vederea centrifugrii ulterioare (pentru separarea mitocondriilor)%
?. se realizeaz controlul citologic (microscopic) al separrii nucleilor #n modul urmtor$
se depune o pictur de zaharoz pe lama de microscop%
mic poriune din sedimentul colectat se amestec pe lam cu zaharoza, se
acoper cu lamela i se observ succesiv, la obiective din ce #n ce mai mari
(6:" 3 <:")% dac separarea este corespunztoare, #n cmpul microscopic
se pot observa direct, prin transparen, corpusculi #n general sferic'ovoizi,
delimitai de o membran refringent, care reprezint nucleii izolai prin
centrifugare.
*ste indicat #ns ca, #nainte de separarea propriu'zis, s se realizeze mai multe
splri de purificare a sedimentului nuclear (8 3 9 cicluri de resuspendare #n zaharoz 3 cen'
trifugare), care conduc la o purificare a sedimentului #n proporie de @; 3 @?A.
@. pentru centrifugarea mitocondriilor, supernatantul, colectat #n urma separrii nucleilor,
se centrifugheaz la parametri corespunztori (>::: g, 6: min)%
6:. la sfritul centrifugrii rezult un sediment (mai redus cantitativ dect #n cazul nucle'
ilor) i un supernatant, care se #ndeprteaz%
66. controlul microscopic al separrii mitocondriilor se face #ntr'o manier analog cu cea
precizat pentru observarea nucleilor, cu deosebirea c pe lama de microscop se a'
daug i o pictur de colorant specific pentru aceste organite celulare (verde
#anus).
68. #n cazul unei coloraii i separri adecvate, mitocondriile pot fi vizualizate doar cu o'
biective mari (<:" 3 imersie), aprnd ca nite formaiuni ovale sau sferice, verzi cu
refle"e glbui i cu densitate relativ redus #n cmpul microscopic.
! n i m a l d e
e x p e r i e n t
( s o b o l a n )
% a c r i f i c a r e &
d i s e c t i e
' r g a n
( f i c a t )
P r e l e v a r e
( a h a r o z
C u b u r i d e
g h e a t
P l a c P e t r i
C i n t r i r e ( ) & * g ) &
o m o g e n i z a r e
' m o g e n i z a t o r
P o t t e r
+ e c a n t a r e
' m o g e n a t
, p r u b e t
d e
c e n t r i f u g a r e
C e n t r i f u g a r e
( - ) ) ) g & - ) m i n . )
% e d i m e n t
d e n u c l e i
% e d i m e n t
d e m i t o c o n d r i i
% e d i m e n t
d e n u c l e i p u r i f i c a t
-
-
/
/
R e s u s p e n d a r e &
r e c e n t r i f u g a r e ( / 0 1 o r i )
C e n t r i f u g a r e
( 2 ) ) ) g & - ) m i n . )
+ e c a n t a r e a
s u p e r n a t a n t u l u i
' b s e r v a r e m i c r o s c o p i c
C o l o r a r e &
o b s e r v a r e m i c r o s c o p i c
#ig! 1!2! Etape de lucru pentru )epararea "i ob)er0area nucleilor "i a mitocondriilor
Lucrarea de laborator '
?ltracentri,ugarea
-ltracentrifugarea reprezint o variant superioar (#nalt) de centrifugare a compo'
nentelor celulare.
Bntre centrifugare i ultracentrifugare, principial, nu e"ist deosebiri de ordin calitativ,
ci doar cantitativ, putndu'se considera c ne aflm #n domeniul ultracentrifugrii atunci cnd
fora centrifugal (C) depete 6::.::: g.
-ltracentrifugele sunt, #n ansamblu, aparate mai comple"e dect centrifugele obinui'
te, aceast comple"itate derivnd din faptul c, la viteze de rotaie foarte mari ale rotorului,
frecrile care apar sunt imense. 4educerea la minim a frecrilor impune vidarea camerei de
centrifugare cu autorul unei pompe de vid, care creaz #n aceast incint o presiune negati'
v avansat (msurat #n torr). !e asemenea, rotorul este ridicat #n timpul rotaiei, odat cu
a"ul su, iar micarea de rotatie a acestuia este controlat i de aciunea unui cmp de fore
electromagnetice, #n afar de rotaia mecanic sustinuta de motorul ultracentrifugei.
+entru evitarea la ma"im a degarii de cldur, care apare totui #n timpul micrii
rotorului, ultracentrifuga este prevzut cu un sistem de rcire comple", menit s reduc la
ma"im e"cesul termic. ,cest sistem de rcire este constituit din trei componente$
instalaie de refrigerare (cu freon) care coboar temperatura din camera apa'
ratului pn la 3;:
:
. (3=:
:
.)%
instalaie de circulare a apei, legat la reeaua de ap%
$ ! % ventilatoare care rcesc piesele aparatului ce se #nclzesc #n timpul
funcionrii.
!eosebirile constructive dintre centrifuge i ultracentrifuge includ i tuburile de ultra'
centrifugare. ,cestea sunt realizate din materiale rezistente (mase plastice sau teflon) i pre'
zint un sistem multiplu de #nchidere, format din urmtoarele piese$ un dop de metal cu gar'
nitur de cauciuc pentru etanare i o prelungire e"tern cu filet dublu (interior i e"terior), un
capac metalic perforat, o piuli care solidarizeaz cele dou piese, #mpiedicnd alunecarea
dopului #n eprubet i un urub ce se #nfileteaz #n prelungirea tubular a dopului metalic
(#ig! '!1!)! ,cest sistem multiplu de #nchidere are rolul de a izola complet coninutul tubului
de atmosfera intern din camera de ultracentrifugare i, totodat, poate fi utilizat pentru elimi'
narea aerului i echilibrarea eprubetelor, #nainte de ultracentrifugare (e"cesul de mediu se e'
limin, sub form de picturi, prin prelungirea tubular a dopului metallic, #n urma presrii
uoare a dopului).
% u r u b
P i c t u r d e
m e d i u e l i m i n a t
p r i n p r e s a r e a
d o p u l u i
+ o p
m e t a l i c
P i u l i t
G a r n i t u r
d e c a u c i u c
#ig! '!1! A)pectul tubului de ultracentri,ugare "i a )i)temului )u de ;nc%idere
'!1! Medii de ultracentri,ugare
!ac la centrifugarea obinuit, pentru separarea particulelor celulare, se utilizeaz
medii omogene din punct de vedere a densitii (de e"emplu, soluie de zaharoz :,8; 5), la
ultracentrifugare se utilizeaz medii neomogene, adic medii care prezint un gradient de
den)itate (diferen de densitate) pe vertical (#n #nalimea coloanei de mediu). !up modul
#n care variaz gradientul, se disting dou tipuri de medii cu gradient de densitate, care, #n
ordinea utilizrii i a capacitii lor de separare a particulelor, sunt$ mediul cu gradient
di)continuu de den)itate i mediul cu gradient continuu de den)itate.
2.1.1. Mediul cu gradient discontinuu de densitate
&n cadrul mediului cu gradient discontinuu de densitate, densitatea variaz brusc
(descrete) pe vertical, #ntre fazele cu densitati diferite aprnd limite nete (interfee) de se'
paraie.
,spectul unui astfel de mediu, realizat din trei soluii de zaharoz cu densitati
(concentraii) diferite, este prezentat #n #ig! '!'! A
( a h a r o z
) & / * M
( a h a r o z
- & / * M
( a h a r o z
/ & 1 ) M
" i m i t e d e
s e p a r a t i e n t r e
f a z e
a
b
c
G
! 3
#ig! '!'! Mediul cu gradient di)continuu de den)itate (A) "i )epararea componentelor celulare ;ntr4un
a)t,el de mediu. prin ultracentri,ugare (@)

!ac, utilizand acest mediu, se ultracentrifugheaz o fraciune iniial, depus pe
suprafaa sa (la suprafa soluiei cu densitatea cea mai mic), se constat c, #n timpul
procesului, din aceast fraciune se separ particule care migreaz #n masa mediului, cu
viteze i pe distane diferite, #n funcie de masa i densitatea acestora$ particulele cu
densitatea cea mai mic se depun la limita de separaie dintre soluiile de zaharoz cu
concentraiile :,8; 5 i 6,8; 5, particulele cu densitate mai mare se etaleaz la interfaa
dintre soluiile de zaharoz 6,8; 5 i 8,9: 5, iar particulele cele mai dense strbat toate
fazele de densitate, depunndu'se pe fundul eprubetei (formeaz un sediment (clasic),
#ntlnit i #n centrifugrile obinuite) (#ig! '!'! @).
Se poate afirma deci c, prin ultracentrifugare n mediul cu gradient discontinuu de
densitate, se obine un numr de fraciuni egal cu numrul fazelor distincte de densitate pe
care le conine mediul respectiv.
&n general, la ultracentrifugare, fiecare particul se depune n masa mediului exact n
punctul n care densitatea sa proprie este egal cu densitatea mediului (punct izopicnic).
+articulele separate prin ultracentrifugare, #ntr'un astfel de mediu, poart numele de
microzomi. 5icrozomii sunt reprezentai de fragmentele de membrane care delimiteaz or'
ganite celulare de mari dimensiuni (reticul endoplasmatic, aparat Colgi) i care nu persist
sub form aplatizat #n mediu, ci se #nchid sub forma unor structuri veziculare, diferite ca
dimensiuni% dintre microzomi fac parte i agregatele ribozomale, de diferite tipuri.
&n e"emplul din #ig!13@, cele trei fraciuni microzomale figurate (a, b i c), repre'
zint$
fraciunea a 3 microzomi cu membran neted (provenii din saculii golgieni i 4*N)%
fraciunea b 3 microzomi cu membran acoperit de ribozomi, rugoas (provenii din
4*C)%
fraciunea c 3 agregate ribozomale de diferite forme i dimensiuni (polimeri ribozomali
i poliribozomi).
&repararea mediului cu gradient di)continuu de den)itate se realizeaz foarte
simplu, manual (#ig! '!/! A i @)$ se pipeteaz soluia cea mai concentrat de zaharoz
(8,9: 5), meninnd pipeta i tubul de ultracentrifugare #n poziie vertical (#ig! '!/! A)% pen'
tru pipetarea soluiilor de zaharoz de concentraii mai mici (urmtoarele faze de densitate),
se #nclin eprubeta la un unghi ct mai ascuit fa de orizontal, se spriin vrful pipetei pe
gura eprubetei i se las s se scurg soluia mai diluat, ct mai lent, peste soluia mai con'
centrat (#ig! '!/! @).
+rocednd #n acest fel se evit amestecul fazelor cu densitate diferit i se prepar
un mediu cu gradient discontinuu corespunztor.
( a h a r o z
/ & 1 M
( a h a r o z
- & / * M
P i p e t
, p r u b e t
d e
u l t r a c e n t r i f u g a r e
3
!
#ig! '!/! &repararea mediului cu gradient di)continuu de den)itate
2.1.2. Mediul cu gradient continuu de densitate
&n cazul acestui mediu, densitatea descrete continuu i discret pe vertical, de la ba'
za spre partea superioar a tubului de ultracentrifugare, nemaiaprnd limite de separaie #n'
tre fazele cu densitati diferite. -n e"emplu de astfel de mediu, realizat din dou soluii de za'
haroz (8:A i ;A) este prezentat #n #ig! '!6.
5ediul cu gradient continuu de densitate se poate utiliza #n continuarea mediului cu
gradient discontinuu, oricare dintre fraciunile microzomale rezultate #n urma ultracentrifugrii
putnd fi re ' centrifugate #n mediul cu gradient continuu.
G
( a h a r o z
* 4
( a h a r o z
/ ) 4
a
b
c
d
e
f
#ig! '!6! A)pectul mediului cu gradient continuu de den)itate "i )epararea componentelor celulare prin
ultracentri,ugare ;ntr4un a)t,el de mediu
0raciunile obinute utiliznd un astfel de mediu (b. c. d. e. ,), separate prin ultracen'
trifugarea fraciunii iniiale a, poart numele de ultramicrozomi. Spre deosebire de fraciuni'
le microzomale, rezultate #n urma ultracentrifugrii #n mediul cu gradient discontinuu de den'
sitate, prin ultracentrifugare #n mediul cu gradient continuu se obine un numr nedefinit de
fraciuni, dar egal cu numrul punctelor izopicnice care se stabilesc #ntre particule i mediu.
&repararea mediului cu gradient continuu de den)itate este mai complicat i ne'
cesit utilizarea unui dispozitiv special conceput in acest scop (#ig! '!5!)!
( a h a r o z
* 4
( a h a r o z
/ ) 4
, p r u b e t
d e
u l t r a c e n t r i f u g a r e
M e d i u c u g r a d i e n t
c o n t i n u u d e d e n s i t a t e
R o b i n e t T u b d e
c o l e c t a r e
P a l e t d e
a m e s t e c
! 3
#ig! '!5! :i)poziti0 de preparare a mediului cu gradient continuu de den)itate
,cest dispozitiv, de ple"iglas, conine #n interior doi cilindri verticali (A i @), #n care se
introduc cele dou soluii de zaharoz cu concentraii diferite (8:A, si respectiv ;A), din care
se prepar mediul% cilindrii sunt conectati printr'un canal circular, care se prelungete i se
deschide pe o latur a dispozitivului. Da acest nivel se introduce un tub elastic, prin
intermediul caruia se colecteaz mediul rezultat #n urma amestecului, #ntr'un tub de
ultracentrifugare.
&n condiiile #n care robinetul care obtureaz comunicarea dintre cei doi cilindrii este
deschis, iar paleta de amestec, ce ptrunde #n soluia concentrat de zaharoz, este aciona'
t de un motor electric, soluia de zaharoz ;A ptrunde #n cilindrul A i este amestecat cu
soluia de zaharoz mai concentrat, aceasta dilundu'se treptat i continuu. !ac debitul
de ptrundere a soluiei diluate #n cilindrul A este egal cu debitul de evacuare a amestecului
din acelai cilindru, mediul cu gradient continuu, preparat la acest nivel, este colectat #n tubul
de ultracentrifugare.
Lucrarea de laborator /
Analiza ultracentri,ugatului
Studiul fraciunilor ultramicrozomale rezultate #n urma ultracentrifugrii #n mediul cu
gradient continuu de densitate se poate realiza, #n principiu, pe douE ci$
prin metode fizicochimice&
prin metoda spectrofotometric"
/!1! &rincipiul metodei )pectro,otometrice
Metoda )pectro,otometric const #n determinarea valorii extinciei (absorbiei)
unei radiaii monocromatice, absorbtie produsa de structura chimic spaial
(tridimensional) a unui cornpus aflat n soluie"
0iecare substan prezint un optimum de absorbie pentru o radiaie cu o lungime
de und determinat (radiaie monocromatic). Fotui, acelai compus poate absorbi mai
mult sau mai puin lumina cu lungime de und caracteristic, #n funcie de concentraia sa.
!eci, prin analiza spectrofotometric se poate stabili in final concentraia compusului
investigat #n soluia de lucru (pe baza interpolrii e"tinciilor obinute #ntr'o aa ' numit curb
etalon, construit #n prealabil).
!eoarece analiza spectrofotometric a #ntregului ultracentrifugat nu se poate realiza
#ntr'o etap unic (datorit heterogenitii sale, care implic apariia concomitent a mai
multor absorbii, la o lungime de und dat), este necesar ca, iniial, coninutul tubului de
ultracentrifugare s fie divizat i distribuit #n mai multe volume mici, egale, #n eprubete de
colectare, urmnd ca ulterior aceste volume de lichid s fie spectrofotometrate, pe rnd.
0ragmentarea ultracentrifugatului #n aceste volume egale se realizeaz numai cu autorul
unui dispozitiv special, numit micropomp peri)taltic!
5icropompa peristaltic funcioneaz #n modul urmtor$ prin rotaia piesei mobile fa
de o piesa fi", se creaz o for de absorbie i #mpingere prin care ultracentrifugatul este
aspirat prin e"tremitatea unui tub elastic, care este introdus #n ultracentrifugat, pn #n
partea bazal a eprubetei de ultracentrifugare. Da e"tremitatea opus a tubului ce se
interpune #ntre cele dou piese, ultracentrifugatul antrenat se scurge sub form de picturi ce
se colecteaz #n mai multe eprubete, #n numr egal (deci, #n volume egale)% micropompa
peristaltic este o pomp aspiratoare'respingtoare% cilindrii care unesc cele dou plci ale
piesei rotative au o micare de sens contrar fa de micarea piesei #n ansamblu, permind
astfel meninerea tubului #n poziie fi" (#ig! /!1!)!
!up cum s'a menionat, fraciile obinute #n urma distribuiei ultracentrifugatului sub
forma mai multor volume egale vor fi ulterior analizate spectrofotometric, succesiv, la o
lungime de und determinat si caracteristica.
P i e s f i x
P i e s
r o t a t i v
C i l i n d r i
T u b d e c e n t r i f u g a r e
c u u l t r a c e n t r i f u g a t
, p r u b e t e d e c o l e c t a r e
a u l t r a c e n t r i f u g a t u l u i
- / 1 5 e t c .
P i c t u r i
T u b p e n t r u a b s o r b t i a s i
d i s t i b u t i a u l t r a c e n t r i f u g a t u l u i

#ig! /!1! Micropompa peri)taltic
*"tinciile obinute vor fi utilizate apoi pentru construirea unui grafic, pe baza cruia
se pot figura, dup desenarea eprubetei de ultracentrifugare, att poziia, ct i concentraia
diferitelor fraciuni #n coloana de mediu cu gradient continuu de densitate. Craficul obinut are
forma unei linii frnte (zig'zag)% vrfurile (peaG'urile) acestui grafic, corespunztoare
e"tinciilor ma"ime obinute, reflecta zonele de concentraie crescut a particulelor #n mediu
(att poziia, ct i densitatea fraciunilor ultramicrozomale) (#ig! /!')!
:
: , 8
: , <
: , =
: , ?
6
6 , 8
6 , <
6 , =
6 , ?
8
6 8 9 < ; = > ? @ 6 :
E p r u b e t e
E
*
t
i
n
c
t
i
e
(
E
)

#ig! /!'! Gra,ic reprezentAnd pozi+ia "i concentra+ia ,rac+iunilor ultramicrozomale. ob+inut
;n urma analizei )pectro,otometrice
/!'! Sc%ema con)tructi0B a )pectro,otometrului

Spectrofotometrul utilizat #n aceast lucrare (HecGman !H) posed cte o surs de
lumin pentru cele dou domenii spectrale #n care funcioneaz I ultraviolet i vizibil (?> "i
>IS)!
Sursele de lumin emit radiaii compuse (policromatice), care aung la nivelul unui
sistem de prisme (monocromator), care transform aceste radiaii #n fascicule
monocromatice, cu lungimea de und dorit. 4adiaiile monocromatice sunt reflectate, #n
continuare, de o oglind plan cu unghi variabil% o parte dintre ele strbat dou fante i aung
la nivelul celor dou cu0e ale aparatului (cuva cu etalonul ' E i cuva cu proba de analizat '
&). 5ediile din cele dou cuve absorb #n mod diferentiat radiaiile incidente, astfel #nct
radiaiile emergente (care ies din cuve) sunt inegale ca intensitate. ,ceste radiaii e"cit
dou celule ,otoelectrice. care transform semnalul luminos #ntr'un curent electric cu
intensitate variabil, ce pune #n micare acul indicator. pe )cala dubl a
spectrofotometrului$ scala transrnisiei (T), ;n partea inferioar i scala extinciei (absorbiei '
A), #n partea superioar. *"tincia variaz logaritmic, avnd valoarea ma"im 8, pe cnd
transmisia este #nscris procentual, de la 6 Ba 6::A (#ig! /!/!)!
&nainte de citirile propriu'zise, se reaBizeaz etalonarea aparatului, in vederea
stabilirii cuantumului de e"tincie datorat etalonului.
Bn cazul de fa, etalonarea se face cu ap distilat
,tt etalonarea, ct i determinarea e"tinciei probelor, se realizeaz la (lungimea
de und) de 8=: nm (#n -J), aceast valoare fiind caracteristic pentru moleculele de ,4N
prezente #n compoziia ultramicrozomilor separai.
)
. ) *
. -
. /
. 1 . 5
. *
. 6
. 7
. 8
. 2
-
/
R a d i a t i e
p o l i c r o m a t i c
R a d i a t i e
m o n o c r o m a t i c
M o n o c r o m a t o r
, P
- )
)
/ )
1 )
5 ) * )
6 )
8 )
- ) ) 4
2 )
7 )
!
T
C u v e
9 a n t e
' g l i n d
% u r s d e
l u m i n
( : $ 0 $ ; % )
C e l u l e
f o t o e l e c t r i c e
#ig! /!/! Sc%ema con)tructi0a a )pectro,otometrului @ECCMAN :@
Lucrarea de laborator 6
:eterminarea re)pira+iei celulare (metoda -arburg)
4espiraia celular reprezint totalitatea proceselor de o"ido ' reducere care au loc la
nivelul unor compartimente celulare specializate (#n general, mitocondrii), procese care
furnizeaz cea mai mare parte a energiei necesare desfurrii activitilor celulare vitale.
Da organismele aerobe, respiraia se desfoar #n dou etape distincte$
eta$a anaero%" in care substraturile nutritive sunt descompuse pn la produi
intermediari de catabolism (aceast etap este asimilat frecvent cu glicoliza
anaerob, sau, #n unele cazuri, cu procesul de fermentaie)% randamentul
energetic al respiraiei anaerobe este relativ sczut%
eta$a aero%" ' prin care produii intermediari rezultai din prima etap sunt
transformai #n produi finali de catabolism (ap i bio"id de carbon), prin
parcurgerea etapelor de reacie ale ciclului Krebs i ale lanului transportorilor de
electroni% randamentul energetic al acestei etape este superior fa de cel al
respiraiei anaerobe.
!eoarece aprecierea intensitii respiraiei celulare, prin investigarea tuturor reaciilor
biochimice care o caracterizeaz, este dificil de realizat, determinarea acestui proces se face
#n mod curent prin msurarea manifestrilor sale e"terioare, #n mod frecvent a schimburilor
de gaze dintre celule i mediu (consumul de /8 sau eliminarea de ./8), #ntr'o unitate
determinata de timp.
-na dintre cele mai utilizate metode de determinare a respiraiei celulare este
metoda -arburg (microrespirometric), utilizata pentru msurarea schimburilor gazoase ale
unei cantiti reduse de material biologic$ un fragment de organ animal sau vegetal, o cultur
de microorganisme, o suspensie planctonic etc.
6!1! &rincipiul metodei -arburg
5etoda 7arburg este o metod manometric, bazat pe msurarea variaiilor
presiunii pariale ale oxigenului ($)2) fa de presiunea atmosferic, la volum constant i
temperatur constant (> 1 ct i T
3
1 ct)"
Aparatul -arburg, folosit #n acest scop, cuprinde urmtoarele componente
principale$
baie de ap termostatat, prevzut cu termometru de contact (pentru
termostatare)%
rezisten electric, pentru #nclzirea apei%
dispozitiv mecanic de agitare%
manometre pentru determinarea variaiilor pO' (sau pCO').
Manometrele aparatului 7arburg sunt construite din sticl, fiind alcatuite din dou
brae verticale ce se unesc #n partea inferioar, unde se continu cu o scurt prelungire la
care se ataeaz rezervorul cu lichid manometric (un tub de cauciuc elastic)% nivelul lichidului
manometric poate fi controlat prin presarea rezervorului elastic, cu autorul unui dispozitiv
(urub).
.ele dou brae ale manometrelor sunt diferite$ unul dintre brae (@) este permanent
deschis, presiunea atmosferic e"ercitndu'se asupra lichidului manometric din acesta% cel
de'al doilea bra (A) prezint un diverticul lateral cu o dilataie la capt, ce servete la
ataarea vasului de respiraie cu materialul biologic% deasupra acestui diverticul e"ist un
robinet, care, #n funcie de poziie, obtureaz sau nu comunicarea cu aerul atmosferic.
,mbele brae sunt notate cu diviziuni liniare (mm i cm), de la diviziunea : la diviziunea 9:
(cm). &n momentul #nceperii determinrii (t3), nivelul lichidului manometric se aduce la
diviziunea 6;, #n ambele brae (,ig! 6!1!).
- * ) m m
1 ) ) m m
) m m
3 r a t d e
l e g t u r
R o b i n e t
" i c h i d
m a n o m e t r i c
( 3 r o d i e )
R e z e r v o r
% u r u b d e p r e s a r e
$ a s d e
r e s p i r a t i e
3 !
#ig! 6!1! A)pectul manometrelor aparatului -arburg
Jolumul constant (>c) #n care se apreciaz consumul de o"igen al celulelor (i, deci,
modificrile pO', conform principiului metodei), cuprinde urmtoarele segmente$ poriunea
din braul A de la nivelul lichidului manometric (diviziunea 6;) pn la robinet #n poziie
#nchis, volumul interior al braului lateral i volumul vasului de respiraie.
&nainte de utilizare, toate manometrele se etaloneaz cu mercur, la temperatura de
lucru (de e"emplu, 9>
:
. pentru esuturile de mamifere).
*talonarea se realizeaz prin umplerea manometrului, ct i a vasului de respiraie
corespunztor, montat la diverticulul lateral, cu o cantitate cunoscut de Lg. +rin etalonare
se stabilesc dou constante$ volumul total al manometrelor (>t) i volumul unei diviziuni ! $
mm liniar (>di0).
Dichidul manometric utilizat pentru msurtori 3 lic%idul @rodie #ntrunete dou
caliti, care'l recomand pentru utilizarea in acest scop$ este suficient de fluid pentru a se
mica cu uurin #n manometru, #nregistrnd cea mai mic variaie de presiune a /8 i are o
tensiune superficial suficient de mare pentru a nu se volatiliza #n aerul din volumul constant
al manometrului i, #n acelai timp, pentru a #mpiedica difuziunea moleculelor de gaz #n mas
sa.
,ceste caliti sunt asigurate de compoziia sa chimic$ ;g taurocolat de sodiu, 89g
Na.l2;::ml ap distilat, o pictur de eozin pentru coloraie i 8'9 cristale de timol pentru
conservare% densitatea lichidului Hrodie este 6,:9< iar presiunea sa echivalent (6 atm) este
de 6:.::: mm coloana lichid.
6!'! Dnregi)trarea 0aria+iilor pO
'
&n condiiile #n care robinetul este #nchis (se delimiteaz >c), consumul de /8 de ctre
celule face ca pO' din >c s scad, lichidul manometric urcnd #n braul A cu #nlimea % i
scznd #n braul @ cu o #nlime echivalent (4 %) #n intervalul de determinare (#ig! 6!'! a).
,ceast cretere a #nlimii lichidului Hrodie #n braul A #nseamn, de fapt, reducerea
valorii >c (enunat anterior)% de aceea, la sfritul intervalului de determinare propus, prin
uoara deurubare a piesei de presare a rezervorului, se readuce nivelul lichidului la
diviziunea de start (6; cm) #n braul A, fapt care antreneaz o scdere echivalent a #nlimii
lichidului #n braul @ (#n care lichidul Hrodie #nregistreaz o scdere total egal cu < '%)
(#ig! 6!'!b).
&n concluzie, msurarea variaiilor $)2 nu se realizeaz n mod direct, pe braul (
(aflat n legtur cu esutul), ci indirect, pe braul deschis (*), apreciinduse de fapt creterea
presiunii atmosferice n raport cu $)2, exercitat prin presiunea hidrostatic a coloanei de
lichid manometric.
< h
0 h
0 / h
!
3
#ig! 6!'! M)urarea con)umului de o*igen prin 0aria+iile ;nl+imii coloanei lic%idului @rodie
.onsumul de o"igen, #n intervalul de timp propus pentru determinare, se apreciaz
prin formula$
C o n s u m d e '
/
( m m ) = h x c
1
#n care$
% 1 scderea #nlimii coloanei de lichid Hrodie #n braul @%
c 1 constanta manometrului (o mrime caracteristic fiecrui instrument de msur #n
parte, care reflecta corelaia #ntre presiune, temperatur i volum).
c se calculeaz din urmtoarea formul$
c
> > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > >
( $ t 0 $ l ) x < $ l x
> > > > > > > > >
/ 2 1
/ 2 1 < t
)
- ) ) ) )
=
unde$
>t 1 volumul total al manometrului (care coincide, #n formul, cu >c)%
>l 1 volumul lichidelor din vasul de respiraie plus volumul materialului biologic%
'9/ 1 temperatura absolut, e"primat #n
:
Kelvin (:
:
.)%
'9/ = t
3
1 temperatura de lucru (9>
:
. pentru esuturile de mamifere)%
1 coeficientul de solubilitate 'unsen (ce e"prim solubilitatea unui gaz #ntr'un
lichid, #n funcie de temperatur)% de e"emplu, pentru /8 1 :,:8< (la 9>
:
., #n tampon
fosfat).
6!/! Etape de lucru
se sacrific animalul de e"perien i se preleveaz 8'9 organe diferite #n soluie
tampon fosfat rcit la ghea (preparat din ?6,?ml Na8L+/< 526; i 6?,8ml KL8
526;)%
se completeaz vasele de respiraie cu amestecul corespunztor (:,8ml K/L 8:
3 =:A, introdus #n incinta central a vasului pentru absorbia ./8 degaat i ;ml
tampon fosfat, pipetat #n restul vasului)%
se cntresc cte :,; g din organele luate #n lucru, se taie #n fragmente mai mici
i se introduc cu pensa #n tamponul fosfat din vasele de respiraie (#ig! 6!/!)%

; n c i n t
c e n t r a l
% o l u t i e ? ' @
( / ) s a u 6 ) 4 )
9 r a g m e n t e d e
o r g a n ( ) & * g )
% o l u t i e t a m p o n
f o s f a t ( * m l )
#ig! 6!'! A)pect )c%ematic al unui 0a) de re)pira+ie )i al con+inutului ace)tuia
vasele de respiraie, #mpreun cu coninutul, lor se monteaz, prin gresare cu
vaselin, la e"tremitatea dilatat a diverticulului lateral al manometrelor cores '
punztoare%
odat pregtite, manometrele se ataeaz, prin #nurubare, la rama
dispozitivului de agitare%
se pornete dispozitivul de agitare mecanic i, timp de 6;min, esuturile se
las la incubat #n baia de ap, cu robinetele deschise (pentru acomodarea lor
cu temperatura de lucru)%
dup 6;min, robinetele se #nchid i se msoar periodic (din 6; #n 6;min)
valorile denivelrilor lichidului Hrodie aprute la nivelul fiecrui manometru%
rezultatele (%) obinute se trec #ntr'un tabel, pe baza cruia se calculeaz
consumul de /8, conform formulei enuntate mai sus.
Ob)er0a+ie
&n afar de manometrele asociate cu probele se utilizeaz i un manometru martor,
numit termobarometru (T@), necesar #nregistrrii variaiilor de moment ale
presiunii gazelor, produse, cel mai frecvent, de o dilataie gazoas
determinat de temperatur% modificrile lui h, obinute pe FH, se scad, sau
se adun (dup caz), la valorile lui h #nregistrate pe manometrele cu probe.
&n vasul de respiraie cuplat la FH nu se introduce material biologic (sau, se
introduc fragmente de organe, dar acestea se inactiveaz n prealabil, prin
fierbere).
6!6! E*emplu de tabel de calcul al con)umului de O
'
Manometrul
Organ %
Corec+ia 1 < c1
(%prob = %T@)
Corec+ia ' < c'
(c1 * >di0)
Con)um O'
(mm
/
) (% * c)
1
'
etc!
T@
,icat
4
4
4
4
4
4
4
4
6!5! >alori ale con)tantelor manometrelor (c) "i ale unei di0iziuni liniare (1mm)
Manometrul c
>olumul unei di0iziuni
liniare (mm
/
)
1 '.3'29 3.31'
' '.3681 3.311
/ 1.915E 3.311
6 1.'93E 3.31'
5 1.2133 3.311
8 1.'932 3.311
Lucrarea de laborator 5
:eterminarea concentra+iei acizilor nucleici (metoda Spirin)
Spre deosebire de alte metode similare, metoda Spirin reprezinta o modalitate
simpl i direct de determinare a concentraiei acizilor nucleici (,!N i ,4N) dintr'o
cantitate determinat de material biologic. Specificul acestei metode const #n complexitatea
calculului final, prin care se realizeaz aprecierea cantitativ a concentraiei fiecrui tip de
acid nucleic prezent #n amestecul de e"tracie.
5!1! &rincipiul metodei
Metoda Spirin const #n extracia i hidroliza concomitent a ()*ului i (+*ului
din materialul biologic cu acid percloric, prin fierbere la $,,
,
-"
!up e"tracie i hidroliz, amestecul de nucleotide rezultat este supus unei analize
cantitative spectrofotometrice, absorbia fiecrei probe fiind determinat la dou lungimi de
und diferite, #n -J (6 1 8>:nm i 8 1 8@:nm).
5!'! (eacti0i nece)ari
,cid percloric (L.l/<) :,;N
5!/! Etape de lucru
se sacrific animalul de e"perien i se preleveaz fragmente foarte mici de
organe, direct pe sticle de ceas%
fragmentele prelevate se cntresc la balana de torsiune (pentru fiecare, o
cantitate foarte redus, cuprinsa #ntre ; 3 8: g)%
fragmentele cntrite se omogenizeaz cu sticl pisat, #n moare%
moaratele se antreneaz cu ;ml L.l/< :,;N, #n eprubete de centrifugare%
probele obinute se introduc #n baia de ap aflat la 6::
:
. i se incubeaz 9:min%
eprubetele se rcesc cu et de ap i, dup echilibrare, se centrifugheaz
(<:::rpm 2 6:min)%
supernatantele obinute (e"tractele hidrolizate de acizi nucleici) se decanteaz #n
noi eprubete i, dup transvazare #n cuvele spectrofotometrului, probele se
spectrofotometreaz pe rnd, la cele dou lungimi de und menionate%
etalonarea se face cu ap distilat.
5!6! Calculul concentra+iei acizilor nucleici
!eterminarea concentraiei acizilor nucleici din e"tractele obinute nu se realizeaz
direct, ci #n dou etape distincte de calcul$
6. determinarea concentraiei fosfatului din acizii nucleici, dup urmtoarea formul$
unde$
C&4AN 1 concentraia fosfatului din acizii nucleici, e"primat #n g2ml%
E'93 1 e"tincia e"tractului hidrolizat la 8>:nm%
E'E3 1 e"tincia e"tractului hidrolizat la 8@:nm%
3.1E 1 indicele e"tinciei specifice.
8. determinarea propriuzis a concentraiei acizilor nucleici, ce se poate realiza pe
dou cai diferite$
a. determinarea concentraiei mediei a ,!N i ,4N, conform formulei$
CAN (gFml) 1 13./ * C&4AN
unde$
CAN (gFml) 1 concentraia medie a celor doi acizi nucleici, e"primat #n g2ml%
13./ 1 coeficientul mediu de transformare.
C
& < AN
(gFml) 1
E
'93
< E
'E3
3.1E
b. determinarea concentraiei fiecrui acid nucleic #n parte, conform formulelor$
CA(N (gFml) 1 13.5 * C&4AN
CA:N (gFml) 1 13.1 * C&4AN
unde$
CA(N (gFml) 1 concentraia ,4N, e"primat #n g2ml%
CA:N (gFml) 1 concentraia ,!N, e"primat #n g2ml%
13.5 1 coeficient specific de transformare pentru ,4N%
13.1 1 coeficient specific de transformare pentru ,!N'ului.
Jaloarea coeficientului specific de transformare este diferit pentru cei doi acizi
nucleici, deoarece s'a constatat, #n soluii pure, c e"tincia unui e"tract de ,!N este diferit
de cea a unui e"tract de ,4N, ca urmare a unei proporii diferite a fosfatului la nivelul
nucleotidelor specifice.
,stfel, coeficientul specific de transformare pentru ,4N este 6:,; deoarece coninutul
procentual al fosfatului este de @,;A #n acest acid nucleic, iar cel a ,!N'ului este 6:,6
deoarece coninutul procentual al fosfatului #n acest acid nucleic este de @,@A.
Lucrarea de laborator 8
:eterminarea concentratiei proteinelor celulare )olubile (metoda
LoGrH modi,icat)
&n funcie de amploarea lor, metodele de determinare a concentratiei proteinelor
celulare solubile se pot clasifica #n dou mari categorii$
metode de ansam%lu 3 prin care se dozeaz concentratia de proteine totale
dintr'o cantitate de material biologic (esut, organ)%
metode de detaliu 3 prin care se realizeaz analiza cantitativ a unei clase
de proteine, sau chiar a unei proteine specifice, dintr'o cantitate determinata
de material biologic.
Metoda LoGrH se bazeaz pe analiza fotocolorimetric" a proteinelor solubile,
extrase din materialul biologic prelucrat, proteine evideniate prin coloraii specifice cu
reactivi diferii de culoare. &n prealabil, #n vederea colorrii, materialul biologic, prelevat #n
condiii adecvate, este omogenizat, tratat cu reactivi de solubilizare a proteinelor i hidrolizat.
8!1! &rincipiul metodei ,otocolorimetrice
Metoda ,otocolorimetric const #n determinarea absorbiei (extinciei) unei radiaii
monocromatice specifice, produsa de intensitatea culorii compusului
analizat, aflat n soluie" !eoarece intensitatea coloraiei este
proporional cu concentraia compusului analizat #n soluie, rezult c, #n
final, prin fotocolorimetrie se determin concentraia compusului respectiv, in
mod indirect (similar metodei spectrofotometrice).
8!'! (eacti0i nece)ari
soluie tam$on fosfat cu $+ ,-2 (preparat prin amestecul a ?6,?ml soluie
Na8L+/< 526; i 6?,8 ml KL8+/< 526;)%
soluie .a)+ 2/ (reactiv de hidroliz)%
reactivi de culoare. Se utilizeaz, #n ordine, doi reactivi de culoare0
AI reacti0ul de culoare 1 preparat prin amestecul urmtoarelor dou
soluii$
aI Na8./9 6:A #n Na/L :,;N
bI .uS/< " ; L8/ :,;A #n citrat de Na 6A
&n momentul utilizrii, se amestec 6: ml soluie aM cu 6 ml soluie bI.
4eactivul de culoare 6 este specific pentru aminoacizii alifatici din compoziia pro'
teinelor.
@I reacti0ul de culoare ' 3 reactivul .olin-ioclteu (amestec de acid
fosfo'Noframic cu acid fosfo'molibdenic).
,cest reactiv coloreaz specific aminoacizii aromatici din proteine.
&nainte de utilizare, reactivul 8 se dilueaz (6ml reactiv 0olin'.ioclteu O 6:ml L8/
distilat).
8!/! Etape de lucru
se sacrific animalul de laborator i, dup incizarea medio'ventral, se preleveaz 8'
9 organe diferite #n soluie tampon fosfat, rcit la ghea%
se cntrete o cantitate de :,; g din fiecare organ%
organele se omogenizeaz, prin moarare cu sticl pisat, pn la obinerea unei
paste fine%
moaratul se antreneaz, prin splare atent i integral, #n eprubete de centrifugare%
rezult o prim diluie a materialului biologic 3 diluia omogenatului (:1)$

:1 1 1 F 13 (:,;g esut O <,;ml soluie tampon fosfat)%
se centrifugheaz probele, ; min la <::: rpm%
se realizeaz hidroliza e"tractelor proteice obinute$ #n noi eprubete se pipeteaz cte
:,; ml din supernatantele corespunztoare i 8,; ml soluie Na/L 8A% probele se
las un scurt timp #n repaus, pn la clarificarea soluiilor. Se obine, aadar, o a
doua diluie succesiv a materialului 3 cea a hidrolizatului (:')$

:' 1 1 F 8 (:,;ml supernatant O 8,;ml soluie Na/L)%
probele obinute se coloreaz #n dou etape succesive, cu cei doi reactivi de culoare
specifici$
o pentru reacia cu reactivul de culoare 6, #n noi eprubete (cte dou pentru
fiecare prob), se introduc$ :,;ml hidrolizat proteic i :,;ml reactiv de culoare
6% amestecul se agit i probele se las 6: min #n repaus, #n stativ, la finele
acestui interval ele cptnd o coloraie albastr'violacee, de diferite
intensiti%
o pentru reacia cu reactivul de culoare 8, se adaug cte 6,; ml reactiv 0olin'
.ioclteu peste e"tractele proteice colorate dea cu reactivul de culoare 6.
+entru o bun fi"are a acestui colorant, eprubetele se incubeaz #n baia de
ap 6: min, la ;=
:
., aprnd, #n final, o coloraie albastr'indigo. !ac
intensitatea culorii este prea puternic, probele se dilueaz cu ap distilat 3
diluia colorantului (:/)$

:/ 1 1F 13 (6ml soluie proteic O @ml L8/ distilat)%
se realizeaz determinarea e"tinciei probelor, la 1 ;<:nm (domeniul albastru),
dup etalonarea aparatului cu ap distilat% dac #ntre probele de acelai tip (care
provin din acelai organ) apar diferene de e"tincie, se calculeaza o medie algebric
a acestui parametru%
rezultatele (e"tinciile) obinute se integraz #n curbe etalon ale concentraiei pro'
teinelor solubile, construite pe baza e"tinciilor unor soluii de albumin cu diluii
diferite%
pentru determinarea concentraiei reale de proteine solubile din fiecare prob,
concentraiile obinute din curba etalon se #nmulesc cu produsul celor trei diluii
practicate succesiv #n prelucrarea materialului biologic$
:total 1 :1 * :' * :/ 1 1F13 * 1F8 * 1F13 1 1F833
Lucrarea de laborator 9
:ozarea acti0it+ii )uccinat4de%idrogenazei (metoda Maco0)Ji)
Succinat4de%idrogenaza (succindehidrogenaza sau succinatoxidoreductaza) este
o enzim care catalizeaz dehidrogenarea (oxidarea) acidului succinic la
acid fumaric, conform urmtoarei ecuaii chimice$
C ' ' @
C @
C @
C ' ' @
/
/
C ' ' @
C @
C @
C ' ' @
0 / @
< / @
C
C @
@ C ' ' @
@ @ ' ' C
a c i d s u c c i n i c a c i d f u m a r i c ( a c i d t r a n s 0 f u m a r i c )
,cidul fumaric, datorit prezenei unei duble legturi #ntre atomii de carbon .8 i .9
din molecul, se prezint sub forma izomerului trans, foarte frecvent. 4eacia catalizat de
succinat'dehidrogenaz reprezint o etap a ciclului /rebs, prin care se realizeaz cuplarea
acestuia cu lanul transportului de electroni, la captul cruia, prin reducerea unei molecule
de o"igen activat, rezult apa, ca produs final de catabolism.
4olul de preluare a doi atomi de hidrogen de la substrat i de transfer a acestora spre
lanul transportorilor de electroni este e"ercitat de ctre coenzima succinatdehidrogenazei 3
#A: (flavinadenindinucleotidul). ,ceast grupare prostetic se poate reduce sau o"ida cu
uurin, proporia celor dou forme ale sale (redus i o"idat) refectnd echilibrul dintre
procesele o"ido'reductoare mitocondriale$
0 / @
< / @
9 ! + @
/
9 ! +
f o r m
r e d u s
f o r m
o x i d a t
Succinat'dehidrogenaza, datorit implicrii #n procesele energogenetice celulare,
este prezent la nivelul cristelor mitocondriale, fiind rspndit cu precdere #n celulele cu
activitate metabolic intens (din ficat, rinichi, splin, miocard i musculatur striat, creier,
suprarenale etc.)% de asemenea, enzima a fost identificat i la plantele superioare (#n
albumenul seminelor) i la unele microorganisme.
&n prezent, activitatea succinat'dehidrogenazei poate fi evideniat prin mai multe ti'
puri de metode$ manometrice, colorimetrice, spectrofotometrice.
9!1! Metoda Maco0)Ji
*ste o metod colorimetric, derivat din metoda T%unberg, mai dificil de aplicat #n
condiii obinuite de laborator, deoarece presupune utilizarea unei instalaii de vidare.
,.1.1. Princi$iul metodei Macovs1i
0etoda const n msurarea (cronometrarea) timpului de decolorare a unui compus
colorat (al%astru de metilen) n forma sa incolor (leuco2al%astru de metilen), ca urmare a
reducerii, n condiii anaerobe, a albastrului de metilen1
#
%
( C @ ) #
1 /
# ( C @ ) C l
< 0
1 /
#
%
( C @ ) #
1 /
# ( C @ )
1 /
9 ! + @
/
9 ! +
0 @ c l
@
a l b a s t r u d e m e t i l e n l e u c o 0 a l b a s t r u d e m e t i l e n
4educerea albastrului de metilen se realizeaz de ctre 0,!L8, coenzima #ncrcn'
du'se, la rndul ei, cu hidrogen, #n urma catalizrii reaciei de dehidrogenare a acidului
succinic la acid fumaric. Se poate afirma c, in vitro, albastrul de metilen oac rolul primului
acceptor al lanului transportorilor de electroni, 0,!L8 cednd 8 atomi de hidrogen acestui
compus colorat. .ondiiile anaerobe, stipulate #n principiul metodei, sunt absolut necesare,
deoarece, #n prezena o"igenului #n incinta de reacie, leuco'albastrul de metilen s ' ar dehi'
drogena, recolorndu'se, ceea ce ar face ca reacia de culoare sa fie nedecelabil.
,.1.2. 3eactivi necesari
soluie tam$on fosfat (?6,?ml Na8L+/< 526; O 6?,8ml KL8+/< 526;)%
soluie succinat de .a 4-42M (:,6=8g succinat de Na #n ;:ml L8/ distilat)%
soluie al%astru de metilen 4-41/%
soluie alcalin" de $irogalol, pentru absorbia o"igenului din incinta de lucru
(9ml soluie pirogalol 9:A O 6>,;ml K/L =:A)%
soluie 5)+ 64/.
,.1.3. 7ta$e de lucru
se sacrific animalul de laborator i se efectueaz seciunea pe linia medio'ventral%
se preleveaz 8 3 9 organe #n soluie tampon fosfat, rcit pe ghea%
se cntresc cte :,; g din fiecare organ prelevat%
se realizeaz omogenate tisulare, cu ! 1 626:, prin metoda +otter (:,;g esut O <,;ml
tampon fosfat)%
se completeaz vasele de reacie (tuburile 0acovs2i) cu componentele necesare%
aceste tuburi sunt nite eprubete modificate, care prezint un diverticul lateral oblic,
menit introducerii unui component din amestecul de reacie, care nu trebuie s se
amestece de la inceput cu celelalte componente (#ig! 9!1!)%
+ o p d e c a u c i u c
R u l o u d e h r t i e d e
f i l t r u u m e c t a t n
p i r o g a l o l
' m o g e n a t c e l u l a r
( ) & / m l )
% u c c i n a t d e # a
( - m l )
T a m p o n f o s f a t
( - & 1 m l )
! l b a s t r u d e m e t i l e n
( - m l )
#ig! 9!1! Tubul Maco0)Ji "i componentele ame)tecului nece)ar dozrii acti0it+ii )uccinat4de%idrogenazei
se realizeaz rulouri de hrtie de filtru, care se #mbib #n soluie alcalin de pirogalol
i se introduc #n partea superioar a tuburilor 5acovsGi%
#n final, tuburile 5acovsGi se astup cu dopuri de cauciuc, pentru a #mpiedica p'
trunderea aerului in interior%
.ot"$ #n afar de probe, se folosete un tub martor, #n care nu se introduce omogenat
celular, sau se pipeteaz volumul corespunztor de omogenat, dar sursa de enzim se
inactiveaz #n prealabil, prin fierbere.
tuburile se las #n repaus 9: min., #ntr'un stativ%
dup e"pirarea acestui interval de timp, necesar e"ercitrii activitii succinat'
dehidrogenazei asupra substratului (succinat de Na), eprubetele se #nclin simultan,
pentru ca albastrul de metilen s se scurg peste restul componentelor de reacie%
din acest moment, se cronometreaz cu e"actitate intervalul de decolorare a
albastrului de metilen din probe, fa de martor (#n acesta compusul #i modific
foarte puin culoarea iniial, datorit lipsei activitii enzimei).
@ibliogra,ie )electi0a (cur) )i lucrari practice)
6. ,lberts H., HraP !., Qohnson ,., DeNis Q., 4aff 5., 4oberts K., 7alter +., 8::< 3 3ssential
-ell 'iolog4, (n introduction to the 0olecular 'iolog4 of the -ell, Bnternational Student
edition, -hapter $1 5ntroduction to -ells, Carland +ublishing, Bnc., NeN RorG, Dondon, FoGio
8. HecGer 7. 5., Kleinsmith D. Q., Lardin Q., 8::9 3 6he 7orld of the -ell, fifth edition, +earson
*ducation Bnc., San 0rancisco, .a
9. +ollard F. !., *arnshaN 7. .., 8::< 3 -ell 'iolog4, *lsevier Science (-S,), Bnc.,
+hiladelphia
<. +etit Q. 5., 5aftah ,., Qulien 4., 6@@> 3 'iologie cellulaire, .hapitre 8$ 08thodes
d9exploration de la cellule, 5asson, +aris
;. 7ilson Q., Lunt F. , 8::8 3 0olecular 'iolog4 of the -ell, ( :roblems (pproach, 0ourth
edition, Carland Science
=. .rciun .., 0lorea ,., !rago N., 6@@@ 3 5ntroduction to cell and molecular biolog4, .lu
-niversitP +ress
>. .ruce 5., 6@@@ 3 'iologie celular i molecular, ,ius, .olecia Lipocrate, .raiova
?. Feuan J., 8::: 3 'iologie celular animal, *ditura Bon Bonescu de la Hrad, Bai
@. Neacu B., .impeanu .. S., 6@@@ 3 'iologie celular lucrri practice, *ditura -niversitatii ,l.
B. .uza, Bai
6:. .otru .., 6@@< 3 0anual de lucrri practice de biologie celular, *ditura Fehnica, .hiinu
66. http$22Neb.mit.edu2esgbio2NNN2>::6main.html, H4pertextboo2 -ell 'iolog4
68. http$22NNN.univ'ag.fr2. -ours de 'iologie cellulaire
69. http$22NNN.Neb'booGs.com25oHio20ree2.ontents.htm, 0olecular 'iolog4 7eb'oo2 -ontents
6<. http$22NNN.snv.ussieu.fr2bmedia2sommaires2bc.htm, 'iologie -ellulaire
6;. http$22schNann.free.fr2biocell:9.html, -ours de 'iologie -ellulaire