H.

Pylori IgG, IgM, IgA

Cdigo: 9001601
9001602
9001603

Ensayo de quimioluminiscencia inmuno absorbente para la deteccin cuantitativa de
H. Pylori IgG, IgM, IgA en suero o plasma

96 Pruebas

INTENCION DE USO

La determinacin cuantitativa de Anticuerpos especficos de Anti-
H.Pylori de tipo IgG, IgM o IgA en suero humano o plasma en un
anlisis con microplato de Quimioluminiscencia (CLIA).

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA

El Helicobacter pylori ha sido mostrado como un bacilo curvo indefinido
que fue observado por Warren
1
y Marshall
2
en contacto cercano con el
epitelio gstrico en estudios de biopsias en pacientes que sufren de
gastritis crnica. A pesar de que la fuente del H. pylori es desconocida,
la evidencia es muy convincente que el bacilo causa una gastritis
aguda y puede caer en gastritis crnica. Sethi et al
5
ha reportado que
el H. pylori se present en noventa y un 91% de pacientes con gastritis
crnica superficial. Marshall
5
determino que el H. pylori se present en
90% de ulcera duodenal y setenta por ciento de pacientes con lcera
gstrica.

El uso de pruebas serolgicas para comprobar el anticuerpo producido
inmunolgicamente por la infeccin de H. pylori se ha sugerido como el
mtodo de eleccin para el monitoreo en grandes poblaciones. Las
mediciones de los anticuerpos de H. pylori se ha hecho por hema-
glutinacin la fijacin del suero de complemento y aglutinacin
bacterial. Estas pruebas no tienen la sensitividad de la enzima por
inmunoensayo y son limitadas por interpretacin subjetiva. Este
procedimiento, con la sensitividad mejorada de la ELISA, permite una
fcil deteccin de anticuerpos para el H. pylori. En adicin, los
resultados son cuantificados por un espectrofotmetro, el cual elimina
la interpretacin subjetiva.

La metodologa de inmunoensayo de enzima por microplato, provee al
tcnico con una sensitividad ptima as como tambin requiere de muy
pocas manipulaciones tcnicas. En este mtodo, el suero de
referencia, el espcimen diluido del paciente, o control es primero
agregado a un pozo de microplato. Se aade el H,pylori Biotinilado, y
entonces se mezclan los reactivos. Una reaccin resulta entre los auto
anticuerpos del H.pylori y el H pylori Biotinilado para formar un
complejo inmune, el cual es depositado sobre la superficie de los
pozos cubiertos con streptavidin a travs de la alta afinidad de la
reaccin de biotin y streptavidin.

Despus de completado el perodo de incubacin requerido, los
reactivos son separados por la aspiracin o decantacin los cuales no
quedaron adheridos a los pozos. Una enzima anti-humana IgG, M o A
conjugada es entonces aadida para permitir la cuantificacin de la
reaccin a travs de la interaccin con complejos inmunes humanos
IgG, IgM e IgA. Despus de lavar, la actividad de la enzima
determinada por la reaccin con el sustrato para producir luz.

El empleo de varias referencias de suero con la actividad de
anticuerpos conocidos permite la construccin de un grfico de la
actividad de la enzima y anticuerpo. De la comparacin de la curva de
la reaccin a cierta dosis, la actividad de un espcimen desconocido se
puede correlacionar con el nivel de anticuerpo auto inmune.

PRINCIPIO

Mtodo Secuencial de CLIA (Tipo 1):
Los reactivos esenciales requeridos por un anlisis secuencial de CLIA
incluido el antgeno inmovilizado, el anticuerpo circulante y el
anticuerpo de enzima-ligada especies-especficos. En este
procedimiento, la inmovilizacin toma lugar durante el ensayo de la
superficie del pozo en el microplato a travs de la interaccin del
streptavidin cubierto sobre el pozo y el antgeno de H. pylori biotinilado
exogenous agregado.







Una vez mezclado el antgeno biotinilado y un suero que contiene el
anticuerpo, resulta una reaccin entre el antgeno y el anticuerpo para
formar un complejo inmune. La interaccin es ilustrada por la siguiente
ecuacin:



Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs de la
reaccin de lata afinidad de streptavidin y antgeno biotinilado. Esta
interaccin se ilustra abajo:

Despus del perodo de incubacin, el pozo se lava para separar los
componentes desatados por la aspiracin o la decantacin. La enzima
ligada al anticuerpo especies-especfico (anti-h-IgG, M o A) se agrega
entonces al pozo. Este conjugado ata al complejo inmune que form.

La enzima conjugada de anti-h-IgG, IgM o IgA que se ata al complejo
inmune en una segunda incubacin es separada del material sin reaccin
por un paso de lavado. La actividad de la enzima en esta fraccin es
directamente proporcional a la concentracin de anticuerpo en el
espcimen. Al utilizar diferentes referencias de suero de actividad de
anticuerpo conocida, una curva de referencia puede ser generada de la
cual la actividad del anticuerpo para un desconocido puede ser
comprobada.
REACTIVOS Y MATERIAL PROVEEIDO

A. Calibradores Anti-H.Pylori -- 1ml/vial - Iconos A-E
Cinco frascos de referencia para anti-H.Pylori en los niveles de 0(A),
10(B), 25(C), 50(D) y 100(E) U/ml* del tipo IgG, IgM e IgA. Almacene
entre 2-8C. Se ha agregado un preservativo. *Valor de referencia del
fabricante.
B. REACTIVO BIOTIN de H.Pylori - 13ml/vial - Icono
Un frasco de H.Pylori biotinilado inactivo (IgG, IgM o IgA) en una matriz
de suero. Un preservativo se ha agregado. Almacnese entre 2-8C.
C. REACTIVO TRAZADOR de H.Pylori - 13ml/- frasco del icono
Un frasco de conjugado de Peroxidasa Horseradish anti-humano IgG, IgM
o IgA en una matriz de suero. Se ha agregado un preservativo. Almacene
entre 2-8C.
D. POZOS DE REACCIN A LA LUZ - 96 pozos - icono
Un microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en
una bolsa de aluminio con un agente deshidratado. Almacnese a 2-8C.
E. Diluyente de Suero - - 20 ml
Un frasco con diluyente de suero que contiene solucin salina y un tinte.
Almacnese entre 2-8C.

F. SOLUCION CONCENTRADA LAVADORA--20ml - icono
Un frasco que contiene un surfactante en solucin salina. Un
preservativo ha sido agregado. Almacnese entre 2-30C.
G. REACTIVO SUSTRATO A -- 7ml/frasco icono S
A

Un frasco que contiene luminol en solucin. Almacn entre 2-8C.
(Vea la Seccin de Preparacin de reactivos.)
H. REACTIVO SUSTRATO B --7ml/frasco icono S
B
Un frasco que contiene el perxido de hidrgeno (HO) en solucin.
Almacnese entre 2-8C.
I. Instrucciones del producto.
Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fecha de vencimiento del
kit.
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta das cuando
estn almacenados entre 2-8C.

MATERIAL REQUERIDO PERO NO
PROPORCIONADO

1. Pipeta capaz de entregar los volmenes 10, 25 y 50l con una
precisin mejor de 1.5%.
2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volmenes
0.100ml y 0.350ml con una precisin de mejor de 1.5%.
3. Lavador de Micro placas o una botella de apretn (opcional).
4. Luminmetro de micro placas.
5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la
microplaca.
6. Plstico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la
incubacin.
7. Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado.
8. Contador de tiempo.
9. Materiales del control de calidad

PRECAUCIONES

Para el Uso De Diagnstico In Vitro No Para el Uso Interno o Externo
en Seres Humanos o Animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido
encontrados para ser no-reactivos para el antgeno superficial de la
hepatitis B, los anticuerpos del VIH 1&2 y de HCV por los reactivos con
licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba sabida puede ofrecer
termine el aseguramiento que los agentes infecciosos estn ausentes,
todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como
potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los
buenos procedimientos del laboratorio para manejar productos de la
sangre se pueden encontrar en el Centro para el Control de
Enfermedad/el Instituto Nacional de la Salud, "Bioseguridad en
laboratorios microbiolgicos y biomdicos," 2da Edicin, 1988,
publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION

Los especmenes deben ser sangre, suero o plasma en tipo y tener las
precauciones generales en la coleccin de muestras del veni-puntura.
Para la comparacin exacta a los valores normales establecidos, una
muestra de ayuno del suero de la maana debe ser obtenida. La
sangre se debe recoger en un tubo liso de venipuntura de tapn rojo
sin aadidos o anticoagulantes. Permita que la sangre coagule.
Centrifugue el espcimen para separar el suero de las clulas.
Las muestras se pueden refrigerar entre 2-8C. por un perodo mximo
de cinco das. Si el espcimen no se puede probar dentro de este
tiempo, la muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20C.
por hasta 30 das. Evite congelar y deshelar. Cuando analice en
duplicado, se requiere 0.100 ml IgM % IgA) o 0.050ml (IgG) se requiere
del espcimen diluido.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS

1. DILUYENTE DE SUERO
Diluya el suero, diluyendo a 200ml en un contenedor adecuado con
agua destilada o desionizada. Almacnese entre 2-8C.
2. SOLUCION LAVADORA.
Diluir el contenido del concentrado lavador a 1000ml con agua
destilada o desionizada en un contenedor adecuado. Almacnese a
temperatura ambiente entre los 20-27C.





3. SOLUCIN DE TRABAJO SUSTRATO.
Determine la cantidad de reactivo necesario y prepare mezclando
porciones iguales del reactivo sustrato A y sustrato B en un contener
limpio. Por ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B por dos tiras de 8
pozos (Se crea un exceso pequeo de solucin). Deseche la porcin sin
usar si no se usa dentro de las 36 horas siguientes despus de ser
mezclado. Si la utilizacin de los reactivos se completa anticipadamente,
dentro del tiempo, vierta los contenidos del Reactivo de Seal B dentro
del Reactivo de Seal A y etiquete adecuadamente.
4. Dilucin de la Muestra del Paciente (1/100)
Dispense 0.010ml (10l) de cada espcimen del paciente en 1 ml del
suero diluido. Cubra y mezcle por inversin. Guarde entre 2-8C. hasta
por cuarenta y ocho horas.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

Antes de proceder con el anlisis, tenga todos los reactivos, referencias
del suero y controles a la temperatura ambiente (20 - 27C.).
1. Ajuste el formato de los pozos de las micro placas para que cada
referencia del suero, control y espcimen del paciente sean analizados en
duplicado. Guarde los micropozos nuevamente dentro del bolso de
aluminio, sllela y almacnela a 2-8C.
2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25l) de la referencia, del control o del
espcimen apropiado del suero en el pozo asignado para la
determinacin de IgG. Para IgM o IgA pipetear 0.50ml (50l) del suero
de referencia apropiado, control o espcimen diluido de paciente en
el pozo asignado.
3. Agregue 0.100 ml (100l) del reactivo Biotin de H.Pylori. Es muy
importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo.
4. Remolinar el micro placa suavemente por 20-30 segundos para
mezclar y cubrir.
5. Incube 45 minutos en la temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido del micro placa por decantacin o la aspiracin.
Si decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con el papel
absorbente.
7. Agregue 350 l de la solucin lavadora (vase la seccin de la
preparacin del reactivo), decntelo (golpee y borre) o asprelo. Repita
cuatro veces adicionales para un total de cinco lavadas. Una lavadora
automtica o manual de la placa puede ser utilizada. Siga las
instrucciones del fabricante para el uso apropiado. Si se emplea una
botella de apretn, llene cada uno bien presionando el envase (evite
burbujas de aire) para dispensar la lavada. Decante la lavada y repita
cuatro veces adicionales.
8. Agregue 0.100ml (100l) de Anti-Ig (x-IgG, IgM o IgA) Reactivo
Trazador de a cada pozo.
9. Remolinar el micro placa suavemente por 20-30 segundos para
mezclar y cubrir e incube por 30 minutos a temperatura ambiente.
10. Repita los pasos (6 & 7) como se explico arriba.
11. Agregue 0.100 ml (100l) del reactivo de la solucin de trabajo a
todos los pozos (vase la seccin de la preparacin el reactivo). Agregue
siempre los reactivos en el mismo orden para reducir al mnimo
diferencias de tiempo de reaccin entre los pozos.
12. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad por cinco minutos.
13. Lea las Unidades Relativas de Luz en cada pozo con un lector de
microplato de quimioluminiscencia por 0.5-1.0 segundo. Los resultados
se deben leer en el plazo de treinta minutos de agregado el sustrato.

Nota: Para especmenes que nuevamente se ensayen con
concentraciones mayores de los 100 U/ml, diluya la muestra un adicional
1:5 o 1:10 usando el material de dilucin original en el suero diluido.
Multiplique por el factor de dilucin para obtener la concentracin del
espcimen.
CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto
rango de la curva de la reaccin para monitorear el buen funcionamiento
del ensayo. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y
determinar los valores en cada mtodo de prueba realizada. Las tablas
de control de Calidad deben de mantenerse para seguir el funcionamiento
de los reactivos provedos. Los mtodos estadsticos pertinentes deben
ser empleados para comprobar las tendencias. Desviaciones
significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un cambio
experimental en las condiciones o degradacin del kit de reactivos. Se
deben usar reactivos frescos para determinar la razn de las variaciones.

CALCULO DE RESULTADOS
Una curva en la reaccin se usa para comprobar la concentracin de
anti-H.pylori en especimenes desconocidos.
1. Registre los RLUs obtenidos del listado del lector del micro placas
conforme al ejemplo 1.
2. Trace los RLUs para cada referencia duplicada del suero contra la
concentracin correspondiente a la actividad de anti-H.pylori en U/ml
en el papel de grfico lineal.
3. Dibuje la mejor curva a travs de los puntos trazados.
4. Para determinar el nivel de actividad de H.pylori para un
desconocido, localice el promedio de RLUs del desconocido en el eje
vertical del grfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y
lea la concentracin (en U/ml) del eje horizontal del grfico (los
duplicados del desconocido se pueden hacer un promedio segn lo
indicado). En el siguiente ejemplo, el promedio de RLUs (70400) del
desconocido intersecta la curva de calibracin a 69.3U/ml de la
concentracin de anti-H.pylori (ver Ejemplo 1)


Nota: El software de la reduccin de datos de la computadora
diseado para los anlisis de Quimioluminiscencia se puede tambin
utilizar para la reduccin de datos.

Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son
ilustrativas solamente no deben usarse para basarse en la curva
preparada con cada ensayo. En adicin, los RLUs de los calibradores
deben ser normalizados a 100,000 RLUs para el calibrador F (mayor
salida de luz). Esta conversin minimiza las diferencias causadas por
la eficiencia de la variedad de instrumentos que pueden ser usados
para medir la salida de luz.
PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD
En orden para que los resultados del anlisis sean considerados
vlidos los criterios siguientes deben ser conocidos:
1. La Curva de Respuesta a la Dosis intercepciones 80%; 50% y 20%)
debe estar dentro de los parmetros establecidos.
2. Cuatro fuera de seis piscinas de control de calidad deben estar
dentro de los rangos establecidos.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

A. Funcionamiento del Anlisis.
1. Es importante que el tiempo de la reaccin en cada uno pozos este
llevada a cabo constante para resultados producibles. El medir con una
pipeta de muestras no debe extender ms all de diez minutos para evitar
la deriva del anlisis. Si se utiliza ms de una placa, se recomienda
repetir la curva de la reaccin a cierta dosis.
2. El no retirar la solucin adecuadamente en el paso del lavado y de la
aspiracin o de la decantacin puede dar lugar a la rplica pobre y a
resultados falsos.
3. Las muestras que puedan estar contaminadas micro biolgicamente,
no deben ser usadas en el anlisis. La lipemia elevada o especmenes
hemolizados no deben ser usados.
4. Los especmenes de pacientes con concentraciones altas de H.pylori
en especmenes de pacientes pueden contaminarse inmediatamente
despus siguiendo estos niveles extremos. Duplicar mal es indicativo de
contaminacin cruzada. Repita cualquier muestra, que le siga al
espcimen de cualquier paciente con el doble de RLUs del calibrador
100 U/ml.

B. Interpretacin.
1. Si se usa la informacin de reduccin de datos por computadora para
interpretar los resultados de la prueba, es imperativo que los valores
predichos para los calibradores caigan dentro un 10% de las
concentraciones asignadas.
2. El significado clnico del resultado no debe ser usado para evaluar la
posible presencia de enfermedades gastrointestinales. De cualquier
manera, las interferencias clnicas no deben basarse solamente en esta
prueba pero es preferible como un adjunto para las manifestaciones
clnicas del paciente y otras pruebas relevantes como la Histologa,
Urologa y cultura. Un resultado positivo no es indicativo de enfermedad
gastrointestinal y no es distinguible entre la colonizacin o infeccin de
H.Pylori. Similarmente, un resultado negativo no elimina la presencia de
infeccin de H.pylori pero tal vez un valor bajo de anticuerpo puede estar
relacionado a estados tempranos de colonizacin.

RANGOS ESPERADOS DE VALORES

Un estudio de poblacin aparentemente saludable (n=118) y pacientes
sufriendo anormalidades gstricas (n=154) fueron tomadas para
determinar los valores esperados para el sistema de pruebas de H. pylori
Acculite de CLIA. Basados sobre la siguiente informacin puntos de
niveles de corte fueron establecidos.

La presencia de anticuerpos IgG e IgA de H.Pylori est confirmada
cuando los niveles de suero excedan los 20U/ml.
La presencia de anticuerpos IgM de H.pylori est confirmada cuando
los niveles de suero excedan los 40U/ml.

Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los
valores que se pueden esperar ser encontrado por un mtodo dado para
una poblacin de personas normal es dependiente sobre una
multiplicidad de factores: la especificidad del mtodo, de la poblacin
probada y de la precisin del mtodo en las manos del analista. Por estas
razones cada laboratorio debe depender de la gama de valores
esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una lata
interna de la gama determinada por los analistas usando el mtodo con
una poblacin indgena al rea en la cual el laboratorio est situado.

CARACTERISTICAS DE ACTUACIN

La precisin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de Anti-
H.Pylori (IgG) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por
anlisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El nmero (N),
el valor medio(X), la desviacin de estndar () y el coeficiente de
variacin (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se presentan
en la tabla 1 y la tabla 2.




B. Precisin Anti-H. Pylori IgM
La precisin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de
Anti-H.Pylori (IgM) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada
por anlisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El
nmero (N), el valor medio(X), la desviacin de estndar () y el
coeficiente de variacin (C.V.) para cada uno de estos sueros del
control se presentan en la tabla 3 y la tabla 4.





C. Precisin Anti-H. Pylori IgA
La precisin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de
Anti-H.Pylori (IgA) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por
anlisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El nmero
(N), el valor medio(X), la desviacin de estndar () y el coeficiente de
variacin (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se
presentan en la tabla 5 y la tabla 6*.




D. Sensitividad, Especificidad y Exactitud:
La sensitividad, especificidad y exactitud para el microplato ACCULITE
de CLIA fue determinado usando las siguientes definiciones sobre una
poblacin de pacientes normales y enfermos. El nmero total de
especimenes fue de 245.
IgG IgM IgA
Sensitividad 95% 91% 94%
Especificidad 98% 88% 91%
Exactitud 97% 91% 93%



REFERENCIAS













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Rev. 08-2011