Engenharia Genetica Conceitos Basicos, Ferramentas e Aplicacoes

ISSN 1517 - 5111
Maio, 2003
86
Engenharia Gentica:
conceitos bsicos, ferramentas
e aplicaes
Ministrio da Agricultura,
Pecuria e Abastecimento
Plasmdeo Plasmdeo
Documentos 86
Maria Cristina Rocha Cordeiro
Engenharia Gentica:
conceitos bsicos,
ferramentas e aplicaes
Planaltina, DF
2003
ISSN 1517-5111
Maio, 2003
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Cerrados
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
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edio
1
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impresso (2003): tiragem 100 exemplares
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A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em
parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610).
CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao.
Embrapa Cerrados.
Cordeiro, Maria Cristina Rocha.
Engenharia gentica: conceitos bsicos, ferramentas e aplicaes /
Maria Cristina Rocha Cordeiro. Planaltina, DF : Embrapa Cerrados,
2003.
43 p. (Documentos / Embrapa Cerrados, ISSN 1517-5111; 86)
1. Engenharia gentica. I. Ttulo. II. Srie.
636.0821 - CDD 21
C794e
Embrapa 2003
Biomdica, Dra., Embrapa Cerrados,
cristina@cpac.embrapa.br
Autora
Apresentao
A Engenharia Gentica tem-se destacado como prtica para a gerao de novas
tecnologias. So inmeros os exemplos em diversas reas como a produo de
vacinas, a terapia gnica, a transgenia, entre outras.
Na agropecuria, a Engenharia Gentica tambm encontra stio para sua prtica,
desenvolvendo novos processos. Nessa rea cita-se a utilizao dessa ferramen-
ta principalmente para melhoria dos processos como o melhoramento gentico,
manejo de pragas e o controle biolgico.
Este documento tem como finalidade introduzir estudantes de graduao e
outros profissionais nessa rea de conhecimento, de maneira a divulgar seu
potencial e importncia.
Roberto Teixeira Alves
Chefe-Geral da Embrapa Cerrados
Sumrio
Introduo .................................................................................. 9
Conceito de Engenharia Gentica................................................ 9
Estrutura dos cidos Nuclicos................................................... 9
Replicao do DNA .................................................................. 14
Expresso da Informao Gnica ................................................ 15
Histrico .................................................................................... 18
Ferramentas Tcnicas da Engenharia Gentica .................................. 22
Extrao de cidos Nuclicos .................................................... 22
Reao de Polimerase em Cadeia (PCR) ....................................... 24
Eletroforese em gel .................................................................. 25
Anlises moleculares ................................................................ 25
Sistemas de Restrio e Metilao ......................................... 25
Enzimas Modificadoras: polimerases, ligases ................................. 26
Clonagem Molecular ................................................................. 27
Tcnicas Bsicas para caracterizao de genes ............................. 29
Construo de Biblioteca genmica ............................................. 29
Construo de biblioteca de cDNA .............................................. 29
Seqenciamento de DNA .......................................................... 30
Tcnicas para estudo de caracterizao e expresso de genes ......... 31
Southern blotting................................................................. 31
Hibridizao subtrativa e Differential Display................................. 32
Northern blotting ................................................................. 34
Anlises em Microarranjos ........................................................ 35
Aplicaes da Engenharia Gentica ................................................. 36
Agricultura ............................................................................. 36
Pecuria ................................................................................ 37
Referncias Bibliogrficas .............................................................. 38
Abstract .................................................................................... 40
Apndice 1. Cdigo Gentico - cdons de aminocidos para sntese de
protenas ................................................................................ 41
Apndice 2. Algumas enzimas de restrio utilizadas em engenharia
gentica................................................................................. 42
Engenharia Gentica:
conceitos bsicos,
ferramentas e aplicaes
Introduo
Conceito de Engenharia Gentica
A Engenharia Gentica constitui um conjunto de tcnicas de anlises moleculares
que permitem estudos de caracterizao, expresso e modificaes do material
gentico (DNA e RNA) dos seres vivos.
A Engenharia Gentica tem sido tema polmico. A sua prtica levanta aspectos
relacionados tica, pois baseia-se em modificao de material gentico natural
(produo de organismos geneticamente modificados OGMs) ou sua
clonagem. A discusso importante, uma vez que expressa a opinio pblica
comunidade cientfica, suscitando reflexes para a soluo de problemas.
necessrio, portanto, conhecer o seu significado para saber como, e de que
forma, ela pode contribuir como um efetivo benefcio vida.
Esta sntese dos principais temas da engenharia gentica tem como objetivo
divulgar o conhecimento bsico sobre suas possveis contribuies na
agropecuria, a estudantes, outros profissionais no familiarizados com a
biologia molecular, e um apoio didtico a professores.
Estrutura dos cidos Nuclicos
Os cidos nuclicos so macromolculas intracelulares de dois tipos: o cido
desoxirribonuclico (DNA) e o cido ribonuclico (RNA). Apresentam
constituio qumica e funo biolgica diferentes.
O DNA considerado o mais importante. Constitui o genoma dos seres vivos
onde esto contidas todas as informaes genticas fundamentais para sua
existncia. A partir dele, essas informaes se expressam nas clulas e se
perpetuam na prognie. Assim, pode-se dizer que o DNA tem funo de
armazenar e manter a informao gentica (cdigo gentico).
10 Engenharia Gentica: Conceitos Bsicos, Ferramentas e Aplicaes
O DNA constitudo por subunidades menores chamadas nucleotdeos,
agrupadas em quatro tipos. Cada tipo subdivide-se em molculas menores que
so: bases nitrogenadas do tipo purinas (adenina e guanina) ou pirimidinas
(timina e citosina); acar do tipo pentose (desoxirribose) e fosfato. As bases
associam-se pentose por uma ligao no carbono 1 da pentose e, o fosfato,
associa-se ao carbono 5 da mesma pentose, e ao carbono 3 da pentose do
nucleotdeo adjacente. Essa ltima ligao chamada de fosfodister e constitui
a cadeia de nucleotdeos. Este tipo de ligao confere uma polaridade a molcula
do DNA que tem funo na replicao e transcrio, chamada de sentido
5 3 (Figura 1).
O P O
O
H
5 CH
2
5 CH
2
H
H
H
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G
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C
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O O P
A
O
H
H H
H
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5 CH
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3
Ligao
Fosfodister
Figura 1. Esquema da ligao fosfodister entre dois
nucleotdeos. C citosina; G guanina; A Adenina.
Fonte: Modificado de Lehninger, 1985.
O DNA constitudo por duas cadeias de nucleotdeos. A associao entre elas
faz-se por pareamento das bases nitrogenadas. Estas no se pareiam ao acaso,
mas a adenina sempre se associa timina e a citosina guanina. Isto deve-se a
ligaes do tipo ponte de hidrognio (H) (Figura 2). H duas possibilidades de
pontes entre adenina e timina (envolvendo o nitrognio (N) de uma base e o
oxignio (O) da base complementar) e trs entre citosina e guanina (envolvendo
dois N com O e um N com N). Essa constituio universal nos seres vivos.
Assim alguns vrus, as bactrias, os fungos, os vegetais e os animais contm
DNA estruturado da mesma maneira. As diferenas esto na seqncia em que
os nucleotdeos se associam.
Timina
Citosina
Guanina
Cadeia
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Cadeia
Cadeia
Cadeia
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
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C
C
C
C
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Pontes de Hidrognio
Adenina
Figura 2. Esquema de ligaes por pontes de
hidrognio entre adenina e timina ou citosina e guanina.
Fonte: Modificado de Lehninger, 1985.
As cadeias de nucleotdeos que, cada uma quando se formam, constituem um
sentido (5 3), quando se associam, o fazem em sentido contrrio. Sentido
5 3 com sentido 3 5. Essa associao vai ter funo no momento da
perpetuao da molcula (replicao) como tambm na sua funo biolgica de
expresso gentica (transcrio e regulao da transcrio).
Existem vrios tipos de DNA: o genmico, o mitocondrial, o de cloroplastos
(clulas vegetais) e o plasmidial (Tabela 1). O primeiro est presente no ncleo
das clulas eucariticas ou no citoplasma das clulas procariticas (bactrias).
Nos seres eucariticos, pode chegar a cerca de 2 m quando distendidos; porm,
encontra-se restrito a um espao extremamente reduzido: ncleo, com 0,006 mm
de dimetro. Como isto ocorre? O DNA associa-se com protenas de carcter
bsico (histonas) constituindo a cromatina. As histonas (que podem ser de
vrios tipos: H1, H2A, H2B, H3, H4...) associam-se e formam nucleossomas
(Figura 3) e, ao redor do qual a dupla cadeia do DNA d voltas. Em conjunto,
essa formao pode ser observada em microscpio eletrnico e conhecida por
colar de prolas. Este pode se enrolar ainda mais sobre si mesmo, como se
fosse um novelo. Assim, a grande molcula de DNA pode assumir tamanhos to
diminutos. Esse processo de espiralizao da molcula do DNA ocorre por ao
de enzimas como as topoisomerases, helicases entre outras.
Tabela 1. Caractersticas dos cidos Nuclicos.
Caracterstica DNA RNA
Principal Funo Armazenar e perpetuar o Transcrever o cdigo
cdigo gentico do ser gentico
Tipos Genmico, plasmidial, Ribossmico, Mensageiro,
mitocondrial, de cloroplasto Transportador
Nmero de cadeias 2 1
em geral
Tipo de bases nitrogenadas Adenina, Timina, Adenina, Uracila,
Guanina, Citosina Guanina, Citosina
Tipo de Acar Deoxiribose Ribose
A outra molcula de cido nuclico conhecida a de RNA. Ao contrrio do
DNA, constitudo por somente uma cadeia de nucleotdeos que se associam
por meio dos fosfatos em polaridade (sentido 5 3). Porm, no RNA as bases
que o constituem so: adenina, uracila, citosina, guanina, ligados por ribose. As
principais caractersticas comparativas entre DNA e RNA podem ser observadas
na Tabela 1.
Figura 3. Desenho esquemtico dos nucleossomas.
O RNA pode ser observado no ncleo e no citoplasma da clula. Na verdade, a
molcula formada no ncleo (clulas eucariticas), mas sua funo principal
ocorre no citoplasma. So molculas bem menores do que o DNA e menos estveis.
Existem trs tipos de RNA: o ribossmico, o mensageiro e o transportador. O
ribossmico pode ser observado no ncleo na regio do nuclolo e no
citoplasma, pois constitui o ribossoma. O transportador formado no ncleo e
sua funo biolgica ocorre no citoplasma; o RNA mensageiro formado no
ncleo e desempenha sua funo tambm no citoplasma. Qual a funo dos
diferentes tipos de RNA? A sntese de protenas, que so os compostos finais da
expresso de um carter gentico estocado no DNA. So elas que desempenham
Histona H1
Histona H1
Histona H1
Fita de DNA
Histonas H2A, H2B, H3, H4
funes nas clulas: estruturais (queratina, colgeno), enzimas (polimerases,
fosfatases, quinases) etc. e como componentes de sistemas como a hemoglobina
e os anticorpos. O RNA mensageiro o carreador da informao gentica
diretamente do DNA. A partir dele, temos a transcrio do cdigo gentico. O
RNA ribossomal, constitudo por subunidades menor e maior dos ribossomas,
so o lcus da sntese de protenas no citoplasma. Encontram-se livres no
citoplasma ou associados ao retculo endoplasmtico rugoso. E, finalmente, os
RNAs transportadores so RNAs pequenos que tm funo de ligar aminocidos
especficos e transport-los para a regio de sntese de protenas. A
transcodificao da mensagem do DNA para protenas faz-se por meio de um
cdigo de trinca ou cdon (trs nucleotdeos). Cada trinca representa um
aminocido; estes porm, podem reconhecer mais de um cdon. Assim, o
cdigo gentico dito degenerado. Essa caracterstica importante em
atividades da engenharia gentica, como a amplificao de seqncias gnicas a
partir de iniciadores degenerados, que tem como base a seqncia de protenas.
No apndice 1, esto relacionados os cdons para os principais aminocidos.
Replicao do DNA
A replicao ou duplicao o processo que permite a perpetuao da molcula
do DNA. Na diviso celular (mitose ou meiose). Subdivide-se em etapas que
sero enumeradas a seguir (Figura 4):
1. O primeiro passo a desespiralizao da molcula por enzimas como as
topoisomerases, helicases e outras;
2. Depois, ocorre a separao das cadeias de nucleotdeos com a ruptura das
pontes de hidrognio. Essa separao faz-se em vrios pontos da molcula,
formando forquilhas ou aberturas onde se origina a replicao;
3. Quando as cadeias esto separadas cada uma associada a um pequeno
RNA chamado iniciador. Este se liga s seqncias presentes em cada
cadeia, sempre no sentido 5 3. A sua presena fundamental para a
posterior associao da enzima DNA polimerase I;
4. Com a associao da enzima, no ponto em que se ligou o iniciador, comea a
polimerizao das novas cadeias do DNA. A mesma fita onde o RNA iniciador
se ligou, serve como molde para a adio, de forma complementar, dos novos
nucleotdeos. A polimerizao se faz no sentido 5 3. Enquanto uma das
cadeias polimerizada de forma contnua, forma-se a outra tambm no sentido
5 3 porm de forma descontnua constituindo pequenas cadeias que se
formam para constituir esta ltima cadeira. Essas cadeias so conhecidas
como fragmentos de Okasaki em homenagem ao pesquisador que as
observou pela primeira vez. Assim, a replicao do DNA bidirecional e
semiconservativa, pois cada molcula nova contm uma fita da molcula
precursora.
Figura 4. Desenho esquemtico das principais fases da replicao do DNA. A
Desespiralizao da cadeia; B Abertura de forquilhas (origem de replicao);
C Polimerizao de novas fitas e D Duas molculas recm-formadas.
Expresso da Informao Gnica
Antes de comentar sobre expresso gnica, importante conceituar o gene.
Gene uma unidade do DNA que capaz de constituir ao menos uma cadeia
polipeptdica. As excees so os que transcrevem os RNAs ribossmico
(subunidade maior e menor) e os RNAs transportadores. Cada unidade gnica
est dividida nas seguintes regies: promotora, EXON, INTRON, terminadora e
reguladoras (Figura 5). A regio promotora ou simplesmente promotor aquela
onde se associam protenas como fatores de transcrio e tambm a enzima RNA
5
3
5
3
A
B
C
D
Iniciador
polimerase. Essa regio uma seqncia geralmente rica em adenina e timina. A
regio de EXON aquela que apresenta a informao para constituir cadeias
polipeptdicas; a regio de INTRON pode estar associada regulao da
expresso gnica. Na verdade, incerta sua presena ou funo nos genes, mas
o fato que elas existem em alguns casos.
Figura 5. Desenho esquemtico indicando a estrutura gnica, formao e
modificao ps-transcripcional do RNA-m.
A regio terminadora aquela em que se pode observar o cdon de trmino de
traduo e transcrio. Esses cdigos apresentam um padro especfico bastante
conservado nos seres vivos.
E
E
E
E
E E E
E
E I
I
Incio de
transcrio
Regio de trmino Promotor
Gene
RNA-m
recm-transcrito
RNA-m
processado
Adio de
Guanina
metilada
(cap)
Adio de
cauda de
poli-A
Sntese de
protena
Regies de splicing
Finalmente, as regies reguladoras da expresso podem estar presentes em cis
(reas adjacentes ao gene, na regio promotora, nas regies de INTRON e
terminadora) ou ainda, em trans (prximas ao gene desde o ponto de vista
tridimensional, porm, afastadas quando observada pela estrutura linear do DNA).
Os RNA-m, transcritos do DNA, nos eucariotos (organismos superiores ou com
ncleo definido) passam por modificaes (ps-transcripcionais) antes de serem
traduzidos em protenas. A primeira a deleo das seqncias de INTRON.
Esse mecanismo chamado de splicing. A segunda a adio da cauda de poliA
em seu extremo 3. Essa cauda no existe nos RNAs-m de procariotos (sem
ncleo definido) e tem funo de aumentar a estabilidade do RNA-m. No extremo
5, adicionado um chapu de guanosina metilada importante no
direcionamento do RNA-m no momento da traduo.
A expresso gnica a principal funo relacionada com os RNAs mensageiros
(RNA-m) e o processo da transcrio. Ela define o perfil das protenas nas clulas e
sua diferenciao. Por exemplo, somente as clulas de tecido muscular expressam
protenas associadas ao sarcmero e, contrao muscular, como miosina e
desmina, as clulas do fgado, enzimas responsveis pela desintoxificao; os
linfcitos tipo B, a sntese de anticorpos especficos. Nas clulas vegetais, ocorre a
sntese de protenas especficas da fotossntese, da reao a estresses biticos ou
abiticos, da formao de compostos fenlicos especficos etc.
A transcrio e a expresso gnica (Figura 5) tm grande importncia na
engenharia gentica. A partir do seu estudo, pode-se isolar e caracterizar genes
que so especificamente ativados em clulas e representam funes mais
relevantes como, por exemplo, anticorpos (para produo de vacinas), protenas de
resistncia a patgenos e a pragas da agricultura, crescimento celular, entre outros.
considerado dogma da biologia molecular que a informao gentica contida
no DNA transcrita em RNA e este traduz uma mensagem que expressa na
forma de protenas (Figura 6). Porm, hoje, possvel inverter esse mecanismo
natural e realiz-lo ao contrrio, ou seja, a partir de protenas ou do RNA, pode-
se obter os genes que os originaram. Esse fato tornou-se possvel graas
descoberta da enzima transcriptase reversa em alguns vrus (retrovrus). Esta
permite muitas estratgias da engenharia gentica que sero vistas a seguir. Alm
da descoberta da enzima transcriptase reversa, tambm h a possibilidade de
desenhar iniciadores in vitro.
Figura 6. Desenho esquemtico de estratgias de trabalho em Engenharia Gentica.
Histrico
At o sculo 18, a biologia estudava basicamente a relao dos seres vivos com
a natureza. Essa poca destacou-se pelas primeiras observaes de clulas vivas.
Havia grande questionamento de como estavam organizados morfologicamente
os seres vivos. Nessa poca, os nomes que se destacaram foram Leenwenhoek e
Hooke por seus trabalhos de Microscopia. Alm desses autores, Lammarck, com
seus trabalhos, comeava a questionar-se a respeito da evoluo das espcies.
No sculo 19, Charles Darwin consolida a teoria da evoluo dizendo que os
seres vivos evoluem de acordo com a seleo natural do ambiente onde, os mais
adaptados sobrevivem em detrimento dos menos adaptados. Nesse sculo,
apareceram tambm grandes personalidades como Louis Pasteur e Gregor
Mendel. O primeiro, bioqumico, confirmou a presena de seres vivos invisveis
(microrganismos) demonstrando o princpio em que estava baseado os
DNA
RNA
Protena
2
1
4 (transcriptase reversa)
3 (amplificao com
degenerados) primers
processos de putrefao. Com seus estudos, a comunidade cientfica
abandonou definitivamente a teoria de origem da vida baseada na gerao
espontnea. Louis Pasteur contribuiu, tambm, com os processos at hoje
utilizados de assepsia, tanto em laboratrios de anlises (utilizados hoje na
cultura de tecidos e na biologia molecular) quanto em hospitais (salas de
cirurgia, unidades de tratamento intensivo). Mendel ficou conhecido como o pai
da gentica. Realizou ensaios com ervilhas e descreveu que os caracteres
morfolgicos (cor das ptalas, textura da semente) so herdadas pelos
descendentes seguindo leis bem definidas. Assim, elaborou duas leis, que so
primordiais na gentica at os dias de hoje: a da segregao e a da distribuio
independente.
Somente no incio do sculo 20 foi caracterizado o material gentico no
ncleo das clulas (cromossomas) e em 1944, Avery; Mac Leod & Mac Carty,
estudando cepas virulentas e avirulentas de Streptococcus pneumoniae
descreveram que havia um princpio transformador que era passado da cepa
virulenta para a avirulenta. Mais tarde, Hershey & Chase, em 1952, atriburam
aos cidos nuclicos (DNA e RNA) esse princpio transformador.
Estudos bioqumicos para determinar a constituio dos cidos nuclicos
realizados principalmente por Chargaff e estudos de difrao de Raios-X,
realizados pelo grupo de Wilkins, foram decisivos para que, em 1953, Watson
& Crick deduzissem a estrutura do DNA em -hlice. Essa dcada tambm foi
marcada por descobertas importantes como a enzima DNA polimerase I
(Kornberg, 1956), os primeiros experimentos de controle da expresso gnica
(Jacob & Monod, 195-), e a descrio da replicao semiconservativa e
bidirecional do DNA (Meselson & Stahl, 1957; J. Cairns, 195-).
Na dcada de 1960, descreveu-se o RNA mensageiro como carreador da
mensagem armazenada no DNA, expressa em protenas no citoplasma. Na
dcada de 1970, foram descobertas vrias enzimas de restrio (endonucleases
especficas), implementados avanos tecnolgicos no estudo da bioqumica /
biologia molecular como processos eletroforticos de anlises, desenvolvidas as
tcnicas de hibridao em colnias (Southern blotting) e os primeiros ensaios
de clonagem. Em 1977, em funo desse conhecimento prvio foi elaborada a
tcnica de seqenciamento de DNA.
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Tabela 2. Histrico das Principais Descobertas / Estudos de Bioqumica, Gentica e Microscopia que permitiram o
desenvolvimento da Engenharia Gentica.
Ano Pesquisador Pesquisa - Descoberta
1632 - 1723 Leenwenhoek Estudos de Microscopia e observao de clulas
1665 R. Hooke Estudos de Microscopia observao da cortia
1744 -1829 Lammarck Estudos de Evoluo Defendeu a tese da herana dos
caracteres adquiridos por modificaes do ambiente
1809 - 1882 Charles Darwin Teoria da Evoluo das Espcies
1822 - 1895 Louis Pasteur Demonstrou a existncia de microrganismos Desenvolveu as
bases dos processos de assepsia
1822 - 1884 Gregor Mendel Considerado pai da gentica Descreveu as teorias da herana
de caracteres genticos
1833 vrios Descoberta das primeiras enzimas
1903 W. Sutton Observou e descreveu os cromossomas no ncleo das clulas
1944 O. Avery; C. Mac Leod; Descreveram o DNA como o princpio transformador que
MacLyn; McCarty; carregava caracteres que se expressavamno fentipo virulento
F. Griffiths (Streptococcus pneumoniae)
1952 A.Hershey; M.Chase Descreveram os cidos nuclicos (DNA e RNA) em vrus como
os carregadores de mensagens genticas
1953 Watson & Crick; E.Chargaff; Deduo da estrutura do DNA em -hlice
Wilkin & Colbs
1956 A. Kornberg Descoberta da enzima DNA polimerase I
195- Jacob & Monod Primeiros experimentos de Controle da Expresso Gnica por
protenas
Continua...
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Tabela 2. Continuao.
Ano Pesquisador Pesquisa - Descoberta
1957 Meselson & Stahl Demonstraram que a replicao do DNA semiconservativa
195- J. Cairns Demonstrou que a replicao do DNA bidirecional originadoem
forquilhas
1960 - Descoberta do RNA mensageiro
1970 vrios Descoberta das enzimas de restrio (nucleases especficas)
1973 Cohen & Boyer Desenvolvem o primeiro experimento de DNA recombinante
utilizando genes bacterianos
1975 Southern Descreveu a tcnica de hibridao em colnias e Southern
blotting para detectar seqncias de DNA especficas,
possibilitando o isolamento de genes individuais do genoma de
organismos
1976 - A hibridao molecular utilizada para diagnose pr-natal de
doena gentica
1977 Sanger Determinao da primeira seqncia de DNA (Bacterifago
X174)
1982 - Produo de insulina humana por engenharia gentica em
bactrias para tratamento de diabetes (primeiro produto da
biotecnologia moderna a ser aprovado pelos rgos competentes
dos Estados Unidos da Amrica)
1985 K.B. Mullins Descrio da tcnica PCR
2000 (vrios laboratrios no mundo) Seqenciamento Completo do Genoma Humano
Em 1985 foi descrita pela primeira vez a tcnica de reao de polimerase em
cadeia tambm conhecida como PCR. Assim, a biologia molecular e a engenharia
gentica j demonstravam seu alto potencial na identificao de doenas
genticas, produo de medicamentos (insulina em bactrias), testes de
paternidade etc.
O incio do sculo 21 marcado pelo seqenciamento completo do genoma
humano. A perspectiva de trabalho em biologia molecular e engenharia gentica
cada vez mais ampla. Talvez o maior questionamento da atualidade, seja
objetivar os temas de pesquisa de forma que representem benefcios reais para a
humanidade.
Ferramentas Tcnicas da
Engenharia Gentica
Extrao de cidos Nuclicos
A extrao de DNA e RNA so as duas primeiras etapas tcnicas aos
posteriores estudos. Existem inmeros procedimentos adotados para sua
extrao. Nas clulas animais so diferentes daqueles utilizados nas clulas
vegetais. A principal diferena a ruptura da parede celular que uma etapa
comum nas clulas vegetais e no na das clulas animais.
Para a extrao do DNA, podem ser citados protocolos que utilizam o
detergente dodecil sulfato de sdio (SDS) ou o brometo de cetil trietil amneo
(CTAB). Esses procedimentos podem ser utilizados em pequena
(minipreparaes), mdia ou grande escalas. Os de pequena escala tendem a
fornecer uma amostra mais suja (com presena de contaminantes fenlicos,
protenas, acares etc.). Em mdia e grande escala o DNA purificado em
gradientes de cloreto de csio ou em colunas de afinidade e so bastante puros.
Porm, pode-se conseguir DNA com razovel pureza e quantidade para alguns
experimentos de biologia molecular e engenharia gentica em minipreparaes.
Ainda, os diferentes procedimentos de extrao fornecem amostras que variam
em peso molecular. Dependendo da finalidade ou do estudo, necessrio
obteno de DNA genmico de alto peso molecular ou um pouco mais
fragmentado. A fragmentao do DNA genmico causada pela ao dos
agentes utilizados no processo de extrao e, alguns deles, apresenta maior
ao lesiva. Essa leso tambm pode estar relacionada ao tipo de tecido
utilizado. Apesar de determinado grau de fragmentao, o DNA extrado para
anlises de engenharia gentica ainda tem um peso molecular elevado (80
150 KB). Em geral, o DNA genmico obtido nos diversos procedimentos deve
ter uma pureza razovel e no deve estar degradado.
Basicamente os protocolos de extrao do DNA de clulas vivas apresentam as
seguintes etapas:
1. Ruptura da parede celular (clulas vegetais) e membrana plasmtica (todas as
clulas). Nos tecidos vegetais inicia-se por meio de macerao do tecido
congelado em gral & pistilo. A ruptura da membrana plasmtica, feita com a
utilizao de detergentes como o SDS e o CTAB;
2. Extrao de protenas. Com a ruptura da membrana plasmtica, saem para o
meio extracelular todos os componentes intracelulares como DNA, RNA,
protenas, polissacardeos e organelas. As organelas e os restos celulares
(membranas, debris) so eliminados por meio de centrifugao em
velocidades de 16.000 X g. Como so mais pesadas, tendem a se precipitar
enquanto as molculas de DNA, RNA e protenas permanecem no
sobrenadante. As protenas so removidas por agentes tais como o fenol, o
clorofrmio e o lcool isoamlico. Esses agentes desnaturam as protenas que
tendem, tambm, a precipitar em solues aquosas. Em seguida, as amostras
so novamente submetidas centrifugao;
3. Precipitao do DNA em soluo aquosa com agentes desidratantes (sais e
lcoois). Nessa fase, geralmente, so utilizados lcoois e os mais freqentes
so o isopropanol e o etanol na presena de sal. Os sais realizam um efeito
precipitante do tipo salting out parecido com aquele que ocorre com solues
de protenas. Os principais so: o cloreto de sdio, o acetato de sdio e o
cloreto de amneo;
4. Degradao do RNA residual. O RNA restante nas amostras de DNA
genmico pode ser eliminado pela ao de ribonucleases (RNAses) que o
degradam. A presena de RNA nas amostras interferem em sua quantificao
espectrofotomtrica, bem como no processo de amplificao gerando
fragmentos amplificados inespecficos;
Na extrao de RNA, algumas medidas adicionais devem ser tomadas tendo em
vista que essa molcula mais instvel que a do DNA. Essa molcula pode ser
facilmente degradada pela ao de RNAses e assim no pode ser utilizada em
nenhuma anlise. A principal causa da degradao da molcula de RNA a
presena de contaminao com RNAses em vidraria e solues . Essas enzimas
so muito estveis mesmo quando submetidas a altas temperaturas que so
normalmente desnaturantes para outras protenas. Ainda que se alterem, ao
trmino do aquecimento podem retornar sua estrutura tridimensional de enzima
ativa. Um dos nicos agentes que garante a desnaturao irreversvel da RNAse
o dietilpirocarbonato (DEPC). Assim, toda a vidraria e soluo usadas nas
extraes de RNA devem ser previamente tratadas com este produto. Alm
disso, durante a manipulao deve-se utilizar luvas, pois, a RNAse pode estar
presentes nas mos do operador.
Os procedimentos prvios so anlogos aos empregados na extrao do DNA.
Uma das principais diferenas que, em geral, o RNA precipitado com
solues de acetato de ltio ou cloreto de ltio. Esses agentes permitem uma
precipitao diferencial de RNA em relao ao DNA, de forma que a amostra
resultante, em geral, obtida por centrifugao, ser enriquecida em RNA. Porm, se
a anlise prescinde da eliminao completa de DNA residual, faz-se necessrio o
tratamento posterior da amostra com desoxiribonuclease (DNAse) livre de RNAse.
Reao de Polimerase em Cadeia (PCR)
A reao de polimerase em cadeia (PCR) uma ferramenta metodolgica muito
utilizada na biologia molecular e na engenharia gentica. Aplica-se em muitos
trabalhos tais como: amplificao de seqncias gnicas total ou parcialmente
homlogas a uma conhecida, identificao genotpica (fingerprinting), testes de
paternidade, anlises de dissimilaridade entre genomas, caracterizao de
germoplasma, mapeamento gentico, seleo diferencial de genes expressos em
sistemas entre outros.
A PCR uma tcnica que imita a duplicao do DNA in vitro. Ela realizada em
trs etapas fundamentais: desnaturao da dupla fita do DNA, hibridao de
oligonucleotdeos iniciadores e polimerizao das novas cadeias de DNA. A
primeira realizada temperatura de 92
o
C a 95
o
C para separar completamente
a dupla cadeia (quebra das pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas). A
segunda varivel de acordo com a seqncia do oligonucleotdeo iniciador
(primer) que pode ser especfico ou no. Assim, a temperatura de anelamento do
primer pode variar de 35
o
C a 52
o
C ou mais conforme T
m
(temperatura de
melting) que depende da sua seqncia. Finalmente submete-se temperatura de
72
o
C, tima para o funcionamento da DNA polimerase (Taq polimerase ou Pfu).
Essas etapas so repetidas em ciclos de 30 a 40 vezes, garantindo uma
amplificao em progresso geomtrica do DNA a partir da quantidade inicial
colocada no ensaio (da ordem de 25 ng de DNA). Esse mecanismo
automatizado em mquinas denominadas termocicladoras. Somente foi possvel
sua concepo e utilizao depois do descobrimento da Taq polimerase,
resistente a temperaturas altas tais como as adotadas na desnaturao da
molcula do DNA. A PCR uma metodologia que tem contribudo largamente
com o avano das pesquisas na rea da biologia molecular.
Eletroforese em gel
A eletroforese um procedimento bsico de todas as anlises com cidos
nuclicos. Essa metodologia baseia-se no fato de que essas molculas
apresentam carga eltrica negativa quando solveis em solues aquosas. Essa
carga fornecida pela ionizao dos grupamentos de fosfato presentes em suas
molculas. Essas molculas podem migrar em um suporte slido (agarose ou
poliacrilamida) submetido a um campo eltrico (condio com diferena de
potencial eltrico). Assim, os cidos nuclicos migram em direo ao plo
positivo e se separam dependendo do peso molecular que contm. Molculas
pequenas tendem a migrar com velocidades maiores do que as grandes.
A eletroforese d suporte a outras tcnicas tais como: clonagem e subclonagem
de fragmentos gnicos; construo de bibliotecas genmicas e de DNA
complementar (cDNA); anlises de southern blot e northern blot, tcnicas
baseadas na amplificao via reao de polimerase em cadeia (PCR), no controle
dos procedimentos da extrao do DNA e RNA; em estudos genticos de
caracterizao de germoplasma, mapeamento gentico.
Alm dos processos eletroforticos de cidos nuclicos, tambm so conhecidos
processos eletroforticos de anlises de protenas. Protenas podem ser
separadas em suportes como o papel, o acetato de celulose, o amido, o gar, a
agarose e a poliacrilamida. Em corridas unidimensionais ou bidimensionais ou,
em separaes por peso molecular ou carga eltrica.
Anlises moleculares
Sistemas de Restrio e Metilao
Esses sistemas so operados por enzimas chamadas de enzimas de restrio e
metilases. A restrio / metilao pode ser operada por uma mesma enzima como
tambm por enzimas distintas.
Os sistemas de restrio/metilao foram caracterizados pela primeira vez, em
bactrias, na dcada de 1950. Esse sistema, nesses organismos, tm funo de
defesa contra vrus invasores (bacterifagos).
As enzimas de restrio so endonucleases que cortam DNA em stios
determinados chamados de palndromos. Palndromos so seqncias de
nucleotdeos idnticas no sentido 5 3 e seu anti-sentido. Cada enzima de
restrio tem um stio especfico. Essas enzimas podem tambm ter funo de
metilases. Quando isso ocorre, ela adiciona um radical metila no stio onde a
poro da enzima com funo de restrio atua. Na presena desse radical, a
parte da enzima com funo de restrio no consegue atuar. As metilases
tambm podem aparecer como enzimas independentes (sem funo de restrio
associada). Ou seja, enquanto as enzimas de restrio cortam o DNA do vrus
invasor, as metilases metilam as bases presentes no DNA da prpria bactria
impedindo sua restrio.
O sistema restrio/metilao em bactrias aquele conhecido como de tipo I.
Alm desses, foram tambm caracterizados os de tipo II e III. O sistema de tipo II
aquele mais utilizado em engenharia gentica.
Existem muitas enzimas de restrio hoje conhecidas. As mais comuns so a Eco
RI, Hind III, Bam H1, Pst I etc (vide apndice 2). Essas enzimas so
consideradas verdadeiras tesouras moleculares, pois podem ser utilizadas para
fragmentar especificamente os genomas de maneira que possam ser facilmente
colocados em outros (clonagem). Porm, para isto necessria outra enzima
chamada de DNA ligase.
Algumas aplicaes das enzimas de restrio na biologia molecular e na
engenharia gentica so: anlises em RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) para, por exemplo, diagnsticos de doenas genticas e
mapeamento gentico, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) para
anlises de divergncia gentica entre genomas e tambm mapeamento gentico,
clonagem e subclonagem de fragmentos para seqenciamento, estudos de
expresso gnica, transformao de plantas.
Enzimas Modificadoras: polimerases, ligases
Alm das enzimas de restrio, a engenharia gentica tambm utiliza outras
muito teis em diversos processos. Entre muitas, podemos citar: DNA ligase,
DNA polimerase I, polinucleotdeo quinases, fosfatases, transcriptase reversa.
A DNA polimerase I a enzima que polimeriza novas cadeias de DNA. Existem
variaes de DNA polimerase como a Taq polimerase, a Pfu e o fragmento de
klenow. Essas ltimas so muito teis na reao de PCR. A DNA ligase, como
o prprio nome diz, uma enzima que tem funo de ligar dois fragmentos
de DNA fazendo ligaes fosfodister entre eles. As polinucleotdeos quinases
transferem um grupamento fosfato do adenosina trifosfato (ATP) para o grupo
5 hidroxil do nucleosdeo da ponta do fragmento de DNA. Essa enzima
tambm pode ser utilizada para fazer marcao radioativa nesse nucleotdeo (da
ponta), com P marcado As fosfatases desfosforilam o ltimo nucleotdeo depois
da restrio com enzima. Essa estratgia utilizada em clonagens direcionadas
para evitar a religao do vetor. A transcriptase reversa aquela enzima que
consegue polimerizar a cadeia de DNA a partir de RNA-m. Ela consegue fazer
cadeia de DNA, utilizando-se de um primer iniciador do tipo oligo dT que se
associar cauda de poli-A presente nos RNA-m dos eucariotos. A
transcriptase reversa uma enzima muito importante para todas as estratgias
que envolvem seleo de genes a partir da transcrio gnica.
Clonagem Molecular
O que afinal clonagem molecular? Clonagem uma estratgia que se pode
dizer chave da engenharia gentica. Significa cortar determinada seqncia
gnica de um genoma e inseri-la em outro DNA que chamado vetor e , em
geral, um plasmdeo (Figura 7). Esse processo de corte seguido de nova
insero somente foi possvel realizar depois do conhecimento das enzimas de
restrio e das ligases respectivamente.
O gene ou fragmento de DNA a ser retirado do genoma pode ser obtido por
meio de clones em bibliotecas de DNA, cDNA (DNA complementar) ou
amplificaes especficas obtidas em reao de PCR. O novo DNA no qual o
gene ser inserido chamado de vetor de clonagem e pode ser um plasmdeo,
cosmdeo, bacterifago, phagemid ou um cromossoma bacteriano artificial
(BACS). A escolha de cada um deles depende basicamente do tamanho do
fragmento de DNA a ser inserido. Plasmdeos so DNAs pequenos (~3 Kb)
que podem ser naturalmente encontrados em bactrias. Foram descobertos, por
carrear genes que tornam as bactrias portadoras, resistentes a um dado
antibitico. Cosmdeos e phagemdeos so variaes construdas em laboratrio
que permitem a clonagem de fragmentos maiores que contem outros genes que
servem de controle do processo de transformao de bactrias. Alm de genes
Figura 7. Esquema das etapas para clonagem molecular.
de controle (em geral resistncia a antibiticos) esses vetores tm um stio de
policlonagem com vrios stios de restrio de enzimas e seqncias
iniciadoras. Estas permitem o rpido seqenciamento do fragmento clonado. Os
phagemideos so DNAs de bacterifago, mas que podem converter-se em
plasmdeos no interior de bactrias, por meio de dupla infeco viral
(phagemideo e fagos helper). So muito utilizados na construo de
bibliotecas de cDNA e facilitam a etapa da subclonagem do fragmento clonado
em fago inicial para plasmdeo. Em plasmdeos e phagemideos, podem-se inserir
fragmentos de at 5 Kb; em cosmdeos, fragmentos maiores, em bacterifagos
ao redor de 20 Kb e os BACS so aqueles mais apropriados para insero de
grandes fragmentos de DNA (~100 Kb). Esses ltimos so especialmente
utilizados na construo de bibliotecas de DNA e outras distintas finalidades.
Depois do corte, insero do fragmento (ou gene) no vetor, este colocado no
interior de clulas bacterianas por metodologias diversas (utilizando-se o cloreto
de clcio, eletroporao, choque trmico etc) e, nessas clulas, podem-se
multiplicar produzindo muitos plasmdeos que contm o fragmento clonado
(gene).
Seqncia gnica a ser clonada
contendo terminaes compatveis com a
enzima de restrio do vetor
Stio de
policlonagem
Ligao com
a DNA ligase
Gene de resistncia
a antibitico
Gene de resistncia
a antibitico
Corte com
enzimas de restrio
Plasmdeo Plasmdeo
Introduo do plasmdeo
contendo o gene e multiplicao em
clulas bacterianas
Gene clonado
Assim, a clonagem permite que um organismo possa conter um gene que no
est presente naturalmente no seu organismo e express-lo (ex. gene da insulina
humana em bactria). Porm, se o objetivo integrar esse fragmento de DNA ou
gene diretamente em seu genoma (ex. um organismo/tecido mais complexo),
ainda so necessrias as tcnicas de transformao estvel de clulas ou tecido
(animal ou vegetal).
Tcnicas Bsicas para caracterizao de genes
Estas metodologias permitem conhecer os genes que esto associados
diretamente a um dado mecanismo fisiolgico de um tecido ou clulas. Existem
muitas estratgias que podem ser utilizadas. Sero citadas aquelas de maior
impacto nos estudos sobre genmica funcional com distintos objetivos.
Construo de Biblioteca genmica
Uma biblioteca genmica o conjunto de todas as informaes gentico-
moleculares de um ser vivo. Como se constri uma biblioteca genmica? Para
constru-la necessrio, em primeiro lugar, obter o DNA do organismo em
questo de forma que ele esteja com alto grau de pureza e integridade. Os
procedimentos adotados para extrao desse DNA devero ser,
preferencialmente, aqueles em larga escala com purificao em gradiente de
cloreto de csio. Depois da obteno do DNA, a estratgia digeri-lo com
enzima de restrio de forma que se obtenha fragmentos entre 5 e 50 Kb sero
selecionados para clonagens aqueles com 20 Kb de peso molecular
aproximadamente. Esses fragmentos devero ser clonados em vetores
preparados a partir de DNA de bacterifagos e posteriormente inseridos nas
capas virais constituindo partculas virais contendo fragmentos de DNA
genmico de um ser vivo. Portanto, uma biblioteca genmica consiste em um
pool de partculas virais, cada uma, contendo um fragmento de DNA genmico
de um dado ser. As bibliotecas de DNA so teis para o isolamento de um gene
especfico para caracterizao de sua seqncia. Tambm so teis em estudos
de seqncias do tipo microssatlites que podem ser utilizadas em estudos de
caracterizao de germoplasma ou testes de paternidade.
Construo de biblioteca de cDNA
Uma biblioteca de cDNA um conjunto de seqncias gnicas de um ser vivo
que expressam-se em uma situao fisiolgica especfica. Como se constri uma
biblioteca de cDNA? Uma biblioteca de cDNA obtida do pool de RNA-m
expresso em uma clula ou tecido especfico. A obteno do cDNA realizada a
partir do RNA-m (que serve de molde) pela polimerizao da primeira fita do
DNA pela enzima transcriptase reversa e um iniciador do tipo oligo dT e, a
segunda fita polimerizada pela DNA polimerase I. Uma vez formada a
seqncia de cDNA procede-se clonagem dela em um vetor que pode ser um
cosmdeo, um DNA de bacterifago ou phagemideo. Os cosmdeos, contendo
seqncias de cDNA, so introduzidos em bactrias ou se o vetor um DNA de
bacterifago ou phagemideo, ele inserido em uma capa protica viral. Assim,
uma biblioteca de cDNA constitui um pool de bactrias ou partculas virais que
contm as seqncias de cDNA, relativas a RNAs-m expressos em clulas ou
tecidos especficos. As bibliotecas de cDNA so teis para caracterizar
seqncias de genes que so especificamente expressas em clulas.
Seqenciamento de DNA
A tcnica de seqenciamento de DNA utilizada principalmente para conhecer a
seqncia de bases nitrogenadas correspondente a um gene. Na obteno de
clones especficos, tanto de bibliotecas genmicas quanto de bibliotecas de
cDNA, o seqenciamento a tcnica subseqente. Existem vrias metodologias
para seqenciar cadeias de DNA: mtodo qumico, dideoxi com marcao
radioativa, mtodo dideoxi com marcao fluorescente etc. O mtodo mais
utilizado hoje o de dideoxi com marcao fluorescente automatizado. O que se
faz amplificar a seqncia que se quer estudar utilizando-se misturas contendo
cada uma um dos dNTPs (A, T, C, ou G) e, nessa mistura, alm do nucleotdeo
normal tambm h um desses (A ou T ou C ou G) do tipo dideoxi (contendo
duas hidroxilas na pentose) que impossibilita a ligao de um novo nucleotdeo a
ele. Nesse ponto da amplificao, a cadeia do DNA interrompida. Como h
uma competio entre dNTP dideoxi e o normal o ponto de polimerizao
parado em momentos distintos e no produto final da reao conseguem-se
fragmentos de diferentes tamanhos. Podem ser utilizadas duas formas de realizar
essa reao: a primeira aquela em que se adiciona um iniciador contendo a
marcao fluorescente (tetrametilrodamina) em quatro tubos que contm, cada
um, um dos nucleotdeos dideoxi e os outros normais. A segunda feita
adicionando-se cada um dos quatro nucleotdeos contendo um com uma
marcao fluorescente diferente (fluorescena; NDB 4 cloro, 7-nitrobenzeno,
2-oxal-diazol; tetrametilrodamina e o vermelho do Texas) mais o nucleotdeo
dideoxi adequado em quatro reaes separadas. Assim, para cada seqncia
estudada, realizam-se quatro reaes de PCR que so analisadas em gel de
eletroforese onde os fragmentos constitudos so revelados por seu tamanho
molecular graas marcao fluorescente (diferente). Da segunda maneira, pode-se
correr as amostras em um nico slot ou pocinho do gel j que os fragmentos esto
com marcaes diferentes. O resultado final organizado seqencialmente em
computador dando o produto que a seqncia correta das bases que compe o
gene ou seqncia expressa. O seqenciamento automatizado pode fornecer
informaes de seqncias de at 1 kb por reao. Dessa maneira, os modernos
laboratrios que trabalham com projetos GENOMA conseguem seqenciar todo o
cdigo gentico de um ser vivo. Essa tcnica hoje em dia considerada de grande
impacto, pois promove enorme acmulo de informaes cientficas.
Tcnicas para estudo de caracterizao e expresso de
genes
Southern blotting
Anlise em Southern blotting constitui uma estratgia tecnolgica, no qual se
reconhecem seqncias de DNA iguais ou semelhantes em genomas. Para a
anlise, necessrio obter DNA (s) genmico (s) e pelo menos uma seqncia
aquela que se quer investigar a presena no (s) genoma (s). Essa seqncia ,
em geral, um gene clonado e caracterizado.
Para realizar a anlise em Southern blotting procede-se ao seguinte esquema de
trabalho:
1. Extrao de DNA genmico que se quer investigar, puro e livre de RNA
residual;
2. Digesto completa com uma enzima de restrio. Em geral, utiliza-se a EcoRI
ou HindIII, mas pode ser tambm outra de corte freqente;
3. Anlise eletrofortica em gel de agarose 0,8%;
4. Transferncia dos fragmentos de DNA resultantes da digesto e separados no
gel para uma membrana de nylon. Essa etapa pode ser realizada por
capilaridade durante a noite ou eletricamente em aparatos prprios por
algumas horas;
5. Desnaturao da cadeia do DNA com soluo de hidrxido de sdio, cido
clordrico e tampo;
6. Ligao irreversvel dos fragmentos de DNA transferidos do gel para
membrana de nylon. Esse processo comumente chamado de crosslinking e
pode ser realizado em temperaturas altas como 80
o
C por duas horas ou sob
ao ultravioleta durante alguns segundos ou minutos;
7. membrana de nylon contendo fragmentos de DNA genmico associados
adicionada uma soluo chamada de hibridao que contm tampo Tris,
NaCl, leite, formamida, polivinilpirrolidona (PVP) em sacos de plstico ou
pequenos reservatrios e submetidos a 42
o
C a 65
o
C (depende da
homologia do DNA e do genoma, por no mnimo duas horas. Essa etapa
chamada de pr-hibridao);
8. Prepara-se o fragmento de DNA (gene) que se quer investigar, sua presena
ou ausncia no determinado genoma. Esta realizada de forma que o
fragmento torna-se marcado de alguma maneira (radiativamente, com
componentes luminescente ou fluorescente). Esse procedimento chamado
de preparo da sonda e pode ser realizado com auxlio de um grande
nmero de possibilidades obtidas em kits comerciais;
9. Hibridao do DNA fixado na membrana de nylon com o fragmento
marcado (sonda). Essa etapa realizada na mesma soluo de hibridao
descrita na mesma temperatura da pr-hibridao por um tempo de pelo
menos 12 horas;
10. Lavagem da membrana de nylon com solues contento Tris e SDS em
concentraes e temperaturas variveis. A variao da concentrao e da
temperatura ser importante para uma lavagem mais estringente ou menos
estringente. Concentraes e temperaturas altas devem ser utilizadas sempre
quando se quer identificar um fragmento com grande homologia com o
DNA genmico em estudo. Se, no entanto, investiga-se a presena de um
gene com uma sonda no homloga realiza-se uma lavagem pouco
estringente (baixa concentrao salina) como em baixa temperatura. Na
prtica, esses parmetros devem ser obtidos por tentativa e erro.
11. Secagem da membrana de nylon e exposio a filmes de Raios-X (sondas
marcadas radiativamente ou luminescentes) e anlise aps revelao do
filme em um aparelho que detecta fluorescncia se for o caso.
Hibridizao subtrativa e Differential Display
Essas tcnicas objetivam basicamente a seleo de genes que so expressos
diferencialmente em tecidos ou clulas e tem significado fisiolgico para o
organismo. Fundamenta-se na seleo dos genes de importncia em um dado
sistema, descartando-se aqueles que so chamados constitutivos nas clulas ou
tecidos. Por exemplo, durante o processo de defesa de plantas a patgenos,
sabe-se que induzido grande nmero de genes. No entanto, nesse tecido as
clulas infectadas continuam a ser expressos genes relacionados s atividades
bsicas (fotossntese, produo de energia etc.).
A hibridao subtrativa uma tcnica que engloba a construo de biblioteca de
cDNA, Southern blotting diferenciado (hibridao em colnia), seqenciamento
de cadeias de DNA e anlise de homologia em banco de dados. Depois da
construo de uma biblioteca de cDNA que contenha as seqncias expressas,
ela plaqueada em meio nutritivo. Utilizam-se clulas bacterianas infectadas pelo
vetor bacterifago com seqncias de cDNA da biblioteca ou, clulas bacterianas
que contenham vetores, plasmdeos ou cosmdeos, com os cDNAs clonados. As
colnias (bactrias) ou placas (vrus) so transferidas para membranas de nylon
por algum tempo. Depois so tratadas com soluo de hidrxido de sdio, cido
clordrico e tampo, para desnaturar as molculas de DNA (abrindo a dupla
cadeia). As molculas de cDNA contidas nas colnias bacterianas ou placas
virais so ligadas irreversivelmente, sendo submetidas pr-hibridao e
hibridao (etapas similares ao mtodo do Southern blotting. A etapa de
hibridao nessas colnias, nesse caso, faz-se com dois tipos de sondas. Uma
proveniente do pool de RNAs-m (cDNA) expressos na situao em estudo (ex.
estresse de plantas) e outra em condies normais do tecido (pool de cDNAs
constitutivos, normais da planta). No primeiro caso, usa-se membrana que
contm o DNA das colnias e, no segundo, com uma membrana que rplica da
primeira. Depois da exposio das membranas a um filme de Raios-X, analisa-se
a expresso diferencial de colnias positivas na membrana 1 em relao a sua
rplica (membrana 2). As colnias constantes da primeira membrana que
hibridaram com cDNAs presentes na situao de estudo e no hibridaram com
aquelas presentes na condio normal, so selecionadas para serem purificadas,
seqenciadas e analisadas em banco de dados. Essas seqncias tm uma
enorme chance de constiturem genes expressos na situao de estudo. Para a
etapa de anlise de seqncias em banco de dados, existem muitas homepages
com programas que realizam anlises em seqncias de DNA, traduzem essa
seqncia para as possveis cadeias polipeptdicas, com padres de incio de
transcrio, traduo, splicing stios de fosforilao. Essa etapa envolve a
utilizao da bioinformtica, bastante utilizada pelos grupos envolvidos em
projetos de seqenciamento de genomas.
O differential display tem o mesmo fundamento da hibridao subtrativa, no
entanto, apresenta algumas vantagens, pois, a seleo faz-se diretamente em
gis de poliacrilamida comparando-se o padro diferencial de amplificao das
amostras em reao de polimerase em cadeia. Para empregar a metodologia,
procede-se extrao de RNA-m nas duas amostras diferentes. Essas amostras
de RNA-m devem estar puras e totalmente livres de DNA residual. Depois dessa
obteno, faz-se a primeira fita do cDNA com a utilizao de um primer ou de
poli dT que vai parear com a cauda de poli A presente nos RNA-m de clulas
eucariticas e a enzima transcriptase reversa. A segunda fita sintetizada em
seguida utilizando-se a enzima DNA polimerase e um primer de seqncia ao acaso
que contm, todavia, dois nucleotdeos conhecidos. As duas fitas so marcadas
por meio de um nucleotdeo radioativo. O mesmo primer deve ser usado nas
amostras que contm padro de expresso gnica diferentes. O pool de fragmentos
amplificados analisado em um gel de poliacrilamida + uria, seco e exposto a um
filme de Raios-X (auto-radiografia). Depois de determinado tempo, o filme
revelado e analisa-se o padro diferencial de expresso encontrado. As
metodologias decorrentes dessa anlise incluem: Northern blotting confirmatrio,
eluio, amplificao, clonagem, seqenciamento e anlise da homologia do
fragmento selecionado. Se a homologia encontrada merecer outros testes, procede-
se seleo da seqncia codante ou do gene completo utilizando-se uma
biblioteca de cDNA ou genmica, como tambm a partir de desenho de primers
homlogos seqncia resgate do gene empregando-se o sistema 5 3 RACE e
seqenciamento completo da seqncia obtida. Esses outros estudos podem servir
para estudo da regulao do gene, expresso tecido ou rgo especfico, anlise da
presena desse gene em outros genomas, transformao gnica etc.
Northern blotting
Anlise em Northern blotting uma estratgia tecnolgica na qual se caracterizam a
presena e o nvel de expresso de genes em determinado tecido ou clulas. Para a
anlise, necessrio obter o RNA-m presente no tecido e/ou clula e a seqncia
gnica que se quer estudar sua expresso. O RNA-m pode ser obtido de diferentes
tecidos e/ou clulas em diferentes tempos de desenvolvimento.
Para realizar a anlise procede-se ao seguinte esquema de trabalho:
1. Extrao do RNA total do tecido e/ou clula que se quer investigar a
expresso de um gene. Essa amostra de RNA deve estar, de preferncia, pura
e livre de DNA residual;
2. Separao eletrofortica em gel de formaldedo a 1,5%;
3. Transferncia dos RNAs separados no gel para uma membrana de nylon.
Essa etapa pode ser realizada por capilaridade durante a noite ou
eletricamente em aparatos prprios por algumas horas;
4. Ligao irreversvel (crosslinking) dos RNAs transferidos do gel na membrana
de nylon;
5. A membrana de nylon contendo os RNAs separados por eletroforese e
associados adicionada a uma soluo chamada de soluo de hibridao
como descrito na anlise em Southern blotting (etapa de pr-hibridao). As
demais etapas que se seguem na anlise em Northern blotting so as mesmas
descritas na anlise em Southern blotting.
Anlises em Microarranjos
Microarranjos de DNA ou cDNA so as seqncias representativas de uma
biblioteca genmica ou de cDNA que so colocadas sobre um suporte e, por
meio de hibridaes especficas com seqncias correspondentes primeira fita
de cDNAs, ou fragmentos de DNA pode-se investigar o padro de expresso
gnica e a presena ou a ausncia da expresso de um gene em determinado
sistema. Por exemplo, imaginemos um estudo que objetive investigar quais so
os genes que se expressam em determinada etapa do desenvolvimento de um
ser. Nessa etapa determinada, so isolados os RNA-m presentes no tecido ou
clulas que servem de molde para preparar uma fita de DNA marcada (por
exemplo por fluorescncia). Essa fita uma sonda ou sinal. Quando colocada
sobre o suporte que contm as seqncias provindas de uma biblioteca
genmica, as sondas iro hibridar com aquelas seqncias que lhes so
complementares. Assim, com o isolamento das seqncias complementares do
suporte e seu seqenciamento, podem-se conhecer os genes que so expressos
naquele tecido ou clula, naquela determinada etapa do desenvolvimento. Em
geral, a marcao da sonda utilizada fluorescente e, como existe mais de um
tipo de composto fluorescente associado sonda, geralmente, analisa-se mais de
uma etapa de desenvolvimento ou situao fisiolgica. Assim, sabe-se quais os
genes expressos em distintas etapas de desenvolvimento.
A anlise em microarranjos tende a superar, com o tempo, as anlises em
Southern blotting e Northern blotting tradicionais.
Figura 8. Esquema geral da anlise em microarranjos.
Aplicaes da Engenharia Gentica
Agricultura
So inmeras as aplicaes da engenharia gentica na agricultura. Podem estar
envolvidas nas diversas etapas do ciclo produtivo de uma cultura de importncia
agronmica. Por exemplo, a engenharia gentica pode auxiliar a seleo de
plantas superiores em um programa de melhoramento, em relao a
caractersticas como resistncia a doenas, pragas e fatores abiticos. Para isto,
so necessrios estudos de caracterizao de genes expressos nesses sistemas,
seguidos da anlise de sua presena em determinada prognie. Nessa fase,
tambm pode-se estudar como estes genes segregam na prognie. Para
conseguir essa deteco, somente necessrio amplificar a seqncia do gene
de interesse em reao de PCR nos diferentes indivduos e assim selecionar
aqueles que o contm. A engenharia gentica pode atuar em fase de manejo das
culturas, em especial, quando se pensa no manejo de pragas e controle biolgico
O uso de engenaria gentica permite o maior conhecimento da fisiologia das
pragas e patgenos nvel da gentica e, assim pode ser usado na elaborao de
estratgias de controle biolgico. Para atingir esses objetivos, so necessrios
estudos preliminares de caracterizao. Na fase de comercializao de um
produto, a engenharia gentica pode beneficiar uma cultura permitindo a seleo
Anlise de Genoma
Biblioteca Genmica/cDNA
Fragmentos de DNA
clones
Hibridao com sondas especficas
Genes expressos
em sistemas de
plantas
Seleo,
seqenciamento,
anlise
Lmina
de gentipos que produzem frutos com vida longa de prateleira. Esse aspecto
muito importante na fruticultura, uma vez que nosso pas tem um enorme
potencial para o mercado interno e exportao. A engenharia gentica tambm
pode auxiliar em fases de processamento, por exemplo, selecionando variedades
de frutas com maior teor de aroma especfico (busca-se nesse estudo a
caracterizao dos genes envolvidos nesses sistemas).Tambm pode ser
utilizada, uma abordagem parecida, na horticultura e na olericultura.
Outra potencialidade da engenharia gentica, auxiliada pela tcnica de cultura de
tecidos in vitro a produo das plantas transgnicas. Essa talvez seja a
aplicao mais controversa da atualidade. Plantas resistentes a uma doena ou a
uma praga que ocasiona restries de produo, resistentes ao alumnio trocvel
do solo, resistentes a herbicidas, produtoras de elementos protetores (como
anticorpos, servindo como alimentos protetores), enriquecidas em protenas,
frutas com menor perecibilidade so algumas das possibilidades da transgenia.
Em geral, a produo de plantas transgnicas envolve questes relacionadas com
propriedade intelectual e royalties, assim os pases detentores de mais tecnologia
deste tipo estaro em posio privilegiada no futuro. No entanto, necessrio
que se estabeleam discusses e elaborem-se critrios claros em mbito mundial,
na distino de estratgias biotecnolgicas de produo de transgnicos, bem
como seu controle, de forma que esta no venha a acarretar em perda do
patrimnio biolgico natural do planeta. Alm disso, so necessrios controles e
testes de segurana alimentar e ambiental.
Pecuria
Na pecuria, a engenharia gentica tambm representa uma ferramenta que pode
contribuir gerando benefcios. Como no caso da agricultura, a engenharia gentica
permite estudos genticos e moleculares dos principais patgenos dos diversos
rebanhos (leiteiro, suno, eqino etc). Esses estudos podem propiciar ainda
estratgias de controle biolgico e produo de vacinas DNA (terapia gnica).
Pode auxiliar igualmente os programas de melhoramento gentico animal de
forma a selecionar caractersticas gnicas especficas contidas em raas, em uma
dada prognie, ou relacionadas a doenas genticas. E, finalmente, fundamentar
estudos de produo de animais transgnicos e a clonagem animal. Esses
ltimos aspectos, sem dvida, os mais controversos e polmicos, exigindo-se
ainda, discusses ticas porque, em especial, a clonagem de animais, abre
prerrogativas e estudos que podem subsidiar a clonagem humana.
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SOUZA JR., M. T. Mamo transgnico. Biotecnologia Cincia &
VAZ JR., I. S. Vacina contra carrapato. Biotecnologia Cincia &
Genetic Engeneering: basic
concepts, tools and
applications
Abstract Basic concepts and methodologies concerning genetic engineering are
presented in this review and is directed to people or professionals not
familiarized to it. Moreover, it can be a document to clarify what is genetic
engineering, the importance of its contributions to modern agriculture, medicine
or livestock research and to support discussions on genetic research ethics.
Covers information on structure of nucleic acids, types, functions and main
processes such us DNA duplication, transcription and traduction. Important
methodologies are covered about DNA / RNA extraction, electrophoresis, PCR,
nucleic acid libraries production, cloning, sequencing, gene characterization in
connection to main historical events of genetic engineering. It emphasizes the
most important applications in agriculture and livestock research.
Index terms: genetic engineering, DNA, RNA, transgenic, molecular biology.
4
1
E
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g
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Apndice 1. Cdigo Gentico - cdons de aminocidos para
sntese de protenas
Primeira Letra Segunda Letra Terceira Letra
U C A G
U Fenilalanina (Fen) Serina (Ser) Tirosina (Tir) Cistena (Cis) U
Fenilalanina (Fen) Serina (Ser) Tirosina (Tir) Cistena (Cis) C
Leucina (Leu) Serina (Ser) Final de Traduo Final de Traduo A
Leucina (Leu) Serina (Ser) Final de Traduo Triptofano (Trp) G
C Leucina (Leu) Prolina (Pro) Histidina (His) Arginina (Arg) U
Leucina (Leu) Prolina (Pro) Histidina (His) Arginina (Arg) C
Leucina (Leu) Prolina (Pro) Glutamina (Glu) Arginina (Arg) A
Leucina (Leu) Prolina (Pro) Glutamina (Glu) Arginina (Arg) G
Isoleucina (Ile) Treonina (Tre) Asparagina (Asn) Serina (Ser) U
Isoleucina (Ile) Treonina (Tre) Asparagina (Asn) Serina (Ser) C
Isoleucina (Ile) Treonina (Tre) Lisina (Lis) Arginina (Arg) A
Metionina (Met) Treonina (Tre) Lisina (Lis) Arginina (Arg) G
G Valina (Val) Alanina (Ala) cido Asprtico (Asp) Glicina (Gli) U
Valina (Val) Alanina (Ala) cido Asprtico (Asp) Glicina (Gli) C
Valina (Val) Alanina (Ala) cido Glutmico (Glu) Glicina (Gli) A
Valina (Val) Alanina (Ala) cido Glutmico (Glu) Glicina (Gli) G
Apndice 2. Algumas enzimas de
restrio utilizadas em engenharia
gentica
Continua...
Enzima Seqncia Palndromo/Stio de Clivagem Origem
Acc I
5 GTATAC 3
3 CATATG 5
Acinobacter calcoaceticus
Alu I
5 AGCT 3
3 TCGA 5
Arthrobacter luteus
Apa I
5 GGGCC 3
3 CCCGG 5
Acetobacter pasteurianus
Bam H I
5 GGATC 3
3 CCTAG 5
Bacillus amyloliquefaciens
Bgl II
5 AGATCT 3
3 TCTAGA 5
Bacillus globigii
Dra I
5 TTTAAA 3
3 AAATTT 5
Deinococcus radiophilus
ATCC 27603
Eco R I
5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5
Escherechia coli
Eco R V
5 GATATC 3
3 CTATAG 5
Escherechia coli
Apndice 2. Continuao.
Enzima Seqncia Palndromo/Stio de Clivagem Origem
Hind III
5 AAGCT 3
3 TTCGA 5
Haemophilus influenzae
Hpa I
5 GTTAAC 3
3 CAATTG 5
Haemophilus
parainfluenzae
Kpn I
5 GGTACC 3
3 CCATGG 5
Klebisiela pneumoniae
Mse I
5 TTAA 3
3 AATT 5
Micrococcus species
Not I
5 GCGGCCGC 3
3 CGCCGGCG 5
Nocardia ottidis-cavarium
Pst I
5 CTGCAG 3
3 GACGTC 5
Providencia stuartii
Sal I
5 GTCGAC 3
3 CAGCTG 5
Streptomyces albus
Sma I
5 CCCGGG 3
3 GGGCCC 5
Serratia marcescens
Xba I
5 TCTAGA 3
3 AGATCT 5
Xanthomonas badrii

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