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Rev Soc Qum Per. 76 (3) 2010

EVALUACIN DELCONTENIDO DE FITOESTEROLES,
COMPUESTOS FENLICOS Y MTODOS QUMICOS PARA
DETERMINAR LAACTIVIDADANTIOXIDANTE EN SEMILLA
DE SACHAINCHI ( L.)
EVALUATION OF THE CONTENT OF PHYTOSTEROLS,
PHENOLIC COMPOUNDS AND CHEMICALMETHODS TO
DETERMINEANTIOXIDANTACTIVITY IN SACHAINCHI`S
SEED ( L.)
Plukenetia volubilis
Plukenetia volubilis
RESUMEN
Palabras clave:
ABSTRACT
AnaMuoz J uregui , FernandoRamosEscudero , CarlosAlvaradoOrtiz-Ureta,
BenjamnCastaedaCastaeda, EdyBarnett Mendoza, J aimeYez Farfn,
DeliaCajalenAsencios
Enel presenteestudioserealizlacuantificacinde compuestosfenlicosporHPLC segn
condicionescromatogrficasdescritaspor Muozetal. Latortadesachapresentaroncidos
fenlicos tales como cido cafeico 3,51 mg/kg, y ferlico 1,68 mg/kg. Asimismo, se
encontraron flavonoides: 42,93mg/kgderutina, 28,46mg/kgdehesperidinay53,24mg/kg
demorina. Seidentificaronentortayaceitepor el mtododescritopor Fierroet al., usando
TLC la presencia de fitoesteroles en sacha inchi. Inmediatamente se cuantificaron
fitoesteroles por HPLC en aceite donde se realiz el tratamiento de la muestra mediante
extraccinpor saponificacinsegnCEE 2568-91. Losresultadosmostraronuncontenido
promediode75,49mg/100gparaestigmasterol y74,56mg/100g Laactividad
antioxidanteserealiz mediantelos mtodosABTS segnVan Overveld ., y DPPH
segnBrand-Williams . Losresultadosmostraronque el extractolipoflicodel aceite
presentabamayoractividadantioxidanteymayorcapacidadinhibitoriaconel mtodo DPPH;
sinembargo,el extractohidroflicodel aceitemostrmayoractividadconel mtodoABTS.
cidosfenlicos,flavonoides,fitoesteroles,sachainchi.
The present research was the quantification of phenolic compounds by HPLC
chromatographic conditions as described by Muoz etal., in the sacha inchi`s cake that
quantifiedphenolicacidsfoundanaverageof 3,51mg/kgof caffeicand1,68mg/kgof ferulic.
Alsoflavonoidsarefoundanaverageof 42,93mg/kgroutinely28,46mg/kgof hesperidinand
53,24mg/kgof morin. Wasidentifiedby themethoddescribedby Fierroet al., usingTLC
wheretheydetectedthepresenceof phytosterolsinsachainchi. Content werequantifiedby
HPLCphytosterolsinoil whichwasextractedbysaponificationaccordingtoEEC2568-91.
Results were average content of 75,49 mg/100g for stigmasterol, while the content of
a* b a
a a c
d
de-sitosterol.
et al
et al
a*
FacultaddeMedicinaHumana, UniversidaddeSanMartndePorres,
Av. Alamedadel Corregidor 1531, Lima12, Per, amariamj@yahoo.es
FacultaddeFarmacia, UniversidaddeSevilla.
Departament of DrugMetabolismandpharmacokinetics, Merck & Co., Inc. MerckReserch
Laboratories, Kenilworth, NJ 07033,USA.
FacultaddeBromatologiayNutricin, UniversidadFaustinoSnchez Carrin.
b
c
d
Recibido el 30-06-2010
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-sitosterol was 74,56 mg/100g. Antioxidant activity was determined by ABTS methods
accordingtoVanOverveldetal.,AndDPPHasBrand-Williamsetal. Theresultsshowedthat
thelipophilicextractoil hadhigher antioxidantactivityshowedagreater inhibitorycapacity
withDPPHmethod, however, thehydrophilicextract of theoil showedgreater activitywith
theABTSmethod.
phenolicacids, flavonoids, phytosterols, sachainchi.
El sachainchi L. en nuestro pas seencuentraen estado silvestreen
diversoslugaresdeSanMartn, Ucayali, Hunuco, Amazonas, MadredeDiosy Loreto. El
presenteestudio evalalapresenciade fitoesteroles, compuestos fenlicos, y actividad
antioxidante de la semilla de sacha inchi . Actualmente son de gran importancia los
compuestosfenlicosporsuspropiedadescomoantioxidantesy porsusatributossensoriales
quebrindanalosalimentoscomo: sabor, color, yporbrindarestabilidadporsuresistenciaala
oxidacinlipdica.Asimismo, sonexcelentesconservadoresnaturalesbrindandoestabilidad
al alimento desplazando a otros conservadores sintticos. La proyeccin en cuanto a su
aplicacinenlaindustriaalimentariayfarmacuticaestenaumento;evaluarsuspropiedades
antioxidantes y la presencia de polifenoles permitir abrir nuevos posibles mercados. El
objetivodel presentetrabajoesdeterminar el contenidodecompuestosfenlicospor HPLC,
capacidadantioxidanteeidentificacinycuantificacindefitoesterolesen semilladesacha
inchi.
Membrana nylon 42mmde 45 um, Acrodisk GHP 45umde 25 mm, Cromatofolios de
silicagel Gf254.
Metanol HPLC, ter etlico, hidrxido depotasio, aguaultrapuraparaHPLC, etanol p.a.,
estndares decidos fenlicos: cafeico y ferlico, estndares deflavonoides: hesperidina,
rutinaymorina.
Laextraccindel aceitedelasalmendras desachainchi sellevacaboporel prensadoenfro.
Laspresionesde extraccinfueronde300700PSIAporespaciode5minutos, alapresiny
temperatura ambiente. Las extracciones se realizaron con muestras de 90 gramos. Las
muestras fueron colocadas en cilindro extractor de acero inoxidable, sometindose
lentamentehastallegar alaspresionesestablecidas, manteniendolapalancadeactivacina
presin constante por espacio de 5 minutos, controlndose esto con un cronmetro.
Terminadoel procesodeextraccinlatortaresidual obtenidaluegodel prensadofuesecadaa
45Cdurante2horas, luegoseenvasysellenbolsasplsticasgradoalimenticio(ziploc ) y
mantenidasenrefrigeracin.
Luegoseprocediarealizar losestudioscromatogrficosdeidentificacinycuantificacin
de compuestos fenlicos, y fitoesteroles por HPLC en el laboratorio de Bioqumica y
Nutricindel InstitutodeInvestigacindeMedicinaHumanadelaUniversidaddeSanMartn
dePorres.
Paralacuantificacindelos compuestos fenlicos serealizaronpruebas preliminares con
estndaresdecidosfenlicoscomoclorognico, cafeicoyferlico, logrndoseidentificar y
Key words:
INTRODUCCIN
PARTE EXPERIMENTAL
Preparacinde lamuestra
Ensayos preliminares
Plukenetia volbilis
1
2
3

Materiales e insumos
Metodologa
Determinacinde compuestos fenlicos
Evaluacin del contenido de fitoesteroles, compuestos fenlicos y mtodos qumicos ...
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cuantificar dos de ellos: cafeico y ferlico. Asimismo, se identificaron y cuantificaron
hesperidina,rutinaymorina.
LaspruebaspreliminaresdecromatografafuerondesarrolladasenlaFacultaddeFarmaciade
laUniversidaddeSevillaenunHPLC AgilentTechnologies(Waldbronn, Germany), modelo
1100;el sistemaconsistideundesgasificadordevaco,bombacuaternaria,automuestreador,
termostatoparacolumnaydetectordearreglodediodo(DAD). El anlisisfuecorridoenuna
columnaSBC18(250x4,6mm, 3,5m,AgilentTechnologies). Lafasemvil fue: solventeA
(agua ultrapuraajustadaconcidoacticoapH2,65)ysolventeB(20%Ay80%MeCN).La
velocidaddelainyeccinfuea1,5mLmin ylatemperaturadelacolumnaa40C. El tiempo
total del anlisisfue45minyel tiempopost-corridafue15min.El volumendeinyeccindela
muestrafue50L.Selogridentificarcidosirngicoycinmico.
Lascondicionesdel anlisisporHPLCfueronpreviamentedescritasporMuoz (2007) .
Seelaboraronestndares decidos fenlicos dondesepesaronindividualmentelos cidos
fenlicos: cafeicoyferlicoysepreparotroestndar conflavonoides: rutina, hesperidinay
morina delosquesepes10mgdecadauno ysediluyconagua enfiolade100ml;luegose
tomaron2ml ysellevaunafiolade100ml conconunamezclahidroetanlica enel casode
los cidosfenlicos. Delos flavonoidessepesaron10mgenfiolasde50ml ydeah setom
2ml paradiluirloen25ml conunamezclahidroetanlica(60:40); seguidamente fueron
identificadospor sutiempoderetencinycalculados enfuncin asusrespectivasreasde
lospicosregistradosa370nm.
La separacin cromatogrfica fue desarrollada a temperatura ambiente con una columna
LiChroCART 250-4 LiChrospher 60 RP-18 (5 m) (Merck KGaA, Alemania). La
separacinfuecorridaaunflujode1000L min ylafasemvil consistienunamezclade
gradientedel eluyenteA (agua cidoo-fosfrico, pH 2,5) y eluyenteB (acetonitrilo). El
programade gradienteutilizado fueel siguiente:0min, 100%deA; 2min,80%deAy20%
deB; 15min, 70%deAy30%deB; 16min, 40%deAy60%deB; 22min, 60%deAy40%
deB; 26min, 100%deA; 28min, 100%deA. lasconcentracionesdeloscidosfenlicosy
flavonolesseexpresaronenmg/kgdepeso. Parael tratamientodelatortadesachainchi se
trabaj conel extracto acuoso aunaconcentracinde8%,lamismaquefuesonificada20
minutosyagitadapormediahoraantesdellevara volumen.
Serealizmedianteel mtododescritoporFierroetal., (2004) . Lasmuestrasdetortayaceite
de sacha inchi fueron pesadas en tubos diferentes y se les agregaron metanol a una
concentracinde10mg/ml. Lostubosfueronagitados envortexpor30minutosy20minutos
sonificados; luego se guard 24 horas. Despues se procedi a sembrar en las placas
cromatogrficasconmicropipeta10ul. Seutilizarondossistemascromatogrficoscomofase
mvil. Laprimerafasemvil fue(CHCl :CHOH:HO10:1:0,05) yfuecorridahastalamitad
delaplacacromatogrfica. Luegolaplacafuesecadaycorridacompletamenteenel segundo
sistemadesolvente(CHCl ).
Serealizel procesamientodelasmuestrassegnel mtododescritoporel reglamento CCE
2568-91 dondesepesenunbaln5gramosdeaceitedesachainchi ysetratarondeforma
similar al estndar constituido por
, losquefueronsaponificadosen baomara yselesextrajoconter etlico
usandoperasdedecantacintresveces, llevandoavolumenen unafiolade100ml; luego se
concentrslo25ml connitrgenoysereconstituyconmetanol HPLCparaser analizados
bajo las condiciones cromatogrficas similares a las descritas por Fierro et al ., dondese
-1
4

-1
5
6
5
Cuantificacinde compuestos fenlicos porHPLC
Identificacinde fitoesteroles porTLC
Cuantificacinde fitoesteroles
et al.
3 3 2
3
aproximadamente10 mg de-sitosterol y 50 mg de
estigmasterol
A. Muoz, F. Ramos, C. Alvarado, B. Castaeda, E. Barnett, J. Yez y D. Cajalen
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trabajenunHPLCLachromMerck-Hitachi 7100condetectoruv.visaunalongitudde215
nmconunacolumnaRP18250x4de5umconfasemvil ACN:METOH(65:35)conflujode
1,2ml por 30minutos. El tiempoderetencinfuede19,4minutosparael estigmasterol yde
22,23minutosel -sitosterol.
Figura 1. Procesodesaponificacindelamuestradeaceitedesacha
inchi paraladeterminacindefitoesteroles.
Actividadantioxidante
Ensayo DPPH
Gmez-Alonso ., 2003
EnsayoABTS
RESULTADOS Y DISCUSIN
Determinacin de compuestos fenlicos por HPLC
Seutilizel radical estableDPPH(Brand-Williams .,1995; ) .
Setom300L decadafaseyseaadi2700L deDPPHde100M, sevortedurante1
minuto, luegosecentrifugdurante5minutosa3500rpm; alos10minutossetomaronlas
lecturasa515nm. LosresultadosseexpresaronenfuncinaTroloxequivalente; el rangode
lasconcentracionesfuede(1,5,10y15mol/L).
Las mediciones del potencial antioxidantetotal radical-trapping(TRAP), fuedesarrollado
medianteel ensayoABAP/ABTS (vanOverveld ., 2000) . Setomaron150L decada
faseyseaadi2850L deABTS/ABAP; sevortedurante1minuto, luegosecentrifug
durante 5 minutos a 3500 rpm; a los 10 minutos se tomaron las lecturas a 734 nm. Los
resultadosseexpresaronenfuncinaTroloxequivalente; el rangodelasconcentracionesfue
de(1,4,7y10mol/L).
Losresultados obtenidossobreel contenidodecompuestosfenlicosentortadesachainchi
estn expresados en latabla1. El contenido decompuestos fenlicos muestracantidades
inferioresalaquepresentael aceitedeoliva. Losfrutossecoscomoel man ylassemillas
oleaginosassonbuenafuentededecidosfenlicoscomoel cafeico. Estudiosrealizadospor
Oliveras manifiesta que hasta el momento se han detectado los siguientes compuestos
polifenlicos en aceite oliva extra virgen: hidroxitirosol, tirosol, cafeico, vanillina, p-
cumrico, luteolina, quercetina y apigenina. Asimismo, Oliveras expresa que estos
et al
et al
et al
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2
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2
Evaluacin del contenido de fitoesteroles, compuestos fenlicos y mtodos qumicos ...
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componentessonlosqueseencuentranconmsfrecuenciaenel aceitede olivavirgen, tal y
comoloreflejannumerososestudios(Pirisi, 1997; Mateos, 2001; Montedoro, 1993; Brenes,
1999) .
Podemosapreciarlapresenciadefitoesteroles -sitosterol ystigmasterol siendolosRF muy
cercanosdeambosestndares. Enlamuestradeaceiteseobservmayorconcentracin de -
sitosterol queenlamuestradetortadesachainchi.
Latabla2nosmuestra
expresados enmg/100g. Seobservaenel cromatograma delafigura2lacorridadelos
estn , yenlafigura3lacorridacorrespondienteal aceite de
sachainchi.
10-13
Determinacinde fitoesteroles
Identificacinde fitoesteroles porTLC
Cuantificacinde fitoesteroles
el contenidode estigmasterol y-sitosterol enel aceitedesachainchi
dares estigmasterol y-sitosterol
Figura 2. Cromatogramadelosestndaresestigmasterol y-sitosterol
Figura 3. Cromatogramadelamuestradeaceitedesachainchi.
A. Muoz, F. Ramos, C. Alvarado, B. Castaeda, E. Barnett, J. Yez y D. Cajalen
0 5 10 15 20 25
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
RetentionTime (min)
I
n
t
e
n
s
i
t
y

(
A
U
)
s
t
i
g
m
a
s
t
e
r
o
l
b
-
s
i
t
o
s
t
e
r
o
l
SAMP 200
N=Meth 0
Sens 20
SAMP 400
N=Meth 1
Vert
0 5 10 15 20 25
RetentionTime (min)
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
I
n
t
e
n
s
i
t
y

(
A
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)
s
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i
g
m
a
s
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e
r
o
l
b
-
s
i
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s
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l
SAMP 200
N=Meth 0
Sens 20
SAMP 400
N=Meth 1
Vert
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Tabla 1. Contenidodecompuestosfenlicos entortadesachainchi
expresadosenmg/kg.
Compuestos fenlicos
Expresado en mg/kg
muestra 1 muestra 2 Promedio SD
cafeico 3,572 3,457 3,51 0,08
ferulico 1,621 1,746 1,68 0,09
rutina 42,547 43,317 42,93 0,54
hesperidina 28,522 28,395 28,46 0,09
morina 52,441 54,033 53,24 1,13
Tabla 2. Contenidodeestigmasterol y -sitosterol enaceitedesachainchi.
Fitoesteroles
Expresado en mg/100g
muestra 1 muestra 2 Promedio SD
stigmasterol 75,947 75,04 75,49 0,64
b-sitosterol 74,764 74,468 74,62 0,21
Encuantoafitoesteroles el sachainchi presentamayor contenido queotros
alimentoscomolosfrejoles17,1mg/100gyarvejas49,5mg/100gestudiadospor Fierro y
queotrosaceitesenel mercadosegnloquereportaAparicio .
Los lmites queestableceel reglamento (CEE) N 2568/91, modificados enel reglamento
(CE) N 282/98 para aceite de oliva virgen, los niveles de esteroles totales se establece
1000mg/kg, los que pueden presentar los distintos tipos de esteroles: colesterol 0,5 %,
brasicasterol 0,1%, campesterol: 4,0%, estigmasterol =campesterol s
La presencia de fitoesteroles dentro de la fraccin insaponificable y su cantidad, est
consideradocomounodelos enlacalidaddel aceitedeoliva. Por otrolado, altosnivelesde
estigmasterol secorrelacionanconaltaacidezybajacalidadsensorial del aceite(Gutirrez
1999;Soledad 2001) .
El ensayo de la actividad antioxidante por decoloracin de radical estable DPPH, los
resultadossemuestranen latabla3,tantodel aceitecomodelatortaenambasfases.
de-sitosterol
, - itosterol 93%, -7-
estigmastenol:0,5%.
5
14
6
15-16
et
al., et al.,
Actividad antioxidante
EnsayoDPPH
Tabla 3. Actividadantioxidantedel aceiteytortadesachainchi.
Condicin
extracto
Fase Muestra Actividad antioxidante
(mol TE/kg)
CV (%)
Hidroflico MeOH:agua(60:40) Torta 2,42 1,7
Lipoflico Hexano Aceite 15,97 0,11
Hidroflico MeOH:agua(60:40) Aceite 1,94 1,17
Lipoflico Hexano Torta 10,56 0,16
El extractolipoflicodel aceitemuestramayor actividadantioxidante.
Evaluacin del contenido de fitoesteroles, compuestos fenlicos y mtodos qumicos ...
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Ensayo ABTS
Tabla 4: Resultadosdel ensayoABTSyDPPHexpresadosentroloxequivalente/kg
EXTRACTO DPPH ABTS Total Inhibicin
Aceitelipoflico 15,97 0,660 16,625
Aceitehidroflico 1,94 9,88 11,826
Tortalipof lico 10,56 6,45 17,013
Tortahidroflico 2,40 8,14 10,538
La mayor parte de los mtodos de medida de la actividad antioxidante miden solamente
compuestossolublesenaguadebidoalasnaturalezashidroflicasdelasespeciesreactivasy
de los sustratos oxidables que emplean. Algunos ensayos pueden adaptarse para medir
antioxidantes lipoflicos como el ABTS; por ese motivo es aconsejable emplear varios
mtodos,yaquecadaunoofreceinformacindiferente.Haycompuestosantioxidantesqueno
reaccionancondeterminadasespeciesoxidantesys conotras.
Laactividad
antioxidanteensachainchi segnel mtododeDPPHmuestramayoractividadenel extracto
lipoflico del aceite, mientrasABTS muestramayor actividadantioxidanteenel extracto
hidroflicodel aceite(tabla4); sinembargo, cuando adicionamosambosmtodosel extracto
lipoflico del aceitemuestramayor actividad antioxidante; esto seexplica porqueambos
mtodosabarcantambin otroscomponentesantioxidantesqueson capacesdereaccionar
concada reactivodiferente encadamtodo; por lotantononecesariamentevanacoincidir
losmtodosaplicados. El mtodo ABTSseadaptamsparamedirextractoslipoflicosqueel
DPPH,siendoenambosespeciesradicalesnobiolgicas.
- Latortadesachainchi contienecompuestos fenlicos en promedio: 3,51 mg/kg de
cafeico, 1,68mg/kgde ferlico, 42,93mg/kgderutina, 53,24mg/kgdemorinay28,46
mg/kgdehesperidina.
- Sedetectenlatortadesachainchi lapresenciadecidocinmicoysirngico.
- El aceitedesachainchi contieneenpromedio75,49mg/100gdeestigmasterol y74,62
mg/100gde - sitosterol.
- El extracto lipoflico del aceitemostr mayor actividad antioxidantecon el mtodo
DPPH, mientrasel extractohidroflicodel aceitemostrmayor actividadconel mtodo
ABTS.
Agradecemos el apoyo recibido por CONCYTEC, asu PresidenteDr. Augusto Mellado
Mndez; alaUSMP y al DecanodelaFacultaddeMedicinaHumanaDr. Frank Lizaraso
Caparporhaberhechoposiblelarealizacindeestainvestigacin.
En la matriz de la semilla
sacha inchi encontramos componentes antioxidantes como los compuestos fenlicos,
tocoferoles y vitaminas antioxidantes que van a influir en los resultados.
CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS

A. Muoz, F. Ramos, C. Alvarado, B. Castaeda, E. Barnett, J. Yez y D. Cajalen

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REFERENCIAS
1. D. Cachique.EstudiodelaBiologaFloral yReproductivaenel CultivodeSachainchi
( L.)INIEA-UNSM, tesis paraoptar el ttulo deIng. Agrnomo,
UniversidadNacional deSanMartn-Per,70,2006.
2. M.Oliveras,Calidaddel aceitedeOlivavirgenextraantioxidantesyfuncinbiolgica,
tesisparaoptar el gradodeDoctor enFarmacia, UniversidaddeGranada- Espaa, 104,
2005.
3. A. Brack, Diccionario enciclopdico de plantas tiles del Per. Programa de las
NacionesUnidasparael Desarrollo, CentrodeEstudiosRegionalesAndinosBartolom
delasCasas.Cusco-Per,1999,550.
4. A. Muoz, A. Fernndez, F. Ramos, C. Alvarado-Ortz. , 2007;
73(1):30-40.
5. A. Fierro, Y. Vsquez, M. Reyes-Parada, S. Seplveda-Boza. 2004;
2(2):43-48.
6. ReglamentoComunidadEconmicaEuropea(CEE) No2568/91delacomisinde11de
juliode1991.
7. W.Brand-Williams,M. Cuvelier,C.Berset. ,1995; 28(1):
2530.
8. V. Overveld, G. Haenen, J . Rhemrev, J . Vermeiden, A. Bast.
,2000;127(2):151161.
9. J . Sabat, Nutricin vegetarina. Editorial Safeliz cientfica, Madrid-Espaa, 2005,
356-57.
10. F.Pirisi ycol. 1997;768:207-213.
11. R.Mateosycol. 2001 49(5)2185-2192.
12. G.Montedoroycol. 1993;41:2228-2234
13. M. Brenes,A. Garca, P. Garca, J . Ros,A. Garrido. 1999 47:3535-
3540.
14. R. Aparicio, L. Roda, M.A. Albi, F.J . Gutierrez.
,1999;47(10);41504155.
15. F.Gutirrez,B.J imnez,A.Ruz,andM.Albi.Effectof OliveRipenessontheOxidative
Stabilityof VirginOliveOil ExtractedfromtheVarietiesPicual andHojiblancaandon
theDifferentComponentsInvolved. 1999;47,121-127.
16. M.Soledad.GrasasyAceites,2001;52(1):52 58.
Plukenetia volubilis
Rev. Soc. Qum. Per
Clnica y Ciencia,
Food Science and Technology
Chemico-Biological
Interactions
J. Chromatogr A.,
J. Agric.Food.Chem. ;
J. Agric.Food.Chem.
J.Agric.Food.Chem. ;
Journal of Agricultural and Food
Chemistry
J. Agric. FoodChem.,
Evaluacin del contenido de fitoesteroles, compuestos fenlicos y mtodos qumicos ...