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Protocolos das Aulas Laboratoriais de

Bioqumica e Biologia Molecular


Lic. Engenharia Biolgica
Lic. Engenharia Biomdica
Lic. Engenharia do Ambiente

1 Semestre, 2006/2007





Arsenio Fialho
Leonilde Moreira
Alvaro Tavares
Jorge H. Leito
Isabel Sa-Correia



Instituto Superior Tcnico


Protocolos das Aulas Laboratoriais de

Bioqumica e Biologia Molecular



TP1.- Anlise de protenas por electroforese em Gel de SDS-Poliacrilamida
(SDS-PAGE)

TP2.- Caracterizao cintica da enzima invertase

TP3.- Extraco do DNA cromossmico de Escherichia coli e clculo da sua
concentrao. Extraco rpida e em pequena escala de DNA plasmdico
(mtodo da lise alcalina).

TP4. - Digesto do DNA cromossmico e plasmdico com endonucleases de
restrio; separao e visualizao de fragmentos de restrio por
electroforese em gel de agarose.

TP5. - Western Blot; Deteco imunolgica da protena UgdG de
Sphingomonas elodea ATCC 31461


TP.1 - ANLISE DE PROTEINAS POR ELECTROFORESE EM GEL DE
SDS-POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)


Introduo

As proteinas constituem uma vasta classe de biomoleculas que desempenham na celula Iunes
muito diversas. Para analisar simultaneamente um to grande e variado grupo de compostos, e
necessario recorrer a tecnicas que utilizem uma propriedade comum a todos esses compostos,
mas que simultaneamente evidenciem pequenas variaes no seu comportamento, de modo a que
as varias moleculas sejam diIerenciadas.
As tecnicas de electroIorese caem nesta categoria, e so largamente utilizadas pois baseiam-se no
Iacto de todas as proteinas apresentarem uma carga electrica global quando colocadas num meio
de pH diIerente do seu ponto isoelectrico. Deste modo e possivel provocar a migrao de
proteinas sugeitando-as a um campo electrico. Essa migrao variara de acordo com a proteina,
uma vez que e inIluenciada pelo tamanho, carga, Iorma e composio quimica de cada molecula.
Grosseiramente, pode-se considerar que a migrao electroIoretica duma molecula e apenas
Iuno da sua densidade de carga, ou seja , da respectiva razo carga/massa. Assim as proteinas
separar-se-o de acordo com o respectivo valor desta razo: quanto maior ela Ior, maior sera a
velocidade de migrao da molecula.

A electroIorese em gel de poliacrilamida (PAGE) e um metodo rapido e sensivel para analisar
a composio de misturas proteicas complexas. A PAGE utiliza um suporte em que os
monomeros de acrilamida, ao polimerizarem, Iormam longas cadeias, as quais se ligam entre si
por crosslinking ('ligaes cruzadas), atraves dos residuos de bis-acrilamida, tambem nelas
incorporados. O processo de polimerizao consiste numa reaco em cadeia de radicais livres,
iniciada pelo persulIato de amonio (PSA) e pelo N,N,N`,N`-tetrametilinediamina (TEMED), os
quais se encontram presentes na mistura de polimerizao. O PSA activa o TEMED, deixando-o
com um electro desemparelhado. Este radical reage ento com uma molecula de acrilamida,
transIormando-a tambem num radical. Este, por sua vez, reage com um outro monomero de
acrilamida (ou, ocasionalmente, com a bis-acrilamida), dando origem a novo radical, e assim
sucessivamente ate se Iormar um polimero com ligaes cruzadas (crosslinked). O numero de
ligaes cruzadas (quantidade de crosslinking), controla o tamanho dos poros do gel e
consequentemente determina o intervalo de massa molecular das proteinas que podem ser
separadas nesse gel. Isto quer dizer que, consoante o numero de ligaes cruzadas, assim se
separam as proteinas com baixa massa molecular ou com elevada massa molecular. O conteudo
total de acrilamida de um gel pode variar entre 3 e 30, correspondendo o valor da percentagem
ao total das moleculas de acrilamida (i.e. acrilamida e bis-acrilamida, p/v).
A separao de uma mistura de proteinas no sistema SDS-PAGE e pois um reIlexo da
diIerena dos respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) proteina(s) em questo pode ser
estimada por comparao da respectiva mobilidade electroIoretica (R
I
), com a de proteinas de
massa molecular conhecida (padres).
A simplicidade e rapidez desta tecnica, adicionadas ao Iacto de que apenas e necessaria uma
pequena quantidade de amostra (alguns microgramas), tornam a electroIorese em gel de
poliacrilamida no metodo mais utilizado para a analise de misturas proteicas complexas. Uma vez
que as proteinas de praticamente todas as origens so Iacilmente solubilizadas pelo SDS, a
tecnica possui aplicao generalizada.
As proteinas separadas no gel de poliacrilamida podem ser Iacilmente coradas com uma
soluo contendo azul de Coomassie. Este composto permite visualizar quantidades de proteina
da ordem de 0,1 g. Apesar deste metodo permitir detectar praticamente todos os constituintes da
maior parte das amostras proteicas, surgem por vezes situaes em que e necessaria uma maior
sensibilidade, a qual pode ser alcanada recorrendo-se ao metodo de colorao com nitrato de
prata.


POOS PARA APLICAO DAS AMOSTRAS
ESQUEMA DE UM GEL DE POLIACRILAMIDA
(AS PROTENAS MIGRARO DE CIMA PARA BAIXO)

GEL CORADO COM AZUL DE COOMASSIE
(as proteinas so visiveis nas diIerentes pistas)
1 2 3
1 PROTENAS PADRO
2 mistura complexa
3 proteina pura
220kDa -
160kDa -
97kDa -
54kDa -
18 kDa -

Separao electrofortica de protenas por SDS-PAGE

1- Preparar o sistema para Iazer o gel.
2- Preparar o gel de resoluo (12,5 de acrilamida), juntando:
-1,25 ml de soluo I (Tabela II)
-2,08 ml de soluo de acrilamida
-1,64 ml de agua destilada
-8 l de TEMED
-33 l de persulIato de amonio 10
Misturar cuidadosamente e pipetar imediatamente a soluo entre as placas de vidro e silica
ate uma altura de aproximadamente 6 cm. Colocar uma camada de 1 ml de isopropanol de
Iorma a obter uma superIicie plana. Deixar polimerizar.
3- Apos polimerizao remover o isopropanol com papel absorvente.
4- Preparar o gel de concentrao (6 de acrilamida) juntando:
-0,4 ml de soluo II (Tabela II)
-0,4 ml de soluo de acrilamida
-1,2 ml de agua destilada
-4 l de TEMED
-12 l de persulIato de amonia 10
Misturar cuidadosamente, encher as placas com esta soluo e colocar o pente. Deixar
polimerizar.
5- Montar o sistema de electroIorese e preencher os tanques com tampo de electroIorese 1x
(Tabela II)
6- Preparar as amostras para aplicao no gel, juntando 20 l de cada uma das Iraces de
puriIicao com 5 l de tampo da amostra. Ferver durante 5 min.
7- Proceder a electroIorese aplicando uma voltagem constante de 150 volts, durante 1h.
8- Retirar o gel e coloca-lo numa soluo corante (Tabela II). Levar ao micro-ondas 30 s e
agitar 10 min.
9- Colocar o gel numa soluo descorante (Tabela II). Levar ao micro-ondas 30 s e agitar 10
min. Findo este tempo devem-se ver as bandas de proteinas.


Tabela II- Solues usadas para a electroIorese de proteinas em gel de poliacrilamida em condies
desnaturantes.
SOLUO REAGENTES OBSERVAES
Tampo do gel de resoluo (I) 1.5 M Tris base
0,4 SDS
pH 8,8-9,0
Tampo do gel de concentrao
(II)
0,5 M Tris base
0,4 SDS
pH 6,6-6,8
Soluo de acrilamida
(bisacrilamida)
30 acrilamida
0,8 bisacrilamida

Tampo de electroIorese Tris-
Glicina 10x
0,25 M Tris base
1,92 M glicina
1 SDS
pH 6,6-6,8
Diluir 1:10 antes de usar
Tampo de aplicao em SDS-
PAGE
20 glicerol
4 SDS
100 mM Tris.Cl pH 6,8
0,2 azul de bromoIenol
200 mM DTT

Soluo corante 2 g Coomassie blue R-250
100 ml acido acetico
475 ml etanol
425 lm agua

Soluo descorante 80 ml acido acetico
210 ml etanol
510 ml agua






Preparao e aplicao das amostras no gel.

1. Adicione a cada amostra de proteina um volume idntico de tampo de amostra.
2. Ferva 2min e coloque em gelo ate a aplicao no gel.
3. Com a ajuda de uma pipeta automatica, aplique as amostras e padres no gel que Ioi ja
previamente preparado. (No se esquea de anotar a ordem de aplicao das
amostras e padres).
4. Coloque a soluo de electroIorese (ja diluida) nas tinas superior e inIerior do aparelho
de electroIorese.
5. Coloque a tampa da camara de electroIorese, Iazendo a conexo dos electrodos.
6. Ligue os electrodos a Ionte de electroIorese, tendo em ateno respectiva
polaridade. (Por conveno, o vermelho e o positivo e o preto e o negativo). As
protenas iro migrar para o polo positivo.
7. Coloque o boto que regula a voltagem no maximo, de Iorma a esta no ser limitante.
8. Regule o boto da intensidade de corrente para um valor correspondente a 20mA por
gel.
9. Deixe que a migrao do azul de bromoIenol atinja o Iim do gel de resoluo.
10. Desligue a Ionte de energia, desligue os electrodos, remova a tampa da cmara, despeje
a soluo de electroIorese, e remova a sanduiche retirando as respectivas molas.
11. Com o auxilio de um espaador (ou de qualquer outro objecto de plstico), separe as
duas placas (a de vidro e a de alumina).

Colorir as protenas no gel

1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo soluo corante com azul de
Coomassie.
2. Deixe a corar durante 15-20min.
3. Retire o gel para outra caixa contendo agua destilada. Escorra a agua e lave novamente
com agua destilada.
4. Escorra a agua e adicione soluo descorante. Agite durante 5-10min.
5. Repita o ponto anterior ate observar nitidamente as bandas correspondendo as varias
proteinas.
6. Coloque o gel sobre um pedao de papel de Iiltro grosso (3MM), cubra com 'LarIilm e
seque no secador de geis.


MARCADOR DE PESO MOLECULAR

LMW (BioRad) 97,0; 66,0; 45,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa




TP2 - CARACTERIZAO CINTICA DA ENZIMA INVERTASE




Introduo
A enzima invertase (beta-IructoIuranosidase) catalisa a hidrolise da sacarose nos seus dois
monomeros constituintes: glucose e Irutose. Existem actualmente varias aplicaes industriais
desta enzima, sobretudo na industria alimentar, onde a enzima usada tem origem na levedura.
No presente trabalho experimental ira proceder-se a caracterizao cinetica da enzima, para
o que se estudara o eIeito da concentrao do substrato (sacarose) na actividade da enzima.

Parte experimental
Executar o seguinte ensaio para cada uma das solues de sacarose
1.- Medir 25ml de soluo de sacarose para o reactor, e termostatiza-la a 45C com agitao
(basta esperar cerca de 5 minutos). Executar os ensaios por ordem crescente de
concentrao da sacarose.
2.- Preparar o numero de tubos de ensaio requeridos para cada ensaio, marcando os tubos e
colocando em cada 0,5ml do reagente de DNS.
3.- Retirar uma amostra de 0,5ml do reactor, correspondente ao tempo zero, para um tubo de
ensaio ja preparado.
4.- Adicionar ao reactor 0,5ml da soluo de invertase, marcando simultaneamente o inicio da
contagem do tempo.
5.- Retirar amostras de 0,5ml do reactor de minuto a minuto ate se completarem 7 minutos de
reaco. As amostras devem ser colocadas nos tubos de ensaio que ja contm reagente de
DNS.
6.- Imediatamente apos a adio de 0.5ml de amostra ao DNS no tubo de ensaio, este deve ser
coberto com uma tampa solta e colocado no banho de agua a 100C durante 5 minutos.
7.- Ao Iim dos 5 minutos os tubos devem ser arreIecidos em agua Iria.
8.- Adicionar 5ml de agua destilada a cada tubo arreIecido.
9.- Agitar cada tubo no vortex.
10.- Ler a densidade optica de cada soluo a 540nm, contra um branco de tampo acetato pH 4.5
que soIreu o mesmo tratamento.

Solues fornecidas:
Solues de substrato (sacarose) a 15, 30, 45, 60, 75 e 100 g/L. Estas solues esto preparadas
em tampo acetato 20mM pH 4,5, contendo 1 (p/v) de cloreto de calcio.
Soluo enzimatica (invertase (0.5mg/ml) em tampo acetato a pH 4,5)

Recta de calibrao (DNS)
1.- A partir de uma soluo de 1.0 g/L de glucose em tampo acetato 20mM pH 4,5, eIectuar
diluies para 0.8 g/L, 0.6 g/L, 0.4 g/L e 0.2 g/L de sacarose no mesmo tampo (preparar
2ml de cada diluio).
2.- Aplicar o metodo do DNS a estas 5 solues padro e traar a recta de calibrao obtida. O
metodo consite na execuo do protocolo acima indicado substituindo as solues de
sacarose pelas de glucose.

Tratamento dos resultados
1.- Determinar as velocidades iniciais de reaco, para cada concentrao inicial de sacarose,
para o sistema ensaiado.
2.- Calcular as constantes cineticas, atraves da representao graIica de Lineweaver-Burk.
3.- Comentar os resultados obtidos

TP3.- Extraco do DNA cromossmico de Escherichia coli e clculo da sua
concentrao. Extraco rpida e em pequena escala de DNA plasmdico
(mtodo da lise alcalina).



Os cromossomas de procariotas so geralmente moleculas circulares covalentemente
Iechadas, embora em alguns casos se tenham observado cromossomas lineares. O tamanho de
um cromossoma bacteriano varia entre algumas centenas de kb (1 kb 1000 pares de base)
(7,8 x 10
5
para Mvcoplasma pneumoniae) e aproximadamente 10000 kb (9,5 x 10
6
para
Mvxococcus xanthus), contendo cada celula apenas uma copia. O cromossoma bacteriano
contem genes essenciais para as diversas Iunes celulares e ainda genes especiIicos da
especie. Devido a inexistncia de membranas celulares internas em bacterias, o DNA
cromossomico encontra-se agregado numa regio citoplasmatica a qual se denominou
nucleoide. Para alem do cromossoma, as celulas bacterianas apresentam ainda outros
elementos geneticos tais como plasmideos, transposes, elementos de insero e virus.
Plasmideos de ocorrncia natural apresentam uma variao de tamanho entre 1 kb e
algumas centenas de kb. Possuem replicao autonoma e a maioria deles so circulares,
embora algumas especies bacterianas apresentem plasmideos lineares. Os plasmideos contm
genes essenciais para a sua manuteno na celula (iniciao e controlo da replicao) e ainda
genes que em determinados ambientes, conIerem vantagem selectiva ao hospedeiro. Assim,
os plasmideos podem ter genes que conIerem resistncia a antibioticos, responsaveis por
processos de virulncia, toxinas, produo de antibioticos, sistemas de modiIicao/restrio,
vias metabolicas degradativas, induo de tumores em plantas ou a Iixao de azoto. Pode-se
aIirmar que os plasmideos de ocorrncia natural so os responsaveis pela grande variedade
Iisiologica em bacterias. A partir destes elementos geneticos naturais, e possivel por
manipulao genetica, construir no laboratorio vectores de clonagem, os quais so depois
utilizados como veiculos para clonagem de genes. Estes elementos geneticos, contem de um
modo geral, entre outros, um local de clonagem com diIerentes locais unicos para
determinadas enzimas de restrio, um ou mais genes que codiIicam para enzimas que
conIerem resistncia a antibioticos e regies promotoras.
Neste trabalho laboratorial pretende-se extrair o cromossoma (trabalho 3A) e dois
plasmideos/vectores de clonagem (pET29b e pUgdG) (trabalho 3B) da estirpe Escherichia
coli HB101 e sua posterior restrio (trabalho 4A) e visualizao apos separao dos
Iragmentos de DNA em gel de agarose (trabalho 4B) onde sera estimado o peso molecular
aproximado desses plasmideos.



3A- Extraco do DNA cromossmico da estirpe Escherichia coli HB101

Procedimento experimental

Diagrama para a preparao de DNA cromossmico

1 ml centriIugar Adicionar
Ressuspender 250 l
sedimento em soluo lisozima
250 l 20 sacarose
E. coli HB101 Vortex 15 min
a 37C


Adicionar TransIerir vortex Adicionar Adicionar 30 min 37C Adicionar 100 l
igual volume Iase superior 70 l acetato pronase
cloroIormio novo tubo centriIugar 300 l de sodio
10 min Ienol/cloroIormio
CentriIugar

TransIerir Adicionar 700 l centriIugar Lavar sedimento
Iase superior isopropanol a -20C
novo tubo 15 min 70

EtOH
Secar a 60
o
C
5 min
Guardar 4
o
ressuspender
em 100 l TE



1- Inocular a estirpe E. coli HB101 em 50 ml de meio LB (composio em anexo) e inocular
durante a noite a 37C com agitao.

2- Pipetar 1 ml para um tubo de microcentriIuga e centriIugar 3 minutos a 13000 rpm. Remover
completamente o sobrenadante e adicionar 250 l de uma soluo 20 de sacarose em
tampo TE. Ressuspender por vortex.

3- Adicionar 250 l de uma soluo de lisozima (5 mg/ml em tampo TE) e misturar
cuidadosamente. Incubar 15 minutos a 37C.

4- Adicionar 100 l de pronase E (5 mg/ml em 10 N-lauroilsarcosine) e misturar. Incubar 30
min a 37C.

5- Adicionar 70 l de acetato de sodio 3 M (pH 5.3) e misturar.

6- Adicionar seguidamente 300 l de Ienol/cloroIormio/alcool isoamilico (25:24:1). Misturar e
centriIugar 10 min. Recolher a Iase aquosa (superior) novo tubo. Repetir o passo 6.

7- A Iase aquosa recolhida, adicionar 300 l de cloroIormio/alcool isoamilico. Misturar e
centriIugar.

8- TransIerir a Iase aquosa (superior) para um novo tubo e precipitar o DNA cromossomico por
adio de 700 l de isopropanol (mantido a -20C) e misturar ate aparecimento do DNA.
CentriIugar 15 min e remover o sobrenadante.

9- Lavar o sedimento de DNA cromossomico com 500 l de etanol a 70. CentriIugar durante
5 min, remover o sobrenadante e secar o DNA a 60C durante 5 minutos.

10- Ressuspender o sedimento de DNA cromossomico em 100 l de tampo TE (10 mM Tris.Cl
pH 8.0; 1 mM EDTA). Conservar a 4C ate posterior utilizao.




3B- Extraco do DNA plasmdico da estirpe Escherichia coli HB101
recorrendo tcnica da lise alcalina


Existem varios metodos de extraco de DNA plasmidico. O metodo utilizado neste
trabalho consiste numa modiIicao do metodo de Birmboin & Doly (1979). O processo
inicia-se pelo crescimento das celulas ate inicio da Iase estacionaria. Segue-se a recolha do
sedimento de celulas por centriIugao e a sua ressuspenso numa soluo contendo glucose e
lisozima e adio de uma soluo de hidroxido de sodio e SDS (dodecil sulIato de sodio). Este
tratamento provoca a lise celular, dissoluo da membrana plasmatica, desnaturao de
macromoleculas (proteinas e DNA) e hidrolise do RNA. Adiciona-se ento uma soluo de
acetato de potassio (KAc) 3M (pH4,5) que promove a precipitao do complexo SDS-
proteinas. O pH acido da soluo KAc permite ainda neutralizar o pH do lisado, Iortemente
alcalino devido a presena de NaOH. Este reequilibrio do pH leva a renaturao do DNA
plasmidico, restabelecendo a sua conIormao original. Contudo, o DNA cromossomico,
devido as suas dimenses, no consegue voltar a sua Iorma nativa, permanecendo sob a Iorma
de agregados complexos. Apos a adio do KAc, e pois possivel, por centriIugao, separar
um sedimento constituido por membranas, proteinas e DNA cromossomico de um
sobrenadante onde o DNA plasmidico se encontra dissolvido. Uma desproteinizao mais
proIunda desse sobrenadante e posteriormente levada a cabo utilizando uma mistura de Ienol-
clorIormio de modo a obter DNA plasmidico suIicientemente puro e assim adequado a servir
de substrato para as enzimas de restrio. Por Iim, o DNA plasmidico e precipitado com
etanol, seco, e ressuspenso em tampo TE.

Birnboin, H.C., & Doly, 1. 1979. A rapid alkaline extraction procedure Ior screening
recombunant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.


Procedimento experimental


Diagrama para a preparao de DNA plasmdico (mtodo da lise alcalina)

1 ml centriIugar 5 min Adicionar
Ressuspender 200 l
Sedimento em em gelo soluo II
200 l soluo I
E. coli HB101/pET 29b Vortex
E. coli HB101/pUgdG 5 min
Temp amb

Adicionar TransIerir vortex Adicionar TransIerir 10 min gelo Adicionar 200 l
igual volume Iase superior sobrenadante soluo III
cloroIormio novo tubo centriIugar igual volume novo tubo CentriIugar
Ienol/cloroIormio
CentriIugar

TransIerir Adicionar colocar 15 min centriIugar Lavar sedimento
Iase superior 70

EtOH
novo tubo 500l EtOH a -70
o
C
Secar a 60
o
C
5 min
Guardar 4
o
C ressuspender
em 50 l TE


1- Inocular as estirpes E.coli HB101 contendo os plasmideos pET29b e pUgdG, em 50 ml de
meio LB (composio em anexo) e incubar durante a noite a 37
o
C com agitao.

2- Pipetar 1 ml para um tubo e centriIugar 3 minutos a 15000 rpm, 4 C. Remover
completamente o sobrenadante e adicionar 200 l de soluo I (50 mM glucose, 10 mM
EDTA, 25 mM Tris.Cl pH 8; 10 mg/ml lisozima) e ressuspender. Incubar 5 min em gelo.

3- Adicinou 200 l de soluo II (0,2 M NaOH; 1 SDS). Misturar suavemente por inverso
do tubo e coloca-lo durante 10 min a temperatura ambiente.

4- Adicionar 200 l de soluo III (3 M acetato de potassio pH 4,5 ajustado com acido
acetico glacial). Misturar por inverso do tubo e coloca-lo durante 10 min em gelo.

5- CentriIugar o lisado durante 15 min a 15000 rpm, 4
o
C. TransIerir o sobrenadante para
novo tubo e adicionar um volume igual de Ienol/ cloroIormio/ alcool isoamilico (25: 24:
1). Vortex e centriIugar durante 5 min.

6- TransIerir a Iase aquosa (superior) para um novo tubo e adicional um volume igual de
cloroIormio: alcool isoamilico (24:1). Vortex e centriIugar durante 5 min.

7- TransIerir a Iase superior aquosa para um novo tubo. Precipitar o DNA plasmidico por
adio de 500 l etanol absoluto colocado a -20
o
C. Deixar 15 min a -70 C. CentriIugar 15
min a 4 C e remover o sobrenadante.

8- Lavar o sedimento de DNA plasmidico com 500 l de etanol a 70.

9- Separar o precipitado por centriIugao (15000 rpm, 5 min), remover o sobrenadante e
secar o DNA plasmidico a 60C durante 5 min.

10- Ressuspender o sedimento de DNA em 50 l de tampo TE (10mM Tris.Cl, pH8; 1 mM
EDTA). Conservar a temperatura de 4C ate posterior utilizao.

TP4. - Digesto do DNA cromossmico e plasmdico com endonucleases de
restrio; separao e visualizao de fragmentos de restrio por
electroforese em gel de agarose.


4 A- Restrio do DNA cromossmico e dos plasmdeos pUC19 e pSUP102
de E. coli HB101 por aco de endonucleases


Endonucleases so enzimas que reconhecem sequncias especiIicas de bases no DNA
e so capazes de hidrolisar as cadeias de DNA. Uma vez que essa hidrolise ocorre em ambas
as cadeias, os sistemas de reparao celular no Iuncionam, permitindo dessa Iorma a
destruio de acidos nucleicos invasores (ex: virus). Para alem da sua Iuno protectora na
celula, as enzimas de restrio tm tambem extrema importncia em investigao cientiIica,
nomeadamente em processos de clonagem de genes, execuo de mapas de restrio ou a
determinao do tamanho de moleculas de DNA.


Procedimento experimental

plasmdeos
pET29b/pUgdG
DNA cromossmico
DNA 5 l 10 l
Tampo do enzima 1x 2 l 2 l
gua 12 l 7 l
Enzima de restrio
HindIII
1 l 1 l


1- Adicionar em cada tubo de microcentriIuga os volumes indicados na tabela anterior, com
a seguinte ordem: DNA (plasmidico ou cromossomico), tampo da enzima 1x, agua e
Iinalmente a enzima de restrio.

2- Misturar cuidadosamente e incubar a 37C durante 1h.

3- Guardar a -20C ate posterior utilizao.


4B- Visualizao do DNA cromossmico e plasmdico por electroforese em
gel de agarose


ElectroIorese e uma tecnica onde moleculas com carga so capazes de migrar por
aplicao de um campo electrico, sendo a sua separao eIectuada com base no peso
molecular. A separao de acidos nucleicos que se encontram carregados negativamente
(grupos IosIato) e eIectuada geralmente em geis de agarose. A agarose Iorma uma matriz
porosa (cujo tamanho do poro pode ser controlado) e atraves do qual as moleculas de acidos
nucleicos migram a uma velocidade principalmente dependente da massa (pb) e conIormao
das moleculas. A velocidade de migrao depende ainda da sua composio nucleotidica, da
concentrao da matriz de agarose utilizada, do campo electrico aplicado ao sistema (V/cm) e
ainda da composio do tampo utilizado na electroIorese.
Apos migrao dos acidos-nucleicos em gel de agarose, e possivel visualizar estas
moleculas, imergindo o gel numa soluo de brometo de etideo, pois este composto intercala-
se nas suas cadeias e e Iluorescente quando irradiado com radiao ultravioleta, permitindo
desta Iorma a sua deteco.

Procedimento Experimental

Dissolver deixar verter numa solidiIicar colocar gel adicionar
0,8 g agarose Iorma com tina
TAE 1x por arreIecer pente electroIoretica TAE 1x
Iervura

Colocar 2 h mergulhar 15 min visualizao
amostras gel gel soluo plasmideos IotograIar
100 V TAE com brometo com luz UV
etideo


DNA plasmidico com ou sem restrio 2 l corante
DNA cromossomico com ou sem restrio 2 l corante
1 l padro DNA 2 l corante



1- Preparar um gel de agarose com concentrao de 0,8 em tampo TAE (1x) (composio
deste tampo em anexo). Apos suspenso da agarose no tampo, Ierver ate obter uma
mistura homogenea. ArreIecer ate 50 C antes deitar a mistura liquida dentro do molde
contendo um pente de 8 dentes de modo a Iormar 8 cmaras com a possibilidade de
aplicao de 25 l da soluo de DNA. Deixar solidiIicar o gel durante ~ 30 min.

2- Remover cuidadosamente o pente e colocar o gel (ainda sobre o molde) na tina horizontal
de electroIorese e encher a unidade com tampo TAE (1x) ate que o nivel do tampo
cubra e ultrapasse em 1 mm a superIicie do gel.

3- Aplicar em cada uma das cmaras presentes no gel, as amostras de DNA cromossomico e
plasmidico, onde se adicinou previamente 2 l de uma soluo corante com elevada
densidade (40 sacarose; 0,25 azul de bromoIenol; 0,25 xilenocianol). Como
reIerncia aplicar tambem uma amostra contendo uma mistura de Iragmentos de peso
molecular conhecido (1 kb DNA ladder) (ver anexo).

4- Iniciar a electroIorese por aplicao de um campo electrico (100 V) (no esquecer que os
acidos nucleicos migram para o nodo).

5- Apos separao electroIoretica, colocar o gel numa soluo de brometo de etideo (1
mg/ml) preparada em tampo TAE 1 x, durante 15 min.

6- Retirar o gel do tampo anterior usando luvas (o brometo de etideo e cancerigeno) e
remover o liquido em excesso.

7- Visualizar o DNA plasmidico pela Iluorescncia emitida pelo brometo de etideo a estes
associado, quando irradiado com radiao UV (cuidado: usar oculos para UV).

8- FotograIar o gel sob radiao ultravioleta.


TP5. - Western Blot; Deteco imunolgica da protena UgdG de
Sphingomonas elodea ATCC 31461

Uma proteina especiIica pode ser identiIicada, apos Iraccionamento em gel de poliacrilamida,
por ligao a um anticorpo especiIico. Este anticorpo especiIico e, muitas vezes acoplado a
um composto radioactivo ou a um composto Iluorescente de modo a permitir a sua deteco.
Este processo e realizado apos todas as proteinas separadas no gel terem sido transIeridas para
uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF. Este metodo de deteco e identiIicao de
proteinas e denominado 'Western Blot. A tecnica e extremamente sensivel e no requer que
a proteina alvo se encontre marcada radioactivamente como ocorre em outras tecnicas de
identiIicao. Como a separao electroIoretica das proteinas e quase sempre realizada sob
condies desnaturantes, limitaes no que se reIere a solubilizao das proteinas, sua
agregao e co-precipitao com proteinas alvo, so eliminadas. No entanto cada anticorpo
pode reconhecer preIerencialmente uma conIormao particular do seu epitopo alvo.
Consequentemente nem todos os anticorpos monoclonais podem ser utilizados como sonda na
realizao de western blots, onde as proteinas alvo esto desnaturadas. Os soros policlonais,
por outro lado, consistem numa mistura de imunoglobulinas indeIinida, cuja especiIicidade,
aIinidade e concentrao so muitas vezes desconhecidas. Consequentemente, so mais
adequados a realizao de western embora no seja possivel prever a eIicincia com que
detectaro os epitopos correspondentes.
Nos Western blots as amostras a analisar so solubilizadas com detergentes e agentes
redutores, separados por SDS-PAGE e transIeridos para um suporte solido (normalmente uma
membrana de nitrocelulose) que pode ser corada. O Iiltro e depois incubado com anticorpos
especiIicos para a proteina alvo (anticorpos primarios). Por Iim o anticorpo primario ligado a
proteina e detectado normalmente por recurso a reagentes imunologicos secundarios.
A quantidade minima de proteina que se consegue detectar por Western blotting e
aproximadamente de 1-5 ng.
DeIine-se luminescncia como a emisso de luz resultante da dissipao da energia de uma
substncia num estado excitado. Na quimioluminescncia, a excitao e resultante de uma
reaco quimica. As reaces quimicas das diacilhidrazidas ciclicas, tais como o luminol, tm
sido extensivamente utilizadas em analise quimica e por isso extensivamente estudadas. Um
dos sistemas sobre o qual existe mais inIormao e o da oxidao catalizada do luminol pelo
HRP/peroxido de hidrogenio, em condies alcalinas. Imediatamente a seguir a oxidao, o
luminol Iica num estado excitado que emite luz ao decair. Pode-se ampliar a reaco
realizando-se a oxidao do luminol pela HRP (Horse Radish Peroxidase) na presena de
Ienois. O eIeito Iinal e um aumento, aproximadamente de 1000x, da emisso de luz e um
periodo de emisso mais extenso. A luz resultante desta reaco de quimoluminiscncia tem
um pico entre 5-20 minutos apos o seu inicio, decaindo depois lentamente com um tempo de
semi-vida de aproximadamente 60 minutos. A emisso maxima de luz da-se a um
comprimento de onda de 428 nm, podendo assim ser detectada por exposio a Iilme de
autoradiograIia sensivel ao azul.
A utilizao da quimioluminescncia em western blots Iornece um metodo sensivel e rapido,
que substitui eIicazmente os metodos radioactivos, que tm uma sensibilidade pouco melhor e
so muito mais demorados (exigem a exposio do Iilme de autoradiograIia durante varios
dias). Na realizao dos western blots, os antigenios imobilizados na membrana so
detectados com anticorpos conjugados directa ou indirectamente com a HRP.

Transferncia das protenas do gel para a membrana

1 Apos a separao das proteinas em gel de poliacrilamida, equilibre o gel em tampo de
transIerncia durante 15 minutos.

2 Usando luvas, corte 6 pedaos de papel Whatman 3MM e uma Iolha de membrana PVDF
ao tamanho do gel.

3 Coloque a membrana de PVDF em metanol puro para a tornar hidroIilica (visivel pela
mudana de cor da membrana).

4 Molhe a membrana de PVDF, e as Iolhas de papel 3MM em tampo de transIerncia
durante 10 minutos.

5 Usando luvas monte o aparelho de transIerncia:
a) Sobre o electrodo inIerior (nodo) coloque 3 Iolhas de papel 3MM impregnadas em
tampo. Tenha o cuidado de evitar que Iiquem entre as Iolhas bolhas de ar.
b) Coloque a membrana de PVDF sobre as Iolhas de papel 3MM.
c) Coloque o gel de poliacrilamida sobre a membrana de PVDF.
d) Coloque sobre o gel as restantes Iolhas de papel 3MM impregnadas em tampo.
Evite novamente as bolhas de ar.
e) Coloque o electrodo superior (catodo).
I) Coloque a tampa de segurana do aparelho. Ligue a uma Ionte de tenso. Numa
transIerncia, a polaridade devera ser do catodo para o nodo. Seleccione o valor de
10-15V durante 30 minutos.

6 No Iinal da transIerncia desligue a Ionte, retire a tampa, despreze as Iolhas de papel
3MM e recolha a membrana de PVDF, na qual as proteinas apos transIerncia a partir do gel,
se encontraro covalentemente ligadas.

Deteco da protena recombinante UgdG transferida para a membrana

1 Proceda ao bloqueio da membrana com 50 ml de PBST leite em po magro 10 (p/v),
durante 30 minutos.

2 Lave a membrana com 20 ml de PBST leite em po 5, durante 5 minutos.

3 Incube a temperatura ambiente e por um periodo de 1 hora a membrana com o anticorpo
primario, diluido 1:1000 em PBST leite em po 5.

4 Proceda a lavagem da membrana com 15 ml de PBST leite em po 5, durante 10
minutos. Repita a operao duas vezes.

5 Incube a membrana com o anticorpo secundario durante 1 h, a temperatura ambiente. O
anticorpo secundario devera ser diluido 1:3000 em PBST leite em po 5.

6 - Proceda a lavagem da membrana com 15 ml de PBST, durante 10 minutos. Repita a
operao duas vezes. Por Iim proceda a remoo do liquido da membrana por escorrncia.

7 Coloque a membrana sobre papel celoIane e proceda a sua impregnao com os reagentes
de deteco.

8 Apos este periodo de incubao, escorra o liquido de deteco e coloque a membrana
sobre papel celoIane, numa cassete para exposio com um Iilme. Para tal proceda a esta
ultima operao na cmara escura.

9 Apos exposio da membrana ao Iilme IotograIico durante 1 minuto, proceda na cmara
escura a sua revelao. Para tal coloque o Iilme na soluo de revelador (1-3 minutos), lave de
seguida com agua corrente e Iinalmente proceda a sua Iixao durante 5 minutos.



ANEXO

Meio LB (g/l)

- 10 g Peptona
- 5 g Extracto de levedura
- 5 g NaCl

Tampo TAE (50x) (TP4)

-242 g TRIS base
-57,1 ml acidi acetico glacial
-100 ml de soluo de EDTA 0,5 M (pH 8.0)
-H
2
O ate 1 litro
Ajustar o pH a 8,0.

Padro de pesos moleculares (TP4)




Tampo de transferncia (TP5):
Glicina 39 mM
Tris base 48 mM
SDS 0.037
20 metanol
(para preparar um litro de tampo (pH 8.3) misture 2,9 g de glicina, 5,8 g de Tris base, 0,37 g
de SDS e 200ml de metanol)

PBST :
PBS 0,5 Tween 20

Mapa de restrio