MARCO TERICO

2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS

Al revisar investigaciones que servirn se soporte al presente estudio se puede citar
los trabajos realizados:

Revista Tumbaga (2010), PRODUCCIN DE BIOETANOL A PARTIR DE
SUBPRODUCTOS AGROINDUSTRIALES LIGNOCELULSICOS. El presente
documento, muestra una revisin del estado del arte de este tipo de materiales
y su potencial de uso para biocombustibles (etanol), describiendo las
caractersticas de las materias primas en cuestin, su estructura, las etapas
(pre-tratamiento, hidrolisis, detoxificacin y fermentacin) y mtodos que cita la
literatura; al igual que los avances microbiolgicos que han logrado para la
incursin de los mismos en algunas de las etapas del proceso.

Articulo biotecnologa, Ao 2009, Vol. 13 No. 3. LIGNOCELULOSA COMO
FUENTE DE AZCARES PARA LA PRODUCCIN DE ETANOL. El propsito
de esta revisin es mostrar un panorama de los mtodos que se han
desarrollado para hidrolizar la lignocelulosa. Algunas estrategias utilizando
microorganismos como las levaduras se han enfocado en la obtencin de
etanol a partir de lignocelulosa mediante la expresin de enzimas celulolticas y
aprovechando la capacidad fermentadora de la levadura. En este proceso de
sacarificacin y fermentacin simultnea se han obtenido cantidades y
rendimientos significativos de etanol lo cual representa un punto de partida que
conducir al desarrollo de tecnologas encauzadas a satisfacer las necesidades
energticas en el futuro.

Artculo tcnico Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera:
EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE ETANOL A PARTIR DE
CASCARILLA DE ARROZ PRETRATADA CON NaOCl, MEDIANTE
HIDRLISIS Y FERMENTACIN SIMULTNEAS, evalan la obtencin de
etanol desde cascarilla de arroz por medio de un proceso de hidrlisis y
fermentacin simultneas, que se realiza sobre cascarilla de arroz pre tratada
con NaOCl en un proceso de de lignificacin qumica.



AMBATO ECUADOR 2011. "ESTUDIO DE LA TECNOLOGA PARA LA
OBTENCIN DE UNA BEBIDA ALCOHLICA CARBONATADA A PARTIR DE
LA DEGRADACIN DE LA CASCARILLA DE ARROZ (Oryza sativa)
TRATADA ENZIMTICAMENTE CON HEMICELULASA. establece una
tecnologa para aprovecha este material como materia prima principal en la
elaboracin de una bebida alcohlica, a partir de la degradacin enzimtica de
hemicelulosa, para lograr una degradacin eficiente de hemicelulosa, la
cascarilla es sometida a un pre-tratamiento que consta de un proceso de
delignificacin, es decir, con accin de NaOCl (6,25%) durante 2 horas; 100
rpm; 30C. Para la actuacin y verificacin de la eficiencia de la enzima
GranozymePM2 (hemicelulosa), se realiza una combinacin de las variables:

Estudios muestran la intervencin de los preparados enzimticos en la
produccin de vino de mora de Castilla (Rubus glaucus Benth) mejora el
rendimiento del vino y ayuda tambin en la clarificacin, facilitando la liberacin
del zumo con la degradacin de la pectina, esto se puede observar claramente
en los valores de absorbancia, mientras que los vinos obtenidos con Vinozym-L
tienen los valores ms bajos de absorbancia, lo cual indica que la enzima acta
sobre la clarificacin del vino. Tambin menciona que la preparada enzimtica
ayuda a descomponer selectivamente los polisacridos del hollejo, liberando
los valiosos compuestos del color y aroma responsables del bouquet del vino.

Otra investigacin establece una tecnologa para la obtencin de una bebida
alcohlica a partir de maz (Zea mays variedad Morochon) usando tratamientos
enzimticos, concluyendo que al trabajar con fungamyl 2500BG utilizando un
0,06% del peso requerido para malta y jora, se reducen notablemente los
tiempos de reaccin, de 150 minutos para malta y jora y 75 minutos para
fungamyl 2500BG, as como se incrementa el porcentaje de desdoblamiento de
almidones, para malta y jora de un 72% al 90% para fungamyl 2500BG.





2.2. FUNDAMENTACIN TERICA

2.2.1 EL ARROZ

2.2.1.1 ESTRUCTURA DEL GRANO DE ARROZ


El fruto del arroz es una caripside en la cual la
semilla nica esta fusionada con la pared
(pericarpio) del ovario maduro, formando un grano
en forma de semilla. La caripside est rodeada
por la lemma y la palea. Entre las variedades, la
caripside del arroz varia ampliamente en forma y
tamao. La semilla de arroz madura se cosecha
como un grano cubierto (arroz bruto) en el cual
est encerrada la caripside.




Anatoma del grano de arroz
Los componentes principales del grano de arroz son la vaina, la cubierta de la
caripside, endospermo y embrin.

Corteza
La caripside del arroz est rodeada por una corteza (cascara) compuesta de dos
hojas modificadas, la plea y una lemma ms grande. La plea y la lemma se
mantienen unidas por estructuras en forma de gancho (Bechtel y Pomeranz, 1978).
Las clulas de la corteza madura estn altamente lignificadas y son frgiles, y
contienen grandes concentraciones de slice, quiz en las clulas epidrmicas
externas.
Cubierta de la caripside
Rodeando el endospermo de la caripside del arroz maduro, pero dentro de la corteza
se encuentran tres capas distintas que forman la cubierta de la caripside-el
pericarpio, la cubierta de la semilla y la nucela. La cubierta de la semilla esta debajo
Figura N1: estructura del
grano de arroz
del pericarpio. Limitando la cutcula de la cubierta de la semilla esta otra cutcula
gruesa de las clulas nucleares comprimidas.

Endospermo
El endospermo consta de:

Una capa de aleurona que forma la capa ms externa del tejido del
endospermo. El nmero de capas de aleurona presentes depende de su
localizacin en el grano, la variedad y los factores ambientales. La capa de
aleurona es rica en fosforo, magnesio y potasio.

Un endospermo de almidn, que consta de clulas de parnquima de pared
delgada, por lo general alargadas radialmente y con una gran carga de
grnulos de almidn compuestos y algunos cuerpos protenicos.

Embrin
El embrin o germen es muy pequeo y se localiza en el lado ventral de la caripside.
Contiene las hojas embrionarias (plmula) y la raz embrionaria primaria (radcula),
que estn unidas por un tallo muy corto (el mesocotilo). La plmula est rodeada por
una cubierta protectora en forma de cilindro, el coleoptilo, y la radcula est rodeada
por una masa de tejido blanco, la caleorriza. La superficie externa del embrin est
rodeada por la capa de aleurona. El coleoptilo est rodeado por el escutelo y el
epiblasto. El rastro vascular del coleoptilo esta fusionedo con las partes laterales del
escutelo.

2.2.1.2 LA CASCARILLA DE ARROZ










Figura N2: Cascarilla de
arroz.
La cascarilla de arroz es un subproducto de la industria molinera, que resulta
abundantemente en las zonas arroceras de muchos pases y que ofrece buenas
propiedades para ser usado como sustrato hidropnico. Entre sus principales
propiedades fsico-qumicas tenemos que es un sustrato orgnico de baja tasa de
descomposicin, es liviano, de buen drenaje, buena aireacin y su principal costo es el
transporte. La cascarilla de arroz es el sustrato empleado para los cultivos
hidropnicos bien sea cruda o parcialmente carbonizada. El principal inconveniente
que presenta la cascarilla de arroz es su baja capacidad de retencin de humedad y lo
difcil que es lograr el reparto homogneo de la misma (humectabilidad) cuando se usa
como sustrato nico en camas o bancadas. El incremento en la Agricultura e
Industrializacin particularmente en el sector alimenticio resulta en una abundancia de
materiales de desecho. La mayora de estos materiales contienen grandes cantidades
de celulosa, hemicelulosa y lignina, tales como: aserrn, paja de arroz, hojas de caa,
desechos de algodn, pulpa de caf, etc.
En la Tabla 1, se aprecian los rangos obtenidos para el anlisis qumico a nivel
mundial.

Tabla N1: Anlisis qumico de la cascarilla de arroz.
Material
lignocelulsico
%Celulosa % Hemicelulosa %Lignina

Cascarilla de
arroz


25.89-35.5

18.1 21.35

18.20 24.6
Fuente: (Valverde et al., 2007).

Aprovechamiento actual de la cascarilla de arroz
La cascarilla no tiene valor en la alimentacin humana, no solo por ser pobre en
nutrientes, sino tambin en su alto contenido de silicio que la hace daina para los
rganos digestivos y respiratorios de los animales
En la actualidad la cascarilla de arroz es utilizada principalmente como combustible
para generar fuerzas en los molinos de arroz, siendo su poder calorfico de 3300 a
3600 kcal/kg. La cascarilla de arroz como residuo celulsico puede ser convertida en
azcar fermentescibles, lo que posteriormente pueden ser transformados en alcohol
mediante fermentacin. Al aplicar tcnicas modernas de sacarificacin de la celulosa,
el rendimiento de alcohol que se obtiene descascarilla de arroz no es inferior al de la
madera, esto es alrededor del 19-21%.Esta utilizacin puede resultar importante si hay
fabricacin de alcohol de madera y de celulosa cercana a los centros productores de
arroz (Stampa 1962, citado por Grist, 1975).

2.2.2 LA BIOMASA CELULSICA O LIGNOCELULSICA

La industria de produccin del etanol utiliza el trmino
biomasa celulsica porque la celulosa es la materia
prima para la obtencin de glucosa de cuya
fermentacin se obtiene el etanol.
Pero la celulosa no es un material fcilmente accesible
como es el almidn o el azcar ya que se encuentra
ntimamente unida a otros materiales como la lignina o
las sustancias ppticas.



La celulosa se encuentra en las paredes de las clulas vegetales. Las clulas que no
lignifican presentan paredes pectocelulsica como en la figura1.1. Estas paredes se
degradan con ms facilidad que las lignocelulsicos.
Las paredes lignocelulsicos son estructuras de mayor complejidad y difcil
accesibilidad a algunos componentes (figura 1. 2) y forman los materiales
lignocelulsicos.
Figura N 3: Matriz pectocelulsica.
Fuente: Buchanan B.









EL MATERIAL LIGNOCELULOSICO (MLC) est constituido por los tejidos de los
vegetales cuyas clulas presentan una pared celular constituida por un entramado de
microfibrilla de celulosa formando capas recubiertas de hemicelulosas y sobre las que
se deposita la lignina.
Esta estructura surge como respuesta a una necesidad de los vegetales. La pared
celular permite crear y sostener la estructura area en las plantas que les permite
captar la radiacin solar. As tejidos con clulas lignificadas dotan a sus rganos,
principalmente tallos, de mayor esbeltez y mayor resistencia mecnica, adems de
mejorar su regulacin hdrica y su resistencia a patgenos.
En este sentido el aprovechamiento global del material requiere mtodos de
preparamiento o fraccionamiento que son complejos, estn alejados de rendimientos
elevados y adems no son capaces de aislar completamente cada componente sin
modificarlo o degradarlo al menos en una parte.
Pero para comprender que es un material lignocelulosico y poder aprovecharlo
completamente se deben conocer cules son los componentes principales de las
paredes celulares, como se distribuye en la propia pared y que tejidos las contienen.



Figura N 4: Matriz lignocelulsico.
Fuente: Bidlack et al., 1992

2.2.2.1 COMPOSICIN DE LOS MATERIALES LIGNOCELULSICA.
Los componentes de los materiales lignocelulosicos se clasifican en:
Componentes estructurales.
Los forman tres polmeros, la celulosa, la lignina y la hemicelulosa. Del total de
compuestos que forman los materiales lignocelulosicos casi la mitad son
celulosa y un 20% lignina.
La unin entre celulosa y lignina puede producirse directamente o
generalmente a travs de las hemicelulosa. En paredes no lignocelulosicos
aparece otro componente formando por sustancias ppticas (pectina).
Componentes secundarios.

Son componentes generalmente de menor proporcin y son de dos tipos; por
un lado componentes de bajo peso molecular, hidrosoluble o extrable en
solventes orgnicos que se denominan extractos y por otras materias
minerales que en los anlisis qumicos se estiman como cenizas.

COMPONENTES ESTRUCTURALES
Entre un 60y 80% de los vegetales estn constituidos por polisacridos de elevado
peso molecular: las holocelulosas. Entre las holocelulosas podemos distinguir unos
polmeros lineales de alto grado de polimerizacin, la celulosa, de otros que resultan
fcilmente extrables en lcalis; las hemicelulosas.

CELULOSA
La celulosa es un homopolimero lineal de elevado peso molecular y grado de
polimerizacin; entre 200 y hasta 10.000 unidades en estado nativo de -D-
glucopiranosa unidas por enlace glucosidico o de tipo ter entre el carbono 1 y 4 (,
14).
Es el componente principal de las paredes celulares de los vegetales y el polmero
mayoritario del planeta, tiene una estructura fibrosa, es blanca, muy estable y
resistente al ataque qumico, tambin a la traccin mecnica.
Debido al carcter asimtrico de ese enlace, tambin puede considerase a la celulosa
como un poliacetal del dinero celobiosa (4-o--D-glucopiranosil--D-glucosa), que no
existe de forma natural, solo puede obtenerse por la hidrlisis parcial de la celulosa.
El enlace osidico o glicosidico se forma por la reaccin del grupo OH hemiacetlico
del carbono anomerico (el carbono 1) de la -D-glucopiranosa con el grupo OH del
carbono 1 un grupo aldehdo de carcter reductor.



La conformacin piranosa, donde los carbonos y oxgenos son tetradricos y la forma
ms estable es la de silla, presentan los grupos

OH, -OH y los enlaces

glicosidicos en posicin ecuatorial y los hidrgenos en posicin axial. Este hecho de
que los grupos OH salgan lateralmente permite a la celulosa formar uniones inter e
intramoleculares por puentes de hidrogeno dando lugar a las fibrillas elementales.







Las fibrillas elementales o micelas estn formadas por entre unas 40 y 100 cadenas de
celulosa donde se presentan zonas con una estructura cristalina, que le confiere a la
celulosa la gran resistencia que se ha comentado y otras regiones amorfas que le
otorgan elasticidad.
Figura N 5: Estructura primaria de la celulosa
Figura N 6: Unidad de celulosa mostrando los grupos ms
voluminosos en posicin ecuatorial y los hidrgenos en la axial.
La presencia de regiones amorfas en la fibrilla elemental permiten mejor penetracin
de reactivos qumicos, por tanto mayor reactividad. Los disolventes pueden entrar
mejor en el material y las enzimas del tipo de las celulosas pueden trabajar mejor si se
aumentan la proporcin de estas zonas. A esta prdida de zonas cristalinas y aumento
de regiones amorfas se la suele designar como perdida de cristalinidad.





Las microfibrilla que forman las paredes celulares de los vegetales y que se orientan
de distinta forma segn las capas estn formadas a partir de las fibrillas elementales.
Adems, esta estructura que presenta los grupos OH formando puentes de hidrogeno
en estructura con forma de cinta presenta los hidrgenos en su superficie, resultando
hidrofobica.






Figura N 7: Fibrilla elemental o micela.
Figura N 8: Estructura de una microfibrilla.
Fuente: Buchanan B.
HEMICELULOSA
Las hemicelulosas forman cadenas ramificadas de menor grado de polimerizacin que
la celulosa y no tienen, por tanto, zonas cristalinas. Adems, los puentes de hidrogeno
son menos eficaces, haciendo de las hemicelulosas polisacridos ms accesibles al
ataque de reactivos qumicos.
Los monmeros que constituyen las hemicelulosas son principalmente monosacridos
u osas y derivados de las osas como los cidos uronicos.
Los monosacridos principales que encontramos en las hemicelulosas son cinco; tres
hexosas: glucosa, manosa y galactosa y dos pentosas: la xilosa y la arabinosa.










Adems de las osas en la pared vegetal aparecen derivados de estas. Lo ms
frecuentes son los cidos uronicos; algunos aparecen en la figura 11.

.
Figura N 9: Representaciones de hawort de las principales hexosas
presentes en las hemicelulosas.
Figura N 10: Representaciones de hawort de las principales
pentosas presentes en las hemicelulosas.






LIGNINA
La lignina es un polmero aromtico de estructura tridimensional bastante compleja,
muy ramificada y amorfa, formada por la condensacin de precursores fenlicos
unidos por diferentes enlaces.
Funciones:
Proteger a la celulosa del ataque microbiano.
Conferir resistencia e impermeabilidad al material.
Mantener unidas las fibras celulsicas.
Unidades:
La sntesis de la lignina es un proceso de polimerizacin cuyos precursores son los
alcoholes p-hidroxicinamilicos.




Figura N 11: cidos urnicos frecuentes en la pared celular de los
vegetales.
Figura N 12: Alcoholes cinamlicos.

COMPONENTES SECUNDARIOS

SOLUBLES EN AGUA Y DISOLVENTES ORGNICOS.
Terpenos: se consideran polmeros del isopreno y estn relacionados con los
alcoholes terpnicos y algunas cetonas.
Resinas: amplia variedad de compuestos no voltiles como grasas, cidos grasos,
alcoholes, resinas acidas, fitoesteroides y otros compuestos neutros.
Fenoles: como los taninos que son polifenoles derivados de acido glico y de la
catequina.
Otros: entre los que se encuentran hidratos de carbono de bajo peso molecular,
alcaloides y lignina soluble.

INSOLUBLES:
Cenizas: son principalmente carbonatos y oxalatos, aunque en otros como el slice es
muy abundante en la paja de cereal.
Otros: son ms raros y de poca proporcin, pero tambin pueden ser insolubles
cantidades pequeas de almidn, pectinas o protenas.

2.2.3 PROCESOS DE OBTENCIN DE ETANOL A PARTIR DE BIOMASA
LIGNOCELULSICA.
La biomasa lignocelulsica presenta una estructura compleja, compuesta de varias
fracciones que deben ser procesadas por separado para asegurar una conversin
eficiente de estos materiales a etanol. La fraccin mayoritaria de la biomasa es la
celulosa, compuesta por largas cadenas de glucosa unidas por enlaces (1-4) que, a
su vez, se agrupan en estructuras superiores de gran cristalinidad. Esta estructura
cristalina es la que dificulta la hidrlisis de la celulosa para la obtencin de azcares
fermentables. La hidrlisis de la celulosa puede realizarse mediante procesos cidos o
enzimticos.

2.2.3.1 Hidrlisis cida.
La hidrlisis cida consiste en un proceso qumico que, mediante el empleo de
catalizadores cidos, transforma las cadenas de polisacridos que forman la biomasa
(hemicelulosa y celulosa) en sus monmeros elementales. La hidrlisis cida de los
materiales lignocelulsicos es un proceso conocido desde 1819 (Larsson, 2000), que
alcanz su mayor desarrollo durante las dos Guerras Mundiales, perodos en los que
la escasez de petrleo hizo que se empleara masivamente la madera para la
produccin de etanol. Durante este perodo se desarrollaron numerosos procesos
(Scholler, Madison, Bergius) cayendo posteriormente en desuso por razones
econmicas. Este tipo de hidrlisis puede realizarse empleando diferentes clases de
cidos como el cido sulfuroso, clorhdrico, sulfrico, fosfrico, ntrico y frmico (Galbe
y Zacchi, 2002). Sin embargo, slo los cidos clorhdrico y sulfrico han sido
empleados a escala industrial.
Los procesos industriales de hidrlisis cida pueden agruparse en dos tipos: los que
emplean cidos concentrados y los que utilizan cidos diluidos.
Los procesos que implican cidos concentrados operan a baja temperatura, pudiendo
obtenerse altos rendimientos de hidrlisis (superiores al 90% de la glucosa potencial).
A pesar de esto, la gran cantidad de cido empleado en la impregnacin del material a
tratar y lo costoso de su recuperacin, unido a los efectos corrosivos de los cidos
concentrados que obliga a altas inversiones en los equipamientos, hacen que el
proceso no sea rentable. Adems, tiene el problema asociado de que es necesario
una costosa etapa de neutralizacin antes de la fermentacin (Keller, 1996). Sin
embargo, los procesos que utilizan cidos concentrados han adquirido un renovado
inters debido a nuevos mtodos que mejoran la economa de recuperacin de los
cidos desarrollados por varias compaas como Masada Resource Group
(Birmingham, Ala), Arkenol (Mission Viejo, California) y APACE (Australia) (Katzen,
1997).
Los procesos que emplean cidos diluidos tienen su principal ventaja en el
relativamente bajo consumo de cidos. Sin embargo, se requieren relativamente altas
temperaturas para alcanzar rendimientos aceptables de conversin de celulosa a
glucosa. El mximo rendimiento en glucosa se consigue a altas temperaturas y
tiempos de residencia cortos. Este tipo de procesos operan a una temperatura de 240
C, una concentracin de cido de 1 % (p/v) y un tiempo de reaccin de 6-12
segundos. An as, bajo estas condiciones los mejores rendimientos alcanzados estn
en torno al 60% del rendimiento terico (Wyman, 1996). Las temperaturas que se
emplean en estos procesos originan, por un lado, una mayor corrosin de los equipos
empleados y, por otro lado, aumenta la tasa de degradacin de los azcares
hemicelulsicos los cuales pueden afectar a la posterior etapa de fermentacin.
Con objeto de disminuir la degradacin de los azcares originados en la hidrlisis, se
puede utilizar un proceso en dos etapas. En la primera etapa y bajo condiciones ms
suaves, se produce la hidrlisis de la hemicelulosa, que por su estructura resulta ms
fcilmente hidrolizable. Esto permite que, durante la segunda etapa, y bajo unas
condiciones ms severas, se produzca la hidrlisis de la celulosa, evitndose la
degradacin de los azcares hemicelulsicos producidos en la primera etapa.
Mediante los procesos en dos etapas es posible conseguir hasta un 98% de
recuperacin de los azcares hemicelulsicos a partir de maderas blandas. Sin
embargo, los rendimientos en glucosa no superan el 50% (Nguyen y col., 1999). En
Estados Unidos, BCI comercializa la tecnologa de hidrlisis en dos etapas con cido
diluido. En la primera etapa se produce la hidrlisis de la hemicelulosa en unas
condiciones suaves (170-190 C) y, en la segunda etapa, se hidroliza la celulosa en
unas condiciones ms severas (200-230 C) (Wyman, 1999). Las altas temperaturas
que se requieren para la hidrlisis de la celulosa hacen que se originen productos de
degradacin de los azucares, que adems de disminuir el rendimiento del proceso,
pueden afectar a la posterior etapa de fermentacin.
En Suecia, la Bioalcohol Fuel Fundation junto con St. Lawrence de Canada y
Tennessee Valley Authority de Estados Unidos, desarrollaron un proceso en dos
etapas con cido diluido, conocido como el proceso CASH (OBoyle y col., 1991). Se
basa en una primera hidrlisis a temperatura moderada impregnando la madera con
dixido de azufre, seguido de una segunda hidrlisis utilizando cido hidroclorhdrico
diluido (Galbe y Zachi, 2002).
2.2.3.2 Hidrlisis enzimtica.
La hidrlisis enzimtica es un proceso catalizado por un grupo de enzimas
denominadas genricamente celulasas, que son en realidad, una mezcla de distintas
actividades enzimticas cuya accin conjunta produce la degradacin de la celulosa.
Las plantas superiores, algunos invertebrados y principalmente microorganismos
(hongos y bacterias) son productores de este tipo de enzimas. Las celulasas de origen
fngico, principalmente de los gneros Trichoderma, Phanerochaete y Fusaruim, han
sido las ms estudiadas por la capacidad de estos microorganismos de producirlas en
grandes cantidades y de forma extracelular, facilitando su separacin en los medios de
cultivo.
El complejo celuloltico de hongos est formado por distintos componentes que actan
sinrgicamente. Este sistema enzimtico tiene tres tipos diferentes de actividad cuya
denominacin y mecanismo de accin son los siguientes (Montenecourt y Eveleigh,
1979):
1. Endo--glucanasas
- (1,4)-glucanglucanohidrolasa (EC 3.2.1.4.)
2. Exo--glucanasas.
a. -(1,4)-glucancelobiohidrolasas (EC 3.2.1.91.) Celobiohidrolasa
(CBH)
b. -(1,4)-glucanglucanohidrolasas (EC 3.2.1.74.) Glucohidrolasa (GGH)
3. - glucosidasa (EC 3.2.1.21.).

La endoglucanasa acta al azar en el interior del polmero, hidrolizando enlaces -(1,4)
y generando nuevos finales de cadena no reductores. Puede actuar sobre
celodextrinas y derivados sustituidos como carboximetilcelulosa (CMC) e
hidroximetilcelulosa (HMC), as como celulosa amorfa, pero no acta ni sobre celulosa
cristalina ni sobre celobiosa. Supone, aproximadamente un 20% del total de protenas
del complejo.
La celobiohidrolasa acta sobre los extremos no reductores de la cadena generados
por la endoglucanasa, liberando molculas de celobiosa. Este enzima tiene actividad
sobre celulosa cristalina y amorfa, y sobre celodextrinas, pero no acta sobre
derivados sustituidos ni sobre celobiosa. Este enzima constituye del 50-80% del
complejo celuloltico.
La glucohidrolasa se encuentra en pequea proporcin y acta sobre los extremos no
reductores liberando unidades de glucosa. Tiene actividad sobre celulosa amorfa,
celo-oligosacridos y CMC.
La -glucosidasa hidroliza celobiosa y oligosacridos de pequeo tamao, y es
absolutamente necesaria para evitar la fuerte inhibicin que sobre las endo y
exoglucanasas producira la celobiosa si se acumulara en el medio de reaccin. Un
esquema del mecanismo de accin de las celulasas se representa en la figura 1.8.
Si se aaden celulasas al material lignocelulsico la hidrlisis de la celulosa es
demasiado lenta, debido a la asociacin de esta con la lignina que constituye una
barrera fsica a la penetracin de los enzimas. Otros factores como la porosidad (rea
superficial accesible), la cristalinidad de la celulosa, el grado de polimerizacin y el
contenido en lignina y hemicelulosa dificultan la accesibilidad de las celulasas
reduciendo la eficiencia de la hidrlisis. Todos estos factores hacen necesaria una
etapa de pre tratamiento, previa a la hidrlisis de la celulosa, que altere la estructura
del material lignocelulsico facilitando la accin de los enzimas.



2.2.4 Pre tratamiento de la biomasa lignocelulsica.
Los objetivos fundamentales del pre tratamiento van encaminados a: reducir la
cristalinidad de la celulosa, disociar el complejo celulosa-lignina, aumentar el rea
Figura N 13: Mecanismo de accin de las celulasas

superficial del material y disminuir la presencia de aquellas sustancias que dificulten la
hidrlisis. Adems, un pre tratamiento eficaz debe reunir otras caractersticas como:
bajo consumo energtico, bajos costes de inversin, utilizacin de reactivos baratos y
fcilmente recuperables y debe ser aplicable a diversos substratos.
Por su naturaleza, los pre tratamientos se pueden dividir en cuatro grupos: fsicos,
fsico-qumicos, qumicos y biolgicos (Sun y Cheng, 2002).




2.2.4.1 Pre tratamientos fsicos.
Trituracin mecnica
La trituracin de los materiales lignocelulsicos mediante una combinacin de astillado
y molienda, reduce la cristalinidad de la celulosa, aumenta la superficie especfica y la
densidad aparente, facilitando la hidrlisis posterior. Existen diferentes tipos de
moliendas (molino de bolas, martillos, cuchillas, rodillos). Los molinos de bolas
vibratorias se han mostrado ms efectivos que los molinos de bolas ordinarios en la
reduccin de la cristalinidad y aumento de digestibilidad de astillas de abeto y chopo
(Millet y col., 1976). Este tipo de pretratamiento tiene el inconveniente de su alto
consumo energtico que depende, tanto del tamao final de partcula al que se muela
el material, como del tipo de material a pretratar (Cadoche y Lpez, 1989).


Figura N 14: Pre tratamiento de la biomasa lignocelulosa.

Radiacin de alta energa
Este tipo de irradiacin rompe los enlaces -glucosdicos y los enlaces entre la
celulosa y la lignina (Khan y col., 1986). Sin embargo, este tipo de pretratamiento es
de difcil aplicacin tcnica debido a la baja densidad de los materiales a tratar y las
altas dosis requeridas que obligan al diseo de instalaciones muy complejas y de alto
coste.
2.2.4.2 Pre tratamientos fsico-qumicos.
Explosin por vapor
El material lignocelulsico se somete a temperaturas entre 190-230 C, mediante la
inyeccin directa de vapor saturado, durante un intervalo de tiempo entre 1 y 10
minutos. Tras el tiempo de tratamiento, se somete el material a una rpida
despresurizacin. El efecto del pretratamiento sobre la biomasa es una combinacin
de alteraciones fsicas (desagregacin y ruptura de las fibras) y qumicas
(despolimerizacin y rotura de enlaces). El efecto mecnico est causado por la rpida
despresurizacin que provoca una evaporacin del agua interna, creando unas fuerzas
de cizalladura que producen la separacin de las fibras, principalmente de las regiones
ms dbiles (celulosa amorfa). El efecto qumico se debe a la hidrlisis de los restos
acetilos de las hemicelulosas produciendo cido actico, que a la temperatura del
proceso, cataliza la hidrlisis de la hemicelulosa (autohidrlisis). Durante el tratamiento
se destruyen parcialmente los enlaces lignina-carbohidrato. Como resultado, se
obtiene un producto fibroso cuya celulosa es ms accesible a la hidrlisis enzimtica.
La hemicelulosa se despolimeriza en mayor o menor medida dependiendo de las
condiciones del tratamiento, siendo fcilmente recuperada por lavado. La lignina,
prcticamente sin alterar puede ser extrada y utilizada con diferentes fines.
Las variables ms importantes en el pretratamiento de explosin por vapor son la
temperatura, el tiempo de residencia, el tamao de partcula y la humedad (Duff y
Murray, 1996).
La explosin por vapor ha sido reconocida como un mtodo muy efectivo para el
pretratamiento de maderas duras y residuos agrcolas. Este pretratamiento se ha
aplicado a diferentes materiales como chopo (Ramos y col., 1992; Excoffier y col.,
1991; Ballesteros y col., 1998), eucalipto (Ramos y col., 1992), pino (San Martin y col.,
1995; Ballesteros y col., 2000; Negro y col., 2003a), paja de arroz (Moniruzzaman,
1995), residuos herbceos (Ballesteros y col., 2002), residuos olecolas (Fernndez-
Bolaos y col., 1998, 2001), bagazo (Martn y col., 2002) etc. Sin embargo, este
pretratamiento se ha mostrado menos efectivo con las maderas blandas, debido a su
estructura mucho ms rgida y su mayor contenido en lignina. Adems, el contenido de
grupos acetilados es mucho menor que en las maderas duras, con lo que el proceso
de autohidrlisis no ocurre en la misma medida. En el caso de las maderas blandas es
deseable aadir un catalizador cido. El cido sulfrico ha sido el ms estudiado por
su coste y efectividad (Torget y col., 1990, 1991, 1996; Nguyen y col, 1998, 1999,
2000; Tenborg y col., 1998). El SO2 tambin ha sido empleado en numerosos trabajos
(Clark y Mackie, 1987; Clark y col., 1989; Ramos y col., 1992; Stenberg y col., 1998,
2000a). Tiene la ventaja de no ser tan corrosivo como el sulfrico y es fcil y rpido de
introducir en el material. Su principal desventaja es su alta toxicidad. Una diferencia
muy importante que se produce al utilizar en el pre tratamiento uno u otro catalizador
es la diferente fermentabilidad de las fracciones obtenidas tras el pre tratamiento. As,
el material obtenido tras el tratamiento con sulfrico muestra una baja fermentabilidad,
debido a las altas concentraciones de productos txicos que se forman.
Entre las ventajas del pre tratamiento con explosin por vapor debe citarse que el
tamao de partcula del material requerido (15-30 mm) es considerablemente superior
a los utilizados en otros pre tratamientos, reducindose costes en la molienda
(Ballesteros, 2001). Adems, no emplea catalizadores cidos (en el caso de las
maderas duras) con lo que se reducen los efectos medioambientales.
Entre sus limitaciones se encuentran, la destruccin de una parte de los xilanos de las
hemicelulosas, la incompleta rotura de la matriz lignina-carbohidratos y la generacin
de compuestos que pueden resultar txicos para los microorganismos empleados en
el proceso de fermentacin tras la hidrlisis enzimtica. Debido a la formacin de estos
compuestos, el material pretratado debe ser lavado con agua para eliminar estos
productos inhibitorios (McMillan, 1994).
La identificacin de los compuestos de degradacin de las distintas fracciones que
forman la biomasa lignocelulsica originados durante la explosin por vapor, as como
el aprovechamiento de la fraccin lquida obtenida tras el pre tratamiento con objeto de
minimizar las necesidades de agua y reducir la cantidad de agua residual generada en
el proceso, son parte de los objetivos de este trabajo.
Para maximizar la recuperacin de azcares en el pre tratamiento de explosin por
vapor se requieren diferentes condiciones de pre tratamiento para la recuperacin de
los azcares celulsicos y hemicelulsicos. Algunos autores (Stenberg y col., 1998 a y
b; Tenborg y col., 1998) han sugerido un pre tratamiento en dos etapas empleando
sulfrico en condiciones suaves en una primera etapa, seguido de una impregnacin
con SO2 bajo unas condiciones ms severas. De esta forma es posible conseguir un
incremento de un 7% en el rendimiento global de azcares despus de la hidrlisis
enzimtica comparndolo con los procesos en una etapa. La explosin por vapor en
dos etapas tiene una serie de ventajas como son, mayor rendimiento en etanol, mejor
aprovechamiento de la materia prima y menor consumo de enzimas en la fase de
hidrlisis. Sin embargo, es necesario una evaluacin econmica para determinar si
estas ventajas justifican una explosin a vapor adicional (Galbe y Zacchi, 2002).
Proceso de explosin por vapor con amoniaco (AFEX).
Es un proceso similar a la explosin por vapor en el que el material es impregnado con
amoniaco lquido (1-2 kg amoniaco/kg biomasa seca) a una temperatura en torno a los
90 C, y un tiempo aproximado de 30 minutos. Transcurrido este tiempo el material es
sometido a una rpida descompresin (Sun y Cheng, 2002).
Este tipo de pretratamiento ha sido empleado con diferentes tipos de sustratos como
alfalfa, paja de trigo (Mes-Hartree y col., 1988), astillas de chopo (Tengerdyy Nagy,
1988), bagazo (Holtzapple y col., 1991), residuos slidos urbanos, papel residual
(Holtzapple y col., 1992) y paja de cebada y arroz (Vlasenko y col., 1997). La
diferencia con la explosin por vapor y otros tipos de pretratamiento cidos, es que en
este proceso no se solubiliza la hemicelulosa. La composicin del material sometido a
un proceso AFEX es prcticamente la misma que la del material original. Utilizando
materiales con bajo contenido en lignina (hasta un 15%), se han obtenido rendimientos
de hidrlisis de la celulosa y hemicelulosa del 90%, despus del pretratamiento. Sin
embargo, este proceso no es tan efectivo con biomasas con un mayor contenido en
lignina. En estos casos los rendimientos de hidrlisis posteriores han sido inferiores al
50% (McMillan, 1994).
Como ventajas del proceso pueden citarse que no se producen inhibidores que
puedan afectar a las posteriores etapas del proceso de produccin de etanol y no
requiere pequeos tamaos de partcula para aumentar su eficiencia. Con objeto de
reducir costes y como medida protectora del medioambiente, el amoniaco debe ser
reciclado despus del pretratamiento.
Explosin con CO2.
Es un proceso similar a la explosin por vapor o al proceso AFEX. La explosin con
dixido de carbono se basa en el hecho que el CO2 forma cido carbnico, lo que
aumenta la tasa de hidrlisis. Este proceso ha sido empleado en el pretratamiento de
alfalfa, obteniendo un rendimiento de hidrlisis del 75% a las 24 horas (Dale y Moreira,
1982). Aunque los rendimientos obtenidos son relativamente bajos comparados con la
explosin por vapor y el proceso AFEX los estudios realizados con bagazo de caa y
papel reciclado, demostraron que este proceso es ms barato que la explosin con
amoniaco y no origina los compuestos inhibitorios que se originan durante la explosin
por vapor (Zheng y col., 1998).
2.2.4.3 Pre tratamientos qumicos.
El objetivo de estos pre tratamientos es solubilizar la fraccin de lignina y modificar la
estructura de la celulosa facilitando la accin de las enzimas. Entre los pre
tratamientos qumicos se encuentran los tratamientos con agua caliente lquida,
oxidacin hmeda, ozono, lcalis, cidos, organosolventes y agentes oxidantes.
Tratamiento con agua caliente lquida
Consiste en someter a la biomasa a la accin de agua caliente en torno a una
temperatura de 220 C durante un tiempo determinado (Van Walsun y col., 1996). El
reactor debe estar presurizado para mantener el agua en estado lquido. Durante este
pretratamiento se recuperan la mayora de los pentosanos (Negro y col., 2003b) y se
obtiene un hidrolizado que no muestra inhibicin en el posterior proceso de
fermentacin (Laser y col., 2002).
Oxidacin hmeda
El material lignocelulsico, se somete a la accin de agua a elevadas temperaturas, en
presencia de oxgeno (Schmidt y Thomsen, 1998). Este tratamiento tiene la ventaja de
no generar prcticamente productos de degradacin como el furfural e HMF ( Klinke y
col., 2002; Varga y col., 2003).
Tratamientos con ozono
El ozono ha sido utilizado para degradar la lignina y la hemicelulosa de numerosos
materiales lignocelulsicos como paja de trigo, bagazo, pino, algodn y serrn de
chopo (Vidal y Molinier, 1988). La degradacin se limita fundamentalmente a la lignina
ya que la hemicelulosa es atacada ligeramente y la celulosa apenas si se ve afectada.
El tratamiento con ozono tiene una serie de ventajas como la eliminacin efectiva de la
lignina, no origina productos txicos que afecten a los procesos posteriores y la
reaccin se produce a una temperatura ambiente y presin atmosfrica. Sin embargo,
la gran cantidad de ozono empleado hace de este proceso un mtodo caro.

Hidrlisis con lcalis.
El tratamiento con NaOH diluida produce un hinchamiento de la biomasa, lo que
conduce a un aumento del rea superficial interna, un descenso de la cristalinidad, una
separacin de las uniones estructurales entre la lignina y los carbohidratos y una
rotura de la estructura de la lignina. El mecanismo de la hidrlisis alcalina de la
biomasa parece estar basada en la saponificacin de los enlaces steres
intramoleculares que unen los xilanos de la hemicelulosa y otros componentes, como
por ejemplo la lignina, u otros componentes de la hemicelulosa (Sun y Cheng, 2002).
La efectividad de este pretratamiento depende del contenido de lignina del material a
tratar. As, por ejemplo, se ha conseguido aumentar la digestibilidad de sustratos como
paja con un contenido de lignina del 18% (Bjerre y col., 1996) y de maderas duras,
pero no de maderas blandas con un contenido de lignina superior al 26% (Millet y col.,
1976).
Tratamiento con organosolventes.
Se emplea una mezcla de solventes orgnicos o acuosos junto con un catalizador
cido (clorhdrico o sulfrico) para romper los enlaces internos de la lignina y la
hemicelulosa. Entre los solventes orgnicos empleados en el proceso se encuentran:
metanol, etanol, acetona y etilenglicol (Thring y col., 1990). Tambin pueden
emplearse cidos orgnicos como el cido oxlico, acetilsaliclico y saliclico. Con
objeto de reducir costes y de evitar problemas en la posterior etapa de fermentacin se
deben reciclar los solventes.
2.2.4.4 Pre tratamientos biolgicos.
En este tratamiento el material lignocelulsico se somete a la accin de determinados
microorganismos, como los hongos de la podredumbre blanca, marrn o blanda. El
objetivo es degradar la lignina y la hemicelulosa, eliminando las barreras que protegen
la celulosa y hacindola ms accesible al posterior ataque enzimtico. Los hongos de
la podredumbre marrn atacan principalmente la celulosa, mientras que los de la
podredumbre blanda y blanca atacan la celulosa y la lignina. Los de la podredumbre
blanca se han mostrado como los ms efectivos en el tratamiento biolgico de los
materiales lignocelulsicos (Fan y col., 1987). Las ventajas del pre tratamiento
biolgico son el bajo requerimiento energtico y las suaves condiciones ambientales
en la que se produce el proceso. Como inconveniente debe citarse que la tasa de
hidrlisis es demasiado lenta. Entre todos los hongos estudiados destaca el de la
podredumbre blanca Phanerochaete chysosporium, que durante el metabolismo
secundario en respuesta a limitaciones de carbono y nitrgeno, produce enzimas
como la lignina peroxidasa y la peroxidasa dependiente de magnesio que degradan la
lignina (Boominathan y Reddy, 1992).
2.2.5 COMPUESTOS TXICOS GENERADOS EN LOS PRETRATAMIENTOS.
2.2.5.1 Tipos y origen.
Durante el pretratamiento del material lignocelulsico no slo se obtienen los azcares
provenientes de la hidrlisis y solubilizacin de la celulosa y hemicelulosa sino que,
debido a las altas temperaturas y condiciones cidas en las que se desarrollan estos
pre tratamientos, se originan una serie de compuestos que pueden actuar como
inhibidores potenciales de la fermentacin. La naturaleza y concentracin de estos
compuestos depende del tipo de materia prima (maderas duras, blandas o herbceas),
del pretratamiento utilizado, de las condiciones del proceso (temperatura y tiempo) y
de la utilizacin o no de catalizadores cidos (Olsson y Hahn-Hgerdal, 1996).
Los productos de degradacin, que son potenciales inhibidores de la fermentacin,
pueden dividirse en tres grupos (Larsson, 2000): derivados del furano, cidos alifticos
de bajo peso molecular y derivados fenlicos.
Como consecuencia de las altas temperaturas empleadas en los pre tratamientos, los
azcares originados en la hidrlisis, principalmente de la hemicelulosa, se degradan
originando dos compuestos derivados del furano: el furfural, formado a partir de la
degradacin de las pentosas (xilosa y arabinosa) y el 5-hidroximetilfurfural (HMF),
formado como consecuencia de la degradacin de las hexosas (glucosa, manosa y
galactosa). A su vez, estos dos compuestos se pueden degradar a otros productos. El
furfural puede degradarse a cido frmico o bien polimerizarse (Dunlop, 1948). El HMF
origina cantidades equimoleculares de cidos frmico y levulnico (Ulbricht y col.,
1984). Adems de estos dos cidos alifticos (frmico y levulnico), se origina cido
actico procedente de la hidrlisis de los restos acetilos de la hemicelulosa. La
composicin de la fraccin lquida obtenida tras el pretratamiento depende del tipo de
madera del que provenga. Los hidrolizados procedentes del pretratamiento de
maderas duras tienen una mayor concentracin de furfural y cido actico que el
hidrolizado obtenidos en el pretratamiento de maderas blandas, debido al mayor
contenido en pentosas y restos acetilados de las hemicelulosas de las maderas duras.
Durante el pretratamiento, una parte de la lignina tambin se degrada originado una
gran variedad de compuestos fenlicos. Se trata de un grupo de compuestos muy
heterogneo que se pueden encontrar en forma de monmeros, dmeros y polmeros
con una gran variedad de sustituyentes (Larsson, 2000). Entre ellos, se encuentran
cidos, aldehdos y alcoholes aromticos. Los fenoles originados en el pretratamiento
varan segn el tipo de biomasa, ya que existe una gran diferenciacin de la lignina
atendiendo al grupo taxonmico al que pertenezca la especie vegetal. Un derivado
fenlico muy abundante en los hidrolizados de maderas duras es el cido 4-
hidroxibenzoico. Se origina por la rotura de los enlaces ester que lo unen a los grupos
hidroxilos de los alcoholes cinmicos que forman la lignina (Sjstrm, 1993). Otros
derivados fenlicos abundantes en los hidrolizados de maderas duras son el
siringaldehdo y el cido sirngico, procedentes de la degradacin de las unidades
siringilpropano de la lignina (Tran y Chambers, 1985; Ando y col., 1986; Jnsson y
col., 1998). El 4- hidroxibenzaldehdo y los cidos gentsico, saliclico y protocatquico
han sido identificados tambin en hidrolizados procedentes de maderas duras
(Jnsson y col., 1998).
Otros derivados fenlicos identificados tanto en maderas blandas como el pino (Clark y
Mackie, 1984) y abeto (Nilvebrant y col., 2000), como en maderas duras como el
chopo (Ando y col. 1986) roble (Tran y Chambers, 1985) y sauce (Jnsson y col 1998),
han sido la vainillina y el cido vainllico originados como consecuencia de la
degradacin de las unidades guayacilpropano de la lignina.. Adems de los
compuestos anteriormente citados, otros derivados fenlicos detectados en el
hidrolizado de diferentes tipos de maderas han sido el catecol (Buchert y col., 1990;
Jnssn y col., 1998), guayacol (Buchert y col., 1990), hidroquinona, (Palmqvist,
1998), aldehdo coniferlico y cido homovainllico (Larsson y col., 1999).
Un tipo de compuestos (no incluidos en los tres grupos citados anteriormente) que se
liberaran durante el pretratamiento son los extractivos. Entre ellos se encuentran
diferentes tipos de resinas (cidos grasos, terpenoides, esteroles y ceras) y
compuestos fenlicos (flavonoides, taninos, etc.) (Ekman y Holmbom, 2000). Estos
compuestos, a pesar de su baja concentracin, tambin pueden actuar como
inhibidores de los microorganismos empleados en la fermentacin de los hidrolizados
procedentes de materiales lignocelulsicos (Larsson, 2000).




2.2.6 EFECTOS DE LOS COMPUESTOS TXICOS SOBRE LOS
MICROORGANISMOS.
2.2.6.1 Furfural e hidroximetilfurfural (HMF).
Entre los efectos producidos por el furfural sobre los microorganismos citados en la
bibliografa se encuentran: reduccin de la tasa especfica de crecimiento (Azhar y
col., 1981; Navarro, 1994); disminucin de la productividad volumtrica de etanol
(Navarro, 1994; Larsson y col., 1999b); descenso de la productividad especfica de
etanol (Palmqvist y col., 1999b; Taherzadeh y col., 2000b) y disminucin de la
produccin de biomasa (Palmqvist y col., 1999b). Los efectos producidos por el HMF
aunque menores ya que la toxicidad mostrada por este compuesto sobre los
microorganismos es menor que la del furfural son los mismos (Taherzadeh y col., 2000
a; Larsson, 2000).
El efecto txico ocasionados por los furanos parece deberse a que, al ser aldehdos,
son compuestos qumicamente reactivos que pueden formar compuestos con
determinadas molculas biolgicas como lpidos, proteinas y cidos nucleicos (Singh y
Khan, 1995), o bien producir daos sobre la membrana plasmtica (Zaldivar y col.,
1999). Adems, el furfural produce la inhibicin de enzimas glicolticos y fermentativos
(Banerjee y col., 1981; Zaldivar y col., 1999; Modig y col., 2002). La inhibicin que el
furfural ejerce sobre la alcohol deshidrogenasa podra explicar la excrecin de
acetaldehdo observada durante las primeras horas de la fermentacin en presencia
de este derivado del furano (Palmqvist y col., 1998).
El furfural y el HMF son metabolizados tanto por bacterias como levaduras (Villa, 1992;
Delgenes y col., 1996; Palmqvist y col., 1999b; Taherzadeh y col., 2000 a, b; Larsson y
col., 2000; Gutirrez y col., 2002). En condiciones de anaerobiosis, como
consecuencia del metabolismo del furfural, se produce principalmente alcohol fufurlico
y, en menor concentracion, cido furoico. La hiptesis de que la reduccin de furfural a
alcohol furfurlico est catalizada por una alcohol deshidrogenasa dependiente de
NADH est prcticamente aceptada (Diaz de Villegas y col., 1992; Taherzadeh y col.,
2000b). En condiciones de anaerobiosis, durante la fermentacin se produce glicerol
para regenerar el exceso de NADH producido en la biosntesis y mantener el balance
redox intracelular (Albers y col., 1996). En fermentaciones en presencia de furfural no
se observa produccin de glicerol, lo que sugiere que la reduccin del furfural a alcohol
furfurlico oxida el NADH en condiciones de anaerobiosis (Palmqvist y col., 1998). Sin
embargo, esta hiptesis puede ser refutada por algunos argumentos. La especificidad
de una enzima por un sustrato viene dada por la forma y tamao del centro activo. El
centro activo de la alcohol deshidrogenasa de S. cerevisiae es demasiado pequeo
para aceptar molculas mayores que el acetaldehdo. Adems, la mayora de
experimentos en relacin con la especificidad de este enzima se han realizado con
preparaciones comerciales, que por un lado son una mezcla de isoenzimas y por otro
lado difieren en algunos aminocidos con la alcohol deshidrogenasa clonada de S.
cerevisiae, lo cual puede influir en la especificidad del enzima por el sustrato (Reid y
Fewson, 1994).

2.2.6.2 cidos alifticos.
Aunque est bien documentado en la bibliografa que los cidos alifticos dbiles
producen descenso del rendimiento en etanol (Pampulha y Loureiro-Dias, 1989) y
disminucin de la produccin de biomasa (Taherzadeh y col., 1997a), el mecanismo
por el que se produce la inhibicin no est completamente aclarado.
Uno de los mecanismos propuesto para explicar el efecto inhibitorio de los cidos
alifticos es la teora del desacoplamiento. Segn esta, el efecto txico depende del
pKa de los cidos y del pH del medio. nicamente la forma no disociada de los cidos
penetra en la clula por difusin (Verduyn y col., 1992), donde, debido al mayor pH
intracelular se disocia, provocando un descenso del pH (Pampulha y Loureiro-Dias,
1989) que debe ser compensado por una ATPasa de membrana que bombea protones
al exterior a costa de la hidrlisis de ATP. La menor cantidad de ATP disponible para
la formacin de biomasa celular, explicara la disminucin del crecimiento observada
cuando hay en el medio cido aliftico. Cuando la concentracin de cido es
suficientemente alta, se supera la capacidad de bombeo de protones, lo que origina la
acidificacin del citoplasma y la posterior muerte celular (Imai y Ohono, 1995).
Otro mecanismo propuesto, para explicar este efecto inhibitorio de los cidos es la
acumulacin intracelular de aniones (Russel, 1992). Segn esta teora, mientras que
los protones son excretados al exterior los aniones son capturados en la clula
producindose una acumulacin de los mismos en el interior de esta. La inhibicin
podra estar relacionada con la toxicidad del anin. Aunque no se conoce con certeza
el mecanismo de inhibicin de los cidos alifticos, el efecto txico mostrado por estos
compuestos puede deberse tanto al desacoplamiento como al efecto inhibitorio de la
acumulacin de aniones. (Palmqvist y col., 1998).Probablemente, el efecto de los
cidos alifticos de cadena corta tambin se deba a un efecto directo de estos
compuestos sobre la integridad de la membrana (Heipieper y col., 1994). La insercin
de las cadenas alifticas en la membrana puede alterar su estructura e hidrofobicidad,
produciendo un aumento de la permeabilidad de la misma y afectar a su funcin de
barrera selectiva.
2.2.6.3 Compuestos fenlicos.
De los inhibidores identificados en los hidrolizados de los materiales lignocelulsicos,
los compuestos aromticos de bajo peso molecular son los que se han mostrado como
los ms txicos para los microorganismos (Tran y Chambers 1986; Buchert y col.,
1989; Palmqvist, 1998; Zaldivar y col., 2001). Aunque, el mecanismo de inhibicin no
se conoce completamente, se ha estudiado el efecto de los derivados fenlicos sobre
procariotas como Klebsiella pneumoniae (Tran y Chambers, 1986; Nishikawa y col.,
1988) y Escherichia coli (Zaldivar y col., 1999, Zaldivar y Ingram, 1999). El efecto
txico de los aldehdos aromticos puede deberse a una interaccin con determinadas
zonas hidrofbicas de las clulas y causar perdida de la integridad de la membrana
afectando a su capacidad de actuar como una barrera selectiva (Heipieper y col.
1994). Zaldivar y col. (2000) demostraron que el efecto txico de los alcoholes
aromticos se deba al dao ocasionado por estos alcoholes sobre la membrana
plamtica. El efecto inhibitorio mostrado por los cidos aromticos puede basarse en
mecanismos semejantes al de los cidos alifticos descritos anteriormente (Larsson,
2000).
Aunque se han realizados diversos estudios sobre el efecto de los derivados fenlicos
sobre levaduras (Mikulsov y col., 1990; Delgenes y col., 1996) y especialmente
sobre Saccharomyces cerevisiae (Jnsson y col., 1998; Palmqvist y col., 1996a, 1998;
Larsson y col., 1999b, 2000). El mecanismo de inhibicin sobre los eucariotas no est
completamente aclarado. Sin embargo, debido a que la estructura de la membrana
plasmtica es similar a la de procariotas, se postula que los mecanismos de inhibicin
pueden ser similares (Larsson, 2000).
Al igual que con el furfural e HMF, existen datos en la bibliografa que demuestran la
capacidad de determinados microorganismos, tanto bacterias como K. pneumoniae
(Nishikawa y col., 1988) o Z. mobilis (Delgenes y col., 1996), como levaduras
pertenecientes a los gneros Saccharomyces, Pichia, Pachysolen y Candida (De Wulf
y col., 1986; Delgenes y col., 1996; Larsson y col., 2000) de metabolizar los aldehdos
aromticos. Sin embargo, los datos ofrecidos por la bibliografa sobre el papel de la
alcohol deshidrogenasa de S. cerevisiae en la conversin de estos compuestos
resultan contradictorios (Bowen y col., 1986; Long y col., 1989). Otros enzimas, que
pueden estar implicadas en el metabolismo de los aldehdos aromticos son la
vainillina oxidoreductasa (De Wulf y col., 1986), aldosa reductasa (Khun y col., 1995) o
la arilalcohol deshidrogenasa (Delnieri y col., 1999).

2.2.7 MTODOS DE DETOXIFICACIN

Son variadas las opciones de detoxificacin que se han aplicado con xito o no en
distintos tipos de biomasa. Las mismas estn clasificadas segn el tipo de substancias
y acciones que las constituyen, por lo cual varios autores las agrupan en fsicas,
qumicas y biolgicas (Oliva, 2003; Mussatto y Roberto, 2004).

2.2.7.1 Mtodos biolgicos.

Involucran el uso de enzimas y microorganismos especficos que actan sobre los
compuestos txicos cambiando su composicin (Mussatt Roberto, 2004). Para el caso
de la detoxificacin con enzimas se encuentran principalmente el uso de peroxidasas y
lacasas. Las primeras, transforman primordialmente fenoles y aminas aromticas;
estas son de gran efectividad e incluyen enzimas tales como horseradish peroxidasa
(HRP), lignin peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP), entre otras; y son
producidas por distintos microorganismos en especial de tipo fngico (Hamid y
Rehman, 2009). En cuanto a las Lacasas, son conocidas bajo el trmino Sistemas
Mediadores de Lacasas (LMS), ya que rene un complejo enzimtico conformado por
distintas enzimas. Son muchas las fuentes o microorganismos productores de lacasas
un completo listado de ellos lo presenta Rodrguez y Toca (2006).

En cuanto a los microorganismos empleados para detoxificacin se encuentran tanto
de tipo bacteriano como fngico. Para el caso de los fngicos existen investigaciones
como Nichols et al. (2008), donde emplean una cepa aislada de Coniochaeta ligniaria
NRRL30616, para tratar los inhibidores presentes en un hidrolizado de maz despues
de pre-tratamiento acido-diluido. En el caso del uso de bacterias, esta Okuda et al.
(2008), en el cual utilizan una cepa de Ureibacillus thermosphaericus, para detoxificar
hidrolizado de madera pre-tratado con acido diluido.





2.2.7.2 Mtodos fsicos y qumicos.

En la tabla 6, se describen cada uno de estos mtodos de detoxificacin, algunos aun
no probados en hidrolizados para produccin de etanol, pero que pueden considerarse
como alternativas de uso y ensayo en esta etapa.


2.2.8 HIDRLISIS ENZIMTICA

2.2.8.1 Definicin

Proceso catalizado por enzimas denominadas celulasas, cuyo proposito es la
degradacin de la celulosa (los autores). El uso del pre-tratamiento como se explicaba
anteriormente, facilita el desarrollo de esta etapa. Cabe destacar que en la mayora de
procesos existe un primordial interes por los azucares provenientes de la celulosa, sin
embargo, la tendencia actual es el aprovechamiento integral de la biomasa, y en
especial de otros azucares como las pentosas, provenientes de la hemicelulosa,
conllevando al uso de enzimas que actuen sobre dichas substancias como es el caso
de las xilanasas y las xilasas (los autores).

2.2.8.2 Contenido enzimtico

Las enzimas del complejo celulasa y el mecanismo de la hidrolisis enzimtica, segun
Cita Gmez (2008), han sido agrupadas en tres componentes mayores:
Endo -glucanasas o 1,4--glucan glucanohydrolasas (EC 3, 2, 1,4), que rompen los
enlaces -glucosidicos en forma aleatoria en el interior de las moleculas de celulosa.

Exo -glucanasas o 1,4--glucan celobiohidrolasas (EC 3, 2, 1,91), que atacan
gradualmente las moleculas de celulosa de los terminales no reductores
liberando subunidades de celobiosa.

B-glucosidasas o celobiosas (EC 3, 2, 1,21), la que hidroliza celobiosas y
celodextrinas de bajo peso molecular (celotriosas y celotetrosas) en glucosa.

Para el caso de la hemicelulosa esta corresponde a un heteropolisacarido, ya
que sus ramificaciones estn compuestas por ms de un tipo de monmero o
polisacridos como es el caso de la xilosa (principal constituyente), arabinosa,
galactosa, manosa, glucosa y acido glucoronico, a su vez unidos por un solo
tipo de monosacaridos unidos por enlaces (1-4), que forman cadena lineal
ramifi cada. Entre los cuales destacan la glucosa, la galactosa o la fructosa
(dependiendo del tipo de material a emplear) (Wikipedia, 2009). Por ello, con el
fi n de aprovechar la fraccin hemicelulosa se suelen emplear enzimas tales
como xilasas, xilanasas, -l arabinofuranosidasa, -xylosidasa, entre otras.


2.2.8.3 Uso de enzimas comerciales

Corresponden a preparados celulticos o hemiceluliticos obtenidos a partir de
microorganismos como hongos y bacterias, aerbicos o anaerbicos, mesofi los o
termfilos. No obstante, son de utilidad solo aquellos que presentan produccin
extracelular de celulasas y/o hemicelulosa. La tabla 4, muestra con base en
informacin encontrada en Ovando y Waliszewski (2005), una serie de
microorganismos a partir de los cuales se obtienen la mayor parte de los preparados
enzimticos comerciales.

Tabla 2. Microorganismos a partir de los cuales se obtienen enzimas celulosicas y/o
Hemicelulosicas.

Tipo de M.O. Caractersticas Nombre del M.O.



Bacteria
Aerobicas mesofilicas y
termofilicas
Cellulomonas sp., Cellvibrio sp.,
Microbispora
bispora y Th ermomonospora sp.
Anaerobicas mesofilicas y
termofilicas
Acetivibrio cellulolyticus,
Bacteroides
succinogenes, Ruminococcus
albus, Ruminococcus
fl avefaciens y Clostridium
thermocellum





Hongo
Aerobicos Trichoderma viride, Trichoderma
reesei,
Penicillium pinophilum,
Sporotrichum
pulverulentum, Fusarium solani,
Talaromyces
emersonii y Trichoderma koningii
Aerobicos Termofilicos Sporotrichum thermophile, Th
ermoascus
aurantiacus y Humicola insolens
Anaerobios mesofilicos Neocallimastix frontalis,
Piromonas communis,
Sphaeromonas communis
Fuente: los autores


De los anteriores segn la fuente citada, los ms comunes son los preparados
celulticos obtenidos a partir de Trichoderma sp, Aspergillius Niger y Bacillus Subtillis.
En cuanto a trabajos desarrollados que han empleando enzimas comerciales para la
hidrolisis de cascarilla se arroz se hallan Saha y Cotta, (2007 y 2008), en donde
adems de evaluar el pre-tratamiento alcalino (con Ca(OH)2 y NaOH), sobre cascarilla
de arroz, tambien determinaron los rendimientos en diferentes mezclas o cocteles
enzimticos. Por su parte, Krishna et al. (2001), emplean Celulasa de Trichoderma
reesei QM-9414 (Celluclast) y -glucosidasa (Novozym 188) de Aspergillus niger, para
la hidrolisis de diferentes residuos agroindustriales.

2.2.9 Fermentacin


Figura N 15. Diagrama general para la produccin de etanol a partir de materiales
lignocelulsicos.






















La fermentacin alcohlica es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia
de aire, originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los
hidratos de carbono (por regla general azucares: como pueden ser por ejemplo la
glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos
finales: un alcohol en forma de etanol, dixido de carbono en forma de gas y unas
moleculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo
celular energtico anaerbico.

2.2.9.1 Fermentacin de hexosas

Las hexosas son monosacaridos (glcidos simples) formados por una cadena de seis
tomos de carbono. Su formula general es C6H12O6. Su principal funcin es producir
energa. Un gramo de cualquier hexosa produce unas 4 kilocaloras de energa. Las
ms importantes desde el punto de vista biolgico son: glucosa, galactosa y fructosa

2.2.9.2 Fermentacin de pentosas

La interconversion de la pentosa y la hexosa sin oxidacion-reduccion tiene lugar por la
va de la pentosa-fosfato. Esta va permite la sntesis de la hexosa por bacterias que
crecen sobre la pentosa, y tambien permite la sntesis de otros dos azucares, la
seudoheptulosa-7-fosfato y la eritrosa-4-fosfato. Esta ltima es una precursora en la
biosntesis de los aminocidos aromticos. La fraccin de pentosas en la hemicelulosa
consiste principalmente de xilosas, pero depende del origen de la materia prima ya
que la fraccin de arabisona puede ser importante. Han sido estudiados diferentes
microorganismos para fermentacin, entre ellos bacterias, levaduras y hongos
(naturales y recombinados).

2.2.9.3 Clases de microorganismos levadura, bacterias y hongos

Las investigaciones desarrolladas sobre este tema se han dirigido a la solucin de
distintas problemticas. Por un lado se encuentra la capacidad natural de accin del
microorganismo empleado (velocidad de procesamiento, temperatura ptima de
trabajo, tipos de substrato a emplear, entre otros factores), y el anlisis de los
inconvenientes que genera en la biomasa y en las etapas posteriores del proceso el
tipo de pre-tratamiento dado a la biomasa y especficamente a su estructura. Por lo
cual han recurrido a diferentes tcnicas de mejoramiento de cepas (etanolgenicas,
termotolerantes,etc.), y al uso de distintas clases de microorganismos como bacterias,
Levaduras y hongos.

2.2.9.4 Bacterias empleadas en la fermentacin.

Se han empleado bacterias de los gneros Clostridium (sporogenes, indolicus,
sphnoides, saccharobutyricum, Th ermohydrosulfuricum y Th ermocellum), que
degradan grandes cantidades de celulosa y otros polisacaridos. Otras bacterias
empleadas son: Zimomonas mobilis, Erwiniaamilovora, Spirocheta aurantia,
Streptococus lactis, Spirocheta litorales y Spirocheta stenostrepta, con resultados
satisfactorios en cuanto a productividad. Igualmente, se han empleado bacterias
modificadas genticamente para la degradacin tanto de hexosas como de pentosas,
y con caractersticas de resistencia. Al respecto Patrouilleau et al. (2007, pag. 24)
sealan las ventajas de emplear la cepa bacteriana de la especie Escherischia coli,
desarrollada y patentizada por la Universidad de Florida (EUA), que fermenta ambos
tipos de azucares; introduccin de operones que codifican enzimas para la asimilacin
de xilosa y de la ruta de las pentosas fosfato en Zymomona mobilis (Zhang et al.,
1995).


2.2.9.5 Levaduras empleadas en la fermentacin.

Aunque ms lentas en la ejecucin del proceso de fermentacin, las levaduras son los
microorganismos de mayor uso en la produccin de etanol, debido a su productividad,
baja produccin de inhibidores y facilidad de separacin despus de la fermentacin.
En dichos procesos se emplean levaduras de los gneros Candida (seudotropicalis),
Saccharomyces (ceresviceae, ellipsoideus, anamensisi, carlsbergensis) y
Kluyveromyces marxianus y fragilis (Krishna et al., 2001), que adems de altas
eficiencias, son capaces de trabajar a temperaturas superiores a los 40C. Otras son
Candida bytyrii, Pichia stipitis, Schizosaccharomyces pombe y Pichia
membranaefaciens.
Al igual que con las bacterias se han desarrollado investigaciones en las cuales se han
modificado de alguna forma las especies originales de levadura. Una de dichas
investigaciones dio lugar al desarrollo, en la Universidad Nacional de Colombia (2007),
de una cepa de la especie Kluyveromyces marxianus, obtenida por mutagenesis
qumica y posterior seleccin, capaz de fermentar la glucosa con buenos rendimientos,
y otra ha sido citada por Patrouilleau et al. (2007, Pag. 24), quien seala la
introduccin de plasmidos con genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa de P.
stipitis en Saccharomyces spp. Para la co-fermentacion eficiente de glucosa y xilosa.

2.2.9.6 Cultivos fngicos empleados en la fermentacin.

Aunque no se encuentran tan ampliamente difundidos a nivel industrial como las
levaduras o las bacterias, estos ofrecen ventajas como reduccin de costos, fcil
adquisicin, entre otras; que coexisten con desventajas como los largos tiempos de
residencia que requieren. Dentro de ellos se encuentran hongos como Mucor
racemosus, del genero Rhizopus y Aspergillus. Karimi et al. (2006), compara la
produccin de etanol a partir del hidrolizado de hemicelulosa de cascarilla de arroz
empleando levadura Pichia stipitis y el hongo Mucor indicus, encontrando mayor
conversin de xilosa a etanol por parte del cultivo fngico en condiciones aerobias.

2.2.9.7 Uso de co-cultivos.

El uso de co-cultivos o cultivos mixtos de microorganismos ya sean del mismo o
diferente tipo tambien ha sido empleado, con el fi n de acelerar el proceso de
fermentacin o de complementar la accin de los microorganismos para obtener
mayores rendimientos en la tasa de conversin de azucares a etanol. Muestra de ello,
es el uso de dos levaduras, una que fermenta las hexosas, como S. ceresviceae, y
otra que fermenta las pentosas, como P. stipitis, aunque se han tenido mejores
resultados en co-cultvios de P. stipitis con K. marxianus (Iraj et al., 2007); o cultivo
mixto de bacteria y levadura, como Clostridium y/o Zymomonas mobilis y/o E. colli y S.
ceresviceae. Tambien se han reportado estudios de cultivos mixtos de hongos y
levaduras como Trichoderma viride y Pachysolen tannphylus, Aspergillus niger y
Saccharomyces cerevisiae, desarrollados con el mismo proposito (Hernandez, 2007).