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IDENTIFICACIN MICROBIANA





TEMA 12

IDENTIFICACIN MICROBIANA. Identificacin microbiana mediante mtodos basados
en sistema de utilizacin de sustratos, inmunoensayos y deteccin molecular.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Al finalizar el estudiante podr:

1. Discutir la importancia de la identificacin microbiana dentro del campo del ejercicio
profesional farmacutico.

2. Enumerar los mtodos utilizados para la identificacin microbiana.

3. Discutir la importancia y dar ejemplos de las pruebas de utilizacin de sustratos y dia-
gramas de flujo utilizados en la identificacin de bacterias y hongos.

4. Utilizando el sistema anterior, citar algunos ejemplos de microorganismos indicadores
de la calidad microbiolgica de productos farmacuticos y cosmticos.

5. Discutir la importancia y dar ejemplos de sistemas miniaturizados utilizados en la
identificacin microbiana.

6. Discutir la aplicacin de los principales mtodos serolgicos utilizados en la identifica-
cin microbiana.

7. Discutir el fundamento y aplicacin de mtodos de deteccin molecular utilizados en
la identificacin microbiana. PCR. Sondas de ADN.

8. Citar ejemplos de microorganismos que pueden identificarse por los mtodos discuti-
dos en los objetivos 6 y 7.

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Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se
aplican para establecer la identidad de un microorganismo. Estas tcnicas se utilizan en dife-
rentes reas, por ejemplo:

En el rea clnica donde es de capital importancia conocer cul es el agente causal de la
infeccin que presenta un paciente, de manera de poder tratarlo con agentes teraputi-
cos.

En la industria farmacutica, cosmtica y de alimentos donde las normas de control de
calidad exigen la ausencia de ciertos microorganismos.

En investigacin bsica donde se asla un determinado microorganismo que debe identi-
ficarse para comprobar si se trata de un microorganismo conocido o de uno nuevo para
poder clasificarlo.

Durante su ejercicio profesional, es muy importante que el farmacutico conozca el funda-
mento de los mtodos existentes para la identificacin microbiana. En el caso del ejercicio
comunitario, un farmacutico, por ejemplo puede estar asesorando a un paciente que tiene
una infeccin bacteriana, y al cual el mdico le tom una muestra para ser enviada al labora-
torio para identificar el agente causal, si el profesional conoce el fundamento y los mtodos
de identificacin microbiana puede explicarle al paciente la razn por la cual los resultados
de la identificacin del microorganismo y su antibiograma puede retrasarse algunos das.

Si se desempea en el rea de produccin de medicamentos y cosmticos, la fabricacin de
stos debe realizarse en reas controladas libres de microorganismos, para evitar la conta-
minacin del producto, y como consecuencia de ello, se produzca su deterioro, o lo que es
ms grave que el producto contaminado le cause una infeccin a un paciente.

En el caso que el profesional se desempee en la industria de medicamentos y/o cosmti-
cos, debe conocer las normas que rigen la calidad microbiolgica del producto a ser elabora-
do, los microorganismos objetables y el fundamento de los mtodos oficiales para descartar
la presencia de stos. Tambin en el caso de la industria alimentaria, los alimentos son so-
metidos a una serie de controles microbiolgicos para asegurar la ausencia de microorga-
nismos que pueden causar enfermedades y/o descartar la presencia de toxinas capaces de
causar intoxicaciones alimentarias.

Por estas razones, es importante conocer los mtodos en los cuales se basa la identificacin
microbiana. No todos los microorganismos se identifican por las mismas tcnicas. La mayor
parte de los mtodos se realizan en un laboratorio y se busca utilizar el menor nmero de
procedimientos y ensayos posibles.

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE IDENTIFICACIN MICROBIANA

Los mtodos ms utilizados para la identificacin microbiana, los podemos clasificar en:
1. Mtodos basados en criterios morfolgicos
2. Mtodos basados en tincin diferencial
3. Mtodos basados en pruebas bioqumicas
4. Mtodos basados en tipificacin con fagos
5. Mtodos basados en pruebas serolgicas
6. Mtodos basados en deteccin molecular
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En la mayora de los casos la identificacin no se realiza con base a un solo mtodo, sino a
la combinacin de ms de uno. Ejemplo: identificacin de bacterias con base a criterios mor-
folgicos, tincin diferencial, pruebas bioqumicas y serolgicas.

Antes de proceder a discutir los mtodos que se han enumerado, es importante hacer nfa-
sis que para cada uno de ellos se requiere disponer de una muestra. Cuando se requiere
identificar un agente que est causando una determinada patologa, la muestra debe proce-
der del sitio donde el microorganismo est causando el dao, o donde se multiplica. Algunos
ejemplos de muestras que se utilizan en microbiologa clnica tenemos: heces, orina, hisopa-
do farngeo, lquido cefalorraqudeo, sangre, lgrimas, semen, fluido vaginal, etc. Tambin
pueden utilizarse tejidos. Para aplicar algunos mtodos se requiere aislar en forma pura el
microorganismo de la muestra, pero para otros no se requiere realizar dicho aislamiento. Con
fines de control de calidad de medicamentos, cosmticos y alimentos, la muestra a ser anali-
zada, puede ser un producto en proceso o terminado.

1. Mtodos basados en criterios morfolgicos

Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos
aos a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatmicos tan
diferentes que pueden ser fcilmente utilizados en su clasificacin, pero con respecto a
los microorganismos, stos lucen bajo el micro-
coscopio tan similares que se dificulta su clasifica-
cin. Es decir, que estos microorganismos que se
ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden di-
ferir en propiedades bioqumicas, fisiolgicas y/o
serolgicas. Sin embargo, aun cuando la morfolo-
ga celular dice poco sobre las relaciones filogen-
ticas, sigue siendo til para la identificacin bacte-
riana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y
su localizacin resulta de mucha utilidad en la
identificacin de bacilos esporulados.

2. Mtodos basados en tincin diferencial

Es posible sacar conclusiones en relacin con la
morfologa de una bacteria, examinando una lmina
que fue sometida a un proceso de tincin diferen-
cial. Estos criterios morfolgicos encabezan las
primeras etapas del proceso de identificacin bacte-
riana. La mayor parte de las bacterias, teidas con
Gram, las podemos clasificar como gram positivas o
gram negativas, otras tinciones diferenciales, como
la cido resistente, se aplican a otro tipo de bacte-
rias, como por ejemplo micobacterias. Un examen
microscpico de una lmina teida por medio de gram o de una tincin diferencial es til
para obtener una informacin rpida sobre la calidad de un ambiente clnico. Por otro la-
do, un mdico tambin puede obtener suficiente informacin de un reporte tcnico de la-
boratorio para comenzar el tratamiento apropiado de un paciente.

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3.
4. Mtodos basados en pruebas bioqumicas

Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente
utilizadas para diferenciar bacterias. Estas prue-
bas se fundamentan en demostrar si el microor-
ganismo es capaz de fermentar azcares, la
presencia de enzimas, la degradacin de com-
puestos, la produccin de compuestos colorea-
dos, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas
pueden separarse en dos especies diferentes
con base a pruebas bioqumicas. Por ejemplo,
las bacterias entricas gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogneo cuyo
hbitat natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia, En-
terobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos. Un gran
nmero de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rpidamente al pat-
geno, para que posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el tratamiento
adecuado, o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de la infeccin.

Existen flujogramas, como el que se describe a continuacin para la identificacin bacte-
riana, mediante pruebas bioqumicas de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de
un coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos
indica la presencia de una enterobacteria, para determinar su gnero podemos seguir el
siguiente esquema.


Fermenta la
Lactosa?

No Si


Pueden utilizar cido Pueden utilizar cido
ctrico como nica ctrico como nica
fuente de carbono? fuente de carbono?


No Si No Si




Shigella: Salmonella: Escherichia Produce
produce lisina Generalmente acetona?
Decarboxilasa produce H
2
S

No Si

Citrobacter Enterobacter




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Los gneros clnicamente ms importantes de la familia Enterobacteriaceae son: Esche-
richia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enterobacter. El gnero Escherichia, Entero-
bacter y Citrobacter fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, a diferencia de
los gneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa.

Por otra parte, los medicamentos no estriles y/o productos cosmticos deben estar ex-
entos de microorganismos patgenos tales como: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli, Salmonella spp. Staphylococcus aureus. Estos productos deben ser controlados pa-
ra verificar la ausencia de estos microorganismos. En la USP se describen los procedi-
mientos a seguir para la identificacin de estas bacterias, que se resumen en procedi-
mientos de enriquecimiento, aislamiento y pruebas bioqumicas para su identificacin fi-
nal.

El tiempo necesario para la identificacin de bacterias puede reducirse considerablemen-
te con el uso de sistemas miniaturizados basados en pruebas bioqumicas. Estas
herramientas que permiten reducir el tiempo del reporte, en primer lugar fueron elabora-
dos para bacterias de importancia mdica, tales como las enterobacterias. Estos siste-
mas han sido diseados para realizar varias pruebas bioqumicas simultneamente y
permitir la identificacin en un tiempo ms corto. Cada uno de los ensayos, consta de tu-
bos miniaturizados que contienen el medio de cultivo que se hidratan al inocularlos con la
suspensin bacteriana pura. Las pruebas se clasifican en grupos; a cada uno de resulta-
dos positivos de los ensayos de se le asigna un determinado valor numrico, obtenindo-
se un cdigo que corresponder a un determinado gnero o especie en un texto de la
base de datos.


Con fines de control microbiolgico, la USP indica cuales son las pruebas bioqumicas
mnimas que se requieren para la identificacin de los microorganismos objetables, pero
no descarta que se utilicen sistemas miniaturizados donde se realizan un nmero mayor
de pruebas bioqumicas.

Existen muchas casas comerciales que producen sistemas miniaturizados para diferen-
tes tipos de microorganismos adems de las enterobacterias. Cada casa fabricante tiene
su propia presentacin, clculos, manuales, etc.

Una limitacin de este tipo de mtodo de identificacin es la aparicin de cepas mutantes
y la adquisicin de plasmidios que pueden dar origen a cepas con caractersticas diferen-
tes. Este tipo de mtodo de identificacin tambin ha sido desarrollado para la identifica-
cin de levaduras y de otros hongos.
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4. Mtodos basados en tipificacin con fagos

La interaccin entre un virus bacteriano (fago) y su clu-
la bacteriana sensible es sumamente especfica, ya que
el proceso de adsorcin se encuentra mediado por re-
ceptores especficos tanto en el virus como en la clula
bacteriana. A una placa con medio de cultivo slido ino-
culado con un cultivo puro de una determinada bacteria,
se le aade una alcuota de un fago especfico; ste
puede ocasionar la lisis de las bacterias, hecho que se
evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, de-
nominadas placas, que indican que hubo infeccin y lisis
celular. El uso de fagos especficos permite identificar y
subclasificar bacterias dentro de una misma especie.


5. Mtodos basados en ensayos serolgicos

Los mtodos serolgicos, implican la utilizacin de preparaciones de inmunoglobulinas
especficas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en
la identificacin microbiana en muestras puras o en muestras biolgicas. Cada uno de los
mtodos tiene su fundamento particular, pero en lneas generales, todos se basan en la
reaccin de un antgeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo correspon-
diente. La solucin que contiene los anticuerpos se denomina antisuero.

Estos mtodos son muy tiles en diversas situaciones:

Si a travs de un sistema miniaturizado basa-
do en pruebas bioqumicas se determin que
la bacteria causante de la infeccin es un
miembro del gnero Salmonella, utilizando
una batera de antisueros contra el antgeno O
presente en el lipopolisacarido de las bacterias
gram negativas, es posible identificar a la Sal-
monella aislada hasta el nivel de serotipo (poli
O, A, B, C, D, etc.).

La inmunofluorescencia ha resultado ser
sumamente til en casos de infecciones de di-
ferente origen. Puede utilizarse para la identifi-
cacin del microorganismo aislado o presente
en una muestra biolgica. En el mtodo directo
se fija la muestra problema a una lmina y se
pone en contacto con el antisuero especfico
marcado con una sustancia fluorescente (ro-
damina o fluorescena). Una vez transcurrido el tiempo para que tenga lugar la reac-
cin antgeno anticuerpo, se expone la lmina a la radiacin ultravioleta para visuali-
zar la reaccin. Tambin existe la tcnica indirecta, donde en primer lugar se utiliza el
anticuerpo especfico no marcado y posteriormente se utiliza un anti anticuerpo mar-
cado.
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En caso de una infeccin viral,
los virus no pueden ser identifi-
cados mediante pruebas bio-
qumicas, pero si pueden ser
identificados en diferentes flui-
dos biolgicos utilizando inmu-
noensayos, tales como el ELI-
SA (Enzyme-linked immunoab-
sorbent assay), el cual, a mane-
ra general, utiliza anticuerpos
monoclonales especficos para
el antgeno a identificar, marca-
dos con una enzima.

En un ensayo de ELISA tipo
sandwich, los anticuerpos espe-
cficos para el antgeno, se co-
locan sobre los pozos de una
microplaca, posteriormente se
aade la muestra donde se
quiere determinar la presencia
del agente (bacteria, virus, pro-
tozoario). Si el agente est pre-
sente ocurre la reaccin antge-
no-anticuerpo; luego del lavado
se aade el anticuerpo especfi-
co marcado con la enzima. Una
vez transcurrido el tiempo de in-
cubacin y realizado el lavado
correspondiente, se aade el
sustrato. Si se desarrolla un co-
lor se trata de un resultado positivo. Estos ensayos, al igual que otros, involucran el
uso de controles positivos y negativos.

Inmunoensayos tipo ELISA han sido desarrollados para la deteccin e identificacin
de varios tipos de agentes microbianos. Ejemplos: VIH, virus de la Hepatitis A,B,C,
Chlamydea trachomatis, Legionella pneumophili, Mycoplasma pneumoniae, Escheri-
chia coli, Entamoeba hystoliticum, Haemophilus influenzae, Neisseria.

6. Mtodos basados en biologa molecular

Modernamente adquiere ms importancia el uso de mtodos basados en biologa
molecular donde, a travs de procedimientos y reactivos, se pueden detectar deter-
minadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano.

El mtodo que se est utilizando ampliamente en los laboratorios de diagnstico es el
PCR (Polymerase Chain Reaction), que se aplica generalmente para la identificacin
de- microorganismos que no pueden ser cultivados por los mtodos convencionales.
A travs de este mtodo, puede aumentarse la cantidad de ADN hasta niveles detec-
tables mediante electroforesis o mediante sondas de ADN.

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El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un n nmero de ve-
ces:

1. Separacin de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura, la
cual rompe los enlaces de hidrgeno que mantiene unidos a las cadenas de ADN.

2. Adicin de cadenas cortas de polinucletidos, denominados cebadores, que se
unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento
de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5 ---3 y otro a la cade-
na 35.

3. Disminucin de la temperatura para permitir que los cebadores hibridicen con las
cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de bases.

4. Adicin de la ADN polimerasa, los cuatro nucletidos (ATP, GTP, TTP, CTP) y
dems cofactores, para que tenga lugar la sntesis de la cadena complementaria.

5. Repeticin de las etapas 1 a 4.

Este proceso se caracteriza por ser exponencial. En cada ciclo se duplica la regin de
ADN ubicada entre los cebadores.


Este procedimiento se realiza en un equipo denominado termociclador, que permite
regular las diferentes temperaturas que se requieren para cada uno de los pasos.

A continuacin se enumeran ejemplos de agentes microbianos subclasificados en
bacterias, virus y protozoario, que han sido identificados mediante PCR.

Bacterias:
Borrelia burghdoferi, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Stahylococcus aureus,
Chlamydea trachomatis, Shigella dysenteriae, Treponema pallidum, Escherichia coli
enterotoxinognica, Mycobacterium tuberculosis y Legionella pneumonophilia, Cam-
pylobacter jejuni.

Virus: Parvovirus, Herpes-simplex virus, Rotavirus, Papillomavirus, Virus del dengue,
Virus Varicella-Zoster, Virus de la Rubola, Adenovirus, Rhinovirus.

Protozoarios: Plasmodium falciparium, Toxoplasma gondii, Entamoeba histolyticum,
Pneumocystis carinii, Trypnanosoma cruzi.


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Otro mtodo que tambin ha sido ampliamente utilizado y que se fundamenta en
complementariedad de bases de cidos nucleicos, son aquellos que utilizan sondas
de ADN, que se definen como secuencias de oligonucleotidos de ADN marcados,
con un elemento radioactivo (
32
P,
125
I,
35
S) o con una protena unida a una enzima co-
mo la fosfatasa alcalina. Estas sondas se utilizan para la deteccin de una secuencia
complementaria de ADN o ARN, presente en el agente que se desea identificar.

La muestra, que se supone que contiene un agente microbiano con una secuencia
complementaria que se desea identificar, se coloca en un filtro, se trata de manera tal
de liberar al cido nucleico, se calienta para que las cadena s complementarias
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se separen. Posteriormente se aade la sonda, y se deja transcurrir un periodo para que
tenga lugar la hibridacin si existe la cadena complementaria. La unin de la sonda a la
secuencia complementaria se detecta mediante la seal radiactiva que emite la sonda o
mediante mtodos enzimticos.



A continuacin se presentan una lista con ejemplos de bacterias que han sido detec-
tadas e identificadas por medio de sondas de ADN:

Bacterias gram negativas: Neisseria gonorrhoeae, Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli, Haemophilus influenzae.

Bacterias gram positivas: Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B,
Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes.

Micobacterias: Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, M. Intracelulare.

Hongos: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitis, Cryptococcus neo-
formans, Coccidiodes immitis.

Siempre que sea posible se debe utilizar el mtodo ms eficiente y ms barato. Las
identificaciones utilizando PCR son muy costosas debido a los equipos, los reactivos
y los materiales de laboratorio que se deben utilizar. El rea donde se realiza una
parte del ensayo slo puede utilizarse para un determinado agente.
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BIBLIOGRAFA

Madigan M.T, Martingo J . M. y J ack Parker. 2004. Dcima Edicin. Brock Biologa de los
Microorganismos Prentice Hall

Mahon, C. and Manuselis G. 2000. Textbook of Diagnostic Microbiolgy. Second Edition. W.B.
Saunders Company. USA

Prescott, L.; Harley, J .; Klein, D. 1999. Microbiologa. Cuarta edicin. McGraw-Hill Interame-
ricana.

Tortora G. J ., B. R. Funke and Ch. L. Case 2007. Introduccin a la Microbiologa 9
na
Edicin.
Editorial Mdica Panamericana.






Milagros de Vizcarrondo
Sofa Gutirrez de Gamboa
Enero 2002
Revisin 2008


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ACTIVIDADES ADICIONALES

Elabore una clave para la identificacin de diferentes especies bacterianas.

Investigue por qu la prueba del ELISA-VIH presenta el inconveniente de obtener falsos ne-
gativos.

Busque en un diccionario de ingls tcnico la traduccin al espaol de las palabras siguien-
tes:

Acid fast stain


Annealing


Antibodies labeled cells


Antiserum


Differential staining


Food associated infections


Human pathogen


Hybridization


Indirect fluorescent antibody


Monoclonal antibodies


Morphology


Nucleic target sequence


Oligonucleotide


Primer


Probe


Serology


Specificity


Sputum


Viral species


Western blotting


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