Enzimas:

Preparacin de las SFPB (Soluciones fosfato para buffers)

ESTAS SOLUCIOES !EBE"A #ATEE"SE SIE#P"E E STOC$%
1) Fosfato #onopot&sico '() #olar% PM: 136,09
para 500 ml: 6,80 gramos
para 1000 ml: 13,60 gramos

2) Fosfato !i pot&sico '() #olar% PM: 174,18
para 500 ml: 8,71 gramos
para 1000 ml: 17,42 gramos
*uardar las soluciones en botellas color cara+elo en ,eladera%
Estas soluciones deberan ser mezcladas para obtener el pH deseado.
Molaridad obtenida 100 mM.
Diluir con agua destilada hasta obtener la molaridad deseada.
3) E!TA di Sodico '(- #. PM: 372,24
Pesar 7,45 gramos y disoler en 100 ml de ag!a des"ilada#
$!ardar en %eladera#
&sire para la prepara'i(n de )!**ers de %omogeiniza'i(n: +os*a"os,E-./ y de medi'i(n de
gl!"a"i(n .012,E-./)
*lutation S/Transferasa (0 Catalasa).
34mero de Em)riones: 20 5onserados en 3i"r(geno l67!ido#
.ipo de .!)o 8"ilizado: .!)o eppendor* ade'!ado para %omogeiniza'i(n me'9ni'a#
:omogeiniza'i(n:
Buffer de ,o+o1eini2acin. (3o+o P$ )' +# E!TA ) +# p3.4).
para ) litro. preparar )'' +l de Buffer Fosfato de Potasio '() # p3. 4 con las SFPB%
A1re1ar a estos ( 5 +l de E!TA '(- # stoc6 0 lle7ar todo a )''' +l%
*uardar en ,eladera% Burbur8ear con - antes de usar para eli+inar el o9i1eno%
:omogeinizar en !nos 400 mi'roli"ros de )!**er las m!es"ras, siempre en *r6o#
/gregar l!ego )!**er %as"a el "ope del "!)o &apro;# 2 ml *inal)
Centrifu1ar las +uestras a ):%''' "P#( a '/:;C( )5 +inutos( 0 separar r&pida+ente el
sobrenadante( teniendo sie+pre los tubos en ,ielo( 0 colocarlo en tubos eppendorf( 0
de8arlos en - li<uido ,asta el +o+ento de su utili2acin% (Perforar los tubos al 1uardar
para <ue no e9ploten)% En caso de utli2ar en el d=a deber& +antenerse en ,ielo%
-es'ongelar en el momen"o de la medi'i(n#
*lutation S Transferasa (*ST)
Medi'i(n de la isoenzima 5-3<:
8sa 5-3< &en *reezer)
1='loro=2,4 dini"ro)en'eno &PM: 202,6)
Pesar 202,6 mg y disoler en 10 ml de E"anol /)sol!"o, en )a>o de mar6a a 40?5 &g!ardar en
*reezer, en "!)o *al'on, )ien "apado, d!ra !n a>o#)
Buffer. Ar+ar buffer fosfato a partir de SFPB p3. >(5 )''+#% A1re1arle )5(: +1 de *lutation
"educido cada 5' +ililitros de buffer% Usar en el d=a% Si pasa +as de una ,ora antes de usar(
1uardar en ,eladera%
Medi'i(n: 0ealizar por d!pli'ado#
@as m!es"ras de)en man"enerse en ag!a,%ielo, y ser sa'adas '!ando se 'omienza a pro'esar la
m!es"ra an"erior para 7!e "omen "empera"!ra am)ien"e#
.empera"!ra de medi'i(n: en"re 25 y 30A 5#
3o de)e ariar m9s de 1 grado d!ran"e la medi'i(n de "odas las m!es"ras# 'olo'ar en el sig!ien"e
orden:
Buffer -(5' +l
C!B -5 ul
agi"ar )ien
#uestra -'' ul
agi"ar )ien
@eer 'on"ra re*eren'ia de ag!a a 340 nm
Pro'eder a la le'"!ra d!ran"e 2 min!"os#
0ealizar 'on 'ada "anda !n )lan'o, el '!al en ez de m!es"ra llea sol!'i(n %omogeneizan"e#
Catalasa (0 *ST).
34mero de Em)riones: 20 5onserados en 3i"r(geno l67!ido#
.ipo de .!)o 8"ilizado: .!)o eppendor* ade'!ado para %omogeiniza'i(n me'9ni'a#
:omogeiniza'i(n:
Buffer de ,o+o1eini2aci?n. (3o+o P$ )' +# E!TA ) +# p3.4).
para ) litro. preparar )'' +l de Buffer Fosfato de Potasio '() # p3. 4 con las SFPB%
A1re1ar a estos ( 5 +l de E!TA '(- # stoc6 0 lle7ar todo a )''' +l%
*uardar en ,eladera% Burbur8ear con - antes de usar para eli+inar el o9i1eno%
:omogeneizar en !nos 400 mi'roli"ros de )!**er las m!es"ras, siempre en *r6o#
/gregar l!ego )!**er %as"a el "ope del "!)o &apro;# 2 ml *inal)
Centrifu1ar las +uestras a ):%''' "P#( a '/:;C( )5 +inutos( 0 separar r&pida+ente el
sobrenadante( teniendo sie+pre los tubos en ,ielo( 0 colocarlo en tubos eppendorf( 0
de8arlos en - li<uido ,asta el +o+ento de su utili2acin% (Perforar los tubos al 1uardar
para <ue no e9ploten)% En caso de utli2ar en el d=a deber& +antenerse en ,ielo%
-es'ongelar en el momen"o de la medi'i(n#
Catalasa (CAT)
<!**er: Ar+ar buffer fosfato a partir de SFPB p3. 4('' 5' +#% A1re1arle )-5/)@' +icrolitros
de a1ua o9i1enada )'' 7olu+enes (dependiendo de cuan nue7a estA)%
Usar en el d=a% Si pasa +&s de una ,ora antes de usar( 1uardar en ,eladera%
Medi'i(n: 0ealizar por d!pli'ado#
.empera"!ra en"re 25 y 30A5#
3o de)e ariar m9s de 1 grado d!ran"e la medi'i(n de "odas las m!es"ras#
@as m!es"ras de)en man"enerse en ag!a,%ielo, y ser sa'adas '!ando se 'omienza a pro'esar la
m!es"ra an"erior para 7!e "omen "empera"!ra am)ien"e#
<!**er 3 ml
M!es"ra 20 !l
agi"ar
@eer 'on"ra re*eren'ia de ag!a a -:' n+
Pro'eder a la le'"!ra d!ran"e 2 min!"os#
0e*erir los da"os a pro"e6nas !"ilizando el 'orrespondien"e 'al'!lador de a'"iidad#
Super9ido !is+utasa (0 *lutatin).
34mero de Em)riones: 40 a 50# 5onserados en 3i"r(geno l67!ido#
.ipo de .!)o 8"ilizado: .!)o eppendor* ade'!ado para %omogeiniza'i(n me'9ni'a#
:omogeiniza'i(n:
Buffer de ,o+o1eini2aci?n (3o+o P$ )' +# E!TA ) +# p3.4).
para ) litro. preparar )'' +l de Buffer Fosfato de Potasio '() # p3. 4 con las SFPB%
A1re1ar a estos ( 5 +l de E!TA '(- # stoc6 0 lle7ar todo a )''' +l%
*uardar en ,eladera% Burbur8ear con - antes de usar para eli+inar el o9i1eno%
:omogeinizar en !nos 400 mi'roli"ros de )!**er las m!es"ras, siempre en *r6o#
/gregar l!ego )!**er %as"a el "ope del "!)o &apro;# 2 ml *inal)
Centrifu1ar las +uestras a ):%''' "P#( a '/:;C( )5 +inutos( 0 separar r&pida+ente el
sobrenadante( teniendo sie+pre los tubos en ,ielo( 0 colocarlo en tubos eppendorf( 0
de8arlos en - li<uido ,asta el +o+ento de su utili2acin% (Perforar los tubos al 1uardar
para <ue no e9ploten)% En caso de utli2ar en el d=a deber& +antenerse en ,ielo%
-es'ongelar en el momen"o de la medi'i(n#
Super9ido !is+utasa. (SO!).
<!**er 2B-:
.rie"anolamina 1,49 gramos
-ie"anolamina 1,05 gramos
5l: 'on'en"rado 1,38 ml
@lear a 100 ml 'on :20, 'orrigiendo el p: a 7,40=7,50
-E<E P0EP/0/02E C 82/02E E3 E@ -1/ P/0/ D8E @/ 2E321<1@1-/- 2E/ M/E1M/#
E-./ 0,2 Molar &100 ml) &/)
Pesar 5,85 gramos de E-./ /51-B &oFo, no disodi'o), agregar !nos 50 milili"ros de ag!a y
agregar B:3a en granallas y l!ego sol!'i(n '' %as"a llearlo a p:: 7 , llear a ol!men# -!ra
m!'%o a ./#
5lor!ro de Manganeso 0,1 Molar: &<)
Pesar 1,62 gramos de 5l2Mn#2:20 y llear a 100 ml 'on :20 des"ilada#
En 'aso de !sar 5l2Mn#4:20 se de)er9 pesar 1,78 gramos#
El d=a de la +edicin preparar una +e2cla de A (5 +l) 0 B (5 +l) %
#ercaptoetanol. a )'' +l de a1ua destilada a1re1ar 4) +icrolitros de +ercaptoetanol% !ura
dos d=as en ,eladera% Bien tapado%
A!3. en el +o+ento de usar( pesar 5 +1 de A!3 0 lle7ar a ) +l con 3-'%
Se usa por tubo de reaccin >5 +icrolitros de A!3( o sea <ue con ) +l es posible +edir.
): tubos% (> +uestras por duplicado( un blanco por duplicado)
Medi'i(n: le'"!ra a 340 nm#
I+portante. Las +uestras controles de sobrenadantes de Bufo arenaru+ deben in,ibir por
lo +enos el 4'B de la acti7idad del blanco en el punto de +a0or 7olu+en( por e8e+plo
cuando se usa -5' +icrolitros( si esto no sucede asi( deber& usarse +a0or 7olu+en( por<ue
sino el +Atodo carece de sensibilidad)% El punto de +enor 7olu+en ,a de ser -(5 7eces
+enor%
5olo'ar los "!)os a <M a 30A5, la '9mara de le'"!ra del apara"o de)e en'on"rarse a !na
"empera"!ra 'er'ana# @os sig!ien"es rea'"ios de)en ser 'olo'ados en el sig!ien"e orden:
Buffer SO! 2 ml
E!TACCl-#n 80 mi'roli"ros
Buffer SO! )lan'o: 250 mi'roli"ros &si es"e ol!men es ade'!ado)
para el p!n"o de 250 mi'roli"ros &GH0) &si es ade'!ado)
para el p!n"o de 100 mi'roli"ros &GH150) &si es ade'!ado)
#uestra 250 mi'roli"ros de so)renadan"e &p!n"o de mayor ol!men)
100 mi'roli"ros de so)renadan"e &p!n"o de menor ol!men)
A!3 65 mi'roli"ros
la rea''i(n se dispara agregando -5' +icrolitros de solucin de #ercaptoetanol%
#Atodo r&pido. el +is+o sir7e para +edir una sola persona 5 +uestras% Por duplicado lle7a
4- +inutos( debe calcularse entonces apro9i+ada+ente una ,ora 0 +edia de traba8o en el
espectrofot+etro%
Car1a del #ercapto Etanol Lectura a los ))D Lectura a los -5D
<lan'o 0I 11I 26I

1I &250) 12I 27I
2I &100) 13I 28I
3I &250) 14I 29I
4I &100) 15I 30I
5I &250) 16I 31I
6I &100) 17I 32I
7I &250) 18I 33I
8I &100) 19I 34I
9I &250) 20I 35I
10I &100) 21I 36I
los ol!menes en"re parJn"esis son indi'a"ios, p!eden ser dis"in"os para 'ada !no de los pares
dependiendo la '' de enzima#
@!ego de la primer le'"!ra, la rea''i(n de)e oler al "!)o de rea''i(n y el mismo de)e oler al
)a>o mar6a#
5ada medi'i(n de)e ser realizada 'on"ra )lan'o de ag!a, !"ilizando do)le '!)e"a de '!arzo#
@os da"os de)en ser pro'esados por el 'al'!lador y re*eridos a la '' de pro"e6nas#
Para *lutation Pero9idasa.
34mero de Em)riones: 30 # 5onserados en 3i"r(geno l67!ido#
.ipo de .!)o 8"ilizado: .!)o eppendor* ade'!ado para %omogeiniza'i(n me'9ni'a#
:omogeiniza'i(n:
Buffer de ,o+o1eini2aci?n EcatalasaE (Buffer CAT/*ST) .
para ) litro. preparar )'' +l de Buffer Fosfato de Potasio '() # p3. 4 con las SFPB% A1re1ar a estos (
5 +l de E!TA '(- # stoc6 0 lle7ar todo a )''' +l%
*uardar en ,eladera% Burbur8ear con - antes de usar para eli+inar el o9i1eno%
:omogeinizar en !nos 400 mi'roli"ros de )!**er las m!es"ras, siempre en *r6o#
/gregar l!ego )!**er %as"a el "ope del "!)o &apro;# 2 ml *inal)
Centrifu1ar las +uestras a ):%''' "P#( a '/:;C( )5 +inutos( 0 separar r&pida+ente el sobrenadante(
teniendo sie+pre los tubos en ,ielo( 0 colocarlo en tubos eppendorf( 0 de8arlos en - li<uido ,asta el
+o+ento de su utili2acin% (Perforar los tubos al 1uardar para <ue no e9ploten)% En caso de utli2ar en
el d=a deber& +antenerse en ,ielo%
-es'ongelar en el momen"o de la medi'i(n#
*lutatin Pero9idasa (*P)
Buffer T"IS 5' +# p3.4(> E!TA '() +#
Pesar 605,5 mg de .ris </2E y llear a 80 milili"ros 'on ag!a des"ilada# Pesar 3,8 mg de E-./ disodi'o2:20
y disoler, agregar 10 milili"ros mas de ag!a y llear a p:: 7,60 'on 5l:, llear a 100 ml en ma"ras a*orado
'on ag!a des"ilada#
Para 5 de"ermina'iones por d!pli'ado:
A1re1ar 5 +ililitros de Buffer TrisCE!TA a tres 7iales de A!P3 (conteniendo cada uno ) +1 de
A!P3) ( 8untar( a1re1ar -' +icrolitros de *lutation "eductasa 0 - +ili1ra+os de *lutation "educido(
final+ente a1re1ar )) +ililitros +as de Buffer TrisCE!TA% *uardar en Oscuridad( usar en el d=a% Si no
se utili2a dentro de la ,ora de uso( debe 1uardarse en ,eladera%
Cu+eno 3idropero9ido. #edir )@ +icrolitros 0 disol7er en )' +ililitros de A1ua destilada (le cuesta un
poco)%
/gregar en el sig!ien"e orden &realizar la medi'i(n por d!pli'ado)
.empera"!ra de "ra)aFo 26=30 A 5#
5 m!es"ras por d!pli'ado llean !n "iempo de "ra)aFo de 1,5 %oras#
Solucin de A!P3C*"C*lu -(5' +l
M!es"ra &2o)renadan"es) 200 mi'roli"ros
Cu+eno 3idroper9ido 4> +icrolitros
@eer a 340 nm# Medir el des'enso de a)sor)an'ia#
Si 200 microlitros de un control de SN de Bufo arenaurm no producen un delta de 0100 unidades de
absorbancia para una medici!n de " minutos en un control como m#nimo deber$ agregarse ma%or
&olumen de sobrenadante.
P!ede "omarse dis"in"os del"as: 2 a 7 min!"os &es el 7!e da meFor %as"a a%ora)
0 a 7 min!"os &"am)ien a)ar'a "odo el rango)
Pro'eder a in'!lar a pro"einas !"ilizando el 'al'!lador#
#edicin de*LUTATIO "E!UCI!O
*lutatin "educido. (1rupos sulf,idrilos no unidos a prote=na)
E!TA di Sodico '(- #. PM: 372,24 Fijarse si no hay en stock
Pesar 7,45 gramos y disoler en 100 ml de ag!a des"ilada##
Buffer Tris '(: # CE!TA '('- # p3. F(G'
Para 50 ml &20 de"ermina'iones): Pesar 2,42 gramos de .ris <ase, agregar 5 ml de E-./ 0,2 M
agregar !nos 30 ml de ag!a des"ilada, llear a p:: 8,90 'on B:3a '' y a*orar a 50 ml#
!TB. pesar 50 mg de &5,5I =di"%io=)is=&2 ni"ro)enzoi' a'id) &0ea'"io de Ellman) y disoler en
12,50 ml de Me"anol#
*lutation "educido Est&ndar. pesar apro;imadamen"e y en *orma e;a'"a &ano"ar) 6 miligramos
de $l!"a"ion 0ed!'ido y llear a 10 ml 'on sol!'i(n de <!*, y el E-./ 0,2 M madre el 7!e de)er9
ser agregado a la mez'la an"erior para lograr !na dil!'i(n 1,200, 'osa de 7!edar 1 mM *inal:
Homogeinizaci!n'
Para SO! 0 *lutatin.
34mero de Em)riones: 40 a 50# 5onserados en 3i"r(geno l67!ido#
.ipo de .!)o 8"ilizado: .!)o eppendor* ade'!ado para %omogeiniza'i(n me'9ni'a#
Buffer de ,o+o1eini2acin. (3o+o P$ )' +# E!TA ) +# p3.4).
para ) litro. preparar )'' +l de Buffer Fosfato de Potasio '() # p3. 4 con las SFPB%
A1re1ar a estos ( 5 +l de E!TA '(- # stoc6 0 lle7ar todo a )''' +l%
*uardar en ,eladera% Burbur8ear con - antes de usar para eli+inar el o9i1eno%
:omogeinizar en !nos 400 mi'roli"ros de )!**er las m!es"ras, siempre en *r6o#
/gregar l!ego )!**er %as"a el "ope del "!)o &apro;# 2 ml *inal)
Centrifu1ar las +uestras a ):%''' "P#( a '/:;C( )5 +inutos( 0 separar r&pida+ente el
sobrenadante( teniendo sie+pre los tubos en ,ielo( 0 colocarlo en tubos eppendorf%
#antenerlos en ,ielo 0 reali2ar la +edicin en el d=a%
Medi'i(n .
"eali2ar por duplicado%
En tubos eppendorff de - +l a1re1ar.
Estandard #uestra
2ol!'i(n s"d 6 mg,10 ml 25 o 50 !l ================
<i**er :omogeiniza'i(n 'sp 500 !l ================
2o)renadan"e =============== 500 !l
/g!a des"ilada 400 !l 400 !l
.5/ 50K 100 !l 100 !l
"apar y agi"ar "apar y agi"ar
-eFar pre'ipi"ar 15 min!"os en %eladera#
5en"ri*!gar en mi'ro*!ge a 10#000 0PM, a 10?5 , 15 min!"os#
#ientras preparar una Esolucin blancoE consistente en ) +l de buffer de ,o+o1eini2acin(
'(F +l de a1ua destilada 0 '(- +l de TCA 5'B
en "!)os de idrio agregar:
Blanco Estandard #uestra
2ol!'i(n )lan'o 500 !l =============== ==============
23 es"andard ==================== 500 !l ==============
23 m!es"ra ==================== =============== 500 !l
<!**er .ris E-./ 2500 !l 2500 !l 2500 !l
-.3< 50 !l 50 !l 50 !l
agi"ar agi"ar agi"ar
2e desarrolla !n 'olor amarillo#
@eer desp!es de 5 min!"os a 412 nm &lampara isi)le) 'on"ra )lan'o#
25 !l de la sn 6mg,10 ml de gl!"a"ion red!'ido 'on"ienen: 15 !g de gl!"a"ion
50 !l de la sn 6mg,10 ml de gl!"a"ion red!'ido 'on"ienen: 30 !g de gl!"a"ion
@a le'"!ra dar9 los !g de gl!"a"ion 'on"enidos en 500 mi'roli"ros del so)renadan"e, re*erir a
pro"e6nas 'omo de 'os"!m)re#
Estrate1ia de #edicin.
H por TuboBuffer 3o+o1%#edicinTubosSO!
*lutatin "educido%
:'BP$ )' +#
E!TA ) +#
p3. 4In+ediata)'
)'*ST
Catalasa%
-'BP$ 5'+#
p3.1uardar -)'
)'*P
Ilipoper9idosJ@'BP$ )' +#
E!TA ) +#
p3.41uardar -5Lipoper9idos5'In+ediata