1.

CUL ES EL SIGNIFICADO DE K
M
?

Km es la constante de Michaelis Menten o constante de saturacion que
indica el nmero de molculas de sustrato (molcula sobre la q actua la
enzima) que cada molecula de enzima es capaz de transformar por una
de tiempo. Es la velocidad media en la k las enzimas tardan en
encontrarse con el sustrato, y si lo representas en mediante un grfico
es justo la mitad respecto a la velocidad total.
Si la suposicin de Michaelis y Menten es vlida, KM es la constante de
disociacin de ES a E + S, igual a k-1/k1. Por lo tanto, es una medida de
la afinidad de la enzima por su substrato. Si KM es grande significa que
k-1 es grande o que k1 es pequea por lo que la reaccin inversa es
ms favorecida que la reaccin directa y con ello la afinidad de la enzima
por su substrato es baja. Por el contrario, si KM es pequea, la afinidad
de la enzima por el substrato es grande.

El valor de KM tambin corresponde a la concentracin de S en la cual
v = VMAX/2, que se interpreta como la concentracin a la cual la enzima
est saturada slo a la mitad.

Cuando ms de una enzima catalizan una reaccin, o si no estamos
seguros de cul es el sustrato verdadero de una enzima, los valores de
KM indican la relacin ms apropiada.

Por lo general, los valores de KM y VMAX determinan usando la
transformacin propuesta por Hans Lineweaver y Dean Burk, que
consiste en obtener la inversa de la ecuacin de Michaelis y
Menten, con lo cual la ecuacin de la hiprbola se convierte en la
ecuacin de una lnea recta.

1/v=[(1/Vmax)+(Km/Vmax)][1/[S]]

2.
Para muchos enzimas, la velocidad d catlisis, Vo varia con la
concentracin de sustrato [S], la velocidad de catlisis aumenta de forma
lineal al incrementar la concentracin de sustrato y luego a mayores
concentraciones de sustrato comienza a aproximarse a un mximo.
El Km es un valor caracterstico de cada enzima y constituye una medida
de la afinidad del enzima. No todas las enzimas presentan el mismo
valor numrico de Km porque cada enzima tiene un sustrato.
3. CUAL ES EL SIGNIFICADO DE UN KM ALTO Y UN KM BAJO?
Un km alto indica poca afinidad de la enzima por su sustrato, mientras
que un km bajo significa alta afinidad de la enzima por su sustrato
4. A QUE SE DENOMINA VELOCIDAD MXIMA?
La velocidad mxima de una reaccin enzimtica se determina
incrementando la concentracin de su sustrato hasta que la tasa de
formacin de producto sea constante. Esta se denomina la velocidad
mxima (V
max
) de una enzima.
6.


7. EN QUE UNIDAD SE EXPRESA EL KM?
En micromoles (um), en milimoles (mm) y moles.

8. QU IMPORTANCIA TIENE LA DETERMINACIN DEL KM DE UNA ENZIMA?
La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parmetro cintico
importante por mltiples razones:
K
M
es la concentracin de sustrato para la
cual la velocidad de reaccin es la mitad de
la velocidad mxima. En efecto, si K
M
= [S],
la ecuacin de Michaelis-Menten se reduce a:
v = V
max
/2.
El valor de K
M
da idea de la afinidad del
enzima por el sustrato: A menor K
M
, mayor
afinidad del enzima por el sustrato, y a
mayor K
M
, menor afinidad. Este hecho tiene
fcil explicacin si tenemos en cuenta que
K
M
se define como (k
2
+k
3
/k
1
), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el
complejo ES, mientras que la reaccin 1 lo forma. As, si K
M
es grande,
el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo
(poca afinidad hacia el sustrato), y si K
M
es pequea, el complejo ES es
estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el
sustrato).
La K
M
del sustrato natural es menor que la de los sustratos
anlogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta K
M
, el que
presente mayor K
M
tiene menor afinidad por el enzima, y la reaccin
transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor K
M
,
salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = V
max
.
Los valores de K
M
de muchos enzimas son prximos a los de la
concentracin fisiolgica de sus sustratos, de forma que pequeas
variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad
de toda una ruta metablica.
9. QU PARMETROS DEBEN CONOCERSE PARA LA DETERMINACIN DEL KM
DE UNA ENZIMA?
Ahora bien, debemos tener en cuenta que la actividad de un enzima es
la velocidad con que cataliza la reaccin. Por eso, todas las mediciones
enzimticas se han de hacer referidas al tiempo (o bien aparicin de
Producto en la unidad de tiempo o bien desaparicin de sustrato en la
unidad de tiempo), pero ello implica una serie de precauciones:
a) En ningn momento el sustrato debe llegar a hacerse limitante, es
decir, llegar a una concentracin lo suficientemente baja como para
limitar la velocidad de la reaccin (lo que ocurrira en la parte ascendente
de la curva de Michaelis); por eso es necesario conocer con antelacin
las caractersticas cinticas del enzima que vamos a medir,
concretamente su Km, dado que los ensayos para determinar
concentracin enzimtica han de hacerse a concentraciones muy
superiores a la Km del sustrato.
b) En la medida de lo posible se deben emplear sustratos con
caractersticas qumicas fijas y definidas: por ello se emplean sustratos
sintticos, como en el caso que nos ocupa, en el que se utiliza el 4-
nitrofenil fosfato, a pesar de que dicho compuesto no aparece nunca
como biomolcula.
c) La reaccin tiene que estar perfectamente cronometrada y se debe
comprobar si es lineal con respecto al tiempo, si no lo fuera, la medicin
no sera vlida ms que a tiempo cero, lo que es difcil de apreciar
experimentalmente.

10.
Para determinar grficamente los valores de K
M
y V
max
es ms sencillo
utilizar la representacin doble recproca (1/v
0
frente a 1/[S]
0
), ya que
es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre
de representacin de Lineweaver-Burk. Es una recta en la cual se
tabula de la siguiente manera:

Cuyo recproco es:


La pendiente es K
M
/V
max

La abscisa en el origen (1/v
0
= 0) es -
1/K
M

La ordenada en el origen (1/[S]
0
= 0) es 1/V
max

Donde V es la velocidad de reaccin, K
m
es
la constante de Michaelis-Menten, V
max
es la
velocidad mxima, y [S] es la concentracin de
sustrato.
La representacin grfica de Lineweaver-Burk permite identificar el K
m
y
V
max
; el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la
inversa de V
max
, y el de abscisas es el valor de -1/K
m
.
De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular
grficamente, los valores de K
M
y V
max
de un enzima para diversos
sustratos.