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Bioqumica experimental

CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Los mtodos espectrofotomtricos principales son:

UV 280
Biuret
Lowry
Bradford


LEY DE LAMBERT-BEER
METODO UV

Las protenas muestran un fuerte grado de absorcin a 280nm en
uv, principalmente por los residuos de triptofano y la tirosina.

Las concentraciones de estos aminocidos en las protenas es
francamente constante se puede utilizar la absorbancia a 280nm para
estimar la concentracin de protenas

VENTAJAS

mtodo rpido y relativamente sensible (varias veces ms sensible que el
mtodo de Biuret)

No existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer

mtodo no destructivo

utilizado en deteccin post-columna de las protenas
DESVENTAJAS


Los cidos nuclicos tambin absorben en la regin de 280nm

el contenido de aminocidos aromticos difiere considerablemente
en varias protenas.

la solucin debe ser clara e incolora. la turbidez puede producir
resultados errticos

se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este mtodo

MTODO DE BIURET

El reactivo de Biuret se compone de hidrxido de sodio y sulfato de cobre (solucin
alcalina fuerte), el grupo amino de las protenas reacciona con los iones del cobre
del reactivo dando el color prpura, la cantidad del color producido es proporcional
al nmero de enlaces peptdicos, y por lo tanto a la cantidad de protena.
METODO

1. 5 ml de reactivo de Biuret se mezcla con 1ml de solucin proteica (1-10 mg de
protena/ml).

2. Despus de reposo a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, se lee la
absorbancia a 540nm contra un blanco con slo reactivo.

3. Se debe elaborar una curva estndar de concentracin vs absorbancia
utilizando albmina de suero de bovino (BSA) para comparacin con la
muestra bajo estudio

VENTAJAS:

Rpido (se puede completar en menos de 30 minutos)
Es el mtodo ms simple de anlisis de protenas
No es frecuente encontrar derivaciones de color
Pocas substancias no proteicas interfieren con la reaccin de Biuret
No detecta N de fuentes no proteicas o no peptdicas
DESVENTAJAS:

No es muy sensible comparado con el mtodo de Lowry
Requiere de al menos 2 a 4 mg de protena por prueba
Las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reaccin
Debe estandarizarse el color mediante cantidades de protena conocidas

MTODO DE LOWRY

El mtodo de Lowry es un mtodo colorimtrico
de valoracin cuantitativa de las protenas.

A la muestra se le aade un reactivo que forma un
complejo coloreado con las protenas, siendo la
intensidad de color proporcional a la
concentracin de protenas, segn la ley de
Lambert-Beer.
1) Los iones Cu
2+
, forman complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces
peptdicos. Estos complejos Cu
2+
-protena tienen un color azul claro.
2) Adems, provocan el desdoblamiento de la protena, exponindose los residuos
fenlicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin.
3) Se reduce del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenlicos de los residuos de
tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador.
4) El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido
fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos
da lugar a un complejo de color azul intenso.
VENTAJAS

muy sensible
menos afectado por la turbidez de la muestra
ms especfico que la mayora de los otros mtodos
relativamente simple
se puede completar en 1 a 1,5 horas
DESVENTAJAS

El color vara con diferentes protenas (ms que el mtodo de biuret)
El color no es estrictamente proporcional a la concentracin de protenas
La sacarosa, lpidos, buffers fosfato, monosacridos y hexoaminas interfieren con
la reaccin
Las altas concentraciones de azcares reductores, sulfato de amonio y compuestos
con sulfidrilo interfieren con la reaccion.
MTODO DE BRADFORD

El azl brillante G-250 Coomassie se adhiere a la protena, el colorante se torna de rojizo a
azulado y el mximo de absorcin del colorante cambia de 465 a 595nm. El cambio en la
absorbancia a 595nm es proporcional a la concentracin de protena en la muestra.
VENTAJAS


mtodo rpido (la reaccin se puede completar en 2 minutos)
reproducible
sensible (mucho ms que el mtodo de Lowry)
no existe interferencia de cationes como K+, Na+, y Mg2+

DESVENTAJAS

el complejo protena-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo
el color vara con diferentes tipos de protenas.
la protena estndar debe seleccionarse con mucho cuidado
interferencia con detergentes.

Mtodo del BCA (acido bicinconnico)
Se basa en las mismas reacciones del ensayo de Lowry.

Las protenas (en medio alcalino) reaccionan con Cu
2+
, estos se reducen por
los aminocidos aromticos.



Sin embargo los iones Cu+ forman complejos con el acido bicinconnico. Este
complejo absorbe a 562 nm.



Ventajas: es sencillo, rpido, muy sensible y muestra tolerancia a compuestos
que afectan los otros mtodos