Guía de Laboratorio Bioqumica 2012

GUA DE LABORATORO
BOQUMCA
CARRERAS FACULTAD DE CENCAS DE
LA SALUD
Profesores:
Mauricio Mondaca
Julia Opazo
Facultad de Ciencias de la Salud 2012
REGLAMENTO INTERNO LABORATORIOS.
1. La Asistencia a Laboratorio es de un 100%.
2. El uso del delantal o cotona blanca es OBLIGATORIO, ste debe usarse
abotonado, el pelo debe llevarse toado, NO se debe !n"er!r al!entos n!
beb!das en el laborator!o. LOS TEL#$ONOS %EL&LARES SE 'EBEN A(AGAR.
3. Se exige (&NT&ALI'A'.
4. Los estudiantes que lleguen atrasados antes del trmino del control, podrn ingresar
y rendir el respectivo control de laboratorio (solo se aceptarn dos atrasos en el
semestre).
5. Los estudiantes que no tengan su delantal NO podrn ingresar al laboratorio, lo cual
implica no rendir el control respectivo siendo calificado con nota 1)0 (uno coma cero).
6. NO se aceptar recuperar laboratorios.
7. El uso de la Gua de Laboratorio es OBLIGATORIO, los estudiantes que no tengan su
gua de laboratorio se les calificar con nota 1.0 (uno coma cero).
*. E+AL&A%IONES,
8.1 En TO'OS los laboratorios se realizar un control de entrada, que comprender
materia DEL LABORATORO A E$E%T&ARSE. Este control tendr una duracin
mxima de diez minutos.
8.2 Para cada tema de laboratorio se deber realizar un informe (ver seccin
elaboracin de informe)
8.3 Al final del semestre se realizar un EXAMEN DE LABORATORO, terico
prctico.
8.4 Las ponderaciones de Laboratorio son:
10% : Controles de Laboratorio
10%: nformes - Seminarios
10% : Examen de Laboratorio
8.5 A LOS ALUMNOS QUE SEAN SORPRENDDOS COPANDO EN LOS
CONTROLES, O EN EL EXAMEN, SE LES RETRARA LA PRUEBA, SENDO
CALFCADOS CON NOTA 1.0 (uno coma cero).
2
$orato de Elaborac!-n de In.ores.
Papel tamao carta.
Letra Arial 10.
Mrgenes 2 cm por cada lado.
Los ttulos y subttulos deben ir en negrita.
Escritura a espacio simple.
El nmero total de hojas no debe sobrepasar las 15, incluyendo portada e ndice.
El informe debe incluir:
1/ Tapa,
Titulo. (nombre de la gua)
ntegrantes. (Nombre y apellidos)
Nombre docente:
Fecha de realizacin del prctico
2/ 0nd!ce.
- Especificar la pgina en la que se encuentra cada uno de los captulos del informe.
1/ Introducc!-n,
- ndicar el marco terico del estudio realizado.
- Especificar los objetivos generales y especficos del trabajo realizado.
2/ Mater!ales 3 M4todos,
- Presentar las actividades realizadas y los medios empleados en su desarrollo incluyendo
fotos, grficos, esquemas, lminas, etc. Citar la bibliografa consultada en el caso de ser
necesario.
5/ Resultados,
- En esta parte se mostrar en forma de tablas todos los resultados de las mediciones
realizadas.
6/ '!scus!ones,
-Realizar una discusin de los diferentes resultados que se obtengan, comparndolos con
fundamento terico de lo observado en el laboratorio.
Ej: Si entre dos muestras problemas observ un cambio de color cual es el principio
qumico que lo hizo cambiar y mostrar ese tipo de reaccin para lo cual debe utilizar
bibliografa.
7/ %onclus!ones,
- Presentar las conclusiones obtenidas y posibles recomendaciones que el alumno pueda
aportar.
*/ B!bl!o"ra.8a,
Al final de cada informe se deber detallar la bibliografa consultada en base al siguiente
modelo.
Libros.
APELLDO E NCAL DEL NOMBRE DEL AUTOR 1; APELLDO E NCAL DEL
NOMBRE AUTOR 2; APELLDO E NCAL DEL NOMBRE AUTOR 3; ETC. Ao de
3
publicacin. Ttulo de la publicacin. Editorial. Cuidad y pas de publicacin. __ Pg.
(pginas del texto).
Ej: Matissek, R., Schnepel, F. N. y Steiner, G. 1998. Anlisis de los alimentos. Ed. Acribia.
Zaragoza, Espaa.: pp. 1 y 229-232.
Revistas u otra publicacin peridica:
APELLDO E NCAL DEL NOMBRE DEL AUTOR 1; APELLDO E NCAL DEL
NOMBRE AUTOR 2; APELLDO E NCAL DEL NOMBRE AUTOR 3; ETC.Ao de
publicacin. Ttulo de la publicacin. EN REVSTA: Editorial.pp.: __ - __ (pginas citadas).
Ej: Mazziatelli, M., and A. Shubert. 1990. Effect of several VAM endophytes and artificial
sustrate on vitropropagated Vitis berlandisi x rupestri 1103. En revista: Agric. Ecosyst.
Environ.29:279-283.
Webibliografa:
APELLDO E NCAL DEL NOMBRE DEL AUTOR. Disponible en: Pgina web.
SORA A., Elia M., REYES E., Carlos, OCCEGUERA A., Zenaida et al.MCORRZACN
DE PLANTAS MCROPROPAGADAS DE CAA DE AZCAR (Sacharum officinarum).
Agric. Tc. [online]. oct. 2001, vol.61,no.4 [citado 02 Septiembre 2007], p.436-443.
Disponible en la web: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-
28072001000400005&lng=es&nrm=iso>. SSN 0365-2807.
NOTA,
No se aceptaran como bibliografa o fuente de informacin.
www.rincondelvago.com
www.wikipedia.com
www.yahoo.com
www.altavista.com
Ni otro tipo de web de dudosa fuente
Si se sorprenden informes en donde la informacin escrita es copiados y pegados textual
desde las pginas web sin haber analizado u ordenado las ideas este informe ser
evaluado con nota 1.0
4
IN'I%E 'E A%TI+I'A'ES
ES(E%TRO$OTOMETRIA 6
TAM(ONES O B&$$ER 11
9I'RATOS 'E %ARBONO 16
LI(I'OS 20
TIT&LA%ION 'E AMINOA%I'OS 22
E:TRA%%I;N 'E 'NA 27
EN<IMAS 10
METABOLISMO 12
%ARBO9I'RATOS 17
TRIGLI%ERI'OS EN (LASMA 20
'ETERMINA%I;N 'E &REA 21
'ETERMINA%I;N 'E %REATININA 26
'ETERMINA%ION 'E $OS$ATASA AL%ALINA =AL(/ 2*
9O>A 'E RE(ORTE 51
5
(RA%TI%O N?1.
ES(E%TRO$OTOMETRIA
.! "#$RO%&''"(#
Utilizando trminos quizs excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometra
de absorcin, como la medida de la atenuacin que el material a estudiar (muestra)
efecta sobre una radiacin incidente sobre el mismo con un espectro definido. En
general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y
este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la rad!ac!-n
v!s!ble, situada por encima de 380 nm, y la zona de la rad!ac!-n ultrav!oleta situada por
debajo de estos 380 nm. La regin del !n.rarro@o se sita por encima de los 800 nm.
La energa de una onda electromagntica est dada por la ecuacin: E = AB) donde h es
la constante de Planck y v es el nmero de onda (el recproco de la longitud de onda /).
La energa de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones C y electrones no
enlazantes desde su estado basal a un nivel energtico mayor (estado excitado) y, en
consecuencia, se dice que la molcula que contiene estos electrones absorbe luz a la
longitud de onda correspondiente.
Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en molculas conjugadas
(molculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugacin
aumenta la longitud de onda de la absorcin al disminuir la diferencia energtica entre el
estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de
alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto nmero de enlaces
conjugados, como el -caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados
que permite la absorcin de luz se denomina cro-.oro.
Si una luz blanca pasa a travs de una solucin que contiene compuestos que actan
como cromforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color
resultante de la solucin se debe a la luz transmitida.
La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella,
que puede ser utilizada para su identificacin y cuantificacin, ya que un compuesto
determinado tiene un espectro de absorcin caracterstico, por lo tanto la comparacin del
espectro de este compuesto puro con los espectros de compuestos conocidos permitir
su identificacin.
6
Le)es de la absorcin de energa radiante
Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el
que es absorbida la energa radiante. En trminos generales, puede decirse que hay dos
variables capaces de afectar al grado de absorcin: la concentracin del absorbente y la
longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a travs de la solucin.
La Le3 de Labert D Beer establece que la absorcin es proporcional al nmero de
molculas de la sustancia absorbente presente en la solucin por donde pasa el haz
electromagntico. La expresin matemtica para esta ley es:
A = s l c
Donde s es la "absortividad molar (una medida de la radiacin absorbida), que es un
valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda /. Cuando la concentracin,
c, es expresada en moles por litro se denomina "coeficiente de extincin molar y cuando
es expresada en gramos por litro "coeficiente de extincin especfico. El trmino "l
representa el espesor de la capa absorbente y est en unidades de cm.
Cuando las medidas se efectan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de
cubetas estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos pticos
debidos a la cubeta son reproducibles, el trmino "l de la expresin de la absorbancia se
hace constante. Dado que s, es tambin constante para un determinado absorbente y una
concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente
proporcional a la concentracin:
A = k c (k = s l)
'aractersticas de un espectrofot*etro
La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotmetro:
7
Estos equipos contienen los siguientes componentes bsicos:
Posee una .uente de luE capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere
medir. El selector de lon"!tud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda
deseada. Una rend!@a u or!.!c!o define la intensidad de luz incidente sobre la muestra
dispuesta en una celda o cubeta que posee un dimetro de 1 cm y no interfiere con el
paso de la luz, y finalmente, la luz emitida despus de su paso por la celda es cuantificada
por un detector.
La fuente de luz emite un rango continuo de longitudes de onda y es regulada por voltaje.
Generalmente, la luz del rango visible es emitida por una lmpara de tungsteno (340-900
nm) y la luz UV es emitida por una lmpara de deuterio (200-360). Las cubetas
empleadas son de vidrio para el rango visible y de cuarzo para el rango UV (el vidrio no es
transparente a la luz UV).
Los espectrofotmetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje
de transmitancia (%T). La relacin entre ambos es:
A F 2 D lo" G T
La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la
Transmitancia es que la relacin existente entre la concentracin y la absorbancia es
lineal, cosa que no sucede con el %T.
La absorbancia de una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya
concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes,
8
reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda. Estos compuestos se
denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para
ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del
sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia
de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se
calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisin.
'urvas de calibracin.
Una curva de calibracin relaciona las A %T con las concentraciones y su empleo es
necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentracin del
absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construccin de una curva de
calibracin que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la prctica.
La elaboracin de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier
procedimiento fotomtrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de
unidades de medida; sin embargo, la medida ms conveniente es emplear para las curvas
las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.
Ejemplo: Curva de la
Hemoglobina.
9
Dado que la Absorbancia es proporcional a la concentracin, tendremos que:
A1 / A2 = C1/ C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema
A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin conocida
C1 = Concentracin del problema
C2 = Concentracin del estndar
%oncentrac!-n =problea/ F A1 =problea/ H A2 =estIndar/J %oncentrac!-n estIndar
+.! O,J-$".O/
Una de las aplicaciones prcticas de mayor inters de la espectrofotometra de absorcin
UV-Visible es la del anlisis cuantitativo, basada en la aplicacin de la ecuacin de
Lambert- Beer.
Mediante el siguiente prctico se buscar:
- Aprender a usar correctamente el espectrofotmetro
- Conocer y aplicar los principios bsicos de la espectrofotometra
0.! P1R$- -2P-R"M-#$1L
&so del espectro.ot-etro
1.D (reparac!-n de soluc!ones de colorantes,
1.1.D (repare las s!"u!entes soluc!ones,
a) 250 mL de solucin de Eosina Amarilla al 0,04 % p/v
b) 250 mL de solucin de Fuccina cida al 0,05 % p/v
c) 500 mL de solucin de Verde Malaquita al 0,05 % p/v
1.2.D A part!r de las soluc!ones anter!ores) real!ce d!luc!ones para preparar,
a) 100 mL de solucin de Eosina Amarilla 20 ppm
b) 100 mL de solucin de Fuccina cida 5 ppm
c) 100 mL de solucin de Verde Malaquita 5 ppm
2.D Real!ce el espectro de absorc!-n de su colorante,
Para el uso del espectrofotmetro siga las siguientes instrucciones:
1. Encendido de lmparas:
1.1.- Lmpara de tungsteno (Zona del visible, 900 a 340 nm), encendido
instantneo
1.2.- Lmpara de Deuterio (Zona del UV, 340 a 200 nm aprox), encienda el equipo
30 min antes de usarlo
2. Oprima la tecla A/T/C para accionar el modo absorbancia
3. Seleccionar la longitud de onda con el mando correspondiente.
4. nserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimiento de muestras
10
5. Oprima la tecla 0 ABS para llevar a cero absorbancia
6. Saque el blanco e inserte la muestra problema en el portaceldas, cierre la puerta del
compartimiento.
7. Lea la medicin de absorbancia en la pantalla.
Iportante, las cubetas epleadas en el espectro.ot-etro =1 c de espesor/
deben estar escrupulosaente l!p!as 3 deben co"erse s!epre por sus caras
eser!ladas u opacas. No es conven!ente secarlas con papel corr!ente por el
carIcter abras!vo de 4ste s!no con un papel suave.
Act!v!dad,
Siguiendo las instrucciones anteriores sobre la utilizacin del equipo:
1. Seleccione una longitud de onda de 400 nm. en el modo absorbancia.
2. nserte el blanco y calibre a cero
3. Saque el blanco, coloque su muestra y determine el valor de absorbancia a 400
nm
4. Seleccione una nueva longitud de onda en 420 nm
5. Vuelva a calibrar con el blanco
6. Lea absorbancia de la muestra a 420 nm
7. Repita el procedimiento hasta los 700 nm para obtener el espectro visible de su
colorante.
8. Registre sus valores en la siguiente tabla:
9. Realice el grfico de la absorbancia en funcin de la longitud de onda en papel
milimetrado.
11
0.! %eter*ine el coeficiente de e3tincin *olar:
1. Cuando tenga el espectro determine la longitud de onda del mximo de
absorcin y calibre el equipo a dicha longitud de onda (/ mx).
2. Prepare 5 diluciones seriadas de su colorante (1/2, 1/4, 1/8 y 1/16) y mida la
absorbancia. No necesita recalibrar el equipo al no cambiar la longitud de
onda.
3. Grafique en papel milimetrado absorbancia v/s concentracin y determine el
coeficiente de extincin molar de su colorante.
12
(RA%TI%O N?2.
TAM(ONES o B&$$ER
INTRO'&%%ION.
La preparacin de tampones constituye una tarea de rutina en un laboratorio de
bioqumica. Su utilizacin no solo es indispensable en la manipulacin de cualquier
enzima, sino que todas aquellas tcnicas, analticas o preparativas, para la separacin de
molculas biolgicas capaces de ionizarse, basadas precisamente en la diferencia de
carga (electroforesis, cromatografa de intercambio inico) de las distintas molculas
implican la utilizacin de tampones adecuados que permitan una ionizacin diferenciada
de las molculas y, por tanto, su separacin.
Es imprescindible, en consecuencia, familiarizarse con la preparacin y caractersticas de
los tampones. Cmo preparar un tampn adecuado?, Cul es la zona til de un
tampn?, Cul es la capacidad de un tampn?, y, en definitiva Cmo debe prepararse
un tampn? Son cuestiones que debemos tener absolutamente claras.
En esta prctica realizaremos una serie de experimentos que adems de pretender
resolver las cuestiones sealadas previamente nos permitan visualizar el efecto de
tamponacin. (En caso de necesidad conviene repasar los conceptos tericos
relacionados: pH, pKa, disociacin de cidos y bases dbiles, etc.).
(RE(ARA%ION 'E &N TAM(ON.
Los tampones son, como sabemos, mezcla de cidos o bases dbiles con sus sales, y su
zona de utilidad como tales depende lgicamente del valor de su pKa. Este es pues un
factor limitante a la hora de seleccionar un tampn. Pero adems hay que tener en
cuenta, por ejemplo, si alguno de los componentes del tampn puede interferir con la
reaccin o el proceso a realizar. Este dato no siempre tendremos la posibilidad de
conocerlo a priori y puede ser necesario ensayar
varios tampones de similar pKa.
Por otra parte hemos de tener en cuenta cuales van a ser los cambios previsibles de la
concentracin de iones hidrgeno durante el proceso, con el fin de que el tampn que
preparemos tenga una capacidad adecuada para amortiguar dicho cambio en forma
conveniente.
En este sentido, hemos de tener en cuenta que si bien el valor de pH que se obtiene con
determinado tampn es dependiente de la relacin existente entre los dos componentes
del tampn, con independencia (dentro de ciertos mrgenes de concentracin en lo que
las variaciones de actividad sean despreciables) de la concentracin del tampn,
expresada siempre como la suma de las concentraciones de ambos componentes. En
definitiva, pues, la preparacin de un tampn implica la seleccin inicial del mismo en
base a los requisitos sealados previamente.
El clculo de la relacin de concentraciones entre ambos componentes necesaria para
obtener el pH deseado, se utiliza la ecuac!-n de 9endersonD9asselbalcA, y el clculo
de las cantidades de cada uno de los componentes en base a la concentracin deseada y
del volumen total a preparar.
Ejemplo:
13
Deseamos preparar 100ml de un tampn A/AH de pKa 7.1 a pH 7.4 y una concentracin
0.1 M.
Partiendo de la ecuacin de Henderson-Hasselbalch:
pH = pKa + log [A] / [AH]
7.4 = 7.1 + log [A] / [AH]
log [A] / [AH] = 0.3 ; [A] / [AH] = 1.995
Teniendo en cuenta que deseamos preparar 100 ml de este tampn con una
concentracin 0.1 M, quiere esto decir que el nmero total de moles de A + AH ha de ser
de 0.01.
Luego:
[A] / [AH] = (0.01 x) / x = 1.995,
dado que el volumen es comn para ambos componentes.
De donde:
x = 0.0034 moles AH
0.01 x = 0.0066 moles de A
obteniendo de aqu el numero de gramos de cido (AH) y de sal (A) que se requieren
para la preparacin de los 100 ml de tampn.
En la prctica resulta ms conveniente preparar soluciones 0.1 M de cada uno de los
componentes del tampn y calcular la relacin de volmenes (que coincidir con la
relacin molar calculada previamente);
[A] / [AH] = 1.995 = c1 x v1 / c2 x v2; c1 = c2
v1/ v2 = 1.995 y como v1 + v2 = 100 ml
(100 v2) / v2 = 1.995
Sobre uno de los volmenes calculados se adicionara gradualmente el del otro
componente siguiendo las variaciones de pH en el pH-metro hasta conseguir el pH
deseado.
Como hemos dicho anteriormente el pH de un tampn es dependiente de la relacin entre
los componentes del mismo e independiente de su concentracin (dentro de ciertos
lmites), pero en cualquier caso no ocurre as con su capacidad de amortiguacin que
depende de la concentracin.
Con el fin de comprender estos conceptos y visualizar el efecto de amortiguacin del pH
se realizar la siguiente parte experimental.
(arte eKper!ental
A partir de soluciones 0.1 M de PO4H2K y PO4HK2, preparar 100 ml de tampn por
mezcla a partes iguales de ambas soluciones. Tras medir el pH del tampn as preparado
se proceder a la adicin, a partirde una bureta de alcuotas de 1 ml de HCl 1N, leyendo y
anotando el pH despus de cada adicin del cido, hasta alcanzar un pH que rebase las
dos unidades por debajo del de partida.
Con otros 100 ml de tampn preparado de la misma manera que anteriormente, se
procede de forma similar pero utilizando en este caso para la valoracin NaOH 1N, hasta
obtener un pH que sobrepase en dos unidades el de partida.
14
El experimento total se repetir con el tampn previamente diluido a la mitad.
Realizar con los datos obtenidos en cada caso las graficas respectivas que relacionen
valores de pH (en ordenadas) frente a ml de HCl y NaOH aadidos (en abscisas).
Comntense los resultados obtenidos respecto a:
- pKa del tampn
- efecto tampn
- capacidad del tampn
- efecto de la dilucin sobre los anteriores apartados.
Ejemplos:
15
(RA%TI%O N?1.
9!dratos de %arbono
INTRO'&%%ION
Los hidratos de carbono pertenecen los compuestos poli-funcionales que contienen grupo
carbonilo (aldehdo o cetnico ) y grupos hidroxilo alcohlicos.
Por lo tanto, ellos poseen simultneamente propiedades de aldehdos o cetonas y
de alcoholes polidroxilicos. Los hidratos de carbono comprenden un grupo amplio de
compuestos naturales que se dividen en monosacridos, oligosacridos y polisacridos.
Los monosacridos, segn el numero de tomos de carbono en la molcula, se
clasifican en triosas, terrosas, hexosas, heptosas, etc. La formula genrica de los
monosacridos es CnH2nOn. Todos los monosacridos naturales, teniendo en sus
molculas tomos de carbono asimtricos , son pticamente activos y giran en el plano de
la luz polarizada.
Los oligosacridos y polisacridos son hidratos de carbono complejos y al ser
calentados con cidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se obtienen monosacridos.
Los polisacridos forman mediante la hidrlisis un gran nmero de molculas de
monosacridos, adems poseen una masa molecular muy elevada, son insolubles en
agua o forman diluciones coloidales.
Los hidratos de carbono estn muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el
reino vegetal. Ellos constituyen los productos finales de la sntesis fotoqumica en plantas
verdes. Los animales, no aptos para la acumulacin de energa solar, aprovechan las
sustancias acumuladas en las plantas. Los hidratos de carbono participan en la
construccin de las estructuras de los organismos vivos, sirven de material para la
biosntesis de los compuestos de otras clases y juegan un papel importante en la
bioenergtica de la clula. Los hidratos de carbono estan en la composicin de los cidos
nucleicos, las glicoprotenas, glicolpidos y en algunas vitaminas y coenzimas.
%LASI$I%A%ION 'E LOS 9I'RATOS 'E %ARBONO
a) Monosacridos: Son generalmente slidos bien cristalizados, solubles en agua, de
sabor ms o menos dulce. Todos poseen propiedades reductoras, derivadas de
grupos carbonilos. Aldehdo (-CHO), o cetosa si contiene el grupo cetona (>C=O)
b) Disacridos: Formados por dos unidades de azcares simples siendo lo ms
importante aquellas derivadas de las hexosas; los que por bloqueo o no de las
funciones reductoras se clasifican en:
1. - Disacridos reductores ej: Maltosa, lactosa.
2. - Disacridos no reductores ej: Sacarosa.
c) Polisacridos: Son grandes molculas formados por condensacin de unidades de
monosacridos. Los ms comunes son: glicgeno, almidn, dextrinas y celulosa.
Cuando se obtienen materiales biolgicos de estructuras desconocidas, se emplean
usualmente dos tipos de determinaciones para establecer la presencia de hidratos de
carbono.
Una de las propiedades de los carbohidratos que se emplean en su determinacin es el
poder reductor (no todos los azcares tienen esta propiedad). El poder reductor de los
16
carbohidratos est condicionado a la presencia de un grupo aldehdo libre o un grupo
cetnico adyacente a un grupo hidroximetil.
En polisacridos donde los grupos aldehdos o cetnicos libres se encuentran
comprometidos formando enlaces glicosdicos, dan valores negativos con el test reductor.
Estos enlaces glicosdicos, son estables en medio alcalino pero se hidrolizan en presencia
de cido, liberando monosacridos que dan reaccin reductora positiva.
Numerosos agentes oxidantes como Cu2+, Ag+ y ferricianuro de potasio pueden
oxidar a los azcares reductores. En estas reacciones los carbohidratos sufren una serie
de degradaciones oxidativas mientras que la sustancia oxidante es reducida.
REA%%IONES 'E RE%ONO%IMIENTO 'E LOS 9I'RATOS 'E %ARBONO.
Usando las diferencias de las propiedades qumicas es posible identificar algunos
carbohidratos abundantes en la naturaleza a travs de ciertos tests muy simples.
Una propiedad de los carbohidratos y que se emplea en su determinacin es el poder
reductor. Esta propiedad est condicionada a la presencia de un carbono anomrico libre,
que es aquel ms oxidado. Numerosos agentes oxidantes como Cu 2+ (Fehling, Nelson),
Ag+ (Tollens) y Ferricianuro (Park-Johnson) pueden oxidar a los azcares reductores.
Todos los Monosacridos son reductores, como lo son tambin la mayora de los
Disacridos, siendo una excepcin importante la Sacarosa. Los Polisacridos son NO
reductores por estructura.
$est de 4e5ling
El complejo in cprico-tartrato (reactivo de Fehling) es reducido en ambiente alcalino
para formar xido cuproso (Cu2O), un precipitado pardo-rojizo. Cualquier carbohidrato
que d positivo el test de Fehling se considerar como un azcar reductor.
$est de /eli6anoff para 'etosas
Este test est basado en las reacciones de deshidratacin (eliminacin de H2O),
catalizada por cidos fuertes, en que las Cetosas la acusan con mayor rapidez que las
Aldosas. Esta deshidratacin conlleva a la formacin de Furfurales. Estos Furfurales luego
reaccionan con Resorcinol dando lugar a un compuesto coloreado. En consecuencia, las
velocidades de desarrollo de color de un azcar en presencia de HC y Resorcinol
(reactivo de Seliwanoff), permite establecer si un azcar es Cetosa o Aldosa.
17
$est de ,arfoed
Este test diferencia entre Monosacridos y Disacridos reductores. Los iones cpricos
(Cu2+) son reducidos por los azcares reductores para dar xido cuproso. En medio cido
los monosacridos reaccionan ms rpido que los disacridos.
7idrlisis 1cida
Los enlaces glicosdicos son estables en medio alcalino pero se hidrolizan en presencia
de cidos inorgnicos enrgicos, liberando Monosacridos los que darn reaccin
reductora positiva al someterlos al test de Fehling.
$est de "odo para 1l*idn
La fraccin molecular de Amilosa del Almidn, tiene estructura helicoidal y es capaz de
atrapar molculas de 2 (o 3-) para dar un complejo de color azul oscuro.
OB>ETI+OS
Caracterizar cualitativamente los carbohidratos de acuerdo a su reactividad en
presencia de reactantes especficos.
dentificar carbohidratos reductores.
Verificar la hidrlisis presentes en distintas muestras
(ARTE E:(ERIMENTAL
En este prctico cada grupo recibe una Muestra que debe ser identificada y que puede
ser cualquiera de los siguientes carbohidratos:
Glucosa, Fructosa, Lactosa, Sacarosa, Almidn u otros que se indicaran.
Para la identificacin se debe realizar los siguientes tests a cada muestra patrn y a la
muestra problema. Sea metdico y ante alguna duda repita el anlisis.
1.- Test de Fehling
Tome 1 punta de esptula de muestra ( 0.1 g) si sta es slida o 1 mL si sta es lquida y
agregue 1 mL de reactivo de Fehling (0,5 mL del A y luego 0,5 mL del B). Se coloca el
tubo de ensayo en un bao de agua a ebullicin por 5 min.(Use pinzas de madera y
coloque en el vaso piedras de ebullicin). El test es positivo si se forma un precipitado
pardo-rojizo de Oxido Cuproso una vez enfriado.
2.- Test de Seliwanoff (Resorcinol: 3-hidroxi fenol)
Tome 1 punta de esptula de muestra si sta es slida o 1 mL si sta es lquida y agregue
8 mL del reactivo de Seliwanoff, agitar. Colocar el tubo de ensayo en agua en ebullicin
por 10 a 15 min. Si la muestra contiene Cetosa aparece una coloracin rosada. Este
reactivo d un color verdoso cuando en el medio hay pentosas.
3.- Hidrlisis Acida
Tome 2 mL de muestra si sta es lquida o el doble de lo que ha estado utilizando, si sta
es slida y en este ltimo caso agregue 1 mL de agua destilada al tubo. Acidifique la
muestra con 0,5 mL de HC conc. (Cuidado!). Colocar el tubo de ensayo en bao de agua
en ebullicin por 15 a 20 min. Luego de enfriar neutralice con NaOH 10 % (p/v) midiendo
con papel pH. Los carbohidratos superiores no reductores deben liberar azcares ms
sencillas reductoras que se confirmaran por el test de Fehling.
18
4.- Test de odo para Almidn
Coloque 1 mL de muestra si sta es lquida o 1 punta de esptula si esta es slida y
agregue 5 gotas de la solucin de yodo/etanol (Lugol). La formacin de un color azul
intenso determina la presencia de Almidn.
Tabla de resultado Test
GLUCDO Fehling Seliwanoff Test de iodo
Glucosa
Fructosa
Lactosa
Sacarosa
Sacarosa
Hidrolizada
Almidon
19
(RA%TI%O N?2.
LI(I'OS.
INTRO'&%%ION
Bajo el trmino Lpidos se agrupan un gran nmero de compuestos, de estructura qumica
variada, que tienen la propiedad comn de ser solubles en solventes orgnicos e
insolubles en agua.
Los lpidos, ampliamente distribuidos en animales y vegetales, comprenden un grupo
heterogneo de sustancias similares entre s por sus caractersticas de solubilidad: son
nada solubles en agua y solubles en solventes orgnicos. Esta propiedad se explica por la
escasa polaridad de sus molculas.
Debido a las interacciones moleculares, una sustancia determinada es soluble en
solventes de naturaleza semejante a la suya. Sustancias polares se disuelven en
solventes polares; sustancias no polares, en solventes no polares.
Los lpidos no forman estructuras polimricas macromoleculares como las de los
polipptidos o polisacridos; su masa no alcanza valores muy elevados.
El estudio de los lpidos tiene especial inters desde el punto de vista biolgico: a) son
componentes esenciales de los seres vivos; constituyen parte fundamental de las
membranas celulares; b) en animales forman el principal material de reserva energtica
(grasas neutras); c) desde el punto de vista nutritivo, los lpidos de alimentos son
importantes fuentes de energa por su alto contenido calrico y, adems, vehiculizan
vitaminas liposolubles; d) numerosas sustancias de notable actividad fisiolgica estn
relacionadas con este grupo de compuestos: hormonas, algunas vitaminas, cidos
biliares.
De acuerdo con la complejidad de su molcula, se distinguen dos categoras de lpidos,
simples y complejos. Existen adems otras sustancias que comparten las propiedades de
solubilidad de los lpidos y se asocian a ellos en la naturaleza.
Son lpidos simples los acilgliceroles y las ceras. Los lpidos complejos comprenden
fosfolpidos, glicolpidos y lipoprotenas. Entre las sustancias asociadas a lpidos se
consideran diversos compuestos, como esteroles, terpenos, vitaminas liposolubles, etc.
En la molcula de casi todos los lpidos se encuentran cidos orgnicos monocarboxlicos
denominados genricamente cidos grasos. La importancia de estos compuestos en la
constitucin de lpidos y en la determinacin de sus propiedades aconseja su estudio en
primer trmino.
La hidrlisis de un fosfolpido de membrana, en ciertas ocasiones presenta particular
inters dado que algunos cidos grasos que estn esterificados al glicerol pueden actuar
como sustratos metablicos importantes, tal es el caso del cido Araquidnico.
Otro ejemplo en donde la hidrlisis de fosfolpidos es importante se da en la intoxicacin
ofdica. La serpiente Crotalus durissus terrificus (cascabel) posee un veneno compuesto
por una conjunto de protenas e iones. Una de las toxinas ms importantes posee
actividad Fosfolipasa (PLA2). El mecanismo de accin de esta protena es la hidrlisis de
la unin ster del carbono 2 presente en los fosfolpidos y de esto resulta la liberacin de
un acido graso y un lisofosfolpido con accin detergente sobre la membrana de los
glbulos rojos.
20
OB>ETI+OS
* Conocer las propiedades fisicoqumicas fundamentales de los Lpidos.
* Diferenciar las caractersticas y propiedades biolgicas de los Lpidos con respecto a
otras Biomolculas.
A%TI+I'A'ES
1/ Ensa3os de solub!l!dad,
a) En un tubo de ensayo colocar unas gotas de aceite y 3 ml de agua. Agitar
fuertemente. Observar. Dejar en reposo. Volver a observar.
b) Repetir el ensayo agregando previamente al aceite tres gotas de solucin de
NaOH.
c) Comparar la estabilidad de las emulsiones en ambos casos.
d) Preparar tres tubos de ensayo con unas gotas de aceite en cada uno.
e) Agregar en cada tubo uno de los siguientes disolventes: cloroformo, benceno,
acetona y tetracloruro de carbono.
f) Agitar, observar y comparar los resultados.
2/ MancAas en papel,
a) Sobre un trozo de papel verter una gota de aceite.
b) Sobre otro trozo de papel untar una pequea cantidad de manteca.
c) Sobre un tercer trozo de papel frotar un poco de grasa animal.
d) Observar los tres trozos de papel al trasluz. Comparar los resultados.
Reconoc!!ento de l8p!dos
MATERALES
Tubos de ensayo
Gradilla
Varillas de vidrio
Mechero
Vasos de precipitados
Pipetas
Solucin de NaOH al 20%
Solucin de Sudn
Tinta china roja
Eter, cloroformo o acetona
Aceite de oliva
1. SA(ONI$I%A%I;N
FUNDAMENTO
Las grasas reaccionan en caliente con el hidrxido sdico o potsico descomponindose
en los dos elementos que las integran: glicerina y cidos grasos. stos se combinan con
los iones sodio o potasio del hidrxido para dar jabones, que son en consecuencia las
sales sdicas o potsicas de los cidos grasos. En los seres vivos, la hidrlisis de los
triglicridos se realiza mediante la accin de enzimas especficos (lipasas) que dan lugar
a la formacin de cidos grasos y glicerina.
21
T#%NI%A
. Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%.
. Agitar enrgicamente y colocar el tubo al bao Mara de 20 a 30 minutos.
. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que
contiene la solucin de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia
semislida que es el jabn formado y una superior lipdica de aceite inalterado.
2. TIN%I;N
FUNDAMENTO
Los lpidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudn .
T#%NI%A
Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite.
Aadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solucin alcohlica de Sudn .
Al otro tubo aadir 4-5 gotas de tinta roja.
Agitar ambos tubos y dejar reposar.
Observar los resultados: en el tubo con Sudn todo el aceite tiene que aparecer teido,
mientras que en el tubo con tinta, sta se ir al fondo y el aceite no estar teido.
1. SOL&BILI'A'
FUNDAMENTO
Los lpidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en
pequesimas gotas formando una emulsin de aspecto lechoso, que es transitoria, pues
desaparece en reposo por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que, por su
menor densidad, se sita sobre el agua.
Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgnicos, como el ter,
cloroformo, acetona, benceno, etc.
TCNCA
Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo.
Aadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de ter u otro disolvente orgnico,
Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.
Observar los resultados: Se ver cmo el aceite se ha disuelto en el ter y, en cambio no
lo hace en el agua y el aceite subir debido a su menor densidad.
22
%&ESTIONARIO
1. Qu familias de compuestos qumicos se asocian bajo la denominacin comn
de lpidos?
2. Explique por qu los lpidos (Grasas y Aceites) son insolubles en agua.
3. A qu se debe el alto poder combustible de los lpidos?
4. Qu es la saponificacin?
5. Cmo acta un detergente?
23
(RA%TI%O N?5.
TIT&LA%ION 'E AMINOA%I'OS
'eter!nac!-n de pL1) pL2) (I
INTRO'&%%ION
Los aminocidos son molculas que contienen un grupo bsico (amino -NH2) y un
grupo cido (carboxilo -COOH) unidos por un tomo de carbono, el carbono d
Fig. N1: Estructura bsica de un aminocido
Los a-aminocidos difieren entre si por la cadena lateral (grupo -R) unida al carbono-a.
Las propiedades de los aminocidos queda determinada por estructura de la cadena
lateral R. Es as como los aminocidos se clasifican en Grupos R: apolares alifticos
(Glicina (Gly), Alanina (Ala), Valina (Val), Leucina (Leu), soleucina (le), Prolina (Pro),
aromticos (Fenilalanina (Fen), Tirosina (Tir), Triptfano (Tri), polares sin carga (Serina
(Ser), Treonina (Thr), Cisterna (Cys), Metionina (Met), Asparagina (Asn), Glutamina (Gln),
polares con carga negativamente (Aspartato (Asp), Glutamato (Glu), polares con carga
positivamente (Lisina (Lis), Arginina (Arg), Histidina (His).
24
Fig. N2: Ejemplos de estructuras de aminocidos.
Fig. N3: Estructura zwitterin.
Dado que todos los aminocidos poseen un grupo cido y un grupo bsico presentan
propiedades anfteras. Es decir, son molculas que puede donar y aceptar protones. En
una solucin cida los aminocidos estn completamente protonados (la forma catinica).
S la solucin es neutra, la mayora de los aminocidos existen como iones dipolares,
tambin llamados zwitterin. La carga neta de un in dipolar es cero (la forma neutra). El
pH en el cual predomina la forma con carga neutra del aminocido se llama el punto
isoelctrico (p). En una solucin alcalina se encuentra mayoritariamente la forma con
carga negativa, completamente desprotonada (la forma aninica).
25
Fig. N4: Curva Titulacin de Glicina
0,1 M A 25C.
Las especies inicas predominantes en puntos clave de la titulacin se muestran encima
de la grfica. Los recuadros sombreados, centrados alrededor de pK1 =2,34 y pK2 = 9,60
indican las regiones de mximo poder tamponante.
OB>ETI+OS
Determinar el pKa1, pKa2 de un aminocido sin carga
Determinar el pKa1, pKa2, pKR y p de un aminocido cido
Determinar el pKa1, pKa2 , pKR y p de un aminocido bsico
Mater!ales por "rupo React!vos
1 vaso pp 250 mL Solucin de Gli 0,025 Molar pH=2,00
2 vasos pp de 100 mL Solucin de Arg 0,025 Molar pH=2,00
1 pipetas aforadas de 25 mL Solucin de Asp 0,025 Molar pH=2,00
1 pizeta Solucin de NaOH 0,10 Molar
1 agitador magntico
1 barra magntica
1 bureta de 50 mL; 1 soporte universal
1 pH-metro; 1 pinza; 1 doble nuez
(arte EKper!ental
1. Tome una alcuota de 25 mL de solucin de glicina 0,025 Molar y virtala en un vaso pp
de 100 mL. ncluya la barra magntica y coloque sobre agitador magntico
2. Proceda a medir el pH. Registre este valor.
3. Ambiente una bureta de 50,0 mL con NaOH 0,10 Molar. Ahora llene la bureta con
NaOH 0,10 Molar (cuide que no queden burbujas en el vstago de la bureta y nala al
soporte universal)
4. Agregue NaOH 0,10 Molar en fracciones de 0,50 mL y mida el pH. (Cuide que la
agitacin sea constante)
5.Repita el paso 4 hasta llegar a pH 12,0.
26
(RA%TI%O N?6.
E:TRA%%I;N 'E 'NA
INTRO'&%%ION
El cido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado ADN, constituye el principal
componente del material gentico de la inmensa mayora de los organismos, junto con el
ARN, siendo el componente qumico primario de los cromosomas y el material con el que
los genes estn codificados.
Se trata de una molcula de gran peso molecular (macromolcula) que est constituida
por tres sustancias distintas: cido fosfrico, un monosacrido aldehdico del tipo pentosa
(la desoxirribosa), y una base nitrogenada cclica que puede ser prica (adenina o
guanina) o pirimidnica (timina, citosina o uracilo). La unin de la base nitrogenada
(citosina, adenina, guanina o timina) con la pentosa (desoxirribosa) forma un nuclesido;
ste, unindose al cido fosfrico, nos da un nucletido; la unin de los nucletidos entre
s en enlace diester nos da el polinucletido, en este caso el cido desoxirribonucleico.
Fig. N1: Estructura Bases Nitrogenadas.
La funcin principal del ADN es mantener a travs de un sistema de claves (cdigo
gentico) la informacin necesaria para que las clulas hijas sean idnticas a las
progenitoras (informacin gentica). Este proceso se almacena en la secuencia de las
bases (aparentemente aleatoria), que tiene una disposicin que es copiada al ARNm
(traduccin) para que en el ribosoma sintetice determinada protena. Este proceso es
27
tambin denominado "dogma central de la biologa molecular". Por medio de los
mecanismos de recombinacin y mutaciones se obtienen las variaciones necesarias para
adaptaciones y evoluciones.
El ncleo dirige las actividades de la clula y en l tienen lugar procesos tan importantes
como la auto duplicacin del ADN o replicacin, antes de comenzar la divisin celular, y la
trascripcin o produccin de los distintos tipos de ARN, que servirn para la sntesis de
protenas. Las cadenas de polipeptdicas codificadas por el ADN pueden ser estructurales
como las protenas de los msculos, cartlagos, pelo, etc., bien funcionales como las de la
hemoglobina o las innumerables enzimas del organismo. La funcin principal de la
herencia es la especificacin de las protenas, siendo el ADN una especie de plano o
receta para nuestras protenas.
El primer paso en la purificacin del DNA consiste en homogeneizar las clulas y lisar los
ncleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extraccin de ordinario contiene un
detergente, como el SDS, que sirve para lisar (romper) los ncleos y liberar el DNA, hecho
que aumenta notablemente la viscosidad de la solucin. El detergente inhibe tambin
cualquier actividad nucleasa en la preparacin. El objetivo de los pasos de purificacin es
separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y protenas.
OB>ETI+OS
- Conocer los procedimientos bsicos de purificacin y extraccin de DNA
- Conocer las diferentes funciones que tienen cada reactivo para realizar la extraccin
- Lograr la visualizacin de DNA
Mater!ales
Hojas de acelga
Sal
Agua fra
Detergente lquido
Licuadora
Jugo de papaya o pia
Vasos precipitados limpios
Colador o filtros
Alcohol fro
Palillos
Cuchara
(arte EKper!ental
En este prctico cada grupo contar con medio vaso de hojas de acelga al que se debe
agregar una punta de esptula de sal y 250 ml de agua destilada fra, licuar a alta
velocidad por 15 minutos. Las cuchillas de la licuadora separar las clulas de los tejidos
que forman parte de la hoja.
28
- Cuele el contenido del vaso de la licuadora a un vaso limpio. Aada 2 cucharadas
soperas de detergente lquido (solubiliza membranas). Mezcle todo y deje reposar 10
minutos.
- Vierta esta mezcla en pequeos recipientes de vidrio limpios.
- Aada a cada recipiente unas gotas de jugo de pia (enzima) y mezcla muy suavemente
para no formar espuma. Deje reposar 2 minutos.
- ncline cada recipiente y aade lentamente desde su borde el alcohol fro hasta que veas
una capa sobre el contenido. El DNA se elevar desde la mezcla hasta la capa de alcohol.
Con un palillo puedes manipular el DNA.
In.orac!-n para la real!Eac!-n del !n.ore
Para el informe deber averiguar lo siguiente:
1) Que funcin cumple el detergente
2) Que funcin cumple el alcohol
3) Que funcin cumple el jugo de lechosa
Esta informacin debe ser incluida en la parte de discusin.
29
(RA%TI%O N?7.
EN<IMAS
'eter!nac!-n de la act!v!dad enE!at!ca de Lactasa 3 coprarac!ones
entre el uso de la enE!a a d!.erentes cond!c!ones
INTRO'&%%ION
Se llaman enzimas a las protenas especficas que possen funcin cataltica. Con
la participacin de enzimas se verifican numerosos procesos qumicos, el conjunto de los
cuales constituye la esencia del metabolismo, influyendo en la velocidad de reacciones
metablicas, las enzimas son capaces de regular procesos de vitalidad. Semejantemente
a los catalizadores inorganicos, las enzimas aumentan las velocidades de reacciones
qumicas a cunata de la disminucin de la energa de activacin. Sin embargo los
catalizadores biologicos poseen una efeciencia mayor en la disminucin de la energa de
activacin, y como regla general , desempean su funcin a una temperatura y pH
caracteristicos segn la enzima. Al mismo tiempo las enzimas son sensibles a las
variaciones de las condiciones del medio en que estan funcinando y tienen una serie de
particularidades relacionada a su naturaleza proteica.
EnE!as d!"est!vas
Las enzimas adoptan una estructura tridimensional que permite reconocer a los
materiales especficos sobre los que pueden actuar -substratos-. Cada una de las
transformaciones, que experimentan los alimentos en nuestro sistema digestivo, est
asociada a un tipo especfico de enzima. Estas enzimas son las llamadas enzimas
digestivas. Cada enzima acta sobre un slo tipo de alimento, como una llave encaja en
una cerradura. Adems, cada tipo de enzima trabaja en unas condiciones muy concretas
de acidez, como se puede ver en el cuadro de abajo. Si no se dan estas condiciones, la
enzima no puede actuar, las reacciones qumicas de los procesos digestivos no se
producen adecuadamente y los alimentos quedan parcialmente digeridos.
El proceso normal de digestin de los alimentos, mediante la accin de las enzimas, da
como resultado nutrientes elementales (aminocidos, glucosa, cidos grasos, etc.) que
asimilamos en el intestino y son aprovechados por el organismo. Sin embargo, cuando las
enzimas no pueden actuar o su cantidad es insuficiente, se producen procesos de
fermentacin y putrefaccin en los alimentos a medio digerir. En este caso, son los
fermentos orgnicos y las bacterias intestinales las encargadas de descomponer los
alimentos. La diferencia es que en lugar de obtener exclusivamente nutrientes
elementales, como en el caso de la digestin propiciada por las enzimas, se producen
adems una gran variedad de productos txicos (indol, escatol, fenol, etc.). Estas
sustancias tambin pasan a la sangre, sobrecargando los sistemas de eliminacin de
txicos del organismo.
30
Tabla 2D Las enE!as 3 la d!"est!-n
Lactasa
La lactasa es una enzima producida en el intestino delgado, que juega un papel
vital en el desdoblamiento de la lactosa (proceso necesario para la absorcin de nuestro
organismo), en sus dos componentes bsicos: glucosa y galactosa. Si los niveles de la
lactasa son bajos a sta no realiza su labor desdobladota, aparecen dificultades para
digerir la lactosa.
(arIetros c!n4t!cos
Las enzimas, se caracterizan por medio de Km, constante de Michaelis-Menten y de la
Vm, velocidad mxima de reaccin.
La cintica o velocidad se puede medir:
a) midiendo la desaparicin de sustrato en el tiempo o
b) midiendo la aparicin de producto en el tiempo.
En este prctico se evaluar la accin de la enzima lactasa sobre la lactosa, disacrido
formado por una molcula de glucosa y galactosa, por lo tanto como producto se obtienen
molculas de glucosa libre, lo cual se puede cuantificar en el tiempo utilizando la
espectrofotometra. Por lo cual se medir la velocidad de la reaccin cuantificando la
concentracin de este en el tiempo (b).
V = p[glucosa]/ pt
mportante es controlar muy bien el tiempo de la reaccin, pt (tiempo de incubacin).
Para cuantificar los parmetros caractersticos de cada enzima con comportamiento de
Michaelis Menten, se realiza el estudio del efecto de la concentracin de sustrato frente a
la velocidad de la reaccin, donde se obtiene una curva, en la cual en un principio se
observa que al aumentar la [S] aumenta la velocidad de reaccin, hasta que llega un
momento en que aunque se aumente la [S], la velocidad ya no aumenta sino que se
mantiene constante, esta es la Vm y se alcanza cuando la enzima se atura con sustrato :
31
Fig N1: Dependencia de la Velocidad inicial con respecto a la concentracin de sustrato
en la que se muestran los parmetros cinticos que definen los lmites de
la curva a concentracin de sustrato alta y baja.
La obtencin de Km desde este grfico no es muy adecuada, ya que se requiere
de gran cantidad de puntos para construir la zona curva. En cambio si se tratar de una
lnea recta, esta queda determinada con tres puntos y es ms fcil, extrapolar o interpolar,
o calcular una pendiente o una interseccin. Es as como Lineweaver y Burk, linealizaron
el comportamiento de Michaelis-Menten obteniendo:
Fig. N3: Grfica doble reciproca o de Lineweaver-Burk (Slope= Pendiente).
Esta ecuacin es una trasformacin de la ecuacin de Michaelis- Menten denominada
ecuacin de Lineweaver- Burk.
OB>ETI+OS
- Determinar experimentalmente cual es la influencia de la temperatura y la concentracin
de sustrato sobre la actividad cataltica de la enzima lactasa en lactosa.
- Determinar experimentalmente los parmetros cinticos
(ARTE E:(ERIMENTAL
En el presente laboratorio se trabajar con lactasa. El sustrato a utilizar ser lactosa. Para
la determinacin de glucosa, se utilizar un kit comercial, las indicaciones del
procedimiento del kit ser informado por el profesor en el momento de realizar el practico
E.ecto de la concentrac!-n de sustrato
- Se prepara una solucin de lactosa al 1%
- Se utilizan 5 vasos precipitados, cada vaso tiene diferentes concentraciones de
lactosa , para evaluar el efecto
32
- Luego se coloca en un agitador magntico hasta alcanzar la temperatura de 35C
- Una vez instalado se agregan diferentes concentraciones de lactosa a cada vaso (que
se indicar en el prctico), en el cual se comienza a controlar el tiempo.
- Se deben sacar muestras cada 1 minuto hasta completar los 15 minutos.
- Las muestras deben ser colocadas en bao de hielo
- Se realiza la cuantificacin de glucosa por medio de Kit comercial.
- Se debe realizar un Blanco que no contenga sustrato
- Se debe realizar un control el cual no tiene enzima y mide la hidrlisis qumica del
sustrato.
E.ecto de la teperatura en la enE!a
Se realizar el mismo protocolo anterior pero a 50C
%Ilculos,
- Con los valores de absorbancia calcule la concentracin de glucosa. Con este valor y el
tiempo de incubacin calcule la velocidad de reaccin.
- Conociendo la concentracin inicial de sustrato, calcule la concentracin de este en cada
vaso.
- Grafique segn Lineweaver y Burk. Determine el valor de Km y Vmax.
33
(RA%TI%O N?*.
Metabol!so
Ses!-n de se!nar!o.
Los alimentos que ingerimos deben estar constituidos por los 6 componentes bsicos que
son protenas, carbohidratos, lpidos, vitaminas, minerales y agua, la cantidad que se
requiere ingerir de cada uno de los componentes vara de acuerdo a la constitucin y la
actividad fsica que se realiza, tanto la falta como en el exceso de consumo de alguno de
los componentes bsicos conlleva a diversos trastornos metablicos. Aproximadamente
del 40 al 45% de nuestra ingesta calrica proviene del consumo diario de carbohidratos
complejos los cuales al ser digeridos dan lugar a los diferentes monosacridos entre los
que se encuentra la glucosa, la cul se distribuye por la sangre a las clulas para poder
captar la glucosa, siendo la principal fuente de energa. Algunos tipos celulares son
dependientes de la liberacin de insulina por el pncreas como es el caso de las clulas
musculares. Si la insulina no funciona adecuadamente, la glucosa se queda en el flujo
sanguneo causando elevacin de los niveles de glucosa en la sangre y a esto se le
denomina hiperglucemia; una de las enfermedades que se caracteriza por la
hiperglucemia en sus primeras etapas es la diabetes mellitus.
La diabetes mellitus est caracterizada por una hiperglucemia resultante de defectos en la
secrecin de insulina, en la accin de la insulina o en ambas. La hiperglucemia crnica de
la diabetes est asociada a lesiones, disfuncin y fallo de varios rganos, especialmente
de los ojos, los riones, el corazn y los vasos sanguneos.
Varios procesos patognicos estn implicados en el desarrollo de la diabetes. Estos van
desde una destruccin autoinmunolgica de las clulas del pncreas, con la
consiguiente deficiencia de insulina, hasta anormalidades, en las que el pncreas no
produce suficiente insulina o la que produce no es eficiente. La accin deficiente de la
insulina en los tejidos diana es la responsable del metabolismo anmalo de los
carbohidratos de carbono, grasas y protenas en la
Diabetes. La accin deficiente de la insulina ocasiona una respuesta inadecuada en uno o
ms puntos de la compleja trama metablica en la que esta hormona tiene papel
regulatorio.
Frecuentemente coexisten en el mismo paciente una inadecuada secrecin de insulina as
como defectos de la accin de sta, en la actualidad no se sabe si una de estas
anormalidades es la consecuencia o la causa de la otra. En cualquier caso, el resultado
es la hiperglucemia. La gran mayora de los casos de diabetes pueden incluirse en dos
amplias categoras etiopatognicas. En el primer caso (diabetes de tipo ) la causa es una
deficiencia absoluta en la secrecin de insulina. Los individuos con alto riesgo de
desarrollar este tipo de diabetes pueden ser a menudo identificados mediante evidencias
serolgicas de un proceso autoinmune que se produce en los islotes pancreticos y
tambin mediante marcadores genticos. En la segunda categora (diabetes de tipo ),
mucho ms prevalente, la causa es una combinacin de una resistencia a la accin de la
34
insulina y de una inadecuada respuesta secretora compensadora. La diabetes tipo se
caracteriza por estar presente muchos aos antes de ser detectada una hiperglucemia sin
sntomas clnicos (sed, prdida de peso), pero suficiente para ocasionar cambios
patolgicos y funcionales sobre los rganos blanco. Durante este perodo asintomtico, es
posible demostrar trastornos en el metabolismo de los carbohidratos midiendo la glucosa
plasmtica en ayunas o despus de una sobrecarga de glucosa por va oral.
El exceso en la ingesta de carbohidratos no solamente mantiene la reserva de energa en
forma de glucgeno sino que tambin el exceso de carbohidratos es convertido en
triacilgliceroles. En el hgado los triacilgliceroles se sintetizan a partir de acil CoA y glicerol
3-fosfato siendo empaquetados con apoprotenas y en lipoprotenas de muy baja
densidad (VLDL), secretados al torrente sanguneo siendo almacenados en tejido
adiposo. Para su consumo los triacilgliceroles son hidrolizados a glicerol y cidos grasos.
En la dieta es importante la presencia de lpidos ya que son precursores de diferentes
componentes de la clula como los fosfolpidos, uno de los lpidos que tiene una gran
importancia en la clula es el colesterol, ya que proporciona rigidez a las membranas
celulares y es precursor de las sales biliares as como de hormonas esteroideas. El
colesterol se puede obtener por la alimentacin y por sntesis del propio organismo,
siendo las clulas hepticas y las suprarrenales las de mayor sntesis.
Para llevar a cabo la sntesis de colesterol se requiere la presencia de acetil-CoA el cual
proviene de la degradacin de glucosa, cidos grasos y aminocidos por lo cual se
denomina a la acetil-CoA la encrucijada metablica. El colesterol es insoluble en agua por
lo que transportado en la sangre por tres lipoprotenas que son de muy baja densidad
(VLDL), de baja densidad (LDL) y las de alta densidad (HDL). Los niveles normales de
colesterol total en sangre en un adulto son de < 200 mg/dl y cuando estos valores se ven
aumentados se asocian a la formacin de placas aterosclerticas que pueden ocluir los
vasos sanguneos y como consecuencia provocar infarto al miocardio y alteraciones
cardiovasculares.
La cuantificacin de las LDL representa un papel clave en la esclerosis coronaria ya que
concentraciones elevadas indican desarrollo de la aterosclerosis.
En el caso de las HDL al disminuir su concentracin aumenta el riesgo de desarrollar
aterosclerosis. Las protenas constituyen la fuente primaria del metabolismo del nitrgeno
en el organismo, Los aminocidos producto de la digestin de las protenas que se
consumen en los alimentos, son utilizados para la sntesis de protenas y de compuestos
nitrogenados o se puede oxidar
para producir energa.
El hgado es el rgano principal en donde se realiza la oxidacin de los aminocidos. El
nitrgeno de los aminocidos forma amoniaco el cual es toxico para el organismo. El
amoniaco y los grupos amino se convierten en urea en el
hgado, que no es toxica y se elimina fcilmente por la orina ya que es hidrosoluble. Otro
de los componentes del metabolismo nitrogenado son los nucletidos. Las purinas y las
pirimidinas, que son esenciales para la sntesis de nucletidos y cidos nuclecos. Los
nucletidos son precursores del DNA y el RNA, as como tambin forman parte de la
estructura de muchas coenzimas adems de ser componentes del metabolismo
energtico. La degradacin de las purinas no genera energa y el producto de la
35
degradacin del anillo purnico es el cido rico, que se elimina por la orina, tiene una
solubilidad limitada por lo que su exceso da como resultado la formacin de cristales en
regiones del organismo como pueden ser los dedos gordos del pie, trastorno que se
conoce como gota.
Los valores elevados de cido rico se presentan en: ingestin de alimentos ricos en
nucleoprotenas, insuficiencia renal, azoemias prerrenales.
Otro de los componentes del metabolismo nitrogenado es la creatinina que en el msculo
en su forma fosorilada sirve como almacn de alta energa y se transforma con facilidad
en ATP por la enzima creatina fosfocinasa. La creatina fosfato es inestable y se cicla
espontneamente forma la creatinina que se elimina en la orina. La produccin de
creatinina es proporcional a la masa muscular corporal. La cantidad de creatinina que se
elimina diariamente puede utilizarse como indicador de la normalidad de la funcin renal.
36
(RA%TI%O N?M.
%arboA!dratos
'eter!nac!-n de "l!ce!a
INTRO'&%%ION
Glicemia, glucemia, y glucosa sangunea, significan la concentracin de glucosa en
sangre. Qumicamente la glucosa es una aldohexosa en la cual la forma aldehdica est
en equilibrio con la forma enlica, estructura que est favorecida a pH fisiolgico.
La utilizacin de glucosa aumenta considerablemente por efecto de la insulina, ya que
sta facilita la penetracin de glucosa a las clulas. Cuando no existe suficiente insulina,
penetra menos glucosa, disminuyendo su oxidacin y aumentando la glucogenlisis
heptica, la utilizacin de grasas, la gluconeognesis y la produccin de cuerpos
cetnicos.
Se reconoce a la diabetes no tratada por presentar una elevacin crnica de la glucemia
llamada hiperglucemia. Este aumento se debe a un dficit total o parcial de insulina que
implica una disminucin de la metabolizacin de la glucosa y una hiperglucemia
secundaria y, segn el dficit, un incremento en la acidez corporal, que puede llegar a ser
incompatible con la vida.
$&N'AMENTO 'EL METO'O
La glucosa presente en la muestra es convertida por la glucosa oxidasa (GOD) en cido
glucnico y perxido de hidrgeno, que en presencia de peroxidasa (POD) oxida el
cromgeno 4-aminofenazona convirtindolo en un compuesto de color rojo.
El esquema de reaccin es el siguiente:
GOD
glucosa + O2 + H2O cido glucnico + H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + 4-hidroxibenzoato quinonimina roja
Se emplea para el anlisis suero o plasma heparinizado separado de la sangre tan pronto
como sea posible.
37
(RO%E'IMIENTO
En tres tubos marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido) colocar:
B S D
Standard - 10 ul -
Muestra - - 10 ul
Reactivo A 1 ml 1 ml 1 ml
ncubar 5 minutos en bao de agua a 37oC o 25 minutos a 15-25oC. Luego leer en
espectrofotmetro a 505 nm o en fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el
aparato a cero con el blanco.
ESTABLDAD DE LA MEZCLA DE REACCON FNAL
El color de reaccin final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leda
dentro de este lapso.
%AL%&LO 'E LOS RES&LTA'OS
Concentracin de la muestra = Absorbancia de la muestra x Concentracin patrn
Absorbancia del patrn
Concentracin del patrn = 100 mg/dL (5,55 mmol/L)
100 mg/dl
glucosa (mg/dl) = D x f f =
S
+ALORES 'E RE$EREN%IA
En la literatura (Tietz, N.W.) se menciona el siguiente rango de referencia:
Suero o plasma
Adultos: 74 - 106 mg/dl (4,11 - 5,89 mmol/l)
Nios: 60 - 100 mg/dl (3,33 - 5,55 mmol/l)
Neonatos: 1 da: 40 - 60 mg/dl (2,22 - 3,33 mmol/l)
mayor a 1 da: 50 - 80 mg/dl (2,78 - 4,44 mmol/l)
Orina aislada fresca
1 - 15 mg/dl (0,06 - 0,83 mmol/l)
Orina de 24 horas
38
< 0,5 g/24 hs (< 2,78 mmol/24 hs)
CONVERSON DE UNDADES AL SSTEMA S
Glucosa (mg/dl) x 0,0555 = Glucosa (mmol/l)
Glucosa (g/24 horas) x 55,5 = Glucosa (mmol/24 hs)
%uest!onar!o,
1-Qu otros mtodos se conocen para determinar glucosa sangunea y cul se
considera como mtodo de referencia?
2-En el mtodo empleado en el laboratorio, cul es el compuesto que finalmente se lee en
el equipo?
3-Mencione al menos tres causas tanto de HPERGLUCEMA fisiolgica como
patolgica y explique en cada caso.
4-Qu se entiende por HPOGLUCEMA y que factores la provocan?
5-Cuales son los criterios actuales para la clasificacin y diagnstico de la diabetes
mellitus?
6-Cul es la diferencia y semejanza entre diabetes mellitus y diabetes inspida?
7-Cmo se regulan los niveles de glucosa en la sangre?
39
(RA%TI%O N?10.
Tr!"l!cer!dos en plasa
INTRO'&%%ION
Los triglicridos son steres de glicerol y cidos grasos que provienen de la dieta o son
sintetizados principalmente en el hgado. Los triglicridos se transportan en el plasma en
las lipoprotenas y son utilizados por el tejido adiposo, msculo y otros. Su principal
funcin es suministrar energa a la clula.
El mayor contenido de los triglicridos se encuentra en quilomicrones y VLDL. Las
concentraciones elevadas de triglicridos en suero pueden ser debidas a alteraciones
hepatobiliares, diabetes mellitus, nefrosis, hipotiroidismo, alcoholismo,
hiperlipoproteinemia familiar tipo V (elevacin de VLDL) y tipo V (elevacin de VLDL y
quilomicrones), rara vez son tipo (elevacin exclusiva de quilomicrones).
El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico
ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.
No es tan clara la relacin entre la enfermedad cardiaca coronaria (CHD) y la
hipertrigliceridemia como con los niveles de colesterol LDL. Sin embargo, por estudios de
metanlisis se consideran los triglicridos un predictor independiente al colesterol de
CHD.
Para las pruebas de perfil lipdico el paciente debe estar en ayuno total excepto agua,
durante un lapso de 12 a 24 horas antes de la prueba. No debe haber realizado ejercicio
vigoroso y bajo la dieta corriente el da anterior de la prueba.
$&N'AMENTO 'EL M#TO'O =GLI%EROL $OS$ATO O:I'ASAH(ERO:I'ASA/
Los triglicridos presentes en la muestra originan, segn las reacciones acopladas
descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra.
El esquema de reaccin es el siguiente:
lipoprotein lipasa
triglicridos glicerol + cidos grasos
glicerol kinasa
glicerol + ATP glicerol-1-P + ADP
GPO
glicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato
POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol quinonimina roja
GPO: Glicerol fosfato oxidasa
40
POD: peroxidasa
4-AF: 4-aminofenazona
M&ESTRAS
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar.
Los triglicridos en suero o plasma son estables 5 das a 2-8 C. Los anticoagulantes
como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.
(RO%E'IMIENTO
Homogeneizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.
En tres cubetas espectrofotomtricas marcadas B (Blanco), S (Standard) y D
(Desconocido) colocar:
B S D
Muestra - - 10 ul
Standard - 10 ul -
Reactivo A 1 ml 1 ml 1 ml
S. Standard: solucin de glicerol 2,26 mmol/l (equivale a 2 g/l de triolena).
CONDCONES DE REACCON
- Longitud de onda: 505 nm
- Temperatura de reaccin: 37oC
- Tiempo de reaccin: 5 minutos
- Volumen de muestra: 10 ul
- Volumen de Reactivo A: 1 ml
- Volumen final de reaccin: 1,01 ml
Mezclar, incubar 5 minutos a 37C o 20 minutos a temperatura ambiente (18-25C).
Enfriar y leer en espectrofotmetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua
destilada.
41
ESTABILI'A' 'E LA ME<%LA 'E REA%%ION $INAL
El color de reaccin final es estable 60 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leda
dentro de este lapso.
Corregir las lecturas con el Blanco de reactivos y usar las lecturas corregidas para los
clculos.
La concentracin de triglicridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula
general:
2 g/l
TG (g/l) = D x factor factor =
S
D: desconocido
S: standard
%ON+ERSION 'E &NI'A'ES
Triglicridos (g/l) = 0,01 x Triglicridos (mg/dl)
Triglicridos (mg/dl) x 0,0113 = Triglicridos (mmol/l)
El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los
siguientes valores de Triglicridos:
Deseable: < 1,50 g/l
Moderadamente elevado a elevado: 1,50 - 1,99 g/l
Elevado: 2,00 - 4,99 g/l
Muy elevado: < 5,00 g/l
42
(RA%TI%O N?11.
'eter!nac!-n de &rea
INTRO'&%%ION
La urea solo se sintetiza en el hgado como un producto de la desaminacin de los
aminocidos. Su eliminacin en la orina representa la principal va de excrecin del
nitrgeno. La elevacin de sus valores se utiliza como indicador de disfuncin de la
filtracin renal y es utilizado como para establecer la necesidad de dilisis en pacientes
con insuficiencia renal crnica. Es considerada una prueba de funcin renal. La
concentracin sangunea y urinaria se pueden incrementar por: la actividad muscular,
traumas, infecciones, ayuno, etc). Se encuentran concentraciones elevadas de urea en
plasma como consecuencia de una dieta hiperproteca, o tratamiento con glucocorticoides
(uremia prerrenal).
En condiciones patolgicas las concentraciones sricas de urea aumentan en:
insuficiencia renal, deshidratacin, inanicin, lcera pptica sangrante, insuficiencia
cardiaca congestiva, choque (hipovolmico, cardiognico, sptico, etc), tirotoxicosis, etc.
El incremento en la mayora de los casos se explica por una disminucin en el indice de
filtracin glomerular.
La uremia postrenal est causada por condiciones que obstruyen el flujo urinario:
nefrolitiasis, tumor o hipertrofia prosttica. La utilidad de la urea como indicador de la
funcin renal est limitada por la variabilidad de su concentracin plasmtica como
consecuencia de factores no renales.
La disminucin de la urea srica se observa, entre otras condiciones, en insuficiencia
heptica, pues es en el hgado donde se sintetiza la urea.
El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico
ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.
$&N'AMENTO 'EL M#TO'O =&REASAHSALI%ILATO/
La urea presente en la muestra origina, segn las reacciones descritas a continuacin, un
indofenol coloreado que se cuantifica espectrofotomtricamente.
Ureasa
urea + H2O 2 NH3 + CO2
GLDH
NH3 + NADH + H+ + 2-oxoglutarato l-glutamato + NAD+ + H2O
43
(RO%E'IMIENTO
- TECNCA CON REACTVOS SEPARADOS
Llevar a cero el espectrofotmetro con agua destilada.
En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo,colocar:
Reactivo A 1 ml
Muestra o Standard 10 ul
Mezclar sin invertir. ncubar aproximadamente 1 minuto a 37oC.
Luego agregar:
Reactivo B 250 ul
Mezclar inmediatamente (sin invertir) y disparar simultneamenteun cronmetro. A los 60
segundos exactos medir la absorbancia (D1 o S1) y continuar la incubacin.
Medir nuevamente la absorbancia (D2 o S2) a los 120 segundos (60 segundos despus
de la 1 lectura).
- TECNCA CON REACTVO UNCO
Llevar a cero el espectrofotmetro con agua destilada.
En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo, colocar:
Reactivo nico 1 ml
Muestra o Standard 10 ul
Mezclar inmediatamente (sin invertir) y disparar simultneamente un cronmetro. A los 60
segundos exactos medir la absorbancia (D1 o S1) y continuar la incubacin.
Medir nuevamente la absorbancia (D2 o S2) a los 120 segundos (60 segundos despus
de la 1 lectura).
- TECNCA EN ORNA
Utilizar la misma tcnica ( o ) diluyendo la orina convenientemente con agua o solucin
fisiolgica. Para el clculo de los resultados, multiplicar por el factor de dilucin utilizado.
%ON'I%IONES 'E REA%%ION
(Disminucin de la absorbancia)
- Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 366)
- Temperatura de reaccin: 37oC
- Tiempo de reaccin: 2 minutos
- Volumen de muestra: 10 ul
- Volumen final de la reaccin: 1,01 ml
44
0,60 g/l
Urea (g/l) = f x (D1 - D2 ) f =
(S1 - S2)
En la literatura (Tietz, N.W.) se menciona el siguiente rango de referencia:
Suero o plasma: 13 - 43 mg/dl (2,1 - 7,1 mmol/l)
Orina: 26 - 43 g/24 hs (0,43 - 0,72 mol/24 horas)
%ON+ERSION 'E &NI'A'ES,
Urea (g/l) x 46,7 = BUN (mg/dl)
Urea (mg/dl) x 0,1665 = Urea (mmol/l)
Urea (mg/dl) x 0,467 = BUN (mg/dl)
BUN (mg/dl) x 2,14 = Urea (mg/dl)
Urea (g/24 hs) x 0,0167 = Urea (mol/24 hs)
Para convertir valores de urea (en g/l) a valores de BUN (en mg/dl), se debe utilizar el
siguiente factor de conversin:
1 1000
factor = x = 46,7
2,14 10
donde:
1/2,14 = factor de conversin entre la urea y el nitrgeno ureico en sangre (BUN: blood
urea nitrogen (nitrgeno ureico plasmtico))
1000 = factor de conversin entre gramo y miligramo
1/10 = factor de conversin entre litro y decilitro
Ejemplo:
0,50 g/l de urea x 46,7 = 23,4 mg/dl de BUN
M&ESTRAS
Suero, plasma u orina recogidos mediante procedimientos estndar.
La urea en suero o plasma es estable 7 das a 2-8 C.
45
(RA%TI%O N?12.
'eter!nac!-n de %reat!n!na
INTRO'&%%ION
La creatinina, compuesto sumamente difusible, se elimina del organismo casi
exclusivamente por filtracin renal. Su determinacin en suero, as como la depuracin de
creatinina endgena constituyen parmetros importantes para el diagnstico de diversas
afecciones renales.
$&N'AMENTOS 'EL METO'O
La creatinina reacciona con el picrato alcalino (reaccin de Jaffe) produciendo un
cromgeno rojo. La velocidad de esta reaccin, bajo condiciones controladas, es una
medida de la concentracin de creatinina de la muestra puesto que se comporta como
una reaccin cintica de primer orden para la creatinina. Por otra parte, se ha demostrado
que los cromgenos no-creatinina que interfieren en la mayor parte de las tcnicas
convencionales, reaccionan dentro de los 30 segundos de iniciada la reaccin. De manera
que entre los 30 segundos y los 5 minutos posteriores al inicio de la reaccin, el
incremento de color se debe exclusivamente a la creatinina.
(RO%E'IMIENTO
ID TE%NI%A (ARA S&ERO O (LASMA
Equilibrar el Reactivo de Trabajo a la temperatura de reaccin (25C). Antes de agregar la
muestra, llevar el aparato a cero con agua destilada. En dos cubetas espectrofotomtricas
marcadas S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
S D
Reactivo de Trabajo 1,2 ml 1,2 ml
Standard 0,2 ml -
Muestra - 0,2 ml
Mezclar inmediatamente, iniciando al mismo tiempo el cronmetro y proseguir la
incubacin. A los 30 segundos exactos medir la absorbancia (S1 y D1) y continuar la
incubacin.
Medir nuevamente la absorbancia (S2 y D2) a los 5 minutos (4 minutos 30 segundos
despus de la primera lectura).
IID TE%NI%A (ARA ORINA
46
Recolectar y preparar la muestra como se describi en "Recoleccin, efectuando una
dilucin 1:50 de la misma en agua desionizada. Aplicar luego la tcnica .
8 'reatinina en suero 9*g:l8 ; (D2 - D1) x f
20 mg/l
f =
S2 - S1
D2 - D1
+8 'reatinina en orina 9g:+< 5s8 ; x V
S2 - S1
siendo:
V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 hs
La frmula surge de:
D2 - D1
Creatinina en orina (g/24 hs) = x 0,020 g/l x 50 x V
S2 - S1
donde:
0,020 g/l = concentracin del Standard
50 = factor de dilucin
Para expresar la creatinina en orina en "mg/Kg/24 hs:
Creatinina en orina (g/24 hs) x 1000 mg/g
Peso del paciente (Kg)
08 %epuracin de 'reatinina -ndgena 9%.'.-.8:
Creatinina en orina (g/24 hs)
D.C.E. ml/min = x 694 ml/min
Creatinina en suero (mg/l)
donde:
g/24 hs 1.000 mg x 1.000 ml 1.000.000 ml
694 ml/min = = =
mg/l 1 mg x 1.440 min 1.440 min
Para expresar D.C.E. en "ml/min/1,73 m
2
:
D.C.E. (ml/min) x 1,73
Superficie corporal del paciente (m2)
47
Suero o plasma:
Hombre: 7 - 13 mg/l
Mujer: 6 - 11 mg/l
Orina:
Hombre: 14 - 26 mg/Kg/24 hs
Mujer: 11 - 20 mg/Kg/24 hs
D.C.E.:
Hombre: 94 - 140 ml/min/1,73 m2
Mujer: 72 - 110 ml/min/1,73 m2
'ETERMINA%ION 'E $OS$ATASA AL%ALINA =AL(/
INTRO'&%%ION
La fosfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliza los
monosteres del cido ortofosfrico en medio alcalino. En el adulto proviene en parte del
hgado (termoestable) y en parte de hueso, sistema reticuloendotelial y vascular
(termolbil) dando lugar a distintas izoenzimas.
La actividad srica de ALP sea, en condiciones normales alcanza su mayor actividad en
los nios en edad de crecimiento, llegando a triplicar los niveles del adulto, debido a que
esta izoenzima se localiza en los osteoblastos. Tambin es fisiolgico el aumento que se
produce al final de primer trimestre de embarazo, a expensad de la izoenzima placentaria
que en este periodo alcanza niveles mximos.
Entre las patologas que afecta la actividad srica de ALP se pueden citar: carcinomas
metastticos en hgado y hueso, colestasis biliar, infarto al miocardio, pulmonar o renal.
48
$&N'AMENTO
La ALP hidroliza al p-nitrofenilfosfato, incoloro, produciendo fosftato y p-nitrofenil a pH de
9.8, la velocidad de aparicin del anion p-nitrofenolto a 405nm, es proporcional a la
actividad enzimatica en la muestra.
La dietanolamina regula en pH de reaccin y acta como aceptor del fosftato liberado por
la fosfatasa.
ALP + p-NFF PO4 + p-Nitrofenol (pH 9.8)
Esta prueba se realiza en el contexto de otras pruebas hepticas (GOT, GPT, Bilirrubina,
GGT) y se utiliza para evaluar problemas hepticos. Suele asociarse en la elevacin de
GGT excepto en problemas seos donde solo se eleva la ALP.
REA%TI+O
Buffer DEA : dietanolamina
Sustrato pNFF (p-nitrofenilfosfato)
M&ESTRA
Suero
MATERIAL
Espectrofotmetro y cubetas
Bao mara
Agua destilada
Pipetas
Estandar de calibracin
Reactivos de ALP
(ARAMETROS
Longitud de onda 405nm
Temperatura de reaccin 25, 30 o 37C
Tiempo 3 minutos
Volumen final de reaccin 2.52mL
(RO%E'IMIENTO
Colocar en cubeta a temperatura de Reaccin:
1 .-Sustrato reconstituido 2.5mL
2.- Pre incubar unos minutos
3.- agregar 20uL de Muestra
49
4.- Leer absorbancia inicial en espectro a 405nm, disparar cronmetro
5.- Registrar absorbancias despus de 1,2 y 3 minutos despus de la primera lectura.
6.- Determinar la diferencia promedio de Absorbancia / min (AA/min), restando cada
absorbancia y obteniendo el promedio.
%AL%&LOS
ALP (U/) = AA/min x 6812
RES&LTA'OS
ALP= ______________ (U/)
Adultos: Nios y adolescentes
25C = 40-190 U/ hasta 400
30C = 45-213 U/ hasta 450
37C = 65-300 U/ hasta 645
50
9O>A 'E RE(ORTE
T!tulo de la (rIct!ca.
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
Nobre de los
alunosNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNN
Muestra
Absorbanc!a
uestra
Absorbanc!a
del
patr-n
%oncentrac!-n
del patr-n
N!veles de
NNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNN
OBSER+A%IONES. NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
%ON%L&SIONES. NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
$E%9A.NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
+oBo 'O%ENTE.NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
51
52

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