UNIVERSITATEA AL. I.

CUZA
FACULTATEA DE BIOLOGIE
PROGRAMUL DE INVMNT LA DISTAN





CULTURI IN VITRO

LUCRARI PRACTICE
Smaranda Vantu






















2
CUPRINS
INTRODUCERE3
LUCRAREA 1
IMPLICAII TEORETICE I APLICATIVE ALE CULTURILOR IN VITRO5
LUCRAREA 2
PRINCIPALELE TIPURI DE CULTURI IN VITRO.10
LUCRAREA 3
INITIEREA UNEI CULTURI IN VITRO LA DAUCUS CAROTA..12
LUCRAREA 4
INDUCEREA ORGANOGENEZEI IN CULTURI DE CALUS DE
PAPAVER SOMNIFERUM.14
LUCRAREA 5
IZOLAREAI CULTIVAREA PROTOPLASTILOR
LA PAPAVER SOMNIFERUM...15
LUCRAREA 6
DETERMINAREA CALITATIV A ALCALOIZILOR IN
SUSPENSII CELULARE DE PAPAVER SOMNIFERUM
PRIN METODA CROMATOGRAFIEI IN STRAT SUBIRE..18
LUCRAREA 7
METODE DE OBTINERE A PLANTELOR HAPLOIDE.21
LUCRAREA 8
CULTURA IN VITRO DE ENDOSPERM SI EMBRIONI 24
LUCRAREA 9
CULTURA IN VITRO DE MERISTEME26
LUCRAREA 10
METODE CITOLOGICE SI HISTOLOGICE DE
ANALIZA A MATERIALULUI VEGETAL CULTIVAT IN VITRO...27
BIBLIOGRAFIE.29

















3


INTRODUCERE
Legitile n conformitate cu care se deruleaz procesele biologice, cu ntreaga lor amplitudine
de variabilitate, au suscitat interesul i au polarizat atenia investigatorilor din toate timpurile.
Treptat dar temeinic, s-a ajuns la concluzia c viaa nu reprezint doar un specific, un stadiu
superior n evoluia materiei universale, ci un fenomen aparte. Altfel spus viaa este i altceva dect
materie.
In ultimele decenii, prin investigaii, experimente i observaii de mare complexitate s-au putut descifra
unele dintre caracteristicile specifice vieii.
S-a definitivat, astfel, concepia n conformitate cu care, n contextul materiei vii, un rol de prim
ordin revine informaiei.
Concomitent s-a conchis c informaia unui sistem este dependent de gradul de organizare
intern a acestuia, de nivelul pe care-l atinge integrarea i interconexarea prilor componente. S-a
definitivat, astfel, concepia heterogenitii interne optime, ca precondiie a asigurrii integralitii
maxime i a coninutului informaional maxim.
Dar, spre a surprinde ct mai multe din intimitile structurale i funcionale ale unui sistem viu,
metodologiile i aparatura clasic s-au dovedit insuficiente i, deci, ineficiente. Se impunea, ca o
necesitate stringent, disocierea unui sistem viu in parile sale componente, dar cu posibilitatea
reasocierii lor, concomitent cu modelarea i simularea structural i funcional a ntregului i a prilor
componente.
Disocierea unui sistem din etapa individual de organizare a materiei vii, de pild, n
subsistemele componente - celule n cazul de fa, a permis redarea tuturor gradelor de libertate
celulelor i cunoaterea comportamentului lor n noua ipostaz (cci nu se pot compara celulele
reprezentnd indivizi unicelulari cu celulele "eliberate" dintr-un individ pluricelular), ct i comportarea
individului n procesul pierderii integralitii (dediferenierea tisular, celular) sau n cel al reconstituirii
integralitii (rediferenierea urmat de organogenez sau embriogenez).
Deci, fr a face o demonstraie pro domo i fr a prezenta o list a problematicii aferente, am
subliniat cauzele care explic, mcar parial, apariia noului i modernului domeniu de investigaii
biologice - CULTURILE IN VITRO.
Funcie de nivelul asupra cruia se exercit intervenia, biotehnologiile se aplic la nivelul
organismelor ntregi, organelor, esuturilor, celulelor sau chiar la nivel molecular.
Utilitatea culturilor de celule i esuturi se poate remarca prin posibilitile pe care le ofer n
studiul i valorificarea abaterilor comportamentale ale celulelor, prin fenomenele cu totul particulare
care apar n condiiile cultivrii "in vitro". Biotehnologia - noiune complex, reflectnd un domeniu
concret al activitii umane, definete ansamblul tehnologiilor neconvenionale i nepoluante de
producere a unor substane utile, prin utilizarea intensiv a potenialului genotipic al organismelor vii,
fenotipizat n capaciti fiziologo-biochimice de sintez, biotransformare, degradare, fermentaie etc. In
fond, totalitatea activitilor umane din agricultur, industria alimentar, zootehnie, farmacie, cosmetic,
presupune aplicaii ale metodelor biotehnologice soldate cu obinerea de alcooli, principii active
medicamentoase, substane cu rol alimentar, colorani.
In acest context, culturilor in vitro le revine un rol de prim ordin i li se intrevd i implicaii
teoretice dintre cele mai profunde.
Rolul i implicaiile practice ale culturilor "in vitro" pot fi redate schematic astfel:


4

CULTURI IN VITRO LA PLANTELE SUPERIOARE

MICROPROPAGARE CREARE DE NOI GENOTIPURI MULTIPLICARE
embrioni mutagenez calus
organe hibridare somatic celule
esuturi inginerie genetic protoplati
celule embrioni somatici
protoplati
embrioni somatici
M R M B
U E U I
L G L O
T E T T
I N I R
P E P A
L R L N
I A I S
C R C F
A E A O
R R R
E E M
A
C R
E E
L
U
L
A
R



CLONAREA I GENERAREA DE PLANTE SNTOASE



PLANTE REGENERATE



MATERIALE NECONVENIONALE






5
LUCRAREA 1
1. IMPLICAII TEORETICE I APLICATIVE ALE CULTURILOR IN VITRO
nc de la debutul cercetrilor din domeniul culturilor in vitro s-a ntrezrit posibilitatea utilizrii
lor pentru multiplicarea unor soiuri sau chiar indivizi, cu caliti productive de excepie.
Primele ncercri n acest sens, au fost efectuate de Morel n 1963 la specii de Cymbidium
(orhidee). In orice caz, necesitile horticulturii au impus folosirea pe scar larg a acestei metode i
aici s-au obinut cele mai multe i valoroase rezultate.
Prin culturile de meristeme radiculare, caulinare sau din muguri axilari, urmat de regenerare s-
au obinut plante identice cu planta donatoare - adic multiplicarea masiv a unui anumit individ
valoros.
La inceput s-a recurs la micropropagarea unor clone de orhidee, apoi metoda s-a extins i
asupra altor specii ornamentale : Begonia, Chrysanthemum, Gerbera. In prezent exist cca 200 specii
la care se poate asigura multiplicarea i propagarea prin metoda culturilor "in vitro". Principala
problem care a fost rezolvat prin aceast metod este obinerea ntr-un ritm ct mai rapid, la un pre
ct mai sczut a unor copii conforme cu planta donatoare (clonarea), deci meninerea calitilor
genotipului supus micromultiplicrii, parametrii imposibil de atins prin metodele tradiionale. La pomii
fructiferi introducerea unui nou soi n cultur, prin practicile tradiionale, presupunea o durat de civa
ani, n timp ce prin micropropagare se realizeaz o scurtare considerabil a perioadei de formare a
unui stoc de plante (Morel, 1962).
Este cunoscut faptul c, prin metodele clasice de nmulire vegetativ exist neajunsul de a
vehicula din planta donatoare de material de inmulire, ctre planta nou format o serie de boli, astfel
nct planta nou format este chiar de la inceputul vieii tarat de prezena germenilor fitopatogeni.
Tehnica culturilor de meristeme, n scopul devirozrii a fost pus la punct, nc din 1962 de ctre Morel
i Martin.
O alt pist pe care se dezvolt cu succes cercetrile i aplicaiile, este aceea a "haploidiei",
adic a culturii de antere, polen, ovule. Pe aceast cale se pot produce plante haploide i, ulterior, prin
diploidizarea lor, se obin indivizi perfect homozigoi (linii izogene). Pe aceast direcie, sunt rezultate
notabile la cartof, tutun, orez.
Plantele haploide se obin fie pornindu-se de la cultura de polen, fie de la cea de antere.
Evident, c prima pist este mult mai eficient n rata de apariie a haploizilor.
De asemenea, prin culturile in vitro, se constat o revigorare a cercetrilor ce au ca scop
obinerea de mutante cu certe valori practice. In timp s-au obinut i selecionat mutante deosebit de
valoroase la cartof (caracterizate prin rezistena la atacul cu Phytophtora infestans), la sfecla de zahr
(cu rezistena la atacul unor virusuri), mutante auxotrofe (cele ce nu se pot dezvolta pe medii
minimale).
O direcie relativ recent dar deosebit de promitoare i modern totodat, este aceea a
crioconservrii (cunoscut i sub numele de crioprezervare).
Unele linii celulare sau chiar indivizi, care prezint valoare (fie teoretic, fie aplicativ), nu pot fi
pstrate un timp prea lung ca atare i nici nu pot fi stocate n stadiul de smn. Fiind foarte utile
pentru bancile de gene i indispensabile pentru iniierea unor investigaii ulterioare, ele sunt conservate
ca atare, prin meninerea la temperaturi sczute. La ora actual sunt puse la punct metode pentru
crioprezervarea protoplatilor, celulelor sau meristemelor.
Tentativele de manipulare a materialului genetic avnd ca el final obinerea de noi genotipuri,
i-au gsit n metoda culturilor "in vitro" un teren extrem de productiv. Incadrate sub genericul de
inginerie genetic, respectivele cercetri vizeaz, n principal, transferarea unor gene de la un individ la
altul, cei doi indivizi aparinnd la aceeai specie, la specii diferite din acelai gen sau chiar la genuri
diferite.
Pentru ca scopul sa fie atins se impun doua condiii i anume:
- gena ce urmeaz a fi transferat trebuie s poat fi integrat n genotipul gazdei;
- gena transferat i integrat n noul genotip trebuie s fie functional, adic s fie apt de a
asigura transcripia i translaia informaiei pe care o conine.


6
In contextul acestui proces un rol de prim ordin i revine vectorului. In majoritatea cazurilor,
drept vectori genici s-au utilizat plasmidele Ti, din Agrobacterium tumefaciens sau virusul mozaicului
tutunului.
Cu utilitate practic imediat este tentativa de a asigura producerea substanelor biologic
active, n special din categoria metaboliilor secundari, prin metoda culturilor "in vitro".
Se tie c plantele sunt un izvor nesecat de produi alcaloidici, terpenici, glicozidici, vitamine ,
hormoni, produi cu larg utilizare n farmacie, cosmetic sau pur i simplu n alimentaie. In cazul
plantelor intacte, acumularea unor astfel de substane este asigurat de prezena unor esuturi sau
organe specializate. De pild, chinina se acumuleaz n scoara plantelor (din specii de Cinchona). In
cazul culturii de celule sau esuturi in vitro acest lucru nu mai este posibil. In plus, prin cultura in vitro,
cu timpul celulele i pierd capacitatea biosintetic pe care o etalau n cazul individului integral. Pe de
alt parte ns, n cazul culturii in vitro se poate exercita o presiune selectiv eficient, succesiunea
generaiilor fiind mult mai rapid (comparativ cu succesiunea indivizilor in vivo). Se cunosc deja
exemple n care, prin selecie, s-au obinut cantiti suficient de mari de substane utile (comparabile,
ca pre de cost, cu cele din vivo).
In acest sens putem cita producerea de acid rosmarinic i antrachinona (Zenk i colab, 1975-
1977). In Japonia se produce ubiquinona, medicament folosit n tratamentul bolilor de inim, prin
cultivarea unor linii celulare de Nicotiana tabacum, n bioreactoare de mare capacitate (Ikuta i colab,
1976).
Un alt aspect, deosebit de promitor, al culturilor "in vitro" l constituie realizarea
biotransformrii unor compui cu utilitate practic. Spre exemplu, s-a asigurat obinerea metil-digoxinei
din metil-digitoxina, prin hidroxilare, n culturi de Digitalis lanata (Reinhard i Alferman, 1980).
In sfrit, dar nu n ultimul rnd, culturile in vitro prezint un mare interes i deosebit
importan pentru biologia teoretic. De la cercetrile din acest domeniu se ateapt elucidarea unor
aspecte privind procesele fiziologo-biochimice la nivel celular, diviziunea celular, diferenierea
celular, rolul fitohormonilor, totipotena celular. Prin investigaii asupra protoplatilor se ateapt
elucidarea unor probleme viznd formarea pereilor celulari.
Evident,toate acestea reprezint doar o parte din problematica pe care o incumb abordarea
studiilor pe culturi de celule, esuturi sau organe.

1.1. RECOMANDARI PRIVIND CONDITIILE DE LUCRU, SUBSTANTELE SI
APARATURA NECESARE PENTRU INITIEREA CULTURILOR IN VITRO

In vitro, tradus ad literam, nseamna n sticl. Prin urmare, orice cultur artificial de organe,
esuturi sau celule, realizat n condiii de asepsie total, pe medii nutritive adecvate, n vase de sticl
(cutii Petri, baloane Erlenmeyer), reprezint o cultur "in vitro". Se impune, deci o precizare: cultura de
organe, esuturi sau celule nu se poate realiza dect "in vitro" (cu toate condiiile menionate), fapt
pentru care expresia cultura de celule in vitro este o sinonimie ce trebuie evitat.
Asigurarea asepsiei totale se impune ca o condiie sine qua non deoarece att explantele, ct
i mediul nutritiv, sunt surse i condiii propice dezvoltrii bacteriilor, virusurilor, ciupercilor.
Prin urmare att sursa de material vegetal, din care se vor preleva eantioane, pentru
experimente, ct i recipientele de sticl cu mediul nutritiv, trebuiesc supuse unei pregtiri speciale i
anume sterilizarea. Deci, fr a pretinde o succesiune strict a operaiunilor (fiecare persoan poate
lucra ntr-o concepie proprie) se impun urmtoarele operaiuni:

a. Pregtirea sticlriei i a instrumentarului

Intr-un laborator de culturi de celule i esuturi se pot utiliza toate tipurile de recipiente din sticl.
Vasele cu capacitate de 1-2 l sunt necesare in prepararea mediilor de cultur. Flacoanele Erlenmeyer
de diferite capaciti (50, 100, 150, 200, 500 ml) servesc ca recipiente de cultur. Acestea vor fi bine
splate i uscate n etuv. Flacoanele astfel pregtite vor fi obturate cu dopuri de vat, nfurate cu
tifon.


7
In tehnicile de culturi in vitro se lucreaz cu instrumentar de tip chirurgical : pense, bisturie,
spatule. Ele sunt sterilizate prin autoclavare nainte de folosire.

b. Prepararea mediului de cultur i sterilizarea prin autoclavare.

Pentru mai mult siguran i mai puine operaiuni, recomandm repartizarea mediului n
vasele de cultur imediat dup preparare i sterilizarea (autoclavarea) n respectivele vase. Ali autori
recomand sterilizarea mediului ca atare, concomitent sau succesiv cu a vaselor, n care va fi
repartizat ulterior, n boxa cu flux laminar. Alteori, se recomand sterilizarea mediului, repartizarea n
vasele de cultur, si, apoi, resterilizarea. Nu suntem adepii acestui mod de lucru, deoarece prin
sterilizri repetate se provoac alterri calitative ale vitaminelor, fitohormonilor i chiar ale glucidelor
folosite n compoziia mediului.

c. Prelevarea i sterilizarea explantelor

Sterilizarea explantelor se efectueaz, de obicei cu ageni chimici de tipul hipoloritului de sodiu
sau calciu (soluie 3%-4%. Durata tratamentului variaz n funcie de specia luat n studiu sau de
originea explantului (epiderma, mezofil, esut palisadic). Cnd este posibil se recomand obinerea de
plante sterilizate, prin germinarea de semine sterilizate n hipoclorit de sodiu de concentraie 4% timp
de 10-12 minute,pe hrtie de filtru, de asemenea sterilizat, plasat n flacoane Erlenmeyer sau cutii
Petri.
Plantulele astfel obinute pot fi plasate ca atare pe mediul de cultur, sau de la caz la caz,pot fi
separate n hipocotil i cotiledoane, pot servi pentru obinerea oricrui tip de explant. Se impune nca o
meniune. Uneori este imposibil obinerea unui explant steril, pe ambele ci menionate, infecia
fungic, bacterian sau viral fiind adnc penetrat n organismul vegetal sau n ntreaga samn.
Evident, n respectivele situaii sterilizarea ca proces nu mai are nici un efect. Totui, pentru obinerea
de calus liber de infecii exist i n aceste cazuri o cale i anume - utilizarea explantelor din vrful
meristematic de cretere al tulpinii. In funcie de tipul de dezinfectant folosit, tipul de tratament, originea
explantului i mediul de cultur utilizat,se poate vorbi despre o rat de calusare i o rat de
supravieuire a calusului.

Modaliti de asigurare a asepsiei explantelor
Nr.
crt.
Tipul explantului Pretratament Sterilizare Postratament
1. Semine
Etanol(96%)
10sec
Ca(OCl)10%
10-20 min
splare de 3ori cu ap
distilat steril
2. Fructe
Etanol(96%)
10sec.
NaOCl 3%
splare cu ap distilat
steril
3. Tulpin
Etanol(96%)
10 sec.
NaOCl 3%
5-30 min.
splare cu ap distilat
steril
4.
Organe de
depozitare
splare cu ap de
robinet
NaOCl 3%
10-30 min.
splare cu ap distilat
steril
5. Frunze Etanol(96%)
HgCl2 O,1%
1 min.
splare de mai multe ori cu
ap distilat

Sterilizarea propriu-zis, att a instrumentarului i recipientelor, ct i a mediului, se efectueaz
la autoclav, la o temperatur de 120
0
C i o presiune de o atmosfer, timp de 20-25 min. Se poate
efectua i o tindalizare, adic o sterilizare discontinu (fracionat), mai ales pentru mediile agarizate.


8
In acest caz mediile sunt "topite" de 3 ori consecutiv, la temperatura de 100
o
C, pe baie de ap. Dup
fiecare etap de fierbere, mediile ramn 24 de ore la temperatura camerei pentru a permite germinarea
sporilor eventualelor microorganisme care au supravieuit sau au suprainfectat mediul.
Sunt i procedee prin care sterilizarea se obine prin filtrare.In aceste cazuri, substanele
termolabile (n special fitohormonii), sunt sterilizate prin filtre bacteriene.
Este indicat ca sticlria n care va fi plasat mediul de cultur, pipetele pensetele, ansele,
spatulele s fie presterilizate, fie prin autoclavare la 120-130
o
C, timp de 20-30 minute, fie prin
meninerea n etuv, la 180
0
C timp de o or. Toate se pot pstra n casolete sau tuburi metalice.

d. Plasarea explantelor sterilizate pe mediul de cultur, n boxa cu aer steril n flux
laminar.

Lucrul propriu-zis (transferul explantelor, subcultivarea calusului, extragerea de probe pentru
analiza se efectueaz n boxa steril (boxa n care se asigur aflux de aer, sub presiune, trecut n
prealabil prin filtre microbiene). Este ceea ce, n terminologia uzual se cunoaste sub numele de box
cu aer n flux laminar.
Este indicat s se iradieze boxa (din timp n timp i mai ales nainte de a se lucra) cu o lamp
UV timp de 20-30 min.
Un alt aparat, utilizat n cazul culturilor pe mediu lichid, este agitatorul rotativ sau liniar, care se
caracterizeaz prin micri oscilatorii (n plan orizontal sau n plan elipsoidal) cu frecvena de 115-120
rot./ min.

1.2. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA
Reactivii utilizai:
1.apa se recomand s fie dublu distilat;
2.srurile minerale trebuie s fie cu un inalt grad de puritate. Uneori este indicat recristalizarea
hormonilor de cretere. Spre exemplu, acizii naftalenacetic i 2,4-D, sunt purificai i decolorai cu
charcoal, apoi sunt recristalizai din soluie de etanol.
3.Hidrolizatul de cazein este un supliment organic utilizat, n concentraie de 0,05-0,2 %
4.Aminoacizii nu sunt necesari n mod obligatoriu.
5.Restul ingredientelor, din mediul de cultur(macronutrieni, micronutrieni, vitamine), se
utilizeaz dup cum urmeaz:
Pentru mediul B
5
(mediul de baz, stabilit de Gamborg n 1968) se prepar soluii stoc, de
micronutrieni, n urmtoarele cantiti:
Micronutrieni mg/100 ml H
2
O
MnSO
4
H
2
O 1000
H
2
BO
3
300
ZnSO
4
7H
2
O 200
Na
2
MoO
4
25
CuSO
4
5H
2
O 2,5
CoCl
2
6H
2
O 2,5
Toate cantitile precizate, cntrite la balana analitic, se dizolv, n ordine, n 100 ml ap
distilat. Soluia stoc astfel preparat se pstreaz n flacon de culoare nchis, bine nchis, la frigider.
Vitaminele, se pregtesc asemenea micronutrienilor, n urmatoarele cantiti:
Vitamina mg/100 ml ap distilat
Acid nicotinic 100
Thiamina HCl 1000
Piridoxina HCl 100
Totul se pstreaz la frigider.
Clorura de calciu (CaCl
2
2H
2
O) se prepar separat, n cantitate de 15 g/100 ml ap distilat.
Iodura de potasiu (KI), n cantitate de 75 mg/100 ml ap distilat se prepar, de asemenea
separat.


9
Soluia stoc de 2,4D se prepar astfel: Se dizolv 50 mg 2,4 D n 2-5 ml etanol, nclzindu-se
uor i dilundu-se cu apa distilat, pn ce se atinge volumul de 100 ml. Se stocheaz la frigider.

Prepararea mediului Gamborg :
In 500 ml ap distilat, se dizolv n ordine:
NaH
2
PO
4
H
2
O 150 mg
KNO
3
2500
(NH
4
)
2
SO
4
134
MgSO
4
7H
2
O 250
Sucroza 20-25 g
- cte 1 ml din soluiile stoc de clorur de calciu, iodur de potasiu, micronutrieni, vitamine i 2
ml din soluia stoc de 2,4 D i 5 ml din soluia stoc de FeEDTA.
Se completeaz cu apa distilat, n balon cotat, pn la 1000 ml. Se regleaz pH-ul la valoarea
de 5,5 (cu soluii de KOH 0,2 N sau HCl 0,2 N). Se adaug 6-8 g agar i se autoclaveaz, conform
precizrilor anteriare. Fr ndoial, att mediul Gamborg, ct i cele de alt formul (MS, White,
Erikson) poate fi modificat, n funcie de scopul cercetrii, prin variaii ale concentraiei fitohormonilor
(2,4 D, IAA, NAA, BAP).
Pentru prepararea mediului MS se procedeaz astfel:
Micronutrieni mg/100 ml
H
2
BO
3
620
MnSO
4
4H
2
O 2230
ZnSO
4
4H
2
O 860
Na
2
MoO
4
2 H
2
O 25
CuSO
4
5 H
2
O 2,5
CoCL
2
6 H
2
O 2.5
Toate celelalte soluii stoc se prepar dup formula folosit n cazul mediului B
5

Macroelementele se adaug astfel:
NH
4
NO
3
1200 mg/l
KNO
3
1900 mg/l
MgSO
4
7H
2
O 370 mg/l
KH
2
PO
4
170 mg/l
FeEDTA 40 mg/l
Sucroza 30 g/l
Din soluiile stoc de clorur de calciu, iodur de potasiu, vitamine, micronutrieni se ia cte 1 ml
iar din soluia stoc de 2,4 D 2 ml. Se execut aceleai operaiuni, n aceeai succesiune, ca pentru
pregtirea mediului Gamborg. Se ajusteaz pH-ul la 5,8.
Pentru pregtirea mediului Erikson, urmndu-se aceleai reguli de preparare, se vor lua
urmtoarele cantiti de substane:
NH
4
NO
3
1200 mg/l
KNO
3
1900 mg/l
MgSO
4
7H
2
O 370 mg/l
KH
2
PO
4
340 mg/l
FeEDTA 40 mg/l
Sucroza 30 g/l
Din soluiile stoc de micronutrieni, vitamine, iodur de potasiu se adaug cte un mililitru, iar
din soluia stoc de clorur de calciu 2 ml. Din soluia de 2,4 D se adaug l ml. Se ajusteaz pH-ul la
5,8.
PREGATIREA MATERIALULUI VEGETAL
Germinarea seminelor n condiii aseptice

Se recomand mai multe metode pentru germinarea seminelor n condiii de asepsie, pentru a
obine plantute sterilizate. Ne vom rezuma la una dintre acestea: se introduc seminele n alcool etilic
70%, pe un agitator (shaker, menionat anterior), timp de 2 min. Se ndeprteaz alcoolul i se
introduce hipoclorit de sodiu, 2-3%. Se menine flaconul pe agitator, timp de 10-20 minute. Se


10
ndeparteaza seminele care plutesc (deoarece, cu siguran sunt goale i, deci, nu vor germina). In
cazul n care se presupune c seminele sunt puternic infectate se poate repeta tratamentul cu
hipoclorit. Dup aceste operaiuni este indicat splarea seminelor cu ap distilat steril. Ulterior
acestei operaii, seminele se disperseaz pe hrtie de filtru, mbibat cu ap distilat, ntr-o cutie Petri
sau un flacon Erlenmeyer, totul autoclavat n prealabil. Este bine ca vasul Petri s fie ermetic nchis cu
pelicula de parafilm. In unele lucrri de specialitate se precizeaz c germinarea seminelor poate fi
asigurat pe vat, n eprubete, nchise cu parafilm. Cele mai multe semine germineaz bine n condiii
de ntuneric, la temperatura de 23-25
o
C. Este avantajos s se utilizeze mai puine semine per flacon,
deoarece dac o singur smn este infectat, se va transmite infecia tuturor celorlalte din vasul
respectiv. Cnd seminele au germinat, plantutele rezultate pot fi utilizate ca atare, sau se pot
fragmenta, utiliznd hipocotilul, cotiledoanele. Alteori, pentru inducerea calusului se pot utiliza explante,
din plante crescute n condiii naturale: poriuni din rdcin, tulpin, ramuri, muguri, frunze, flori.
Explantele se vor trata cu alcool etilic 7O%, timp de 1-3 minute, apoi se vor spla de 2-3 ori cu ap
distilat steril. Dac este vorba de rdcini, tuberculi, bulbi, dup imersare n alcool etilic, se
recomand tratarea cu hipoclorit de sodiu, timp de 15-20 minute. Din experienta proprie recomandm
tratarea, att n cazul seminelor ct i n cazul explantelor, doar cu hipoclorit de sodiu 3% timp de 15-
25 minute (in funcie de mrimea seminelor sau a explantelor).

LUCRAREA 2
PRINCIPALELE TIPURI DE CULTURI IN VITRO
Cultivarea esuturilor i celulelor vegetale are la baz metode similare celor din microbiologie.
Primele culturi "in vitro" au fost cele n regim staionar sau, altfel spus, culturile statice, care sunt
caracterizate prin utilizarea substratului nutritiv solid, obinut pe seama unor ageni de gelificare ca :
agarul, gelatina sau silicagelul. Aceast modalitate de cultivare, de la nceputurile dezvoltrii tehnicilor
"in vitro" i pn astzi, ramne de baz, n investigaiile experimentale, cu toate c determin un
caracter limitat al reaciei explantului la factorii inductivi ai mediului. In esen este vorba despre
contactul redus al calusului sau al explantului cu substratul nutritiv, avnd ca rezultat accesul difereniat
al celulelor la substanele mediului de cultur.
Alternativa pentru acest neajuns este cultivarea esuturilor i celulelor vegetale pe medii lichide,
n regim de agitare continu, sistem care asigur utilizarea mai eficient a nutrienilor din mediu,
schimburi gazoase mai echilibrate.
Suspensiile celulare sunt iniiate prin utilizarea fragmentelor de calus friabil i cultivarea lor pe
medii lichide.
Culturile celulare n suspensie sau suspensiile celulare reprezint ansamblul celulelor i
agregatelor celulare, care cresc ntr-un mediu nutritiv lichid, n condiii de agitare continu. In timpul
incubrii, cantitatea materialului celular crete i ajunge la un punct de maxim acumulare, moment n
care este necesar subcultivarea sa. Astfel de culturi pot fi propagate timp nelimitat, prin subcultivri
periodice (7 zile). Exprimarea numrului de celule dintr-o suspensie celular funcie de durata incubrii
poate fi reprezentat grafic prin modelul creterii exponeniale (Wilson i Street, 1971), care cuprinde o
faz lag, urmat de faza de cretere exponenial, faza creterii liniare, faza accelerrii negative a
creterii i faza staionar. Tehnica general de pstrare i perpetuare a suspensiei celulare este
subcultivarea n faza staionar. Perioada cuprins de la iniierea culturii pan la atingerea fazei
staionare, poate fi caracterizat prin : densitatea celular iniial, durata fazei lag i rata de cretere
celular. Densitatea iniial a inoculului trebuie s fie cuprins ntre 0,5-2,5 x 10
5
celule/ ml mediu ,
valoare care crete n timpul incubrii culturilor ajungand la 1-4 x 10
6
celule/ ml mediu.
Principalii indicatori ai creterii unei suspensii celulare sunt estimai prin: numrarea celulelor,
determinarea volumului celular total (packed cell volume), greutatea substanei proaspete (cell fresh
weight), greutatea subsanei uscate (cell dry weight) i coninutul de proteine.

Numrul celulelor

Operaia preliminar numrrii celulelor este separarea lor din agragatele celulare. In acest
scop sunt tratate cu acid cromic 5-15% (Street, 1960) sau supuse unui tratament cu pectinaz.


11
Operaia propriu-zis de numrare se realizeaz cu ajutorul unei camere de numrat celule de tip
Fuchs-Rosenthal.

Volumul celular total

Este determinat prin transferarea unui volum de suspensie celular ntr-un tub conic gradat, de
centrifug, de 15 ml i centrifugarea la o turaie de 2000 rot/min., timp de 5 minute. Se exprim n ml
sediment celular/ ml mediu.

Greutatea substanei proaspete

Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi celulele sunt splate i uscate la pompa
de vid, dup care urmeaz cntrirea.

Greutatea substanei uscate

Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi sunt meninute la 60
o
C, timp de 12 ore.
Rcirea se execut ntr-un desicator, care conine silicagel, dup care materialul vegetal este cntrit.
Att greutatea substanei proaspete. ct i a celei uscate, sunt exprimate n raport cu unitatea de
volum i la 10
6
celule.

Indicele mitotic

Durata ciclului mitotic poate fi evaluat prin numrarea celulelor. Intervalul de timp, n care o
populaie celular i dubleaz numrul de celule, este considerat durata unei generaii. Sincronizarea
parial sau complet a diviziunilor celulare, n culturi de celule vegetale este necesar n scopul
studierii metabolismului celular, pentru determinarea lungimii ciclului mitotic total.
Eriksson(1966) a elaborat o metod bazat pe tratamentul suspensiilor celulare cu 5
aminouracil sau hidroxiuree, ca ageni sincronizatori ai culturii. Tratamentul cu aceste substane
inhibitoare ale sintezei ADN ului, se aplic n culturi n vrst de o zi, obinute din linii celulare
subcultivate regulat i dureaz 12-14 ore, funcie de agentul sincronizator folosit.
Dup tratament, celulele sunt splate de dou ori n mediul nutritiv proaspt i transferate n
flacoane cu mediu proaspt. Se iau probe pentru fixare, n diferite intervale de timp de la aplicarea
tratamentului. Se folosete fixatorul Carnoy. Apoi se ndeprteaz fixatorul prin centrifugare. Urmeaz
hidroliza cu HCl 1N, la 60
o
C,timp de 5 minute. Celulele sunt centrifugate pentru ndeprtarea HCl i
sunt colorate cu orcein lactopropionic (1g orcein n 100 ml dintr-un amestec n pri egale de acid
propionic/acid lactic.
Pentru determinarea indicelui mitotic se numr minimum 1000 de celule pentru fiecare prob.
100 x
analizate celule de total Nr.
mitotice celulelor Nr.
= IM
Agentul sincronizator este eficace cnd produce un indice mitotic cel puin dublu fa de cel
constatat la martor.
Tehnica culturii celulelor n suspensie presupune mai multe sisteme de culturi: sistemul de
agregate celulare pe agitator rotativ, sistemul nchis de cultur continu, sistemul deschis de cultur
continu.

1. Sistemul de agragate celulare pe agitator rotativ se realizeaz prin transferul calusului
ntr-un mediu lichid, agitat continuu. In cazul acestui tip de cultur, cu volum fix al mediului nutritiv,
biomasa crete prin diviziune celular, astfel nct unele substane nutritive, ct i cantitatea de oxigen
pot deveni factori limitativi ai culturii. De aceea se impune subcultivarea periodic a suspensiilor
celulare, la interval de 7 zile.



12
2. Sistemul nchis de cultur continu este sistemul n care componenii nutritivi necesari
sunt suplimentai printr-un flux continuu de mediu proaspt. Acest tip de sistem se utilizeaz att
pentru obinerea metaboliilor primari ct i a celor secundari.

3. Sistemul deschis de cultur continu implic echilibrarea mediului nou introdus cu
recoltarea unui volum egal de cultur. In categoria sistemelor deschise intr chemostatele, n care
mediul nutritiv este introdus n doze calculate i turbidistatele, in care densitatea celular este
meninut n anumite limite.

Tehnici ale clonrii celulare

Culturile celulare n suspensie se caracterizeaz, de obicei, printr-o mare heterogenitate att
sub aspect morfologic, ct i biochimic. Diversitatea genetic, reflectat n numrul i morfologia
cromosomilor este un fenomen frecvent semnalat la nivelul culturilor celulare n suspensie. n scopul
obinerii unor populaii celulare omogene, care s prezinte stabilitate genetic, au fost elaborate diferite
tehnici prin care se cultiv celule izolate, a cror evoluie ulterioar poate fi mai bine controlat i
dirijat.

1. Metoda suportului nutritiv (Hildebrandt ,1977) const n plasarea celulelor izolate pe o
hrtie de filtru, plasat la rndul ei deasupra unei mase de calus, care acioneaz ca o surs de hran.
Celula plasat pe hrtia de filtru se poate divide formnd, dup cteva sptmni, o mic colonie.

2. Metoda culturii n pictur (Hildebrandt,1977) const n cultivarea unei celule ntr-o
pictur de mediu lichid,nconjurat de ulei mineral, pe o lam microscopic. Se pune cte o pictur
de ulei de parafin pe fiecare latur a picturii de mediu, iar peste cele dou picturi de parafin se
aeaz cte o lamel steril. A treia lamel este plasat peste mediul de cultur care conine celula i
face legtura ntre cele dou lamele laterale. Celula crete i se divide n aceast pictur de mediu,
fr ca acesta s fie schombat. Parafina permite schimbul de oxigen i mpiedec pierderea apei din
mediu.

3. Metoda "plating-ului" a fost elaborat de Bergmann, n 1960 i const n amestecarea unui
mililitru dintr-o suspensie celular cu 9 ml mediu nutritiv, ce conine 0,5 % agar, la temperatura de
40
o
C. Dup amestec, cei 10 ml sunt trecui n vase Petri . Dup solidificarea mediului, evoluia fiecrei
celule din suspensia celular poate fi urmrit prin examinarea microscopic. De regul coloniile
celulare ncep s se formeze dup aproximativ 1-2 sptmani de cultur. Plcile Petri sunt incubate la
25
o
C i ntuneric. Declanarea diviziunii celulare depinde n mare msur de densitatea celulelor
etalate n vasele Petri. Densitatea minim este de 1 x 10
3
celule/ ml.

LUCRAREA 3
3. INITIEREA UNEI CULTURI IN VITRO LA DAUCUS CAROTA

Explante de 0,5-3 cm, prelevate din rdcina de morcov i sterilizate prin tratament chimic, se
plaseaz pe mediul B
5
, care conine 0,1 mg/l 2,4D. Pentru iniierea culturii se utilizeaz mediul agarizat.
Flacoanele cu mediu i explante sunt pstrate la ntuneric, n camera de cretere a culturi lor, la o
temperatur constant de 23-25
o
C.
Dup aproximativ 20-25 zile, biomasa acumulat, constnd din calus, este de 4-5 ori mai mare
dect cea de la care s-a pornit (dect mrimea explantului).
Pentru a obine o cultur celular n suspensie, calusul din 2-3 flacoane se transfer n 100 ml
mediu lichid (cu aceeai compoziie ca cel pe care a fost cultivat explantul), ntr-un flacon de 500 ml.
Flaconul se plaseaz pe un agitator, cu 150 rot/min, la 25
o
C i lumin continu. Dup 5-7 zile, se
nlocuieste mediul uzat cu mediu proaspt, permind o subcultur continu. O bun cultur celular (o
suspensie celular care s aib nivelul calitativ dorit, se obine dup 4-6 sptmni. In primele faze de


13
dezvoltare, adic n primele 1-2 sptmni, este posibil nlocuirea a 1/2 sau chiar a numai 1/4 din
mediul de cultur uzat cu unul proaspt.
In principiu, metodologia utilizat pentru morcov poate fi adaptat, cu unele modificri i la alte
specii.
In cazul n care dorim s obinem culturi celulare de mazre, putem utiliza explante din rdcini
sau lstari. De aceast dat este indicat suplimentarea mediului de cultur (formula de baz B
5
) cu 2
g hidrolizat de cazein i 1 mg/l 2,4 D. Cu toate acestea calusarea este nceat i pot fi necesare i
dou luni pentru a iniia o cultur (suspensie celular). Pentru gru, secar i porumb, calusul se obine
la ntuneric, din explante de rdcin, pe mediu de formula B
5
suplimentat cu 1 mg/l 2,4 D.

3.1. EMBRIOGENEZA SOMATICA IN SUSPENSII CELULARE DE DAUCUS CAROTA

Iniierea suspensiei celulare din calus de DAUCUS CAROTA
Materiale si reactivi
- rdcini de morcov;
- soluie de NaOCl 3%;
- ap distilat steril;
- mediul B
5
(agarizat i lichid);
- bisturiu , spatul, sit metalic;

Materialul vegetal

Rdcina tuberizat de Daucus carota, reprezint materialul ideal pentru iniierea calusului i,
apoi a suspensiilor celulare. Este indicat s se preleve explante din zona cambial a rdcinii. Acestea
se vor plasa pe mediul nutritiv n care este prezent o auxin, de obicei 2,4 D. In timp foarte scurt, pe
suprafaa explantului, apar zone cu intens diviziune mitotic. Ulterior ntregul explant se transform
ntr-o mas omogen de calus. Acesta constituie punctul de plecare pentru iniierea suspensiei
celulare. Calusul se repartizeaz conform indicaiilor date n paginile anterioare, n flacoanele cu mediu
lichid.
Dup aproximativ o sptmn de incubare n mediu lichid, n condiii de agitare, materialul
vegetal este transferat pe mediu proaspat cu ajutorul unei site metalice. Este indicat, ca la fiecare
subcultivare (transfer pe mediu proaspt), s se procedeze la o examinare microscopic, pentru
stabilirea gradului de viabilitate i sterilitate a materialului vegetal.

Inducerea embriogenezei somatice

Neoformarea embrionilor este posibil printr-o frecvent repicare a esuturilor cu cretere
activ, pe medii cu auxin, apoi transferul inoculilor pe mediu fr auxin. Metoda este utilizat
frecvent, att pentru obinerea de embrioni somatici, ct i pentru inducerea organogenezei. Un aspect
deosebit de important, n acest context, l constituie creterea procentului de embrioni.
S-a constatat, de pild, c o plasmolizare puternic, dar de scurt durat a celulelor n
suspensie (45 de minute, ntr-o soluie 1 % zaharoza), a indus o cretere de peste 3 ori a frecvenei
embrionilor somatici, n mediul lipsit de auxin. Se apreciaz c plasmoliza determin ntreruperea
comunicrilor intercelulare la nivelul agragatelor. In acest mod, plasmodesmele intercelulare se
ntrerup i celulele devin izolate, situaie care favorizeaz declanarea dezvoltrii independente, adic
generarea de embrioni somatici.
In cazul concret, al speciei Daucus carota, potenialul embriogen optim este atins dup
aproximativ 15 sptmni de la iniierea culturii. Potenialul embriogen descrete, n condiiile
prelungirii duratei de cultivare. Sunt 3 ipoteze care explic pierderea acestui potenial i anume:
- cauze de ordin citogenetic - poliploidia, aneuploidie;
- cauze fiziologice - alterri ale echilibrului hormonal, sensibilizri celulare la aciunea unor
factori exogeni (habituaie). Este situaia n care se poate produce o blocare a diferenierii, fr a se
pierde potenialitatea;


14
- cauze combinate, decurgnd din sensibilizarea culturii n prezena auxinei, ct i din creterea
ratei diviziunii celulelor neembriogene concomitent cu prelungirea duratei de cultur. In mod practic se
produce o "competiie" ntre celulele neembriogene i cele embriogene, care devin din ce in ce mai
rare.
In ceea ce privete embriogeneza somatic la Daucus carota, s-au evideniat 4 etape ale
diferenierii i anume:
- faza de cretere izodiametric, caracterizat printr-o diviziune neorientat a celulelor (cnd se
ajunge la stadiul globular);
- imprimarea treptat a caracterului de polaritate, faza de distribuire polarizat a esterazelor
(reacie pus n eviden prin metode histochimice);
- polaritate progresiv, caracterizat prin diviziuni celulare orientate, cnd se formeaz
cotiledoanele i apexul rdcinii, apoi se demarcheaz meristemul apical al tulpinii (stadiul cordiform i
torpedo);
- creterea bipolar, n care meristemele apicale (radicular i caulinar) se constituie i sunt apte
de a intra n diviziune.
Studiile histo-anatomice au reliefat faptul c att n calus ct i n suspensii celulare se pot
distinge dou categorii de celule:
- celule mari, cu vacuol mare, lipsite de potenial embriogenic;
- celule mici, cu citoplasm dens, aglomerate ntr-un fel de noduli (noduli embriogeni) care, la
rndul lor, conin dou categorii de celule:
a. celule centrale,cu o singur vacuol mare i nuclei mici, compaci, numr redus de
amiloplaste i activitate dehidrogenazic sczut;
b. celule meristematice,grupate la periferia nodulilor embriogeni, cu vacuole puine, cu
nuclei mari, citoplasma dens i ribozomi numeroi, intens activitate dehidrogenazic, coninut bogat
de ARN i proteine.
Pe msur ce calusul se acumuleaz se poate observa dezorganizarea nodulilor embriogenici.
Celulele meristematice disociate sunt reagregate n grupuri, ce pot genera noi centri embriogenici, deci
noi noduli. Dac grupurile de celule meristematice, aprute n subcultur, vor fi separate i transferate
pe medii de cultur fr auxin, n zonele lor periferice se vor forma muli embrioni.

LUCRAREA 4
INDUCEREA ORGANOGENEZEI IN CULTURI DE CALUS DE
PAPAVER SOMNIFERUM

n inducerea procesului de regenerare prin organogenez, un factor esenial l constituie tipul i
concentraia regulatorilor de cretere (fitohormonii) din compoziia substratului nutritiv.
Schematic, etapele procesului de dedifereniere i redifereniere celular pot fi reprezentate
astfel:
Explant
dedifereniere.
Calus
redifereniere
rizogenez caulogenez
Rdcini Lstari
Caulogenez rizogenez
Plante regenerate Plante regenerate

n experimentul de fat, urmrim efectul a doua variante de mediu, respectiv mediul B
5
cu 0,5
mg/l NAA i acelai mediu B
5
cu 0,1 mg/l AIA i 1 mg/l BAP,2 mg/l kinetina asupra procesului
regenerrii, n culturi de calus de Papaver somniferum (calus primar, adic provenit din
dediferenierea plantulelor de 5-7 zile de Papaver somniferum, n decurs de 3-6 sptmni.
Material vegetal


15
Calus de Papaver somniferum obinut n decurs de 3-6 sptmni de la iniierea culturii
(plasarea plantulelor de 5-7 zile pe mediu de calusare).
Mod de lucru
Calusul obinut ntr-un interval de 3-6 sptmni, poate fi meninut pe perioade nelimitate,cu
condiia s fie transferat periodic pe medii proaspete. Subcultivarea se face pe mediul de intreinere a
calusului, care de regul are aceeai compoziie cu cel de iniiere a culturii (n cazul nostru am folosit
mediul Gamborg cu 2,4 D). Inducerea morfogenezei poate fi obinut folosind tot mediul de baz
Gamborg, dar variind cele dou tipuri de fitohormoni sub aspectul concentraiei. Auxinele sunt implicate
n rizogenez, iar citochininele n caulogenez.
Mediul de calusare - B
5
cu 1 mg/l 2,4 D
Mediul de intreinere -idem
Mediul de regenerare - rizogenez - B
5
cu 0,5 mg/l NAA
- caulogenez - B
5
cu 0.1 mg/l IAA,1 mg/l BAP, 2 mg/l kinetina

LUCRAREA 5
5. IZOLAREA I CULTIVAREA PROTOPLASTILOR LA
PAPAVER SOMNIFERUM

Manipularea genetic a plantelor a devenit posibil graie perfecionrii unor tehnici care permit
izolarea i cultivarea protoplatilor. Protoplatii sunt celule nude, obinute prin ndeprtarea pereilor
celulaeri rigizi. Utilitatea culturilor de protoplati pentru ameliorarea plantelor, nu se rezum numai la
calitatea lor de sisteme apte pentru ingineria genetica, ci s-au dovedit a avea un enorm potenial n
creterea variabilitii genetice a plantelor. Studiile de regenerare a plantelor din culturi de protoplati
au condus la decelarea de mutaii spontane i n special a variaiilor somaclonale, care cuprind
totalitatea schimbrilor genomice, cromozomiale sau genice, induse n timpul dezvoltrii "in vitro" a
celulelor.
Tehnica obinerii protoplatilor a devenit de mare interes, mai ales prin aceea c ofer
posibilitatea hibridrii somatice si, pe calea regenerrii, obinerea unor genotipuri valoroase Tehnicile
destinate transferului de nuclei, organite, fragmente mici de ADN n protoplati sporesc ansele de
transformare mai rapid a plantelor n sensul obinerii unor genotipuri valoroase.
Material si metoda
Plantule de 5-7 zile, obinute prin germinarea seminelor de Papaver somniferum, n condiii
aseptice.Tehnica izolrii protoplatilor cuprinde 3 etape:
- Plasmoliza materialului vegetal;
- Tratamentul enzimatic;
- Purificarea protoplatilor.
Compoziia chimic a soluiilor utilizate pentru izolarea protoplatilor:

Soluia de plasmoliz

Soluia enzimatic

Soluia de splare

KH2PO4 27,2 mg/l

Celulaz 0,75g/100ml

CaCl2 1,3g/l

KNO3 101 mg/l

Macerozim 0,2g/100 ml

NaCl 0,905g/l

CaCL2.H2O 1480 mg/l



KCl 0,037g/l

MgSO4,7H2O 246 mg/l



Glucoz 0,099g/l

KI 0,16 mg/l





CuSO4.5H2O 0,025 mg/l





Manitol 130 g/l pH-5,8

pH-5,8

pH-5,6


16

Plasmoliza materialului vegetal este prima etap n izolarea protoplatilor. Plasmoliza cu soluia
13% manitol este efectuat n scopul ruperii plasmodesmelor i pregtirii pereilor celulari pentru
tratamentul enzimatic. Durata plasmolizei este de 30 minute. Dup ndeprtarea soluiei de plasmoliz,
materialul vegetal este tratat cu soluia enzimatic. Durata incubrii n soluia enzimatic variaz n
funcie de tipul explantului i concentraia amestecului enzimatic. In cazul de fa am utilizat o soluie
enzimatic coninnd 0,75 % celulaz i 0,2 % macerozim. Celulaza este un amestec de hidrolaze,
care desfac celuloza pn la glucoz, iar macerozimul, al crui component principal este pectinaza,
hidrolizeaz legturile 1,4 galacturonice ale pectinei, elibernd acizii galacturonici. Pectinliaza este o
alt component a macerozimului, care catalizeaz eliminarea acizilor nesaturai 4,5 galacturonici din
pectin. Incubarea materialului vegetal n soluia enzimatic s-a realizat n condiii de agitare, timp de
16 ore, la ntuneric. Purificarea protoplatilor reprezint urmtoarea etap n izolarea lor.Se pot utiliza
dou metode:


1. Filtrarea prin sita de nylon cu diametrul porilor de 80 m:

Protoplatii eliberai n urma tratamentului enzimatic sunt separai de resturile tisulare
nedigerate, la inceput printr-o sit metalic, apoi prin sita de nylon. Filtratul este centrifugat timp de 5-7
minute (1000 rot/min). Supernatantul este ndepartat, iar sedimentul format din protoplati este
resuspendat n soluia de splare. Operaia de splare a protoplatilor se repet de dou ori, n scopul
eliminrii totale a soluiei enzimatice.

2. Flotarea protoplatilor, ca mijloc de purificare:

Purificarea protoplatilor prin metoda filtrrii i centrifugrii prezint dezavantajul distrugerii
protoplatilor ntr-o proporie destul de mare. De aceea putem recurge la o alt metod, care s
inlture acest neajuns.
Sedimentul de protoplati obinut dup prima splare, este resuspendat ntr-o soluie
concentrat de sucroz (40 %). Se centrifugheaz timp de 5 minute, protoplatii se adun la suprafaa
ntr-o band verde, care va fi colectat
i resuspendat n mediul de cultivare al protoplatilor.

Mediul de cultivare al protoplastilor
Mediul Gamborg (sruri minerale + vitamine)
manitol 54,6 g/l
glucoz 20,0 g/l
hidrolizat de cazein 1,0 g/l
2,4 D 1 mg/l
kinetina 2 mg/l
pH 5,8

Protoplatii purificai prin cele dou metode mai sus amintite, sunt resuspendai n mediul
nutritiv pentru protoplati. Cultivarea lor se face la ntuneric i la temperatur constant (23-24
o
C).
Protoplatii proaspt izolai i refac peretele celular n decursul a 48 ore, iar dup trei zile se pot
observa primele diviziuni.
Pentru cultivarea protoplatilor pot fi utilizate att medii lichide ct i medii agarizate. Cultivarea
protoplatilor pe mediul solid prezint avantajul unei mai bune vizualizri a diviziunilor celulare i a
agragatelor celulare, care premerg formrii calusului.
Imediat dup izolare, trebuie s determinm viabilitatea protoplatilor la microscopul optic n
contrast de faz. Pe o lam se pune o picatur din suspensia de protoplati i se acoper cu o lamel.
Forma sferic i existena unui perete continuu la periferia protoplastului format pe seama
cloroplatilor, indic faptul c protoplatii sunt viabili. Protoplatii neviabili au o form neregulat i
cloroplatii sunt aglomerai n grmezi dezordonate.


17
La 7 zile de la izolarea protoplatilor putem determina "capacitatea de regenerare" a celulelor
prin numrarea stadiilor de diviziune. Capacitatea regenerativ a fost stabilit ca raport ntre numrul
celulelor divizate (dup 7 zile) i numrul total al protoplatilor (dup izolare). Pentru numrarea
protoplatilor se poate utiliza o camer de numrare a celulelor de tip Fuchs-Rosenthal 0,2 mm.
Densitatea optim a protoplatilor pentru diviziune i implicit pentru regenerare este de 5.10
4
-1.10
5

protoplati/ml.

5.1. METODA HIBRIDRII CELULARE LA PLANTE PRIN FUZIUNI DE PROTOPLATI

Hibridarea somatic este o tehnic de mare actualitate pentru aplicaiile sale n genetic,
biologia celular. Prin intermediul nmulirii parasexuate se pot realiza genotipuri noi, care sunt
imposibil de realizat prin metodele convenionale de ameliorare.
Inducerea fuziunii protoplatilor se poate realiza utiliznd o gam foarte larg de ageni de
fuziune cum ar fi : nitratul de sodiu, proteine de agregare dar cel mai eficient este polietilenglicolul
(PEG). Introdus relativ recent n tehnicile de hibridare somatic la plante (Kao i Michayluk, 1974),
polietilenglicolul este un polimer solubil n ap i eficiena sa n aglutinare i fuzionare este datorat
capacitii de a forma legturi ionice ntre constituienii de suprafa ai celulei.

Inducerea fuziunii protoplatilor la Papaver somniferum i Papaver pseudo-oientale cu
ajutorul polietilenglicolului

Izolarea protoplatilor a fost realizat prin metoda enzimatic descris n capitolul anterior,
utiliznd dou surse de protoplati: cotiledoanele plantulelor de Papaver somniferum i suspensii
celulare de Papaver pseudo-orientale.
Pentru inducerea fuziunii celor dou tipuri de protoplati s-a utilizat tehnica culturii "n pictur".
Protoplatii izolai de la cele dou surse sunt amestecai n raport de 1:1 (aproximativ 100l fiecare)
ntr-un vas Petri i se las 10 minute la temperatura camerei. Se adaug apoi 2-3 picturi din soluia de
PEG la periferia suspensiei mixte de protoplati, dup care amestecul se incub 30 minute, timp n
care are loc aderarea i aglutinarea reciproc a protoplatilor. Dup tratamentul cu soluia PEG ,
aceasta este nlocuit treptat cu mediul de cultivare al protoplatilor. Att procesul adeziv, ct i cel de
fuziune necesit o anumit compoziie a soluiei de fuziune.

Compoziia soluiei PEG
- polietilenglicol 50 g
- CaCl
2
2H
2
O 120 mg
- KH
2
PO
4
10 mg
- glucoza 1 g
- pH 5,8

In timpul fuziunii, marginile externe ale protoplatilor se unesc, iar poriunile intermediare
formeaz vezicule, care se degradeaz treptat. Organitele celulare migreaz ctre periferia celulelor
fuzionate. In general, amestecul complet al citoplasmelor are loc dup aproximativ 12 ore. Natura
hibrid a produilor de fuziune este evident numai dup fuziunea nucleilor mitotici i parcurgerea mai
multor cicluri celulare. Selecia hibrizilor somatici vegetali poate avea loc n diferite faze:
- imediat dup fuziune, naintea apariiei diviziunii;
- dup apariia calusului;
- dup regenerarea de hibrizi somatici.







18
LUCRAREA 6
6. DETERMINAREA CALITATIV A ALCALOIZILOR
IN SUSPENSII CELULARE DE PAPAVER SOMNIFERUM
PRIN METODA CROMATOGRAFIEI IN STRAT SUBIRE

Cromatografia reprezint o metod de separare a diverilor componeni ai unui amestec, pe
baza migrrii lor difereniate, n funcie de greutatea molecular, pe un substrat specific. Metoda
implic repartizarea componentelor amestecului supus analizei, ntre dou faze - lichid i solid
(mobil i staionar).
In timpul deplasrii prin faza staionar solid (silicagel), faza mobil antreneaz componenii
amestecului supus analizei, n proporii dependente de interaciunile dintre acetia i cele dou faze,cu
care se afl n contact permanent. Tehnica concret de lucru const n urmtoarele:
Pe o plac de sticl, avnd dimensiunile de 20 x 20 cm, se ntinde un strat subire i omogen de
silicagel. Pe respectiva plac de sticl, la distana de 1,5-2 cm de la margine, se pipeteaz amestecul
ce trebuie analizat, sub forma unui spot cu diametrul ct mai mic posibil. Cantitatea pipetat este de 50
microlitri. Distana dintre centrii spoturilor este de 2 cm (spre a se evita suprapunerea lor), fapt pentru
care pe o plac normal se pot pipeta 8 spoturi. Dup ce s-a picurat ntreaga cantitate de substan ce
trebuie analizat, n numrul respectiv de spoturi, placa de sticl se introduce n camera de migrare. In
prealabil, cuva cu amestecul pentru migrare a fost bine inchis pentru a se asigura obinerea unei
atmosfere saturate n vapori. Migrarea se produce difereniat, n sensul c moleculele cu greutate mare
ramn la baza plcii, cele cu masa mai mic migreaz ctre partea superioar a plcii.

Metoda CSS (TLC-Thin Leyer Chromatography)

Metoda cromatografiei n strat subire este larg utilizat pentru analiza calitativ i cantitativ a
alcaloizilor.

Pregtirea si analiza probelor

Suspensiile celulare de Papaver somniferum obinute din cultivarea calusului pe mediul nutritiv
lichid reprezint materialul supus analizei. Aproximativ 1 g de calus obinut prin filtrarea suspensiilor
celulare printr-o sit metalic, este supus extraciei. Acesta este tratat cu 5 ml ap distilat i 1 ml HCl
1N. Se omogenizeaza amestecul, apoi se adaug 10 ml alcool etilic absolut. Rolul HCl este de a
separa morfina sub forma de clorhidrat de morfin. Amestecul astfel pregtit se las, pentru macerare,
timp de 24 de ore. Apoi maceratul se filtreaz, cu ajutorul pompei de vid. Extractul se concentreaz,
prin evaporare pe baia de ap. Reziduul este preluat cu 2 picturi de HCl 1 N i 1 ml alcool etilic 70%

Pregtirea plcilor de silicagel

Pentru asigurarea stratului de silicagel, pe o plac normal (20x20 cm) se utilizeaz, n medie,
2,5 g silicagel. Anterior pipetrii probelor de analizat, plcile sunt activate prin incubarea lor n etuv,
timp de 30 minute, la 100
o
C. Pentru migrare, n baia cromatografic, se utilizeaz o soluie alctuit
din: 5O ml aceton + 4O ml xilen + 6 ml metanol + 5 ml amoniac.
Pipetarea probelor de analizat pe plci se efectueaz cu ajutorul tuburilor capilare. Migrarea
componentelor amestecului supus analizei este urmrit permanent, timpul de meninere a plcii n
baia de migrare este cuprins ntre 30-60 minute.
Apoi plcile sunt scoase din cuva de migrare i supuse uscrii dup care sunt examinate sub o lamp
de ultraviolete la lungimile de und de 254 i 366 nm.
Viteza de migrare a probei, notat cu Rf, poate lua valori cuprinse ntre zero (cnd pictura din
prob rmne n poziia de start) i egalul distanei de migrare.
Separarea componentelor din proba de analizat se realizeaz n ordinea descresctoare a
dimensiunilor moleculare. Evaluarea cantitativ se face direct pe placa cromatografic, pe criteriul
morfologiei spotului migrat sau prin raclarea i extragerea spoturilor i citirea la un spectrofotometru.


19

6.1. OBINEREA METABOLIILOR SECUNDARI
IN SUSPENSII CELULARE TRATATE CU ELICITORI

O nou metod de cretere a produciei i acumulrii de metabolii secundari, n suspensii
celulare, o constituie inducerea reaciilor chimice de aparare. Multe plante reacioneaz la invazia
microbian, ct i la toi ceilali factori din mediu, care provoac un stres celular (radiaii UV, ioni de
metale grele, substane toxice) prin producerea unor compui, cunoscui sub numele de fitoalexine.
Alturi de aceste substane chimice de aprare, a cror biosintez este limitat cantitativ i temporal,
stresul celular poate fi premiza unor variaii cantitative i calitative considerabile n biosinteza unor
metabolii secundari.
Aceast metod asigur utilizarea biotehnologic a culturilor vegetale, realiznd premizele
sporirii producerii i acumulrii de metabolii secundari de importan n industria chimic, alimentar,
farmaceutic. In culturile celulare acioneaz, n principiu, aceeai ageni de elicitare, ca i n plantele
intacte. Compuii care declaneaz reacii chimice de aprare n organismele asupra crora
acioneaz, sunt cunoscui sub numele de elicitori i pot fi de dou categorii: biotici i abiotici.
In categoria elicitorilor biotici se ncadreaz att organismele intacte ca: bacterii, ciuperci
patogene sau nepatogene, ct i molecule organice, izolate din aceste organisme ca: oligozaharide,
glicoproteine.
Printre elicitorii abiotici se numr srurile unor metale grele ca HgCl
2
, CuSO
4
, detergeni,
actinomicina D.
Elicitorii, n general, induc n culturile celulare oactivitate enzimatic, care catalizeaz
producerea unor substane antimicrobiene, de tipul fitoalexinelor (acumulate n esuturile necrotice).
Intregul proces poate fi reprezentat ca un complex: stimul - rspuns - produs. Efectul acestui
stimul l constituie creterea producerii de metabolii secundari n culturile vegetale. In ultimii ani,
majoritatea eforturilor se concentreaz spre aceast metod, culturile celulare reprezentnd un sistem
model pentru studiul mecanismelor de control al acumularii fitoalexinelor i a altor metabolii de stres.

SISTEMUL MODEL AL INTERACIUNII ELICITOR - SUSPENSIE CELULAR

ELICITOR

RECUNOATEREA ELICITORULUI LA NIVELUL CULTURII IN SUSPENSIE


ACTIVAREA GENIC I SINTEZA ENZIMELOR IMPLICATE IN LANURILE METABOLICE


FORMAREA FITOALEXINELOR I A ALTOR METABOLII DE STRES


ACUMULAREA DE METABOLII SECREIA DE METABOLII
DE STRES IN SUSPENSII CELULARE DE STRES DIN CELULE IN MEDIUL
NUTRITIV
Acumularea metaboliilor secundari n suspensii celulare tratate cu elicitori

Nr.
Crt
Elicitori biotici
Suspensii
celulare
Metabolii
secundari
Autorii
1.
Bacterii
Pseudomonas syringae
Nicotiana
tabacum
Fituberol
fituberina
Tanaka,1985
2.
Alge brune
Laminaria, Fucus
Lithospermum
erythrorhizon
shikonina Fukui, 1983


20
3.
Alge roii
Gelidium amansii
(alginat de Ca)
Glycyrrhiza
echinata
echinatina Ayabe,1986
4.
Oomycetae
Phytophtora megasperma
Nicotiana
tabacum
capsidiol Chapell,1985
Petroselinum
crispum
cumarine Kombrink,1985
5.
Zigomycetae
Rhyzopus errhisus
Discorea
deltoidea
diosgenina Rokem,1984
6.
Ascomycetae
Saccharomyces cerevisiae
Sclerotina sclerotiorum
Thalictrum
rugosum
berberine Funk,1987
Papaver
somniferum
sanguinarina Eilert,1985
7.
Deuteromycetae

Aspergillus niger

Trichoderma viridae

Verticillium dahliae

Fusarium moniliforme
Cinchona
ledgeriana
antrachinone Wijusma,1985
Nicotiana
tabacum

capsidiol Threlfall,1988
Papaver
somniferum

morfina Heinstein,1985
Papaver
somniferum
codeina Heinstein,1985
8.
Spermatophyta
Phaseolus vulgaris
(extract)
Phaseolus
vulgaris
faseolina Hargreaves,1978
9.
Elicitori abiotici

crbune activ

CuSO4

HgCl2
Lithospermum
erythrorhizon
echinofuran Fukui,1984
Apium
graveolens
bergapten
Medicago
sativa
medicarpina Gustine,1982

In reuita acestei metode se impune crearea condiiilor pentru o interaciune optim ntre
elicitor i suspensia celular. Este foarte important alegerea unui elicitor adecvat, cci aceeai
molecul de elicitor nu activeaz, la diferite specii aceeai cale metabolic. Pe lng tipul de elicitor, se
are n vedere i doza n care este el administrat. Pe de alt parte, suspensia celular trebuie s fie
aptde a reaciona adecvat la tratamentul cu elicitor. Se are n vedere originea explantului, care a
generat cultura, vrsta culturii, starea ei fiziologic. Elicitorul este recunoscut de celulele cultivate, prin
intermediul receptorilor de la nivelul membranei plasmatice, urmnd apoi un ntreg lan de procese
fiziologice i biochimice, la finele cruia se acumuleaz o cantitate nsemnat de metabolii secundari.
Pe lng metabolii secundari de tipul fitoalexinelor, se pot acumula i substane fr efect
antimicrobian. Vom exemplifica cteva reuite ale acestei metode. Suspensii celulare de Glycine max
tratate cu preparate fungice, sintetizeaza cantiti nsemnate de izoflavone, iar suspensii celulare de
Daucus carota, tratate cu spori de Chaetomium globosum sintetizeaz cantiti nsemnate de
izocumarina. Compui de tipul terpenelor au fost obinui n suspensii celulare de Gosypium arboreum
tratate cu conidii de Verticillium dahliae.
In ciuda rezultatelor satisfctoare i de perspectiv, metoda tratrii suspensiilor celulare cu
elicitori, ridic o serie de probleme cum ar fi distrugerea unei cantiti mari de celule dup aplicarea
tratamentului.
Actualmente "strategiile" de producere a metaboliilor secundari "in vitro" se axeaz pe
studierea tuturor factorilor care duc la moartea celulelor i se ncearc limitarea acestui proces, fcnd
posibil o elicitare de lung durat a culturii. Utilizarea sistemului experimental elicitor-suspensii
celulare, ramne o alternativ de perspectiv n obinerea metabiliilor secundari "in vitro".



21
LUCRAREA 7
7. METODE DE OBTINERE A PLANTELOR HAPLOIDE

Obinerea "in vitro" a plantelor haploide (organisme care posed numrul gametic de
cromozomi n) este posibil prin tehnica cultivrii "in vitro" a anterelor si polenului izolat. Androgeneza a
fost indus pentru prima dat prin cultura "in vitro" a anterelor la specia Datura inoxia, de catre Guha i
Maheshwari, 1964. O prim cerin pentru succesul culturii "in vitro" de antere o constituie stadiul de
dezvoltare a grunciorilor de polen n momentul recoltrii i compoziia mediului de cultur.
Tehnica de lucru cuprinde urmtoarele etape:
- recoltarea mugurilor florali;
- dezinfectarea mugurilor florali cu soluie de hipoclorit de calciu 1%, timp de 10 minute, urmat
de splarea lor cu ap distilat steril;
- dup tratament, anterele nernite, cu o poriune mic din filamentul staminal se trec pe
mediul nutritiv solid, n vase Petri sau eprubete;
- culturile se pstreaz la temperatura de 26-27
O
C i se expun la lumin timp de 12-14 ore pe
zi;
- aproximativ, dup 3-8 sptmni, microsporii din antere genereaz embrioni din care se
dezvolt plantule.

Mediul de cultur i rolul lui n inducerea androgenezei

Mediul de cultur este un factor esenial pentru succesul cultivrii "in vitro" a anterelor i este
specific pentru diferite specii de plante. Acesta trebuie s conin n principal macroelemente,
microelemente, aminoacizi eseniali, vitamine, fitohormoni, zaharoz i uneori suplimente organice.
Pentru cultura anterelor "in vitro" se utilizeaz fie mediul White (1943), fie Murashige-Skoog
(1962).

Medii nutritive folosite pentru cultura anterelor "in vitro

COMPOZIIA CHIMIC MEDII DE CULTUR
White Nitsch
Macroelemente mg/l mg/l
Ca(NO
3
)
2
,4H
2
O 288 950
KNO
3
80 950
NH
4
NO
3
_ 720
KCl 65 _
KH
2
PO
4
_ 68
NaH
2
PO
4
, 4H
2
O 19 _
CaCl
2
. 2 H
2
O _ 166
MgSO
4
7 H
2
O 737 185
Na
2
SO
4
200

Microelemente
Fe
2
(SO
4
)
3
2,5 -
FeSO
4
7 H
2
O - 27,8
Na
2
EDTA - 37,3
MgSO
4
4 H
2
O 6,7 25
H
3
BO
3
1,5 6,2
ZnSO
4
4 H
2
O 2,2 10
KI 0,75 -
Na
2
MoO
4
2 H
2
O - 0,25
CuSO
4
5 H
2
O - 0,025


22

Substane organice
Biotina - 0,05
Glicina 3 2
Inozitol - 100
Acid nicotinic 0,5 5
Piridoxina 0,1 0,5
Tiamina 0,1 0,5
Acid folic - 5
Zaharoza 20 000 20 000
Obinerea de plante haploide prin culturi de antere

Mugure floral
Antere
Microspori
Embriogenez Calus haploid
Plante haploide Mutagenez
Dublarea cromozomial Selecie
( tratament cu colchicin)
Regenerare
Plante homozigote 2n
(linii izogene) Mutante haploide


7.1. CULTURA IN VITRO DE MICROSPORI IZOLATI

In cazul culturii de microspori izolai posibilitatea de obinere a populaiilor omogene de plante
haploide sunt mai mari n raport cu utilizarea culturilor de antere. Acest fapt s-ar explica prin influena
negativ a esutului anterei asupra dezvoltrii microsporilor (n cultura de antere). Astfel, pe de o parte,
esutul degenerativ al anterei, prin substane inhibitoare de cretere, limiteaz dezvoltarea
microsporului, iar pe de alt parte, esutul diploid al anterei crete foarte activ formnd calus care
inund microsporii. Plantele haploide obinute prin cultura de microspori prezint o mai mare stabilitate
genetic fa de cele obinute prin cultura de antere.
Metoda include dou etape importante:
- prima, influenarea microsporilor n vederea schimbrii evoluiei normale sexuale cu o evoluie
pe cale vegetativ. Inducerea dezvoltrii microsporului pe cale vegetativ are la baz inhibarea formrii
nucleului generativ, astfel ca nucleul vegetativ s se poat dezvolta similar unei celule somatice
- a doua, direcionarea dezvoltrii microsporilor ctre embriogenez. Dezvoltarea polenului
poate fi indus prin tratarea anterelor cu diferii ageni fizici sau chimici, care au rolul de a produce
modificri n mitoza polinic. Dintre acetia amintim:
- ocurile de temperatur, care aplicate la polen au ca rezultat formarea a doi nuclei identici
nedifereniai;
- centrifugarea polenului la temperaturi sczute;
- utilizarea colchicinei pentru alterarea mitozelor polinice.

Tehnica izolrii microsporilor

Pentru izolarea microsporilor au fost elaborate mai multe metode:
1. Tehnica lui Sunderland N. i Roberts M. (1977) de izolare a microsporilor.
Mugurii florali (recoltai dup prima diviziune mitotic, la tutun, cnd corola are 21-23 mm) se
pstreaz 12 zile la 7-8
0
C apoi anterele se extrag din muguri i se trec n mediu lichid (cte 15 antere
n 5 ml mediu) cu urmtoarea compoziie:



23
mg/l
KNO
3
950
NH
4
NO
3
825
MgSO
4
7H
2
O 185
CaCl
2
220
KH
2
PO
4
85
FeSO
4
.7H
2
O 27,8
Na
2
EDTA 37,3
Sucroza 20 000
pH 5,5

Vasele Petri se izoleaz cu Parafilm i se incubeaz la 28
0
C , la ntuneric primele 14 zile. Apoi
se trec la 25
0
C i lumin, timp de 12 ore pe zi. Polenul eliberat n mediu dup 6,10, 14 zile continu s
creasc i s germineze, genernd embrioni haploizi.
2. Tehnica lui Nitsch (1974), de izolare a microsporilor
Metoda se bazeaz pe extracia polenului n mediul de cultur prin presarea anterelor, cu ajutorul unui
piston de sering. Urmeaz operaia de filtrare, printr-o sit de nylon n scopul ndeprtrii esuturilor
anterei. Suspensia de polen se centrifugheaz la 100 turaii, timp de 5 minute. Polenul este splat de
dou ori, dup care suspensia final este pipetat n vase Petri mici, cu diametrul de 5 cm. Vasele
Petri sunt izolate cu parafilm i sunt incubate la 27-30
o
C

7.2. CULTURA IN VITRO DE OVARE

Cultura in vitro de ovare a fost realizat pentru prima dat de La Rue C.D, n anul
1942, care a utilizat n experimentri 92 de specii de mono i dicotiledonate. Succesul culturii de ovare
este limitat la speciile care posed o morfologie simpl i fructele ajung rapid la maturitate. Vom
prezenta metoda folosit de Rao P.S., Rangaswamy N.S. (1965) pentru cultura ovarelor de Nicotiana
rustica. Mediul de cultur are urmtoarea compoziie:

mg/l
Ca(NO
3
)
2
4H
2
O 500
KNO
3
125
MgSO
4
H
2
O 125
KH
2
PO
4
125
MnSO
4
4H
2
O 3
ZnSO
4
7H
2
O 5
H
2
BO
3
5
CuSO
4
5H
2
O 0,25
Na
2
MoO
4
0,25
CaCl
2
0,25
citrat de Fe 10
glicina 7,5
acid nicotinic 11,25
tiamina 25
pantotenat de Ca 0,25
piridoxina 0,25
hidrolizat de casein 500
zaharoz 40,0
agar 8,0
pH 5,8

Mediul de cultur se sterilizeaz prin autoclavare la 121
o
C, timp de 15 minute. Apoi se
repartizeaz n eprubete, cte 25 ml/eprubet.



24
Prepararea explantului i plasarea sa pe mediul de cultur

1. Se recolteaz florile sau mugurii florali, iar pedunculul, staminele i petalele se indeprteaz ;
2. Ovarele se dezinfecteaz cu etanol 70%, apoi, se imerseaz n 0,5 % hipoclorit de sodiu timp
de 10 minute i se spal cu ap distilat steril ;
3. Se transfer pistilele pe mediul nutritiv cu agar. Culturile se in la 27
o
C i la lumin
fluorescent 10 000 lucsi, timp de 16 ore/zi.



LUCRAREA 8
CULTURA IN VITRO DE ENDOSPERM


Endospermul este un esut unic din punct de vedere genetic, fiind triploid la cele mai multe
angiosperme, rezultnd din fuziunea a trei nuclei haploizi. Endospermul este esutul nutritiv al
embrionului i n acelai timp centrul dinamic al influenei de dezvoltare a acestuia. Cercetrile din
ultimii ani au bsolute potenialul organogenetic al endospermului cultivat in vitro. Dat fiind faptul ca
esutul endospermic este triploid, plantele formate prin cultura acestuia in vitro sunt triploide.
Primele cercetri privind cultura de esut endospermic au fost efectuate nc din 1933 de Mills
R, Lamp C. Acetia au plasat endosperm de la boabele tinere de Zea mays pe mediu nutritiv,
coninnd extract de cartof i au obinut o uoar proliferare a celulelor nvecinate embrionului. Mai
trziu, n 1949, La Rue, extinde cercetrile privind creterea i diferenierea endospermului in vitro,
reuind s obin o cretere continu de esut endospermic, imatur provenit de la porumb.

Tehnica culturii in vitro de endosperm

O importan deosebit pentru tehnica culturii endospermului o constituie momentul optim de
excizare a endospermului. Astfel, la Zea mays, timpul optim este la 8-11 zile dup polenizare iar la
Cucumis sativus la 7-10 zile dup polenizare.
In scopul realizrii unei bune proliferri a endospermului, mediul de cultur se suplimenteaz cu
diferii factori de cretere : suc de tomate, extract de drojdie. Cele mai adecvate medii nutritive pentru
cultivarea endospermului sunt mediul White (1943) i mediul MS (Murashige-Skoog,1962). Indiferent
de compoziia mediului de baz, prezena auxinei (2,4D sau IAA), a citokininei (BAP sau kinetina) i a
extractului de drojdii sau hidrolizatului de cazein (sursa de azot organic) este esenial pentru iniierea
unei culturi de endosperm.
Organogeneza indus n calusul bsolute din culturile de endosperm
Specia Autorii
Euphorbiaceae
Jatropha panduraefolia
Putranjiva roxburghii
Srivastava, 1973
Srivastava, 1973
Gramineae
Oryza sativa
Bajaj et al., 1980
Loranthaceae
Scurrula pulverulenta
Taxillus vestitus
Bhojwani, 1970
Nag si Johri, 1971
Santalaceae
Santalum album
Lakshmi Sita et al,1980
Rutaceae
Citrus grandis
Wang si Chang, 1978
Rosaceae
Prunus persica
Pyrus malus
Shu-quiong si Jia qu, 1980
Mu et al, 1977



25
Endospermul cultivat pe medii nutritive adecvate poate genera plantule direct prin
embriogenez sau indirect prin formarea mai nti a calusului i apoi, prin diferenierea acestuia.
Pentru formarea mugurilor direct din tesut endospermic este absolut necesar prezena n mediu a
unei citokinine.
CULTURA IN VITRO DE EMBRIONI
Embriocultura constituie o metod eficient de obinere de plante fertile de la hibrizi neviabili
sau de la semine care i-au pierdut capacitatea de a germina. Metoda culturii de embrioni const, din
izolarea aseptic a embrionului i transferul lui pe mediu nutritiv.
Ovulele intacte, seminele sau capsulele care conin ovule se sterilizeaz iar embrionii sunt
extrai n condiii aseptice. Sterilizarea seminelor se poate face cu etanol, timp de 3 minute, sau cu
clorura mercuric 0,1%, timp de 15 minute. In condiiile n care se lucreaz cu semine de dimensiuni
reduse, toate operaiile de excizare a embrionilor din semine se efectueaz sub microscop.
Mediile de cultur folosite pentru cultivarea embrionilor variaz funcie de specia de la care
provin embrionii si de vrsta acestora. Embrionii maturi pot crete pe un mediu cu sruri minerale i
zaharoz, iar proembrionii necesit suplimentarea mediului de cultur cu vitamine, aminoacizi,
fitohormoni.

Prepararea mediului de cultur

Mediul nutritiv complet prezint urmtoarea compoziie :
mg/l
KH
2
PO
4
910
KCl 750
MgSO
4
7H
2
O 740
MnSO
4
H
2
O 3
H
2
BO
3
5
ZnSO
4
7H
2
O 5
CoCl
2
0,25
CuSO
4
5H
2
O 0,25
citrat de Fe 10
inozitol 50
tiamin 25
pantotenat de Ca 25
piridoxin 25
glutamin 400
alanin 50
cistein 20
arginin 10
leucin 10
fenilalanin 10
tirozin 10
acid malic 1
zaharoz 30000

Tehnica culturii in vitro de embrioni la gru (Triticum aestivum)

Boabele de gru sunt splate n alcool etilic 70 %. Apoi, sunt sterilizate cu hipoclorit de calciu 5
%, timp de 5-10 minute, dup care urmeaz excizia embrionului cu ajutorul unui bisturiu. Embrionii
excizai sunt plasai n vase Petri mici, fiecare coninnd 5 ml din mediul de cultur. Probele sunt
meninute la o temperatur de 25
o
C, n condiiile unei fotoperioade de 16 ore.





26
Compoziia mediului nutritiv utilizat pentru cultivarea embrionilor de gru (Triticum
aestivum)

Macroelemente mg/l
KNO
3
1900
CaCl
2
.2H
2
O 880
NH
4
NO
3
825
MgSO4
.
7H
2
O 370
KCl 350
KH
2
PO
4
170

Microelemente mg/l
H
3
BO
3
12,4
MnSO
4
.H
2
O 33,6
ZnSO
4
.7H
2
O 21
KI 1,66
Na
2
MoO
4
0,5
CuSO
4
.5H
2
O 0,5
CaCl
2
.6H
2
O 0,5




LUCRAREA 9
METODA CULTURII IN VITRO DE MERISTEME

Cultivarea "in vitro" a meristemelor urmrete n principal dou aspecte: obinerea plantelor
sntoase i multiplicarea clonal rapid. Cerinele pentru cultura "in vitro" de meristeme variaz n
funcie de dimensiunea explantului, scopul culturii i genotipul din care provine explantul. Astfel,
explantul de meristem apical necesit un mediu nutritiv suplimentat cu hormoni, n timp ce acela format
din mici poriuni de primordii foliare nu necesit un astfel de mediu. Explantul de tip meristem, utilizat
pentru obinerea plantelor libere de viroze poate fi mic de 0,1-0,3 mm, iar cel folosit pentru multiplicarea
clonal poate avea civa mm.
In cazul explantului meristematic de dimensiuni reduse, se recomand cultivarea lui pe unul din
mediile nutritive: Murashige-Skoog (1962), White (1954), Morel i Martin (1955).

Tehnica cultivrii meristemelor

Zonele meristematice situate n varful de cretere al tulpinii, n zona axilar a mugurilor foliari
sau n varful rdcinii reprezint sursa de iniiere a culturii.
Prelevarea zonelor meristematice este realizat n condiii aseptice, n boxa cu flux laminar,
dup ce n prealabil explantele au fost dezinfectate prin imersarea lor ntr-o soluie de hipoclorit de
sodiu 6-7 %, timp de 10 minute urmat de splarea repetat cu ap distilat steril.
Explantele meristematice sunt plasate pe medii nutritive adecvate, n scopul regenerrii
plantelor ntregi. Pe lang natura substratului nutritiv, un rol important l prezint i factorii fizici n
declanarea proceselor regenerative. Culturile de meristeme sunt pstrate la o temperatur de 22-26
o

C, intensitatea luminii este cuprins ntre 3000-4000 luci, fotoperioada 16/8 ore.
Fitohormonii constituie factorii decisivi n regenerarea plantelor ntregi. Combinaiile de
citokinine i auxine se folosesc pentru inducerea lstarilor.



27



Medii nutritive pentru cultivarea meristemelor
Compoziia chimic White Martin i Morel
Macroelemente mg/l mg/l
Ca(NO
3
)
2
4H
2
O 288 500
KNO
3
125 125
KCl 65 -
KH
2
PO
4
- 125
NaH
2
PO
4
4H
2
O 19 -
MgSO
4
7H
2
O 737 125
Na
2
SO
4
200 -
Microelemente mg/l mg/l
Fe
2
(SO
4
)
3
2,5 2,5
MnSO
4
4H
2
O 7,7 0,8
H
2
BO
3
1,5 0,025
ZnSO
4
4H
2
O 2,2 0,04
KI 0,75 0,25
CuSO
4
5H
2
O _ 0,025
NiCl
2
6H
2
O _ 0,025
CoCl
2
6H
2
O _ _
Substane organice mg/l mg/l
biotina _ 0,001
pantotenat de calciu _ 0,001
cisteina _ 0,01
glicina 3 _
inozitol _ 0,001
acid naftalenacetic _ 0,01
acid nicotinic 0,5 _
piridoxina 0,1 _
tiamina 0,1 0,001
glucoza _ 40000
zaharoza 20000 _


LUCRAREA 10
10. METODE CITOLOGICE SI HISTOLOGICE DE STUDIERE A
MATERIALULUI VEGETAL IN VITRO

10.1. METODA DE COLORARE A CROMOSOMILOR DIN CELULELE IN SUSPENSIE
Perpetuarea unui genotip valoros depinde, n esen, de succesiunea ordonat a proceselor de
replicare cromosomial i diviziune. Imperfeciunile ocazionale, aprute n derularea acestor procese,
constituie baza material a variabilitii, i implicit, a evoluiei. Celulele i esuturile vegetale, n
condiiile cultivrii "in vitro" sunt expuse mai mult dect n ipostaza integrat, manifestrii unor procese
deviante . Modificrile nucleare pot fi apreciate prin semnalarea mutaiilor cromosomiale sau genice.
Evidenierea mutaiilor cromosomiale este realizat prin intermediul preparatelor microscopice.
Mutaiile cromosomiale sunt markerii principali ai schimbrilor genetice.
Culturile celulare conin, adesea, celule cu grad diferit de difereniere. Legat de acest aspect,
grosimea i consistena pereilor celulari variaz, ceea ce creeaz dificulti n observaiile
microscopice. De aceea, operaia preliminar efecturii preparatelor microscopice este tratarea
celulelor cu pectinaz sau celulaz, n scopul distrugerii pereilor celulari. Metoda care va fi prezentat


28
n cele ce urmeaz, a fost aplicat n cazul multor specii : Triticum aestivum, Daucus carota, Phaseolus
vulgaris, Vicia hajastana, Haplopappus gracilis.


Materialul vegetal
Suspensii celulare
Reactivi
1. Soluia acid acetic/alcool etilic 1:3
2. Soluia de carbol fuxin modificat
3. Soluia tampon de acetat de sodiu 0,1 M, pH 4,5
4. Soluia enzimatic:celulaz Onozuka 0,5% i pectinaz Sigma 0,5%, in 0,1 M soluie
de acetat de sodiu, pH 4,5
Metoda de lucru
I. Pretratarea
0,5 ml suspensie celular se pstreaz la temperatura de 1-2
o
C, timp de 12-24 de ore
II.Fixarea
Suspensia celular (0,5 ml) este tratat cu soluia de fixare (acid acetic/alcool etilic). Se
pastreaz la 4
o
C timp de 12-14 ore. Durata mazim de pstrare n soluia fixatoare este de
dou sptmni.
III. Tratamentul enzimatic
Celulele sau agragatele celulare meninute n soluia fixatoare, sunt transferate ntr-
untub de centrifug i centrifugate timp de 6 minute la 1000 rot/min.
Se ndeprteaz supernatantul i celulele sunt splate de dou ori cu soluia tanpon 0,1 M.
Urmeaz tratamentul cu soluia enzimatic, durata acestui tratament fiind de 1-2 ore. Celulele
sunt splate i suspensionate n acid acetic 45%.
IV. Pregtirea preparatelor microscopice
Pe o lam microscopic se pipeteaz 20 l din suspensia de celule n acid acetic, peste
care se adaug 50 l carbol fuxin modificat 5%. Timpul de colorare al lamei este cuprins ntre
10 i 30 minute. Lama este aezat ntre dou straturi absorbante de hrtie de filtru, iar lamela
este presat cu un b de chibrit, pentru obinerea preparatului tip squash. Preparatul astfel
pregtit este observat la microscop pentru evidenierea cromosomilor.

10.2. METODE HISTOLOGICE DE STUDIERE A MATERIALULUI VEGETAL IN VITRO

Celulele cultivate "in vitro" pot evolua spontan sau indus pe calea formrii : traheidelor,
primordiilor de organe sau a embrionilor. Investigarea acestor procese ale dezvoltrii "in vitro",
presupun studii comparative, pe baza preparatelor histologice. Exist diverse metode, prin care
esuturile vegetale pot fi pregtite pentru examinarea microscopic. Procedeul care va fi prezentat
const ntr-o succesiune de operaiuni : includerea, seciunea, colorarea calusului.

A. Reactivii
I. Fixatorii
1. Glutaraldehida 4%,n soluie fosfatic tampon 0,025 M, pH- 6,8.pstrat la
temperatura de 0-4
o
C.
2. FAA
formalin 5 ml
acid acetic glacial 5 ml
alcool etilic 70% 90 ml
II.Ageni de deshidratare
1. alcool etilic absolut
2. 2-metoxietanol
III.Material de includere
1. xilen


29
2. parafin
IV. Colorani
1. Hematoxilin Delafield
2. Albastru de metilen 1%
3. Rou ruteniu- soluie apoas 0,1%
B. Metoda de lucru
I. Fixarea
1. Fragmente mici de calus (5 mm) sunt introduse ntr-un recipient de sticl, care
conine soluia fixatoare (glutaraldehida). Se pstreaz la temperatura de 4
o
C, cel puin 36 de
ore. Glutaraldehida este folosit ca fixator pentru conservarea citoplasmei, iar FAA este utilizat
ca fixator, n cazul efecturii preparatelor histologice. In acest ultim caz, fixarea se realizeaz la
temperatura camerei i dureaz 24 de ore.
2. Splarea materialului vegetal este realizat prin nlocuirea soluiei fixatoare cu ap.
Au loc dou splri, fiecare dureaz o or.
II. Deshidratarea
1. Materialul vegetal este trecut succesiv n etanol 30%, 50% i 70% i meninut la rece
(0-4
o
C). Timpul de incubare n fiecare baie de etanol este de 30 de minute.
2. Se continu deshidratarea materialului vegetal, prin treceri succesive ale acestuia
prin bi de etanol 89%, 90% i 95%, la temperatura camerei.
3. Urmeaz tratarea materialului vegetal cu alcool etilic absolut, operaie care se repet
de 3 ori, fiecare baie dureaz o or.
4. Materialul vegetal este tratat apoi cu o soluie etanol-xilen 1:1 i apoi cu xilen, fiecare
tratament dureaz 30-60 minute.
5. Se topete parafina la 60-70
o
C.
6. Materialul vegetal este introdus n xilen -parafin 1:1 i se pstreaz peste noapte la
temperatura de 60-70
o
C.
7. Se nlocuiete amestecul xilen:parafin cu parafin pur, aceast schimbare este
fcut de dou ori, n decursul unei zile. 2-Metoxietanolul este un alt agent de deshidratare.
Materialul vegetal fixat cu FAA, poate fi deshidratat la temperatura camerei.
III. Includerea n parafin
1. Materialul vegetal este transferat n blocul de parafin lichid.
2. Parafina se va solidifica n decurs de cteva ore.
IV. Secionarea
1. Se efectueaz seciuni rectangulare de 10-15 m grosime, cu ajutorul microtomului.
2. Se aleg cte 4-5 seciuni i se transfer pe o lam, ntr-o pictur de ap.
3. Lamele se nclzesc i se usuc la 30-40
o
C.
V. Colorarea
1. Preparatele perfect uscate, sunt trecute prin xilen (de 3 ori), alcool etilic absolut (de 3
ori) i alcool etilic 95, 90, 80, 70, 50 i 30%. Preparatele sunt lsate n fiecare soluie cte 2-3
minute.
2. Lamele sunt plasate ntr-un vas, care conine hematoxilin, timpul de colorare este de 15-30
minute. Dac se utilizeaz albastru de metilen, timpul de colorare este de 10 minute.
3. Preparatele sunt splate cu ap.
4. Se revine la etapele bilor cu etanol i xilen, durata fiecrei bi este de 1-2 minute. Prin
utilizarea hematoxilinei, pereii celulari i nucleul, se coloreaz albastru, iar n cazul albastrului de
metilen i a roului de ruteniu, lamela median i pereii primari se coloreaz rou, iar pereii celulari
lignificai se coloreaz albastru.


BIBLIOGRAFIE

1. Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, J.; Roberts, K.Watson, J. (1983)-Special Features of Plant Cells In:
Molecular Biology of the Cell, Garlland Publishing, 1100-1110


30
2. Ammirato, P. V. (1985) - Patterns of development in culture In: Tissue Culture in Forestry and Agriculture,
Plenum Press, 9-29
3. Ayers, A.; Ebel, J.; Valent, B.; Albersheim, P.(1976) -Host- Pathogen interactions. Fractionation and
biological activity of an elicitor isolated from the mycelial walls of Phythophthora var. sojae, Plant Phisiol. 57:760-
785
4. Bra, I. (1989) -Reproducerea, factor al evoluiei plantelor, Ed.Academiei Romne
5. Beiderbeck, R.; Reichling, J. (1989) -Pflanzenzellkulturen in Forschung und Praxis, 188-193
6. Bhojwani, S.; Razdan, M. K. (1983)-Plant Tissue Culture: Theory and Practice In: Developments in Crop
Science, vol. 5, Elsevier, Amsterdam, Oxford, NewYork
7. Bigot, C. (1987)-Cell Culture Techniques Applied to Plant Production and Plant Breeding, Bocconcibod, J. et
al. (Eds), ENITHP, Angers, 5-10
8.Bengochea,T.;Dodds,J.N.(1986)-Plant Protoplasts- A Biotechnological Tool for Plant Improvement,
Chapmann, Hold (Eds), 3-24
9. Botnariuc, N. (1976)-Concepia i metoda sistemic n biologia general, Ed.Acad.
10. Cachi Cosma, D. (1984)-Tehnica cultivrii "in vitro"a celulelor i esuturilor vegetale In: Culturi de celule i
esuturi vegetale Aplicaii n agricultur, Edit. Ceres, Bucureti
11. Cantrel, C.; Guallot-Salomon, T.; Brown, S.; Dubocq, M, Dubocq,J.B. (1991)-Isolation and biochemical
characteristics of Protoplasts of Jojoba (Simmondsia chinensis), Plant Cell Phisiol.,12 (7),959-967
12. Constabel, F. (1975)- Histological Methods In: Plant Tissue Culture Methods, Gamborg, O.L.; Wetter,
L.R.(Eds.), 50-54
13. Coocking, C. E. (1984) -Plant Cell Fusion:Transformation Using Plant and Bacterial Protoplasts In: Cell
Fusion: Gene Transfer and Transformation Roland F.M., Beers J., Bassett P.D. (Eds), Raven Press, 140-150
14. Coocking, C. E. (1987) -Plant Cell Biology in the 21.Century: The Neede of Plant Cell and Tissue Culture In:
Plant Tissue and Cell Culture,3-15
15. Dale, P. J.; Cheyne, V. A.; Dalton, J. (1980)-Pathogen elimination and in vitro plant storage in forage
grasses and legumes In:Tissue Culture methods for plant pathologists, Ingram D.S., Helgeson Y.P.(Eds), 119-
124
16. D'Amato, D. (1978) -Chromosome number variation in cultured cells and regenerated plants In: Frontiers of
plant tissue culture, Thorpe T.A. (Ed), Calgary Canada, 287-295
17. Debergh, P.; Maene, L. (1981)-A schema for comercial propagation of ornamental plants by tissue culture,
Scientia Horticulturae 14, 335-345
18. Dixon, R. A.; Lamb, C. L. (1990) -Molecular communication in interactions between plants and microbial
pathogens, Ann. Rev. Plant Physiol. 41, 339-367
19. Dodds, J. H.; Roberts, L. W. (1982)-Experiments in Plant Tissue Culture, University Press Cambridge, 133-
144
20. Dougall, D. K.; Johnson, J. M.; Whitten, G. H. (1980)-Clonal analysis of anthocianin accumulation by cell
cultures of wild carrot, Planta 49,292-297
21. Demarly, Y.(1977)-Genetique et amelioration des plantes, Edit. Masson
22. Eriksson, T. (1965) - Studies on the growth requirements and growth measurements of cell cultures of
Haplopappus gracilis, Physiologia Pl., 18, 976-993
23. Evans, D. A.; Flick, C. E.; Jensen, R. H. (1981)-Disease rezistance incorporation into sexually incompatible
somatic hybrids of the genus Nicotiana, Science 213, 907-909
24. Evans, D. A.; Sharp, W. R.; Flick, C. E. (1981)-Growth and behaviour of cell cultures. Embriogenesis and
organogenesis In: Plant tissue culture Methods and applications in agriculture,Thorpe T.A. (Ed), Academic
Press,45-115
25. Fitzsimons, P. J.; Weyers, J. D. H. (1985)- Properties of some enzymes used for protoplasts isolation In:
The Physiological Properties of Plant Protoplasts, Pilet P. E. (Ed.)
26. Fujimura, T.; Komamine, A. (1984)-Fractionation of cultured cells In : Cell Culture and somatic cell genetics
of plants, Vasil I. K. (Ed.), Academic Press,159-166
27. Furuja, T.; Nakano, M.; Yoshikawa, T (1978)-Biotransformation of RS-reticuline and morphinan alkaloids by
cell cultures in Papaver somniferum, Phytochemistry 17, 891-893
28. Galun, E.; Aviv, D. (1986)-Cell Culture and Tansformation In: Plant Molecular Biology,Weissbach A.,
Weissbach H. (Eds.), Academic Press, 595-611
29. Gamborg, O. L.; Wetter, I. D. (1975)-Plant Tissue Culture Methods, Ed. N. R. C. Canada Saskatoon
30. Gautheret, R. (1959)-Le culture des tissus vegetaux. Techniques realisations, Ed.Masson Paris
31. George E. F, Hall , M.A. De Klerk Geert-Ja- 2008- Plant Propagation by Tissue Culture, Springer
32. Gleba, Y.; Sytnik, K. M. (1984)-Protoplast Fusion -Genetic Engineering in Higher Plant, Shoenan, R. (Ed.),
Springer Verlag, 7-20


31
33. Glimelius, K. (1984)-High growth rate and regeneration capacity of hypokotyl protoplasts in some
Brassicaceae, Plant Physiol. 61, 38-44
34. Green, C. E.; Phillips, R. E. (1975)-Plant regeneration from tissue cultures of maize, Crop Sci. 15, 417-420
35. Gyerese, A.; Racs, G. (1973)-Neuen Fliessmittel zur Trennung der Hauptalkaloiden des Opiums, Pharmazie
28, 271-275
36. Heinstein, P. F. (1985)-Future approaches to the formation of secondary natural products in plant cell
suspension cultures, J. Nat . Prod. 48, 1-9
37. Hodges, C. C.; Rapoport, H. (1982)-Morphinan alkaloids in callus cultures of Papaver somniferum, J. Nat.
Prod. 45, 481-485
38. He, G. Y.; Korbuly, E.; Barnabas, R. (1993)-High frequency of callus formation and regeneration of fertile
plants from haploid cell suspensions derived from anther culture in wheat (Triticum aestivum L.), Plant Science
90, 81-87
39. Ikuta,A.(1974)-Alkaloids of callus, tissues and redifferentiated plantlets in the Papaveraceae , Phytochemistry
13, 2157-2179
40.Jain, S.M. ; Hggman, H, (2007) - Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits
41.Jain, M.S.; Saxena, P.K. (2009) -Methods in Molecular Biology, Protocols for In Vitro Cultures and Secondary
Metabolite Analysis of Aromatic and Medicinal Plants, vol. 547, Springer Science
42.Kao, K.N.(1975)- A chromosomal staining method for cultured cells In: Plant Tissue Culture Methods,
Gamborg, O.L.;Wetter, L.R.(Eds), 63-64
43.Kao, K.N. (1975)- A nuclear staining method for plant protoplasts In; Plant Tissue Culture Methods, Gamborg,
O.L.; Wetter, L.R (Eds), 60-61
44. Krens, F. A.; Schilperoort, R. A. (1984)-Ti-Plasmid, DNA Uptake and Expression by Protoplasts of Nicotiana
tabacum In : Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vasil I.K (Ed.), 523-533
45. Larquin, P. J.; Scowcroft, W. R. (1981)-Somaclonal variation -a novel source of variability from cell culture,
Theor. Appl. Genet. 60, 197-214
46. Lazzeri ,P. A.; Lorz, H. (1988) -In vitro genetic manipulation of cereals and grasses In : Advances in Cell
Culture, Maramorosch K, Sato Gordon (Eds), vol.6, 291-309
47. Lorz, H. (1980)-Isolierte Protoplasten hoherer Pflanzen -ihre Bedeutung in Grund-lagenforschung und
Pflanzenzuchtung, Mikrokosmos 69, 241-250
48. Lowe, K.C., Davey, M.R.; Power, J.B. (1996)- Plant tissue culture ; past, present and future In; Plant Tissue
Culture and Biotechnology, vol.2, no.4, 175, no.4, 175-186
49. Maheshwari, S. C.; Gill, R.; Maheshwari, N.; Gharyal,P.K. (1986) Isolation and Regeneration of Protoplasts
from Higher Plants In: Results and Problems in Cell Differentiation, Hennig W., Reinert, J.(Eds.), 3-35
50. Melchers, S.; Labib, G. (1974) -Somatic hybridization of plants by fusion of protoplasts. Selection of light-
rezistant hybrids of light sensitive varieties of tabacco, Mol. Gen. Genet.,135, 277-291.
51. Melchers, G.; Sacristan, M. O.; Holder, A.(1978)-Somatic hybrid plants of potato and tomato regenerated
from fused protoplasts, Pflanzenphysiol. 43, 203-218
52. Misawa, M.; Takayana, S. (1985)-Accumulation of antineoplasic agents by plant cell cultures In: Primary and
Secondary metabolism of plant cell cultures Neumann, K., Reinhard, E. (Eds), Springer Verlag, 235-246
53. Murashige, T. (1974)-Plant propagation tissue culture, Ann. Rev. Plant Physiol. 25, 126-166
54. Power, J; Chapman, J. V. (1985)-Isolation, Culture and Genetic Manipulation of Plant Protoplasts In: Plant
Cell Culture- A Practical Approach, Dixon, R. A.(Ed.), IRL Press
55. Power, J.; Davey, M.R.; McLellan , M.; Wilson, D. (1995) - Laboratory Manual, Plant Tissue Culture. Plant
Genetic Manipulation Group, Department of Botant, univ. of Nottingham,
56. Robins, J. R.; Nicholas, J. W.; Hamil, J. D; Parr, A; Rhodes, J.C. (1991)-Strategies for the Genetic
Manipulation of Alkaloid Producing Pathways in Plants, Planta Medica 57, 27-29
57. Ruffoni, B, Massabo, F. (1996)- Plant production by somatic embryogenesis in cell suspension cultures of
Lisianthus russellianus Hook In: Plant Tissue Culture and Biotechnology,vol.2, nr.4, 104-198
58. Schuchmann, R.; Wellmann, E. (1985)-Somatic embryogenesis of tissue cultures of Papaver somniferum
and Papaver orientale and its relationship to alkaloid and lipid metabolism, Plant Cell Report 2, 88-91
59. Schell, J. (1995)- Progress in plant sciences is our best hope to achieve an economically rewarding,
sustainable and environmentally stable agriculture. In Plant Tissue Culture and Biotechnology, vol.1, nr.1, 10-12
60. Seitz, H. V.; Seitz, V.; Alfermann, W. (1985)-Pflanzliche Gewebekultur, ein Praktikum, Gustav Fischer
Verlag, 50-55
61. Shepard, J. F.; Bidney, D.; Barsby, T.; Kemble, R. (1983)-Genetic transfer in plants through interspecific
protoplast fusion, Science,219, 683-688
62. Spangenberg, G,; Neuhaus, G.; Potrykus, J.(1990) Micromanipulation of Higher Plant Cells In: Plant Cell
Line Selection- Procedures and Applications, Dix, P.Y (Ed.) 88-100


32
63. Sunderland, N. (1978)-Strategies in the improvement of yields in anther culture In: Proceedings of
Symposium on plant tissue culture, Science Press, 65-86
64. Sul,J.W.; Korban, S.S. (1996) - A highly efficient method for isolating genomic DNA from plant tissues. In :
Plant Culture and Biotechnology, vol 2. no. 2, 113-116
65. Sweykowska, A. (1977) -Regulation of organogenesis in cell and tissue cultures by phytohormones In:
Regulation of developmental processes in plants, 123-134
66. Tam, W. H. J.; Constabel, F.; Kurz, W. G. (1980)-Codeine from cell suspensions cultures of Papaver
somniferum, Phytochemistry 19, 486-487
67. Tabata, M.; Yoshikawa, N. (1978)-Frontiers of Plant Tissue Culture, Thorpe, T.(Ed.), Calgary Press
68. Tesule, E. (1993)-Biotechnologie et Amelioration des plantes In:Biotechnologie, Scriban R. (Ed.), 566-588
69. Thorpe, T. A.(1981)-Plant Tissue Culture-Methods and Application in Agriculture, Academic Press
70. Torrey, Y. C. (1973)-Plant embryos In: Tissue Culture Methods and Application, Academic Press, 166-170
71. Urban, L. A.; Sherman, J. M.; Daub, M.(1994)-High frequency shoot regeneration and Agrobacterium
mediated transformation of Chrysanthemum, Plant Science 98, 69-74
72. Vasil, I. K. (1986)-Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol.3, Academic Press,121-150
73. Vntu, S. ; Bra, I. ; Toma, O. (1998)- Culturi in vitro- Tehnici de laborator, Edit. Corson
74. Vntu, S. (2005)- Culturi de celule i esuturi vegetale n biotehnologie, Edit. Univ. Al.I.Cuza, Iai
75. Wenzel, G.; Schieder, G.; Melchers, S. G. (1979)-Comparison of single cell culture-derived Solanum
tuberosum plants and a model for their application in breeding programms,Theor. Appl. Genet. 55, 49-55
76. Wilson, D.(1988)- Laboratory Manual. Plant Tissue Culture. Plant Genetic Manipulation Group, Department
of Botany University of Nottingham,
77. Witte, L.; Berlin, J.; Wray, V.; Kohl, W.; Hammer, H.(1983)-Mono- and diterpene from cell cultures of Thuja
occidentalis, Planta Medica 49, 216-221
78. Zimmermann, R. H. (1986)-Methodes modernes de multiplicatio vegetative, C. R.Acad., 619-719
79. Zhang, L.Y.; Harris, P.J.C.; Yao, D.Y.(1997)- In vitro regeneration of fertile plants from Amaranthus species.
In: Plant Tissue Culture and Biotechnology, vol.2, no.1, 32-36