de los antgenos inducen la produccin especifica de anticuerpos y linfocitos T efectores. Este reconocimiento entre el antigeno anticuerpo o linfocito sienta las bases del diagnostico inmunolgico.
El estudio de las inmunoreacciones se realiza mediante el empleo de tcnicas inmunolgicas basadas en la deteccin de y evaluacin de la respuesta humoral ( anticuerpos y complemento) o de base celular (linfocitos T y fagocitos).
Unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) Interaccin reversible (enlaces no- covalentes). Interaccin primaria no visualizable Interaccin secundaria visible (ej.: aglutinacin, precipitacin) No siempre se produce la interaccin Ag-Ac secundaria SEROLOGIA La medicin de las interacciones Antigeno- Anticuerpo con fines diagnsticos. Se realizan en 2 vas: Utilizacin de anticuerpos especficos para detectar el antigeno.(diagnostico directo)
Utilizacin de antigenos especficos para detectar anticuerpos. (diagnostico indirecto)
Especificidad; capacidad de los anticuerpos de distinguir y reaccionar con una estructura qumica entre muchas. Reactividad cruzada: el anticuerpo reacciona con otro antgeno, cuando este y el antgeno que estimulo la produccin del anticuerpo especifico comparten un epitopo idntico o muy similar. Afinidad de un anticuerpo es la fuerza o intensidad de la unin, entre un sitio de unin del anticuerpo y un determinante antignico. Avidez: es la fuerza con la que el anticuerpo multivalente se une a un antgeno multivalente. Los anticuerpos o antgenos marcados reciben el nombre de conjugado. Los anticuerpos conjugados suelen ser monoclonales o antinmunoglobulinas especificas. Se les llama sistemas competitivos. Se establece competencia por los sitos de unin disponibles entre el reactivo conocido, (ag, o ac) aadido al ensayo a concentracin limitada, y el elemento a investigar. PRUEBAS DE UNION SECUNDARIA Aglutinacin: en placa, en tubo. Precipitacin: Inmunodifusion en agar, inmunoelectroforesis Hemoaglutinacin. Inhibicin de la hemoaglutinacin. Fijacin de complemento. Neutralizacin y Seroneutralizacion realizadas in vitro. Concentracin de Antgeno Reacciones de precipitacin: antgeno soluble Inmunodifusin radial (precipitacin) Concentracin de Ag Inmunodifusin Radial Inmunodifusin doble Inmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis de veneno crudo (VC) y enzima LAO de serpiente Bothrops atrox, con suero antibothrpico Reacciones de aglutinacin: antgeno particulado Reacciones con marcadores Inmunohistoqumica Trozo de tejido Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Anticuerpo 1 Anticuerpo 2 biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado Inmunohistoqumica - Sustratos Inmunohistoqumica - Revelado Anti MMP-13 revelado con DAB Contratincin hematoxilina Rodamina Fluoresceina Ficoeritrina DAPI Bromuro de Etidio Naranja de Acridina Inmunofluorescencia N-myc/CD56 Rat neurons Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia - colocalizacin La colocalizacin permite determinar si dos antgenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retculo, etc) dentro de una clula Inmunofluorescencia - colocalizacin Citometra de Flujo Citometra de Flujo Clula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las clulas mientras estn en un flujo de lquido Inmunofenotipificacin Viabilidad/apoptosis/Proliferacin Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimtica Citometra de Flujo Mezcla de clulas Marcacin con anticuerpos monoclonales Citometra de Flujo La presin ejercida por una columna de fluido obliga a las clulas a enfilarse de a una Citometra de Flujo Columna de clulas Citometra de Flujo Laser Detector Citometra de Flujo Tamao Granularidad La luz que se detecta en la misma direccin del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la seal detectada se relaciona con el tamao, y el indice de refraccin de las clulas La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la seal es proporcional a la cantidad de estructuras citoslicas en la clula (grnulos, inclusiones, etc) Citometra de Flujo Dado que FSC es proporcional al tamao y SSC a las estructuras internas, una correlacin entre ellos permiten la diferenciacin de los distintos tipos celulares en una poblacin celular heterogenea FSC S S C
Linfocitos Monocitos Granulocitos RBCs, debris, Clulas muertas Citometra de Flujo - Histograma Intensidad de fluorescencia C u e n t a s
Citometra de Flujo - Dot Plot FL1 F L 2
Citometra de Flujo - Dot Plot Citometra de Flujo - Cell sorting Citometra de Flujo Citometra de Flujo Sensible Especfica Precoz Reproducible Fcil de implementar Tcnicas inmunolgicas CELLULAR ANTIGENS Sensory Adhesion Metabolic Ejemplo: inmunohistoqumica para HER-2 N de sujetos con resultad o positivo para el test N de sujetos con resultad o negativo para el test Totales N de sujeto s enfer mos VP FN VP+FN N de sujeto s sanos FP VN FP+VN Totale s VP+FP FN+VN VP+VN+ FP+FN Sensibilidad diagnstica: probabilidad de que una persona que sufre una enfermedad determinada tenga un resultado positivo en un test. VP / ( VP + FN) Enfermos Test Positivo (VP) Test Negativo (FN) Especificidad diagnstica: probabilidad de que una persona que no sufre esta enfermedad tenga un resultado negativo del test.
VN / ( FP + VN) Sanos Test Positivo (FP) Test Negativo (VN) Valor de prediccin positivo de un test : la probabilidad de que una persona que tenga un resultado positivo a un test sufra una determinada enfermedad.
VP / ( VP + FP ) Enfermos Test Positivo (VP) Sanos Test Positivo (FP) Prevalencia: 10/1000 hab Valor de prediccin negativo de un test : la probabilidad de que una persona que tenga un resultado negativo de un test no sufra una enfermedad determinada.
VN / ( VN + FN ) Enfermos Test Negativo (FN) Sanos Test Negativo (VN) Prevalencia: 10/1000 hab Eficacia del test: fraccin numrica de pacientes correctamente clasificados
VP + VN / ( VP + FP + FN + VN) Enfermos Test Positivo (VP) Test Negativo (FN) Sanos Test Positivo (FP) Test Negativo (VN) Interpretacin Reacciones cruzadas Sensibilidad y especificidad Grupo poblacional Etapa de la enfermedad Presencia de complejos Ag-Ac Pacientes inmunocomprometidos Variaciones intra e interlaboratorio Interferencia de la terapia Velocidad de depuracin de los Ag Discriminar colonizacin de infeccin Ejemplo: Sfilis Treponema pallidum Chancro (sfilis primaria) Roseola (sfilis secundaria) Ejemplo: fiebre tifoidea Salmonella typhi Reaccin de Widal Zona no endmica: anti-O y anti-H 50-100
Zona endmica: anti-O y anti-H 160-200 Infec. 6 das 8 das 6 meses 12 meses Anti O Anti H Western blot Western blot
Transferencia SDS PAGE Gel Membrana Western blot Bloqueo Anticuerpo 1 Anticuerpo 2 biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccinar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima Generacin de gene KO SEPARACIN MAGNTICA DE CLULAS Microscopa y tcnicas de estudio a nivel celular Tipos de microscopios pticos Electrnicos Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Transmisin Barrido Microscopa Algunos Conceptos Resolucin (D) Magnificacin Aumento que logra el equipo Distancia mnima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas Microscopio ptico - Campo claro Eosinofilia Microscopio ptico - Campo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tincin Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Microscopio ptico - Campo oscuro Treponema pallidum Aumenta pequeas diferencias en el ndice de refraccin y densidad en la clula Microscopio ptico - Contraste de fase Observar organismos vivos sin necesidad de tincin El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra Microscopio ptico - Contraste de fase Clulas HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae Microscopio ptico - Contraste de fase Microscopio ptico - Interferencia Permite la visualizacin detallada sin teir
Maximiza la diferencia entre los ndices de refraccin entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada
Microscopio ptico - Contraste de fase e interferencia Contraste de fase Interferencia diferencial Los objetos pueden tambin visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Microscopio ptico - Fluorescencia Restringe infrarrojo Pasa slo la que permite la excitacin del fluorocromo Aequoria victoria Microscopio ptico - Fluorescencia Algunos objetos fluorescentes GFP (Green fluorescent protein) hela Drpspphila Clula de cebolla (peroxisomas) Microscopio ptico - Fluorescencia - Confocal Microscopio ptico - Fluorescencia - Confocal Microscopio ptico - Fluorescencia - Confocal Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de transmisin (TEM) Bacilos en divisin Mitocondria 60.000x Herpes virus ensamblndose en el ncleo Bacteria fagocitada por un macrfago Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de transmisin (TEM) Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de barrido (SEM) Glomrulo renal 1200x Clula en corte transversal Piel humana Espermatozoides bovinos Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de barrido (SEM) Clula vegetal con cristales (falsa tincin) Bacterias sobre un estoma Glb. Rojo Glb. Blanco Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de barrido (SEM)
Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la tcnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulacin de reactivos se torna peligroso por la elevada condicin toxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creacin de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal tcnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolucin y magnificacin Microscopa electrnica - Ventajas y desventajas Tcnicas inmunolgicas ELISA Western blot Inmunohistoqumica Inmunofluorescencia Citometra de flujo Tcnicas inmunolgicas Introduccin a las Tcnicas inmunolgicas Tcnicas inmunolgicas - Inmunoglobulinas Anticuerpo Antgeno Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos epitope Linfocito B Activacin Antgeno Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos Epitope A Epitope C Epitope B Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos policlonales Antigeno Activacin Linfocitos B Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos policlonales Suero Centrifugacin Sangre Purificacin Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos policlonales Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos monoclonales Antgeno Purificacin de Linfocitos B Sangrado Cultivo de clulas tumorales + Fusin Hibridoma Hibridomas Screening: Bsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificacin de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos monoclonales ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Para detectar Antgenos Anticuerpos ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilizacin Bloqueo Incubacin con Suero ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado Anticuerpo 2 Revelado ELISA ELISA Para detectar Antgenos
Sensibilizacin Bloqueo Incubacin con Suero ELISA ELISA Para detectar Antgenos
Lavado Anticuerpo 2 Revelado ELISA Tcnicas inmunolgicas - Deteccin indirecta Biotina Avidina Tcnicas inmunolgicas - Complejo avidina/biotina Antgeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Cromgeno Cromforo Avidina Peroxidasa Tcnicas inmunolgicas - Deteccin indirecta Cultivos Primarios (El principio de la historia.....) A- Aislamiento del tejido B- Diseccin/disgregacin C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario) Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de divisin mayor. Preparacin cultivos Cultivos secundarios y lneas estables
1. Si uno o varios tipos de clulas de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. 2. La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinar qu clulas se desarrollarn. 3. Las lneas estables son las que se obtienen por sub- cultivo y seleccin de cultivos secundarios. Tambin se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.
Seleccin de la lnea estable Lneas celulares estables Control del entorno celular
Homogeneidad celular
Conocimiento del tipo celular
Economa
Ventajas Desventajas Falta de diferenciacin
Inestabilidad de la lnea (mutaciones DNA) Medios de Cultivo: Medios Base Medios base: Eagles Basal Medium, Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), RPMI1640, etc. Contienen: Hidratos de Carbono, cidos grasos esenciales y otros lpidos, aminocidos, sales minerales, oligoelementos.
*Cada lnea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio Medios de Cultivo: Aditivos Antibiticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos) Tampn pH: Hepes, bicarbonato, etc. Indicador pH. Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2- 50%). Aditivos especficos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc.
Tamponadores de pH Hepes Buffer tamponador que acta de manera muy eficiente en el rango 7,2-7,6
*Importancia de la ppCO 2 en el mantenimiento del pH
H 2 O + CO 2 H 2 CO 3 H + + HCO 3 -
* Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)
Propiedades fsico-qumicos del Medio CO 2 : Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO 3 - ] pH.............................................................(7.0-7.7) Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg Viscosidad................................................ Suero Temperatura............................................. 37C (mamfero) (aves: 38,5C; epitelio de ratn: 33C; insectos: 28C)
Test de medio completo con suero Previamente a la realizacin de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles.
1. Posible Contaminacin 2. Niveles de Proliferacin Celular (eficiencia) Subcultivos Celulares Protocolo Subcultivo Depende de las caractersticas de la lnea celular con la que se esta trabajando.
1. Clulas en suspensin
2. Clulas adheridas al substrato Cultivo primario en monocapa ELISA Los mtodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimtica se dividen en dos tipos: Competitivos No competitivos ELISA ELISA COMPETITIVO: En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
ELISA ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando color ELISA Dentro de los no competitivos tenemos: Los directos que detectan antgenos Los indirectos que detectan anticuerpos. ELISA Pasos generales de un ELISA 1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo 2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos 3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el posillo. 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antgeno no unido 5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adicin del sustrato 9. Unin del sustrato a la enzima 10. Desarrollo del color