Sunteți pe pagina 1din 15

TETRACICLINE

Curs 5
5. BIOTEHNOLOGIA DE OBINERE A
TETRACICLINELOR
Tetraciclinele constituie una din grupele de antibiotice deosebit de apre-
ciate din punct de vedere terapeutic. Primul antibiotic din aceast grup,
clortetraciclina, a fost izolat din culturi de Streptomyces aureofaciens de Duggar
n 194 !i introdus n terapeutic n anul 194". #$itetraciclina a fost izolat ceva
mai t%rziu &'ane, (inla), *obin, 1949+, din lic,idele de fermenta-ie a unei tulpini
de Streptomyces rimosus. Tetracilina descoperit n 19. a fost ob-inut ini-ial
prin ,idrogenerarea selectiv a clortetraciclinei, iar mai t%rziu prin fermenta-ia n
profunzime a microorganismului Streptomyces aureofaciens.
/n ultimul timp se studiaz intens tetraciclinele de semisintez carac-
terizate printr-o ac-iune terapeutic superioar tetraciclinelor naturale. Dintre
compu!ii introdu!i n terapeutic se men-ioneaz minocilina, solvocilina !i 0-
metileno$itetraciclina.
Datorit spectrului larg de ac-iune, to$icit-ii sczute, lipsei generale a
fenomenelor secundare, tetraciclinele constituie antibioticele cu cea mai larg
1utilizare1 terapeutic, consumul lor reprezent%nd 2 din consumul total de
antibiotice.
Tetraciclinele ac-ioneaz asupra germenilor gram-pozitivi &streptococi,
pneumococi, stafilococi+, gram-negativi &brucele, s,igele+, asupra virusurilor !i
asupra unor protozoare. 3le se prezint sub form de pulberi cristaline,
galbene, indore, amorfe, insolubile n ap sub form de baze, solubile sub
form de clor,idra-i. /n solu-ii apoase se inactiveaz la pH sub . !i peste ",
stabilitatea ma$im fiind n intervalul de pH cuprins ntre 4 !i .
5.1. Structura i activitatea tetraciclinelor
*tructura c,imic a tetraciclinelor s-a stabilit prin reac-ii de degradare n
mediu bazic, acid sau reductor. 3le con-in un sistem ciclic de patru inele
condensate liniar, corespunztor sc,eletului ,idronaftacenului &s-a ob-inut
naftacen, 44, prin distilare cu pulbere de zinc+.
Dup stabilirea naturii !i locului diferi-ilor substituien-i n molecul, s-a
atribuit tetraciclinelor de biosintez &4+ urmtoarele structuri5
R
1
HO R
2
R
3
N(CH
3
)
2
OH
CONH
2
O OH O OH
OH
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
4a 5a
11a 10a 12a
6a
A
B C D
I
II
6lortetraciclina 71 7. 78
#$itetraciclina 6l 698 9
Tetraciclina 9 698 #9
0 - Demetiltetraciclina 9 9 9
0 : Demetil : ; : clortetraciclina 6l 9 9
99
TETRACICLINE
Curs 5
Dup cum se vede, clortetraciclina con-ine un atom de clor n inelul D
pozi-ia ;, o$itetraciclina con-ine un ,idro$il n nucleul B pozi-ia , iar tetraciclina
are o structur mai simpl, fr ,alogen n pozi-ia ; !i fr ,idro$il n .
Tetraciclinele pot suferi unele modificri structurale fr pierderea acti -
vit-ii. <stfel, eliminarea grupelor func-ionale din pozi-iile , 0, ; nu afecteaz
activitatea fiziologic, iar nlocuirea grupei -#9 de la 6
0
din tetraciclin !i
o$itetraciclin cu un atom de ,idrogen, are repercusiuni nensemnate asupra
activit-ii.
6ompusul cel mai simplu din seria tetraciclinelor, care mai pstreaz nc
activitatea antibacterian, este 0-deso$i-demetiltetraciclin, care nu mai con-ine
nici o grup func-ional la atomii de carbon din pozi-iile , 0, ;. <ctivitatea
antibacterian este influen-at de modificrile sterice !i de pozi-ia anumitor
substituien-i. Prin eliminarea o$idrilului din pozi-ia =1. a1 se ob-ine =1. a1-
deso$itetraciclina inactiv, iar des,idratarea grupei .-carbo$iamidic duce la
tetraciclino-nitrili cu slab ac-iune fiziologic. >itrilii reac-ioneaz cu morfolin,
piperidin, pirolidin, aminoacizi &lizin+ d%nd produ!i solubili, cu activitate
antibacterian !i propriet-i terapeutice apreciabile.
5.. Bio!inte"a tetraciclinelor
6unoa!terea mecanismului de biosintez a antibioticelor din aceast
grup este una din problemele cele mai interesante sub raport teoretic !i practic
deoarece permite gsirea posibilit-ilor de diri?are a procesului spre formarea n
e$clusivitate a antibioticului urmrit. 6u toate eforturile depuse, problema nu
este complet elucidat. Pentru elucidarea mecanismului de biosintez a
antibioticelor ciclice, mul-i cercettori se spri?in pe teoria acetic a lui 6ollie !i
@irc,, conform creia moleculele acidului acetic se unesc ntre ele dup
modelul =cap-coad1 !i apoi se ciclizeaz prin condensare aldolic &'leisen+.
@irc, a descris sc,ema ipotetic de formare a sistemelor ciclice simple prin
urmtorul mecanism5
R COOH+ CH
3
COOH + + CH
3
COOH CH
3
COOH
- H
2
O
R CO CH
2
CO CH
2
CO CH
2
COOH
H
2
R CO CH
2
CH CH
2
CO CH
2
COOH
OH
OH
COOH
HO
R
COR
OH
HO
III
IV
V
VI
OH
OH
OH
OH
COR
HO
R
AA
Dac condenseaz un numr mai mare de unit-i acetice se ob-in com-
bina-ii mai comple$e. Pentru confirmarea ipotezei de mai sus, s-a introdus n
100
TETRACICLINE
Curs 5
mediul de cultur a microorganismelor productoare de tetracicline acid acetic
cu carbon marcat !i apoi s-au studiat produsele de descompunere a
o$itetraciclinei formate. *tudiile efectuate cu acid acetic marcat au dus la
concluzia c acidul acetic este precursor n biosinteza tetraciclinelor.
6arbonul marcat din grupele metilice ale acidului acetic se regse!te n
molecula o$itetraciclinei n pozi-iile ., 4, , 0, ;, 9, 1B a, 11a, 1.a, iar carbonul
din grupele carbo$ilice n celelalte pozi-ii &1, 8, 4a, a, etc+5
R
1
HO
R
2
R
3
N(CH
3
)
2
OH
CONH
2
O OH O
OH
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
4a 5a
11a 10a 12a
6a
A
B C D
OH
H
H
CH
3
COOH
Streptomyces
aureofaciens
Datorit faptului c radioactivitatea inelului A este mai mic, s-a emis
ipoteza c acest inel este format din acid glutamic !i acid acetic, conform
urmtoarei sc,eme5
RO
O
C
CH
3 RO
CH
3
CH
2
O
C
RO
CH
3
O
C
RO
CH
O
C
NH
2
COOR
CH
2
OR HC
3
O
C
OR HC
3
O
C
OR HC
3
O
C
OR HC
3
O
C
2 acetati + 2 acetati + 2 acetati + 1 acetat +
1 glutamat
7ezultatele au artat c nici acidul glutamic nu e$plic scderea
radioactivit-ii inelului A. 7ecent s-a reu!it a se separar cu mutante un produs
numit demetil-policetidamida &C44+, care supus apoi unor prelucrri ulterioare a
condus la pretetramid &C444+ &nucleul de baz din tetracicline+ !i la protetron
&4D+5
101
TETRACICLINE
Curs 5
O O O
OH
OH
O
O
O O O O
NH
2
S - enim!
VII
Ciclizare prin aldolizare si
acilare intermolecular
Calea normal a
metabolismului
OH
OH OH OH
OH
CONH
2
VIII
IX
Ciclizare prin aldolizare si
acilare intermolecular
OH OH
OH
S - enim!
NH
2
O
O
O
+ H
2
O" O
2
- enzim
O OH
OH
NH
2
O O
O
O
OH
Protetron
Din protetron &4D+ se poate trece u!or la pretetramid sau produ!i nru-
di-i, prin urmtoarele reac-ii5
O OH
OH
NH
2
O O
O
O
OH
H
#

r
e
f
l
u
x
H$% sau
fenol
Z
n

p
u
l
b
e
r
e
OH
OH OH OH
OH
CONH
2
VIII
O OH
OH
CONH
2
OH
O
OH
X
XI
*tructura protetronei arat c gruparea carbo$iamidic se formeaz ntr-
un stadiu timpuriu !i c policetidamida are structura propus mai sus.
6alea de biosintez de la pretetramid la tetraciclin are un fundament
e$perimental temeinic.
Prepararea unui mare numr de deriva-i de pretetramid a permis
testarea lor privind posibilit-ile transformrii, prin procedee bioc,imice, n
tetracicline. 7ezultatele ob-inute au dus la concluzia c pretetramidele cons-
102
TETRACICLINE
Curs 5
tituie intermediari n biosinteza tetraciclinelor, iar gruparea carbo$iamidic !i
grupa 0-metil este introdus n caten naintea ciclizrii nucleului naftacenic.
Dovada principal c 0-metilarea precede ciclizarea, o constituie faptul
c ob-inerea antibioticului 0-metilat depinde de prezen-a sau absen-a metilului
n pozi-ia 0, n deriva-ii de pretetramid. Prezen-a substituientului ;-clor n
antibioticul ob-inut &clortetraciclin+ prin transformarea unei pretetramide poate fi
e$plicat fie prin folosirea unui derivat clorurat de pretetramid, fie prin folosirea
unui mutant care are capacitatea, genetic determinat, de clorurare. Dac se
pleac de la o pretetramid neclorurat !i se folose!te un mutant de clorurare
se ob-ine clortetraciclin, fapt ce demonstreaz c procesul de clorurare are loc
dup stadiul de formare a pretetramidei.
6onfirmarea faptului c intermediarii naftacenici sunt ntr-adevr impli ca-i
n biosintez normal a tetraciclinei, s-a ob-inut !i prin descoperirea unei 4-
,idro$i-0-metilpretetramide &D44+, a crui structur a fost stabilit folosind
reac-iile de o$idare !i reducere n diverse condi-ii &sc,ema 4+.
O OH
OH
CONH
2
O
OH
OH
OH
Cl
CH
3
N(CH
3
)
2
I
S. aureofaciens
OH OH OH OH
CONH
2
OH
OH CH
3
XII
O O
OH
O
CH
3
XV
OH
Rapid
H
2
O
2
+ NaOH
OH OH OH OH
CONH
2
OH
CH
3
XIII
H
&
"

f
e
n
o
l


R
e
f
l
u
x
H
2 O
2
+

N
a
O
H
N
a
O
H

+

O
2

l
a

c
a
l
d











R
a
p
i
d
H
2
O
2

+

N
a
O
H
L
e
n
t
O
CH
3
OH
COOH
COOH
XIV
Schema I
Prin reducere cu 94, la fierbere n fenol se ob-ine 0-metilpretetramid &D444+
care se o$ideaz rapid n solu-ie alcalin, la aer, ntr-o c,inon &DC+, iar
aceasta la r%ndul ei se o$ideaz u!or cu 9
.
#
.
n mediu alcalin la acid antro-
103
TETRACICLINE
Curs 5
dicarbo$ilic 1B,1B-disubstituit &D4C+, 4-,idro$ipretetramidele prezint interes prin
faptul c sugereaz calea prin care gruparea 4-dimetil-amino este introdus n
ciclu. /n continuare se red calea de trecere de la 4-,idro$ipretetramid la
tetracicline. &*c,ema 44+.
OH OH OH OH
CONH
2
OH
OH CH
3
XII
O
2
12a
OH OH O O
CONH
2
OH
O CH
3
XVI
Cl
2
OH
XVII
VIII
OH OH O O
CONH
2
OH
O CH
3
Cl
OH
NH
3
OH OH O O
CH
3
Cl
OH
H NH
2
CH
3
&
OH OH O O
CH
3
Cl
OH
H
NH
CH
3
&
CH
3
OH
CONH
2
OH OH O O
CH
3
Cl
OH
H
N(CH
3
)
2
OH
CONH
2
Schema II
Prin ,idro$ilarea produs la 6
1.a
a 4-,idro$i-pretetramidei se ob-ine 4-
ceto-dedimetilamino-an,idro-tetraciclina &DC4+, fapt ce confirm rolul ei n
procesul de biosintez a tetraciclinelor. <ceast constatare stabile!te n acela!i
timp c ,idro$ilarea la 6
4
precede ,idro$ilarea la 6
1.a
a 0-metilpretetramidei !i
c clorurarea la 6
;
are loc ntr-un stadiu ulterior ,idro$ilrii la 6
1.a
.
Din 4 : ceto : dedimetilamino - an,idrotetraciclin se poate a?unge la
tetraciclin sau la o$itetraciclin, prin urmtoarele faze5 an,idrotetraciclin
&D4D+, an,idroo$itetraciclin &DD+, de,idrotetraciclin &DD4+, tetraciclin5
104
TETRACICLINE
Curs 5
OH O O O
CH
3
OH
H
N(CH
3
)
2
OH
CONH
2
HO H
OH OH O O
CONH
2
OH
O CH
3
XVI
OH
OH OH O O
CH
3
OH
H N(CH
3
)
2
OH
CONH
2
NH
3
Tetraciclin
Oxitetraciclin
H
2
OH OH O O
CH
3
OH
H N(CH
3
)
2
OH
CONH
2
O
2
XXI XX
Toate aceste procese de metilare, aminare, o$idare, reducere sunt rea-
lizate enzimatic n procesul de biosintez.
Pentru determinarea cantitativ a tetraciclinelor se pot folosi cu succes
metode titrimetrice, spectrofotometrice, colorimetrice, electroc,imice,
refractometrice !i cromatografice.
5.#. Te$nolo%ia &e o'(inere a tetraciclinelor
Te,nologia de fabrica-ie a tetraciclinelor const n fermentarea n pro-
funzime a unor tulpini de Streptomyces aureofaciens folosind, pentru dezvol-
tarea microorganismului !i producerea antibioticelor, un mediu comple$ n a
crui compozi-ie intr, n general, surse de ,idra-i de carbon, surse de azot
&organic !i anorganic+, sruri minerale, microelemente &ioni metalici+, sti-
mulatori, in,ibitori, antispuman-i.
Procesul de fermenta-ie a actinomicetului Streptomyces aureofaciens
parcurge trei etape.
Prima etap, de cre!tere intens a miceliului, are loc ntre .B !i "B - 9B
de ore de la nsm%n-are. <ceast etap se caracterizeaz prin consum rapid
de glucoz !i asimilarea azotului.
A doua etap, care are loc ntre 9B !i 1.B de ore de la nsm%n-are, se
caracterizeaz printr-o cre!tere lent a masei microbiene !i mpr-irea miceliului
n fragmente. /n aceast perioad cantitatea de tetraciclin acumulat n lic,idul
de cultur este ma$im.
A treia etap, se caracterizeaz prin cre!terea cantit-ii de azot solubil n
mediu !i prin accelerarea u!oar a formrii de >9
8
care produce o cre!tere de
p9. <pari-ia acestei etape indic terminarea procesului de biosintez.
Streptomyces aureofaciens este capabil s utilizeze za,aroza, amidonul,
glucoza, fructoza !i galactoza, ns nu poate utiliza maltoza, lactoza, manoza !i
sorbitolul. <similarea za,rului de ctre *. aureofaciens este reglat de raportul
dintre cantit-ile de za,r !i azot din mediu. Dac acest raport este sub
valoarea optim procesul de cre!tere respira-ie !i producere de antibiotic se
desf!oar cu viteze mici, iar n final cantitatea de antibiotic biosintetizat este
mult diminuat.
105
TETRACICLINE
Curs 5
(actorul intracelular rspunztor de trecerea de la faza de cre!tere in-
tensiv !i asimilarea tuturor elementelor din mediu, la faza de producere a
antibioticului, se presupune a fi scderea acidului dezo$iribonucleic &<7>+ din
protoplasm.
Propriet-ile fiziologice ale miceliului se modific continuu !i la aceasta
contribuie !i con-inutul n fosfor al mediilor de cultur. Pe de alt parte, e$ist
suficiente date care cofirm c trecerea de la faza de cre!tere a *. aureo-
faciens la faza de biosintez a antibioticului, este determinat n mare parte de
concentra-ia fosforului n mediul de cultur. De asemenea, datele din literatur
demonstreaz ca antibioticul este biosintetizat numai de microorganismele
a?unse la maturitate, iar ntre concentra-ia fosforului, viteza de cre!tere a
biomasei !i viteza de producere a antibioticului este o str%ns corela-ie &figura
.1+.
Figura 5.1. Dependena ite!ei specifice de cre"tere a masei ce#u#are
"i a ite!ei de e#a$orare a tetracic#ine#or funcie de concentraia de fosfor "i durata fermentaiei%
4 - 10 Eg fosforFmlG 44 - 18B Eg fosforFmlG 444 - .;B Eg fosforFmlG 4C - "B Eg fosforFml.
Din figura .1 rezult c fosforul stimuleaz procesul de cre!tere a masei
celulare, dar acest efect se manifest numai p%n la o concentra-ie a fosforului
de &4B - B+ H 1B
-0
gFml, dup care viteza de cre!tere a masei celulare rm%ne
practic constant. Dac se urmre!te influen-a concentra-iei fosforului asupra
vitezei de producere a tetraciclinelor, se constat c la concentra-ii mici
stimuleaz acest proces, iar la concentra-ii mari l in,ib &figura .1, curba &'(.
6alcul%ndu-se viteza de cre!tere a masei celulare E cu ecua-ia Ionod !i viteza
de formare a tetraciclinelor ' cu ecua-ia Iic,aelis : Ienten, func-ie de
concentra-ia fosforului &substrat limitativ+ s-a demonstrat c mrind con-inutul
de fosfor de la 1B H 1B
-0
gFml la 4 H 1B
-0
gFml viteza de cre!tere a masei celulare
cre!te de la B,BB; la B,B.9 ,
-1
, iar viteza de producere a tetraciclinelor scade
106
TETRACICLINE
Curs 5
brusc la cre!terea sau mic!orarea concentra-iei de fosfor comparativ cu
valoarea optim &concentra-ia optim este 8B H 1B
-0
gFml+.
3ste interesant de remarcat faptul c viteza ma$im de producere a
tetraciclinelor se ob-ine n culturile care au viteza de cre!tere a biomasei de
B,B. - B,B8 ,
-1
&figura ..+, ceea ce corespunde unei viteze de 8 ori mai mici
fa- de viteza ma$im de cre!tere a masei celulare &tabelul .1+.
Figura 5.). Dependena dintre ite!a de cre"tere a masei ce#u#are "i
ite!a de e#a$orare a tetracic#ine#or%
a - influen-a concentra-iei fosforuluiG $ - corela-ia dintre viteza de cre!tere
a masei celulare !i viteza de elaborarea produsului
*a$e#u# 5.1. 'ite!e#e specifice de cre"tere a $iomasei "i de acumu#are a tetracic#ine#or funcie
de concentraia de fosfor +n cu#turi#e de Act. Aureofaciens
In&ici
Con&i(ii o)ti*e
)entru creterea
'io*a!ei
)entru 'io!inte"a
tetraciclinelor
Jlucoza &mgFml+
<zot amoniacal &mgFml+
(osfor &mgFml+
11,4G .B,.
B,";G B,";
0G ;B
11,BG 10,"G 11,BG 10,"
B,40G B,40G B,0"G B,0"
.G ."G 8BG .;
Citeza specific de cre!tere,
,
-1
Citeza specific de acumulare
a tetraciclinelor &KgFmgF,+
B,B;9G B,B;B
B,4BG B,4.
B,B.4G B,B.8G B,B.1G B,B.9
4,"BG 4,BG 4,4.G 4,..
Prin urmare, procesul de biosintez a tetraciclinelor trebuie condus la
viteze mici de cre!tere a masei celulare, iar aceste viteze se regleaz prin men-
-inerea concentra-iei de fosfor la valoarea de &. - 8B+ H 1B
-0
gFml.
<supra vitezei de cre!tere a masei celulare !i de producere a tetracicli -
nelor influen-eaz foarte mult !i valoarea pH-ului. Pentru orice sistem de
fermenta-ie a tetraciclinelor influen-a p,-ului poate fi descris prin una din
ecua-iile5
E L E
ma$
-
2 2
1 S S S
S
C C ! C C !
C C
+ +

&.1+
107
TETRACICLINE
Curs 5
E L E
ma$
L
S

S
S
C
!
C
C
!
!
C
+

+ +
2
1
1
&..+
E L E
ma$
L

+ + +

+ +
4
3
2
1
1 1
!
C
C
!
C
!
C
C
!
!
C

S
S
&.8+
E L E
ma$
L

O
O

S S
S
C
!
!
C !
!
C !
C
1
+

+ &.4+
E L E
ma$
L
2
1
1
2
1
+

+ + O
O

S
S
!
!
C !
!
C
!
C
C
!
!
C
&.+
n care5 ,
1,
,
)
, ,
-
, ,
.,
,
H
, ,
/H
sunt constante.
<legerea modelului matematic, care descrie cel mai corect influen-a pH-
ului asupra vitezei de cre!tere a biomasei !i de elaborare a tetraciclinelor, se
face prin corelare cu datele e$perimentale.
Figura 5.-. Dependena intensitii respiraiei , 0# 1/)2m# 3 4 "i pH-u#ui
funcie de concentraia g#uco!ei +n $iosinte!a tetracic#ine#or %
a - . mgFmlG 0 - .8 mgFmlG c - 4 mgFml
Figura 5... 'ariaia ite!ei de cre"tere a $iomasei "i de acumu#are a tetracic#ine#or funcie de
pH%
a - conform ecuaiei 55.6(7 $ - conform ecuaiei 55.8(.
108
TETRACICLINE
Curs 5
Pentru cazul n care substratul limitativ este glucoza, aceast influen-
este descris cel mai fidel de ecua-ia &.4+.
Prin determinarea concentra-iei optime a substratului &figura .8+ !i a
constantelor '
9
!i ,
/H
!i introducerea n ecua-ia &.4+ se ob-in e$presiile de
calcul a vitezei de cre!tere a biomsei !i a vitezei de formare a produsului5
E L E
ma$

C
C
1
10 6 " 16
10 6 " 16
10 64 " 5
10 64 " 5
6
6
6
6
+

&.0+
v L C

C
C
1
10 1 " 6
10 1 " 6
10 6 " 10
10 6 " 10
6
6
6
6
+

&.;+
unde5 E
ma9
: 1,.0 ,
-1
!i CL 1,10 M4Fmg miceliuF,.
7eprezentarea ecua-iilor &.0+ !i &.;+ demonstreaz c datele e$peri -
mentale se nscriu pe curbele teoretice &figura .4+, iar valorile optime ale p9-uli
pentru cre!terea biomasei !i producerea antibioticului snt cuprinse ntre 0 !i
0,;.
>ecesarul de azot pentru Streptomyces aureofaciens este furnizat de
substan-ele minerale !i compu!ii organici cu azotG se utilizeaz sruri de amo-
niu, nitra-i !i substan-e organice bogate n aminoacizi. De asemenea, n
procesul de biosintez se folosesc stimulatori de biosintez, ca de e$emplu
rodanura de benzil, care stimuleaz procesul de biosintez a clortetraciclinei
&aureomicinei+. 7odanura de benzil mre!te randamentul n clortetraciclin !i
tetraciclin la tulpinile de nalt productivitate cu B2. 3fectul acestui stimulator
este remarcabil n faza 4 de cultivare !i se caracterizeaz printr-un grad mrit de
utilizare a fosfatului !i o intensificare a respira-iei. 3fectul stimulator al rodanurii
este mai pronun-at la medii cu con-inut mai ridicat n fosfat, unde metabolismul
za,rului progreseaz rapid !i este evident numai dac se adaug la nceputul
procesului. Prin urmare, rodanura de benzil nu afecteaz direct viteza reac-iilor
enzimatice n cursul ciclului de fermenta-ie, dar produce o anumit modificare
metabolic n cursul primelor ore de cultivare.
De asemenea, s-a constatat c ionii de clor sunt aceia care diri?eaz !i
stimuleaz producerea de clortetraciclinG dac se urmre!te ob-inerea
tetraciclinei trebuie evitat prezen-a clorului. Pentru acesta ori se purific mediul
de clor, dar metoda este foarte scump, ori se folose!te un mediu adecvat, ca
de e$emplu e$tract de graminee, ob-in%ndu-se p%n la 9.2 tetraciclin, ori se
utilizeaz mutan-i ce bloc,eaz clorurarea &in,ibitori de clorurare+.
# metod mai comod este efectuarea fermenta-iei pe medii obi!nuite
dar folosind substan-e care in,ib clorurarea bioc,imic, ca de e$emplu
bromurile, iodurile !i unii compu!i cu sulf.
Parametrii optimi ai procesului de fermenta-ie a tetraciclinelor sunt5
temperatura .;N1O6, pH 0, - 0,", viteza de agitare 11B - 1.B rotFmin, aera-ie
B,0 - B," l aerFl mediuFminut, presiunea n fermentator 1,. - 1,8 ata.
Din dinamica procesului de fermenta-ie, prezentat n figura ., rezult
c durata procesului de biosintez este de 1. - 18B de ore !i coincide cu
epuizarea componentelor mediului de cultur.
109
TETRACICLINE
Curs 5
Dup terminarea procesului de fermenta-ie mediul se aciduleaz cu acid
sulfuric p%n la pH 1, - ., se filtreaz pe filtru pres, iar din lic,idul ob-inut se
separ tetraciclinele.
Pentru separarea tetraciclinelor au fost ncercate metode cromatografice,
e$trac-ia lic,id-lic,id !i e$trac-ia cu solven-i organici dintr-un comple$ al
tetraciclinei cu acizi sau baze. Dintre metodele studiate, ultima este aplicabil
pe scar industrial, deoarece ofer randamente bune.
Figura 5.5. Dinamica procesu#ui de fermentaie a tetracic#ine#or
Pentru comple$area tetraciclinei se folosesc curent acizi organici,
,e$ametafosfat, uree !i amoniac.
6omple$ul format, fiind insolubil n ap, se filtreaz pe filtru pres !i se
prelucreaz n vederea ob-inerii tetraciclinelor pure. Pentru aceasta comple$ul
se trateaz cu acid p%n la pH 1, - 1,9, pentru solubilizare, dup care se tra-
teaz cu o baz p%n la pH 4 - 4,. c%nd precipit tetraciclin brut. <ceasta se
filtreaz, se usuc !i apoi se supune e$trac-iei cu un amestec de acetat de butil-
metanol &1B51+. Din solu-ia de acetat de butil filtrat n prealabil de impurit-i,
tetraciclina se separ prin adugare de ap desalinat n propor-ie de 8B - 4B2
fa- de volumul e$tractului. Tetraciclina cristalizat se filtreaz, se spal pe filtru
cu clorur de metilen !i se usuc la 4B - 4O6. 7andamentul de ob-inere a
tetraciclinei pure din comple$ este de ; - "B2.
5.+. Deriva(i ai tetraciclinei
<dministrarea tetraciclinelor numai pe cale oral nu a permis atingerea
unor concentra-ii terapeutice n timp util, iar un tratament ndelungat cu
tetraciclin duce la tulburri gastrice, colite, urticare, eritreme etc.
6lor,idra-ii !i srurile de tetraciclin au o slab toleran- general !i
local deoarece sunt insolubile la p9-ul -esutului, conduc%nd la depuneri care
provoac leziuni. De aceea, se urmre!te ob-inerea unor deriva-i de tetracicline
110
TETRACICLINE
Curs 5
solubile la pH-ul fiziologic, cu to$icitate redus !i spectru asemntor
tetraciclinelor !i care pot fi utilizate sub form in?ectabil fr efecte secundare.
# prim clas de compu!i o constituie complec!ii metalici cu 6a, Pn, T,5
R
1
R
2
OH CH
3
N(CH
3
)
2
CONH
2
O
O
O O
OH
'( '(
O
O
O O
H H H
HH H H H
XXII
6omple$ul metal-tetraciclin se caracterizeaz prin solubilitate bun,
ac-iune apropiat tectraciclinei !i o mare stabilitate.
/n ultimul timp au aprut noi compu!i de tetraciclin, ob-inu-i, fie prin
semisintez, fie prin substitui-i la gruparea .-carbo$iamidic, fie prin substitu-ie
n nucleul aromat.
6ei mai importan-i deriva-i de tetracicline care substituie la gruparea
carbo$amid sunt5 piridonometiltetraciclina &DD444+, denumit !i reverin sau
solvocilin, >-,idro$ietil-piperazino-tetraciclin &DD4C+ !i #-lizinometil-tetraciclin
&DDC+5
OH
O
N(CH
3
)
2
CONH
OH
CH
2
N
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
XXIII
OH
O
N(CH
3
)
2
CO
OH
CH
2
N
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
XXIV
NH
N
CH
2
CH
2
OH
OH
O
N(CH
3
)
2
CO
OH
CH
2
N
(CH
2
)
4
NH
NH
2
COONa
XXV
111
TETRACICLINE
Curs 5
To-i ace!ti produ!i se ob-in prin reac-ia de amino-metilare &reac-ia
Iannic,+ a tetraciclinelor cu amine corespunztoare. 7eac-ia se efectueaz de
obicei n condi-ii cunoscute !i anume5 se solv tetraciclina ntr-un solvent potrivit
&de preferin- alcool alifatic inferior+ !i se trateaz stoec,iometric cu amin
secundar !i cu alde,id formic5
NH
R
1
R
2
+ 'et%aciclin!
+
CH
2
O
OH
O
N(CH
3
)
2
CO
OH
CH
2
N
NH
R
1
R
2
Dac n locul alde,idei formice se utilizeaz alte alde,ide se ob-in
deriva-i cu gruparea5
CO CH NH N
R
3
R
1
R
2
/nlocuirea grupei 69
8
de la 6
0
cu 9 duce la o simplificare a moleculei cu
pstrarea activit-ii antibacteriene !i la o cre!tere a stabilit-ii la acizi !i baze, iar
produsul ob-inut este denumit 0-demetiltetraciclin5
R
1
R
2
OH N(CH
3
)
2
CONH
2
OH
O
O OH
OH
XXVI
0-Demetiltetraciclina &DDC4+ se ob-ine prin fermenta-ie n profunzime n
condi-ii speciale, utiliz%nd mutan-i care au mecanismul de metilare blocat, sau
introduc%nd n mediul de cultur in,ibitori de metilare cum ar fi5 etionina, sulf-
o$idul de metionin, metil-metionina, etc.
4zolarea !i purificarea 0-demetiltetraciclinei se face prin procedeele
obi!nuite de separare !i purificare a tetraciclinelor.
/nlocuirea grupei #9 de la 6
0
cu 9, are ca efect simplificarea moleculei,
fr o diminuare apreciabil a activit-ii antibacteriene.
0-deo$itetraciclina se ob-ine prin ,idrogenarea catalitic a clor,idratului
de tetraciclin n mediu de dimetilformamid-ap &151+, utiliz%nd drept
catalizator paladiu depus pe crbune.
Din masa de reac-ie se separ 0-deo$itetraciclina cu ; L 02 !i 0-deo$i-0-
demetiltetraciclina cu ; L .12. 0-deo$i-0-demetil-tetraciclina este cel mai
simplu compus din clasa tetraciclinelor care are activitate biologic.
112
TETRACICLINE
Curs 5
113