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Los tres métodos principales de medición hormonal son el radioinmunoanálisis (RIA), el enzimoinmunoanálisis (ELISA) y el análisis inmunoradiométrico (IRMA). Todos se basan en la específica reacción antígeno-anticuerpo para cuantificar pequeñas concentraciones de hormonas u otros analitos en la sangre, orina u otros fluidos. El RIA utiliza isótopos radiactivos para lograr alta sensibilidad y especificidad al medir la formación del complejo hormona-anticuerpo
Los tres métodos principales de medición hormonal son el radioinmunoanálisis (RIA), el enzimoinmunoanálisis (ELISA) y el análisis inmunoradiométrico (IRMA). Todos se basan en la específica reacción antígeno-anticuerpo para cuantificar pequeñas concentraciones de hormonas u otros analitos en la sangre, orina u otros fluidos. El RIA utiliza isótopos radiactivos para lograr alta sensibilidad y especificidad al medir la formación del complejo hormona-anticuerpo
Los tres métodos principales de medición hormonal son el radioinmunoanálisis (RIA), el enzimoinmunoanálisis (ELISA) y el análisis inmunoradiométrico (IRMA). Todos se basan en la específica reacción antígeno-anticuerpo para cuantificar pequeñas concentraciones de hormonas u otros analitos en la sangre, orina u otros fluidos. El RIA utiliza isótopos radiactivos para lograr alta sensibilidad y especificidad al medir la formación del complejo hormona-anticuerpo
MEDICIONES HORMONALES INMUNOANLISIS Y MTODOS AFINES Entre los mtodos de medicin hormonal, los de ms uso son el radioinmunoanlisis (RIA), el enzimoinmunoanalisis (ELISA) y el anlisis inmunoradiomtrico (IRMA). Todos ellos tienen la ventaja de poder cuantificar pequesimas concentraciones de sustancias de la sangre, orina u otras medios orgnicos, lo que han transformado a estas metodologas en una palanca de desarrollo de la endocrinologa. Todos ellos se basan en la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo. Por esta razn, miden la actividad inmunolgica de los analitos, lo que no siempre coincide con su actividad biolgica. Se pueden clasificar en anlisis por competencia, y anlisis no competitivos. Concepto de inmunoensayo Se denominan tcnicas inmunoquimicas aquellas tcnicas de laboratorio que utilizan la reaccin antgeno-anticuerpo o algunas de sus propiedades o consecuencias para medir elementos, sustratos o enzimas. Si en una situacin de exceso de anticuerpo cuantificamos la cantidad de complejo antgeno-anticuerpo formado, esta candidad ser directamente proporcional al antgeno presente. La relacin antgeno-anticuerpo es indetectable por si misma in vitro; se requiere la puesta en marcha de una segunda fase o fase indicadora: una segunda reaccin o una consecuencia de ella para que podamos detectarla. Anlisis por competencia Radioinmunoanlisis (RIA) En 1956 el RIA fue introducido en los Estados unidos por Berson y Yalow y en la Inglaterra por Ekins. Se inici en el rea de la endocrinologa, pero actualmente es de utilidad para medir vitaminas, drogas enzimas, neutransmisores, etc. El anlisis radioinmunolgico se beneficia de la gran sensibilidad que otorga el uso de istopos radiactivos y de la notable especificidad con que ocurre la unin entre molculas afines como son un antgeno y su anticuerpo, una hormona y su transportador, o una hormona y su receptor celular especifico. El RIA se basa en la especificidad de la reaccin entre una hormona que llamaremos antgeno y su anticuerpo. La hormona marcada con un isotopo radiactiva compite con su forma no radiactiva para unirse a un anticuerpo que les es especfico. La reaccin hormona-anticuerpo se efecta en condiciones establecidas de pH y temperatura del medio, es reversible y obedece a la ley de accin de masas. De este modo se establece un equilibrio, por lo que la razn de los productos de las concentraciones a que ambos lados de la ecuacin ser constante. La reaccin hormona-anticuerpo puede ser expresada como sigue: Dnde: H* = Hormona Radiactiva Libre(No Unida Al Anticuerpo) AB = Anticuerpo Especifico H* AB = Hormona Radiactiva Unida Al Anticuerpo. K1 = Constante De Velocidad De Asociacin. K2 = Constante De Velocidad De Disociacin. As, cuando se llega al equilibrio de la reaccin, K eq( constante de equilibrio) = K1 [H* AB] K2[H*][Ab] Si a esta de agrega hormona (H) no radioactiva ya sea de una solucin o de una muestra biolgica en estudio, esta desplazara, segn sea su concentracin, a la hormona marcada unida al anticuerpo, produciendo una disminucin de la cantidad del complejo antgeno radiactiva- anticuerpo. Al mantener constante con la concentracin de anticuerpo y de H*, la cantidad del complejo depender solo de la cantidad de H que se agrega al sistema. Asi, si la concentracin de H es alta, la cantidad de H* Ab ser pequea y viceversa. Disponiendo de soluciones de concentraciones conocidas y crecientes de H se puede construir una curva de calibracin (curva estanadar) en la cual se interpolan las muestras desconocidas para determinar su concentracin. Una etapa esencial del mtodo RIA lo constituye la separacin de antgeno libre (hormona) de complejo antgeno-anticuerpo (hormona-anticuerpo). Los procedimientos ms comunes para ello son: Adsorcin de la hormona libre por carbn cubierto con dextrn. Precipitacin de la hormona unidad al anticuerpo por medio de un segundo anticuerpo dirigido contra el primer anticuerpo. Separacin en la fase solida: cuando el anticuerpo especfico para la hormona a medir est que se realiza la reaccin. Elementos necesarios para el radioinmunoanlisis Hormona marcada con un istopo radiactivo: los istopos ms unidos son 125 I (hormonas tiroideas, proteicas, y algunas esteroidales); 3 H y 14 C (esteroides y drogas) Hormona pura no reactivas: es necesario para construir la curva de calibracin. Anticuerpo especfico: se obtiene de animales inyectndoles riteractivamente la hormona pura. Las hormonas peptdicas inducen una buena respuesta inmunolgica, pero las esteroidales y tiroideas debido a su pequeo tamao, deben ser conjugadas con albmina antes de ser inyectadas. Mtodo de separacin Muestra problema: las determinaciones hormonales puede3n realizarse en suero, plasma, orina, saliva, lquidos cefalorraqudeos, etc. Equipos para medir radiactividad. Cuando el istopo empleado es; 3 H y 14 C se usa un contador de centelleo lquido que cuantifica radiaciones beta; mientras que para medir 125 I se requioere un contador de centello gamma. Radioinmunoensayo Si marcamos el inmunoensayo con un compuesto radiactivo, hablamos de radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores usados en RIA son de dos tipos, segn la reaccin que produzca: Radiacin beta: tritio ( 3 H), carbono 14 ( 14 C) y fosforo 32( 32 C) Radiacin gamma: iodo 125 ( 125 I) iodo131 ( 131 I) y cobalto ( 58 C). Los RIA son esencialmente ensayos competivos. Existen dos tipos: de equilibrio o secuenciales. En el ensayo de equilibrio (el usado habitualmente en RIA), ambos, el antgeno marcado yl antgeno no marcado de la muestra, se enfrentan simultneamente para competir por los lugares de ligazn del anticuerpo hasta llegar a una fase de equilibrio (la ley de accin de masa). Se presume que tanto el marcado como el no marcado tienen la misma afinidad por anticuerpo. En este punto, el antgeno (marcado y no marcado) ligado al anticuerpo es separado del antgeno (marcado y no marcado): la proporcin ligado/libre (B/F) del antigenbo es inversamente proporcional a la concentracin de antgenos (no marcado) presente en la muestra. Un antisuero ideal debera tener una alta concentracin de afinidad, dado que la recproca de la constante afinidad (1/K) es una medidad de la sensibilidad del ensayo. As, antisueros con una K de 10 12 I/mol puede medir 10 -12 mol/l. Existen dos aproximaciones grficas para para presentar los resultados del ensayo y calcular los valores: Diagrama de Scatchard. Se presenta la proporcin B/F frente a la concentracin de antgeno marcado. Si la grfica es lineal, ello implica que que todos los sitios de ligazn tiene la misma afinidad por el antgeno marcado. La pendiente de la recta no dara el valor de K(constante de afinidad) Graficva de Odell. Se representa la cantidad de complejo (antgeno- anticuerpo) marcado frente a la concentracin total de ligando marcado aadido a una concentracin fija de anticuerpo. La grfica que resulta es una hiprbole. La concentracin de afinidad coincidira con la recproca de la concentracin de ligando libre marcado a una concentracin de anticuerpo del 50 por 100 de saturacin. En la saturacin secuencial, el antgeno no marcado se expone al anticuerpo para su saturacin. Posteriormente, se aade el antgeno, que reaccionara con los lugares que han quedado libre, separndose despus del antgeno marcado no unido. El postulado bsico de este sistema es que la reaccin antgeno anticuerpo en las condiciones del ensayo sea virtualmente irreversible. Separacin del antgeno anticuerpo marcado del no marcado.- Existe una variedad de sistemas para conseguir esa separacin: el carbn activado cubierto de dextrano captura el antgeno libre marcado. Una centrifugacin posterior deja el antgeno marcado ligado en el sobrenadante. Tcnica de doble anticuerpo.- Se trata de un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo al que se ha ligado el antgeno y que, unido por ejemplo una fase slida, permite retenerlo. BIBLIOGRAFIA Libro de Laboratorio clnico de Prieto