i

ii

JURADO DICTAMINADOR















iii

PRESENTACIN

SEORES MIEMBROS DEL JURADO:

Cumpliendo con el reglamento de graduacin de la Escuela de Post-Grado de la
Universidad Nacional de Trujillo, someto a vuestra consideracin la tesis doctoral titulada:
EFECTO DEL Bacillus subtilis Y Gallinaza COMO SUPRESORES DE Meloidogyne sp. EN
CULTIVO Capsicum annuum, PIURA, PER 2010 2011.





Trujillo, 15 de febrero de 2014



MsC. Nancy Mercedes Soto Deza
iv

Gracias...




A DIOS,
por guiarme en el camino del saber, darme la sabidura para
culminar este proyecto y poder contribuir a un mundo mejor.





A mi esposo GERARDO EDMUNDO,
por su amor y ser el cmplice incondicional en el logro
de mis metas.




A mi hijo FRANCHESCOLY,
por ser mi fuente de inspiracin para avanzar y que un
da quiera seguir mis pasos.

v

Gracias...


A mis Padres ARTEMIO Y PAULINA, por su amor, apoyo y
motivacin constante en el logro de cada proyecto soado.
Gracias por pertenecerles.


A mis Hermanos EDGAR, MARA SONIA, JULIA
MARLENY, TERESA ISABEL Y ELOISA ANTONIETA y
Hermanos Polticos RIGOBERTO Y MERY, por brindarme
su cario y con el compromiso de ser su mano amiga en el
logro de sus metas.


A mis sobrinos, JOUSETH, SEBASTIAN,
ALLMENDRA, FIORELLA, EDGAR MANUEL,
JHAROL y JIMMY, con el deseo me tengan presente
en su superacin personal y ser parte de sus xitos.


A mi sobrino JHOSSER, con cario en
memoria de su recuerdo.





vi


AGRADECIMIENTOS

Expreso mi especial agradecimiento a:

- Mis asesores, Dr. Segundo Eloy Lpez Medina y Dr. Csar A. Murgua Reyes,
por sus sabios consejos y orientaciones en el desarrollo del presente trabajo.
- Sr. Guillermo Len Armbulo, Gerente General de ECOSAC, por su apoyo
incondicional en la ejecucin del presente trabajo.
- Dra. Milly Otiniano Garca, por su orientacin en el trabajo de laboratorio.
- Dr. Mario Esparza Mantilla, por su apoyo en la identificacin molecular de
microorganismos.
- Sr. Luis Bustamante, Gerente Agrcola de la empresa ECOSAC y al equipo
tcnico que hizo posible la ejecucin del plan de trabajo para el cultivo de aj
pimiento del piquillo:
I ng. J orge Espinoza Huancas: Jefe de cultivos de Pimientos
Ing. Luis Bobadilla: Supervisor del rea en estudio.
Bach. Jessica K. Valdivieso Calle: rea de Investigacin y Desarrollo
I ng. William Saavedra: Coordinador Fertirriego Capsicums

- Instituciones pblicas y privadas que de una u otra manera han colaborado en la
presente investigacin:
Empresa Ecoacuicola SAC, Chapair, Castilla, Piura, Per.
Universidad Nacional de Trujillo, Facultad de Ciencias Biolgicas, Trujillo, Per.
Universidad Nacional de Piura, Laboratorio de Nematologa, Piura, Per.
Universidad de Antofagasta, Laboratorio de Biominera. Centro de Bioinnovacin
y Departamento de Acuicultura, Chile.

vii












La causa de tu presente es tu pasado, as como la causa de tu futuro ser
tu presente
Pablo Neruda











viii

RESUMEN

En Piura, Chapair, en parcela de cultivo de Capsicum annuum aj pimiento piquillo
infestados con nematodos Meloidogyne sp., se evalu el efecto del Bacillus subtilis y
gallinaza como agentes supresores del nematodo del nudo Meloidogyne sp.; se aplic
diseo de bloques completos al azar. En la parcela se incorpor gallinaza al 85 % de
pureza, en dosis 15 y 30 t/ha. Para la siembra directa se inocul semilla de C. annuum en B.
subtilis, a concentracin 1 X10
6
esp/mL y 2 X 10
6
esp/mL. A los 45 y 90 das se determin:
anlisis de poblaciones de nematodos, ndice de nodulacin, altura de planta, nmero total
de frutos y anlisis microbiolgico para determinar presencia de B. subtilis en raz de C.
annuum. Los datos se sometieron a anlisis de varianza utilizndose software Statgraphics
Plus 5.0. Las poblaciones iniciales de Meloidogyne sp., antes de aplicacin de tratamientos
variaron entre 275 y 27720 nematodos/100 cm
3
de suelo; despus de aplicar B. subtilis, la
poblacin final registr valores de 13 a 0 nematodos/100 cm
3
de suelo, con un ndice de
agallamiento entre grado 0 y 2. Los resultados indicaron diferencias significativas (P0,05)
entre los tratamientos; concluyendo que la gallinaza interactu con B. subtilis
favoreciendo la accin supresora sobre Meloidogyne sp., en cultivo de C. annuum,
mejorando la productividad del cultivo.



Palabras clave: Bacillus subtilis, Gallinaza, Meloidogyne sp., Capsicum annuum.








ix


ABSTRACT


In Piura, Chapair in plot cultivated Capsicum annuum "chili pepper piquillo" infested with
nematodes Meloidogyne sp., the effect of Bacillus subtilis and "chicken manure" was
evaluated as suppressing agents knot nematode Meloidogyne sp. Two trials were
established, where it is applied design of complete randomized block design. Driveway
"chicken manure" was incorporated into 85% pure, at doses 15 and 30 t / ha. For direct
sowing seed C. annuum in B. subtilis was inoculated at a concentration of 1X10
6
spore/mL
and 2 X 10
6
spore/mL. At 45 and 90 days was determined: analysis of nematode
populations, nodulation index, plant height, total number of fruits and microbiological
analysis to determine the presence of B. subtilis in the wake of C. annuum. The data was
subjected to analysis of variance using the Statgraphics plus 5.0 software. Initially, the study
showed highly infested knot nematode Meloidogyne sp., 275 to 27720 soil nematodes/100
cm
3
; after application of B. subtilis, the final population recorded values nematodos/100 13-
0 cm
3
soil with degree galling index between 0 and 2. The results indicated significant
differences (P 0.05) between treatments. Concluding that the "chicken manure"
interacted with B. subtilis favoring suppressive action on Meloidogyne sp. in culture of C.
annuum, improving crop productivity.
.


Key words: Bacillus subtilis, Chicken manure, Meloidogyne sp., Capsicum annuum





x


INDICE
Pg.

AGRADECIMIENTO ......................................................................................... viii
RESUMEN ........................................................................................................... viii
ABSTRACT ........................................................................................................... ix
LISTA DE TABLAS. ............................................................................................ xi
LISTA DE FIGURAS. .......................................................................................... xii

I. INTRODUCCIN................................ 1
II. MATERIAL Y MTODOS . ............. 8
2.1MATERIAL DE ESTUDIO ............................................................................... 8
2.2REA DE ESTUDIO ........................................................................................... 8
2.3LUGAR DE ESTUDIO ........................................................................................ 8
2.4 DISEO DE EXPERIMENTACIN ............................................................... 8
2.5 METODOLOGA ............................................................................................... 9
2.5.1 Preparacin del terreno ............................................................................. 9
2.5.2 Adquisicin del inoculo ............................................................................. 10
2.5.4 Estandarizacin del inculo ..................................................................... 12
2.5.5 Tratamiento ............................................................................................... 13
2.5.6 Parmetros de medicin ........................................................................... 14
2.5.7 Anlisis de datos ........................................................................................ 15

III. RESULTADOS ......................................................................................................... 16
IV. DISCUSIN .............................................................................................................. 27
V. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 31
VI. RECOMENDACIONES .......................................................................................... 32
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 33
VIII. ANEXOS ................................................................................................................ 36
iv
xi


LISTA DE TABLAS
Pgina

Tabla II-1. Aplicacin de tratamientos. 9
Tabla III-2.

Efecto de Bacillus subtilis sobre poblacin de Meloidogyne sp. en
cultivo de Capsicum annuum aj pimiento piquillo 17
Tabla III-3.

Anlisis de varianza (ANVA) del efecto de Bacillus subtilis, y
Gallinaza sobre poblaciones del nematodo Meloidogyne sp. en
cultivo de Capsicum annuum aj pimiento piquillo 24













xii


LISTA DE FIGURAS
Pgina
Fig. 8-1. Fruto de Capsicum annuum. 37
Fig. 8-2. Melidogyne sp. 38
Fig. 8-3. Ciclo de vida de Meloidogyne sp. 39
Fig. 8-4. Bacillus subtilis con tincin de Gram. 40
Fig. 8-5.

Preparacin de la parcela, distribucin de camas y tendido de mangueras
para sistema de riego tecnificado por goteo. 41
Fig. 8-6. Vista panormica del fundo Ecoacucola SAC, Chapair, Piura. 41
Fig. 2-7. Distribucin de tratamientos en la parcela. 13
Fig. 3-8.

Interaccin entre agallamiento de la raz de Capsicum annuum aj
pimiento piquillo, Gallinaza y concentracin de Bacillus subtilis. 18
Fig. 3-9.

Interaccin entre agallamiento de raz de Capsicum annuum aj pimiento
piquillo, concentracin de Bacillus subtilis y Gallinaza. 19
Fig. 3-10.

Interaccin entre la altura de planta de Capsicum annuum aj pimiento
piquillo, concentracin de Bacillus subtilis y Gallinaza. 20
Fig. 3-11.
Interaccin entre altura de planta de Capsicum annuum aj pimiento
piquillo, Gallinaza y concentracin de Bacillus subtilis. 21
Fig. 3-12.

Interaccin entre tamao de fruto de Capsicum annuum aj pimiento
piquillo, Gallinaza y concentracin de Bacillus subtilis. 22
Fig. 3-13.

Interaccin entre tamao de fruto de Capsicum annuum aj pimiento
piquillo, concentracin de Bacillus subtilis y Gallinaza. 23
Fig. 3-14. Colonias de Bacillus subtilis. 25
xiii

Fig. 3-15.

Esporas de Bacillus subtilis en raz de Capsicum annum a 1000X (coloracin
Gram) 25
Fig. 3-16.

Esporas de Bacillus subtilis adheridas a la cutcula de Meloidogyne sp. J2
(3000X). 26
Fig. 8-17.

Observacin de clorosis en las hojas de Capsicum annuum en Fundo
Ecoacuicola SAC, Chapair, Piura, 2010. 42
Fig. 8-18.

Raz de Capsicum annuum, con presencia de ndulos (Fundo Ecoacuicola
SAC, Chapair, Piura, 2010.) 42
Fig. 8-19.

Observacin de no evidencia de clorosis en las hojas de Capsicum annuum
en Fundo Ecoacuicola SAC, Chapair, Piura, 2011. 43
Fig. 8-20.

Inoculacin de esporas de Bacillus subtilis en semillas de Capsicum
annuum aj pimiento piquillo. 47
Fig. 8-21. Siembra directa de Capsicum annuum aj pimiento piquillo. 47
Fig. 8-22. Distribucin de Bloques I, II y III. 48
Fig. 8-23. Recalce de Capsicum annuum. 48
Fig. 8-24. Raz de Capsicum annuum sin ndulos 49
Fig. 8-25. Planta y fruto de Capsicum annuum. 49
Fig. 8-26. Cultivo de Capsicum annuum a los 45 das. 50
Fig. 8-27. Altura de planta de Capsicum annuum a los 65 das. 50
Fig. 8-28. Fruto de Capsicum annuum 51
Fig. 8-29. Cosecha de Capsicum annuum a los 90 das 52

1

I. INTRODUCCIN

El cultivo de Capsicum annum aj pimiento piquillo, est siendo de gran
importancia comercial en la zona de Chapair, Piura; sin embargo, requiere de un
manejo especial para alcanzar rendimientos altos y de ptima calidad; en el mes de
marzo (2010), una semana despus de la siembra de C. annuum, se observaron
nodulaciones en las races, se tomaron muestras de bandeja de plantines transportadas
del vivero Gnesis y se enviaron al laboratorio de nematologa de la Universidad
Nacional de Piura, para determinar la fuente de infectacin temprana; el resultado de
estos anlisis fueron positivos para Meloidogyne sp. y otros saprfitos, tanto en races
como para el suelo.

Con la presencia de Meloidogyne sp. en las plantas de C. annuum, se observ
clorosis en las hojas, nodulaciones en las races, ocasionado disminucin en la calidad
y produccin de la cosecha, incrementando la aplicacin de nematicidas, elevando los
costos de produccin en un 40% y provocando con el uso elevado de sustancias
qumicas la alteracin al ambiente.

Meloidogyne sp. son organismos microscpicos que suelen producir bultos en las
races de las plantas, llamados "rosarios" o "porrillas"; producen deformaciones,
necrosis y podredumbre en los rganos vegetales especialmente del sistema radical y,
en el caso de ataques graves, la progresiva reduccin de los rendimientos, cuyo efecto
generalmente es aducido al agotamiento de nutrientes del suelo y a una mala nutricin
de la planta. Estos daos impiden la absorcin por las races, traducindose en un
menor desarrollo de la planta y la aparicin de sntomas de marchitez en verde en las
horas de ms calor, clorosis y enanismo. Se distribuyen por rodales o lneas y se
transmiten con facilidad por el agua de riego, con el calzado, etc. Slo especies del
gnero Meloidogyne atacan al pimiento, produciendo marchitez y enanismo en las
plantas (Incagro, 2009).

2

La duracin del ciclo de vida de Meloidogyne sp, nematodo nodulador es altamente
influenciada por la temperatura y otros factores edficos, se inicia con la formacin
de un huevo, seguido de cuatro etapas juveniles y la etapa adulta. Las larvas del
segundo estado o etapa infectiva generalmente penetran la raz justamente en la punta
o caliptra y se mueven entre las clulas no diferenciadas, alojndose cerca de los
haces vasculares donde completan su ciclo. Con los estiletes perforan las paredes de
las clulas alimentndose e inyectando secreciones a la planta. El sntoma ms
comn producido por la hembra del nematodo nodulador es la formacin de
engrosamientos radiculares conocidos como ndulos. Una raz puede presentar
ndulos pequeos causados por una sola hembra incrustada y/o ndulos grandes
como resultado del ataque de varias hembras en su interior. Una vez infectadas las
races, se acortan y se deforman, se reduce el nmero de races laterales y el
desarrollo de pelos radiculares, teniendo como consecuencia que se disminuya la
absorcin de agua y nutrientes del suelo. Adems, se paraliza el crecimiento general
del sistema radicular, y la planta se debilita (Prez, 2007).

En investigaciones realizadas por Prez (2007) en Puerto Rico, se determin que
densidades poblacionales de Meloidogyne incognita mayores a 12,000 huevos/J
2
, por
tiesto causaron amarillamiento, defoliacin y hasta la muerte de la planta de kenaf
(H. cannabinus), malvcea utilizada en la produccin de papel y alimento de ganado.
Las plantas infectadas con Meloidogyne incognita mostraron clorosis en hojas.
Poblaciones de 6,000 huevos/J
2
estimadas, redujeron significativamente el peso fresco
del follaje.

Segn Jimnez, et al. (2009), reporta investigaciones en Venezuela donde se
registraron que el nematodo Meloidogyne sp. es el ms ampliamente distribuido en
los cultivos y es el que causa mayor dao.

En la bsqueda de alternativas de solucin, se encuentra a nivel internacional
investigaciones realizada por Rodrguez, et al. (2005) quien plante que las
3

afectaciones fundamentales atribuidas a Meloidogyne sp. estn relacionadas con el
acortamiento del perodo til de las plantaciones y mermas en los rendimientos.

Prez (2007) report que en el control de nematodos de la platanera, las poblaciones
mximas de nematodos a partir de las cuales se recomienda tratamientos de control es
1.000 Meloidogyne/100 g de raz. An as, para decidir realizar un tratamiento
qumico debe efectuarse un examen del conjunto de la plantacin y del desarrollo
radicular, ya que una correcta nutricin y riego y races bien desarrolladas soportan
niveles superiores sin provocar daos en la produccin. Asimismo, aportes de
materia orgnica al suelo manteniendo niveles superiores al 3% estimulan el
desarrollo radicular y ejercen un efecto de control natural sobre los nematodos.

En la segunda convencin internacional en sistemas de produccin y fitosanidad de
hortalizas, Garca (2008), report que los plaguicidas qumicos provocan persistencia
ambiental, generacin de organismos resistentes, contaminacin de recursos hdricos
con degradacin de flora y fauna y crean ambientes inhabitables en el suelo para otro
tipo de microorganismos que actan de manera benfica.

Es importante resaltar que Prez (2007), afirma que las aplicaciones de nematicidas
qumicos son muy txicos para el suelo y el ambiente por lo que debe efectuarse slo
en casos absolutamente necesarios; si la decisin es aplicar productos qumicos
recomienda tener en cuenta: Alternar familias qumicas, el pH del agua, ya que los
nematicidas se inactivan a pH superiores a 7, no dar ms de dos tratamiento al ao, a
principios de primavera (marzo-abril) y a finales de otoo (septiembre-octubre), el
sistema de riego para establecer dosis correctas y la solubilidad de los nematicidas ya
que influye en la distribucin del producto en el suelo.

El desarrollo y aplicacin de agentes de control biolgico de plagas adquiere una
importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una agricultura
sostenible que preserve los recursos naturales y el ambiente para las futuras
4

generaciones. La aplicacin controlada en agro ecosistemas de organismos vivos o
sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, implica el mejoramiento de
los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por agentes fitopatgenos
(Gmez, et al., 2002).

El control biolgico de nematodos es una de las mejores alternativas para incrementar
los rendimientos, sin causar dao al medio ambiente. Se han realizado algunos
estudios utilizando leguminosas supresoras de nematodos, las cuales en las prcticas
agrcolas adems se brindan otros beneficios como: Control de la erosin hdrica
cuando se establecen como cobertoras, estimulacin de una microfauna benfica y el
mejoramiento de la fertilidad del suelo. En Per, segn el manual de buenas prcticas
en el manejo orgnico del cultivo de Sacha inchi (Incagro, 2009), se afirma que la
agricultura orgnica es importante porque contribuye a reducir al mnimo la
contaminacin del ambiente, evitando los fertilizantes y plaguicidas sintticos lo que
propicia un ecosistema sostenible, alimentos seguros, buena nutricin, bienestar
animal y desarrollo rural.

Garca (2008), afirma que la aplicacin de un control natural contra las plagas, tiene
ventajas como: son menos txicos que los qumicos, por lo general son inocuos,
pueden ayudar a disminuir notablemente el uso de qumicos, disminuyen la cantidad
de residuos, son efectivos en pequeas cantidades, frecuentemente se descomponen
rpido y por lo general afectan solo a la plaga objetivo.

Lpez, et al. (2004) recomienda que para combatir los nematodos en aj pimiento se
debe rotar con otros cultivos, desinfectar la tierra mediante la solarizacin. La
Solarizacin consiste en elevar la temperatura del suelo mediante la colocacin de
una lmina de plstico transparente sobre el suelo regado previamente en abundancia
durante un mnimo de 30 das en verano. Lo que se hace es "cocer" el suelo y matar
muchos parsitos: hongos, nematodos, insectos, malas hierbas, etc.

5

Los agentes biocontroladores como los organismos que interactan con los
nematodos fitoparsitos en el suelo deben tener algunas caractersticas bsicas: No
deben ser patgenos de plantas, hombres o animales, capaz de reducir o suprimir
eficientemente las poblaciones de nematodos por debajo del nivel crtico, capacidad
de adaptacin a diferentes ambientes del suelo (textura, grado de humedad,
composicin qumica y materia orgnica), buena habilidad competitiva, alto potencial
de reproduccin para obtener una poblacin alta, capacidad de sobrevivir en pocas
difciles (Piedra, 2008).

Gallegos, et al. (2009). Reporta que las bacterias son un grupo abundante de
microorganismos del suelo sobre los cuales se ha realizado pocos esfuerzos para
determinar su potencial de uso y que las bacterias que presenta un potencial
biocontrolador son Pasteuria penetrans, Bacillus cereus y Bacillus subtilis.

El gnero Bacillus incluye una importante variedad de especies gram positivas, no
patognicas, con propiedades antagonistas; son buenas secretoras de protenas y
metabolitos, fciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y
enfermedades. Los mecanismos de accin de Bacillus sp., incluyen competencia por
espacio y nutrientes, antibiosis e induccin de resistencia. Adems, tienen
comprobado efecto en la promocin de crecimiento de las plantas. La capacidad de
Bacillus sp. de formar esporas que sobreviven y permanecen metabolitamente activas
bajo condiciones adversas, las hace apropiadas para la formulacin de productos
viables y estables para el control biolgico (Chaves, 2007). Para considerar que la
bacteria sea un biocontrolador del nematodo, su ciclo de vida debe desarrollarse en
sincrona con el del nematodo.

B. subtilis, microorganismo cuyo hbitat natural es el suelo, se encuentra
ampliamente distribuido en la naturaleza. Entre sus principales caractersticas se
encuentra su capacidad para formar esporas en diversas condiciones de estrs, crecer
en un intervalo amplio de temperaturas (desde 15 hasta 55 C), presentar motilidad y
6

velocidades de crecimiento altas, sobrevivir en concentraciones salinas (hasta el 7%
de NaCl), producir una amplia variedad de antibiticos y enzimas hidrolticas
extracelulares (Nakamura et al., 1999).

Estudios realizados en cultivo de garbanzo Siddiqui, et al. (2001), reportan que;
plantas tratadas con B. subtilis redujeron el agallamiento y multiplicacin del
nematodo M. incgnita, dando como resultado crecimiento vegetal mejorado. Este
tratamiento tambin redujo el ndice de putrefaccin de la raz en plantas inoculadas
con M. phaseolina. Las mejoras en crecimiento vegetal pueden ser atribuidos a
efectos inhibitorios de agentes patgenos por B. subtilis. Estudios previos indicaron
que el tratamiento con B. subtilis incrementa la produccin en varias cosechas.
Adems, la bacteria mejora el crecimiento vegetal, por inhibicin del parsito
patgeno de la raz, produciendo substancias biolgicamente activas, o por
transformacin inexequible de mineral y de componentes orgnicos disponibles para
la planta. Por otra parte el extracto no celular de B. subtilis, se reporta que tambin
tiene un alto grado de propiedades larvicidas sobre nudos y quistes nematodos.

De Araujo y Poletto (2009), reportaron que las endotoxinas producidas por B.
subtilis, intervienen con el ciclo reproductivo de nematodos, en el estado de
ovulacin y eclosin de juveniles, considerando a B. subtilis, como supresor del
nematodo formador de agallas en cultivo de tomate.

En Per, no se ha encontrado investigaciones especficas de control de nematodos por
bacterias en solanceas, pero Nicho (2005), en investigaciones en cultivo de aj
paprika, realizadas en la estacin experimental Donoso-Huaral, recomienda para el
control de Meloidogyne aplicar en la siembra guano de vaca 15 toneladas por
hectrea.

La zona de Chapair, Piura; los suelos deteriorados por el uso ineficiente de
fertilizantes qumicos, ha provocado una disminucin en el contenido de materia
7

orgnica y nutricin de los cultivos de C. annum. Alcozer et al. (2006), encontr que
el Meloidogyne sp., est muy diseminado en los suelos agrcolas de los valles de
Piura, siendo el uso de nematicidas qumicos la principal medida de control;
buscando otras alternativas evalu efectos de solarizacin y enmiendas orgnicas
contra el nematodo del nudo M. incognita bajo condiciones de vivero, determinando
que su poblacin en el substrato solarizado y no solarizado disminuyeron con
respecto a las iniciales.

Aldana (2001) manifiesta que el pimiento es muy exigente en fsforo y nitrgeno;
por lo que recomienda adicionar gallinaza antes del transplante. Segn Macas
(2012), la aplicacin de gallinaza al suelo representa una excelente alternativa en la
produccin, pues incrementa el rendimiento, precocidad y calidad del fruto. Quezada
(1999) en su investigacin en banano evidencia que, la severidad del dao de los
nematodos puede reducirse si se crean condiciones que favorezcan el desarrollo de
enemigos naturales que ya estn presentes en el suelo. La adicin de gallinaza
incrementa sustancialmente la actividad microbial de los suelo, por que proveen de
carbono, energa, y nutrientes para favorecer el crecimiento, actividad y nmero de
microorganismos.

En este contexto, el objetivo del presente trabajo, fue evaluar el efecto del B. subtilis
y gallinaza como agentes supresores del nematodo del nudo Meloidogyne sp, en el
cultivo de C. annuum, para promover la utilizacin de productos biolgicos en la
mejora de la productividad del aj pimiento piquillo, disminuir el uso de productos
qumicos, reducir los costos de produccin y no provocar dao al ambiente.






8

II. MATERIAL Y MTODOS

2.1 MATERIAL DE ESTUDIO
Semillas de Capsicum annuum aj pimiento piquillo (Anexo 1) del Fundo
Ecoacuicola SAC, gallinaza (85 % de pureza), suelo agrcola infestado por
Meloidogyne sp. (Anexo 2) y cepa nativa Bacillus subtilis (Anexo 3).

2.2. REA DE ESTUDIO
Parcela con siembra directa de C. annuum, en un rea total de 0.270 ha, divido en
3 bloques, con microparcelas de 200 m
2
, conformado por dos camas de 50 m
lineales, con una distancia de cama-surco-cama de 4 m
2
; aplicacin de sistema de
riego tecnificado por goteo; en condiciones climticas de principios de otoo
(marzo), hasta primavera (octubre). (Anexo 4, fig. 5).

2.2. LUGAR DE ESTUDIO
La investigacin se realiz en campos de cultivo de la empresa acua-
agroindustrial Ecoacucola SAC., ubicado en el casero de Chapair, distrito de
Castilla, provincia de Piura, departamento de Piura, a una Latitud de -5.1166 y
una longitud de -80.6333, zona privilegiada por su estupendo clima clido y
tierras frtiles, idneas para el cultivo durante los 365 das del ao; en campos
provenientes de siembras de Capsicum annuum aj pimiento piquillo con
infestacin de nematodos. (Anexo 4, fig.6).

2.4 DISEO DE EXPERIMENTACIN
Se aplic un arreglo factorial de 2 X 3 en un diseo bloques completos al azar,
DBCA. Como factor 1: sin y con esporas de B. subtillis y el factor 2: sin y con
gallinaza. En total se trabaj 9 tratamientos, 3 repeticiones y 27 unidades
mustrales (Tabla 1).


9

Tabla 1. Aplicacin de tratamientos


Factor 1

To
=
0 esporas B. subtilis /mL
T
1 =
1000000 esporas B. subtilis /mL
T
2 =
2000000 esporas B. subtilis /mL
Factor 2

G
o =
0 t Gallinaza/ha
G
1 =
15 t Gallinaza/ha
G
2 =
30 t Gallinaza/ha



2.5 METODOLOGA

2.5.1 Preparacin del terreno
Segn buenas prcticas agrcolas, BPA (sistema EUROGAP).
En la parcela se realiz movimiento de tierra y exposicin al sol
(solarizacin natural).
Luego se incorpor en forma uniforme gallinaza, en la dosis de
15 t/ha y 30 t/ha, segn distribucin de tratamientos (Fig. 7);
inmediatamente se aplic riego hasta conseguir la humedad de
capacidad de campo.

Tratamiento (T)
Gallinaza
0 esporas
B. subtilis/mL
1 000 000 esporas
B. subtilis /mL
2 000 000 esporas
B. subtilis /mL
G T
o
T
1
T
2

0 t/ha G
o
T
o
G
o
T
1
G
o
T
2

15 t/ha G
1
T
o
G
1
T
1
G
1
T
2

30 t/ha G
2
T
o
G
2
T
1
G
2
T
2

X 2 X3
10


2.5.2 Adquisicin del inculo
2.5.2.1. Aislamiento de Bacillus subtilis
Para el aislamiento de B. subtilis, se seleccionaron races de aj
pimiento piquillo con presencia de ndulos y muestra de suelo del
fundo Ecocuicola SAC, infestado con Meloidogyne, siguiendo el
procedimiento siguiente:

1. Lavado y Desinfeccin:
Las races seleccionadas se lavaron con agua corriente hasta
eliminar toda la tierra, luego se desinfectaron con hipoclorito
de sodio al 2%, y se enjuagaron con agua destilada estril.

2. Extraccin de las bacterias.
Las races desinfectadas se colocaron en un recipiente estril
con SSF estril y con una bagueta estril fueron trituradas,
luego se dej sedimentar y se recogi la suspensin en un
recipiente estril. A partir de este extracto se prepararon
diluciones y se sembr en placas conteniendo Agar Soya
Tripticasa (AST), y se incub a temperatura ambiental (19 +2
C) durante 48 horas.

La muestra de suelo fue usada para preparar diluciones
seriadas. Para ello, se pesaron 10 gramos, los que fueron
colocados en una botella con 90 mililitros de agua destilada
estril (dilucin 1/10). La suspensin de suelo fue agitada por
45 minutos. Una vez trascurrido ste tiempo, se prepararon las
diluciones hasta llegar a 1/10
6
; se sembr en placas
conteniendo Agar Soya Tripticasa (AST), y se incub a
temperatura ambiental (19 +2 C) durante 48 horas.
11


Una vez transcurrido el tiempo se cont el nmero de colonias
y se determin el nmero de unidades formadoras de colonias
por gramo de muestra (ufc/g) (Fig. 14).

3. Seleccin de Cultivos
Despus del periodo de incubacin, se seleccionaron las
colonias con las caractersticas de Bacillus y se colorearon
mediante la tcnica de Gram (Fig. 15). Los bacilos esporulados
Gram positivos fueron aislados en tubos con agar nutritivo,
para su identificacin.

4. Identificacin del cultivo
La identificacin molecular de los cultivos se llev a cabo en el
Centro de Bioinnovacin de Antofagasta, Universidad de
Antofagasta, Chile, siguiendo la siguiente metodologa: Se
purific el ADN total del aislado microbiano enviado al CBIA,
para ser usado como molde en la amplificacin del gen ARNr
16S mediante PCR, luego se separaron las bandas mediante
electroforesis de gel en gradiente denaturante (DGGE) para
verificar la pureza del cultivo previo a la secuenciacin. Se
detectaron fragmentos de ADN (bandas) que demostraron la
presencia de microorganismos del dominio Bacteria.
Posteriormente se realiz la amplificacin del gen ARNr 16S
por PCR, con primers para el dominio Bacteria que amplifican
un fragmento de aproximadamente 1500 pb, el que fue
posteriormente purificado y secuenciado. El microorganismo se
identific mediante anlisis computacional usando software
Bioinformticos en tres bases de datos diferentes y se
seleccion la prediccin con mayor precisin (Anexo 7).
12


2.5.3 Estandarizacin del inculo
El cultivo identificado fue sembrado en placas con AST y se
incub a temperatura ambiental (19 +2 C) durante 48 horas.
En un tubo con agua destilada estril, se prepar una suspensin de
B. subtilis, del cual se prepararon diluciones semejante al tubo 1 del
nefelmetro de Mac farland, (3 x 10
8
cel/mL) y se hicieron
diluciones hasta alcanzar una concentracin aproximada de 1X10
6
esp/mL y 2X10
6
esp/mL. que constituyen la formulacin de las
dosis.

Formulacin de las dosis.
1000000

y 2000000

esporas B. subtilis /mL.

13

2.5.4 Tratamiento
En la parcela seleccionada con un rea total de 0.270 ha, se estableci 27 camas con una distancia de cama-surco-cama de 4 m
2
,
cada microparcela de 50 m lineales y se realiz siembra directa cada 12.5 cm/lnea/1 semilla de C. annuum, previa inoculacin
de esporas de B. subtilis mediante inmersin, teniendo en cuenta la distribucin de los tratamientos planificados (Fig. 7); luego
se realiz el monitoreo correspondiente.














Fig. 7. Distribucin de tratamientos en la parcela.


To
=
0 esporas B. subtilis /mL
T
1 =
1000000 esporas B. subtilis /mL
T
2 =
2000000 esporas B. subtilis /mL
G
o =
0 t Gallinaza/ha
G
1 =
15 t Gallinaza/ha
G
2 =
30 t Gallinaza/ha
BLOQUE I BLOQUE II BLOQUE III
0 Das 0 Das 0 Das
G
o
T
o
G
o
T
2
G
o
T
2
G
o
T
1
G
o
T
o
G
o
T
1
G
o
T
2
G
o
T
1
G
o
T
o
G
1
T
1
G
1
T
2
G
1
T
o
G
1
T
2
G
1
T
o
G
1
T
1
G
1
T
o
G
1
T
1
GM
1
T
2
G
2
T
1
G
2
T
2
G
2
T
o
G
2
T
2
G
2
T
o
G
2
T
1
G
2
T
o
G
2
T
1
G
2
T
2
Siembra directa Capsicum annuum aj pimiento piquillo
50 m
4 m
2

14


2.5.5 Parmetros de medicin
2.5.5.1 Poblaciones del nematodo: En cada uno de los tratamientos se
realizaron anlisis de suelo para determinar las poblaciones iniciales
del nematodo antes de la aplicacin de la bacteria B. subtilis.
Posteriormente se realizaron anlisis de la dinmica de poblaciones
del nematodo, a los 45 y 90 das despus de la siembra directa y
trasplante.
Se colect muestras de suelo por cada bloque experimental tomadas
con un barreno de 2,5 cm de dimetro x 20 cm de profundidad. Las
muestras se mezclaron para obtener muestra final de 100 cm
3
para
la extraccin de nematodos usndose el mtodo de tamizado de
Cobb, filtrndose luego la solucin suelo obtenida, con el mtodo
del embudo de Baermann. La cuantificacin de poblaciones se
determino utilizndose un microscopio estereoscpico.
2.5.5.2 ndice de Nodulacin: Durante la cosecha se seleccionaron
20 plantas al azar por unidad experimental para determinar el ndice
de agallamiento sobre races, utilizndose la Escala de Zeck (1971).
:INDICE DE NODULACION
GRADO 0
GRADO 1
Sin ndulos
10 %
20 %,
30 %,
40 %,
50 %,
60 %,
70 %,
80 %,
90 %,
100 % del sistema radical agallado

GRADO 2
GRADO 3
GRADO 4
GRADO 5
GRADO 6
GRADO 7
GRADO 8
GRADO 9
GRADO 10

2.5.5.3 Anlisis de la produccin: Antes de la cosecha se determin la
altura de planta y el nmero total de frutos.
15

2.5.5.4 Anlisis microbiolgico: Presencia de bacteria B. subtilis en raz de
C. annuum aj pimiento piquillo.

2.5.6 Anlisis de datos
Los datos poblacionales obtenidos en las mediciones posteriores a la
aplicacin de los productos (P
f
) se compararon con los obtenidos de muestras
previas (P
i
). Se obtuvo la Tasa de Reproduccin (TR) que relaciona las
poblaciones finales con las iniciales (P
f
/P
i
). Los datos de las poblaciones del
nematodo, ndices de agallamiento, altura de planta, y nmero de frutos se
sometieron a un anlisis de varianza (ANVA) para un diseo de bloques
completos al azar utilizndose el software Statgraphics Plus 5.0.




















16


III. RESULTADOS

A nivel de siembra directa, la poblaciones iniciales de Meloidogyne sp., antes de la
aplicacin de los tratamientos variaron entre 342 y 27720 nematodos / 100 cm
3
de suelo,
confirmando que los suelos presentaron altos niveles de infestacin del nematodo. Despus
de la aplicacin de la bacteria Bacillus subtilis, la poblacin final registr valores de 13 y 0
nematodos/100 cm
3
de suelo; los niveles de poblacin de nematodos disminuy
considerablemente, con TR de 0.0327 a cero (Tabla 2).

El agallamiento alcanz valores de 8 a 23 %, con un ndice de agallamiento entre el grado 0
y 2, presentando diferencias significativas (P0,05) entre los tratamientos (Fig. 8 y 9). La
menor altura de planta registr 20 cm a concentracin cero de B. subtilis y Gallinaza y
la mayor altura a 32 cm a concentracin 2000000 esporas B. subtilis, con 30 t/ha de
Gallinaza, la interaccin respecto a la concentracin de B. subtilis y la dosis de
Gallinaza se observa en las figuras 10 y 11. En la interaccin concentracin de B. subtilis
y Gallinaza, el menor tamao de fruto alcanz 9 cm a concentracin cero de B. subtilis y
Gallinaza y el tamao mayor a 19.5 cm a concentracin 1000000 esporas B. subtilis, con
15 t/ha de Gallinaza, (Fig. 12 y 13).

El anlisis de varianza (P0,05) para las poblaciones iniciales y finales de Meloidogyne sp.,
as como para la tasa de reproduccin, muestran diferencia significativa entre los
tratamientos aplicados (Tabla 3).







17


Tabla 2. Efecto de Bacillus subtilis sobre Poblacin de Meloidogyne sp. en cultivo de
Capsicum annuum aj pimiento piquillo
N esporas
Bacillus
subtilis/mL)
Gallinaza
(tn/ha) Bloque
Meloidogyne sp/100 cm
3
de
suelo
Agallamiento
(%)
Altura planta
(cm)
Tamao fruto
(cm) Pob. Inicial Pob. Final TR
0 0 1 647 2 0.0031 23 20 10
0 0 2 647 2 0.0031 21 22 9
0 0 3 647 2 0.0031 21 28 12
0 15 1 2410 9 0.0037 14 25 15
0 15 2 7610 0 0 14 26 16.5
0 15 3 5104 3 0.0006 20 25 19
0 30 1 7443 8 0.0011 21 25 16
0 30 2 20570 13 0.0006 19 30 17.5
0 30 3 342 0 0 20 29 19
1000000 0 1 2410a 9 0.0037 14 25 15
1000000 0 2 7610 0a 0a 14 26 16.5
1000000 0 3 5104 3 0.0006 20 25 19
1000000 15 1 9340 5 0.0005 13 27 16.5
1000000 15 2 12030 1 0.0001 8 27 14
1000000 15 3 1200 1 0.0008 17 27 19.5
1000000 30 1 4540 4 0.0009 11 27 17
1000000 30 2 581 0a 0a 12 25 17
1000000 30 3 1879 0a 0a 13 27 17.5
2000000 0 1 7443 8 0.0011 21 25 16
2000000 0 2 20570 13 0.0006 19 30 17.5
2000000 0 3 342 0a 0a 20 29 19
2000000 15 1 1555 2 0.0013 17 29 15.5
2000000 15 2 13184 3 0.0002 9 29 15.5
2000000 15 3 275 9 0.0327 13 31 17.5
2000000 30 1 3124 2 0.0006 16 27 16
2000000 30 2 27720 2 0.0001 14 32 16.5
2000000 30 3 2875 2a 0.0007a 11 30 18





18























Fig. 8. Interaccin entre agallamiento de raz de Capsicum annuum aj pimiento piquillo, Gallinaza y concentracin de
Bacillus subtilis.
19

















.


Fig.9. Interaccin entre agallamiento de raz de Capsicum annuum aj pimiento piquillo, concentracin de Bacillus subtilis y
Gallinaza.

20























Fig. 10. Interaccin entre la altura de planta de Capsicum annuum aj pimiento piquillo, concentracin de Bacillus subtilis y
Gallinaza.

21




















Fig. 11. Interaccin entre altura de planta de Capsicum annuum aj pimiento piquillo, Gallinaza y concentracin de
Bacillus subtilis.
22




















Fig. 12. Interaccin entre tamao de fruto de Capsicum annuum aj pimiento piquillo, Gallinaza y concentracin de
Bacillus subtilis.

23



















Fig. 13. Interaccin entre tamao de fruto de Capsicum annuum aj pimiento piquillo, concentracin de Bacillus subtilis y
Gallinaza.

24

Tabla 3. Anlisis de varianza (ANVA) del efecto Bacillus subtilis, y Gallinaza sobre poblaciones del nematodo Meloidogyne sp.
en cultivo de Capsicum annuum aj pimiento piquillo.

POBLACIN INICIAL

POBLACIN FINAL
Fuente
Suma de
cuadrados

GL
Cuadrado
promedio
Cociente-F P-Valor

Fuente
Suma de
cuadrados

GL
Cuadrado
promedio
Cociente-F P-Valor
A: N esporas
Bacillus subtilis /mL)
7.60E+07 2 3.80E+07 0.67 0.5264

A: N esporas
Bacillus subtilis /mL)
21.6296 2 10.8148 0.64 0.5408
B: Gallinaza (t/ha) 3.26E+07 2 1.63E+07 0.29 0.7551

B: Gallinaza (t/ha) 3.85185 2 1.92593 0.11 0.8935
INTERACCIONES
Suma de
cuadrados

GL
Cuadrado
Medio
Cociente-F P-Valor

INTERACCIONES
Suma de
cuadrados

GL
Cuadrado
promedio
Cociente-F P-Valor
AB 1.86E+08 4 4.65E+07 0.81 0.533

AB 82.5926 4 20.6481 1.21 0.3391
Totales 1.03E+09 18 5.71E+07


Totales 306 18 17


TR = PF/PI
Fuente Suma de cuadrados GL
Cuadrado
promedio
Cociente-F P-Valor
A: N esporas Bacillus subtilis /mL) 0.00005563 2 0.00002781 072 0.5020
B: Gallinaza (t/ha) 0.00007487 2 0.00003743 096 0.4002
INTERACCIONES
Suma de
cuadrados
GL
Cuadrado
promedio
Cociente-F P-Valor
AB 0.00017422 4 0.00004356 1.12 0.3773
Totales 0.00069912 18 0.00003884

25



















Fig. 14. Colonias de Bacillus subtilis.













Fig. 15. Esporas de Bacillus subtilis en raz de Capsicum annum a 1000X
(coloracin Gram).
26
























Fig. 16. Esporas de Bacillus subtilis adheridas a la cutcula de Meloidogynesp. J2 (3000X)
Foto: Murgua, 2011.
27

IV. DISCUSIN

En el cultivo de Capsicum annuum, antes a la ejecucin de la presente investigacin, se
evidenci presencia de clorosis y nodulaciones en las races (Anexo 5); una de las causas
que provoca sta manifestacin, es por infestacin del nematodo Meloidogyne sp., el cual
es responsable de la formacin de ndulos en la raz e interfiere en la absorcin de agua y
nutrientes.

Segn Prez, (2007), las plantas enfermas presentan sntomas tpicos tales como: cese del
crecimiento de la planta, proliferacin del desarrollo de ndulos en races, amarillamiento
en las hojas, defoliacin, culminando con la muerte en plantas, etc.

El control (Tabla 2) evidenci una poblacin alta de Meloidogyne sp., luego de un espacio
de seis meses a campo limpio mostr una poblacin baja, posiblemente debido a factores
climticos de la zona en los meses de octubre a marzo, donde se registraron temperaturas
que oscilaron entre 30 y 48C a 20 cm de profundidad del suelo, coincidiendo con Alcozer,
et al. (2006), quien report en su investigacin sobre solarizacin en suelos agrcolas del
valle de Piura, que en el substrato solarizado las temperaturas promedio a 10 cm de
profundidad superaron los 40 C y que es posible que el riego aplicado durante el
bioensayo (sin ningn tratamiento) incentivaran la actuacin de los antagonistas del nematodo
y que stos contribuyeran a la reduccin de las poblaciones.


La aplicacin de esporas de B. subtilis, en la semilla para siembra directa se hizo por
inoculacin (Anexo 8), sta estrategia es una de las ms sugeridas para obtener efectividad
en la disminucin de poblaciones de Meloidogyne sp., de forma directa; segn Gmez, et
al. (2010), indican que ste tipo de estrategia es ms eficiente en el control de diversas
poblaciones de Meloidogyne sp., pero requiere de ms tiempo para que ocurra la seleccin
natural, de esta forma las endosporas especficas para una determinada poblacin de
Meloidogyne sp. presente en un rea dada, se multiplicaran en su progenie.

28

Despus de aplicar la cepa nativa de Bacillus subtilis, se observ ausencia de clorosis,
evidenciando accin supresora en Meloidogyne sp. (Anexo 6).

Los resultados de sta investigacin muestran que el efecto que ejerce la bacteria B. subtilis
sobre la poblacin del nematodo del nudo Meloidogyne sp. (fig. 8, 11 y 12), est
relacionada con la cantidad de esporas inyectadas; esto se hace evidente al aplicar el
tratamiento con 1000000 esporas B. subtilis /mL y Gallinaza 30 t/ha y 2000000 esporas
B. subtilis /mL y Gallinaza 0 t/ha siendo la efectividad aproximado 99% (Tabla 2).

Segn Rojas, et al. (1999), la eficacia de la bacteria depende en gran medida de la cantidad
de esporas existentes en el suelo y de la posibilidad de que stas se puedan adherir a la
cutcula de los nematodos para poder parasitar generaciones futuras; las esporas se pueden
almacenar en el suelo y raz seca por periodos largos sin mostrar prdida aparente de
viabilidad. Solorio (2002) afirma que nematicidas a base de B. subtilis con un mnimo de
esporas de 10
7
UFC/mL, resulta una buena alternativa para el control de Meloidogyne sp. y
que adems fortalece y estimula el crecimiento vegetativo de la planta.

A los 90 das de aplicacin de los tratamientos, se estim la tasa de reproduccin,
encontrndose comportamientos similares en los registros de poblacin final del nematodo
Meloidogyne sp., con una tasa de reproduccin menor que 1, lo cual indica el control
ejercido por la bacteria B. subtilis; y esto se evidencia en la menor formacin de
agallamiento (48% races agalladas) (Fig. 8 y 9). As mismo se encontr que las plantas de
C. annum lograron mayor altura a tratamiento de 2000000 esporas B. subtilis /mL y el
tamao de fruto tuvo mayor tamao y uniformidad con los tratamientos de 1000000 y
2000000 esporas B. subtilis /mL (Fig. 10, 11, 12, y 13), (Anexo 8, fig. 27 y 28). Los
resultados obtenidos tienen una similitud con el reporte de Guilln, et al (2006), sobre el
rendimiento de plantas de chile, donde la altura increment en un 33% y 24% a los 56 das,
despus de inocular cepas de Bacillus sp.; infiere que algunas bacterias de Bacillus, inducen
diferentes mecanismos relacionados con la promocin de crecimiento en las plantas, ya sea
que proporcionen directamente nutrientes, participen en la fijacin de nitrgeno, fsforo y
potasio, o bien que las plantas sean capaces de producir hormonas vegetales y sustancias
29

promotoras del crecimiento como el cido indolactico o por la produccin de antibiticos
para la supresin de daos.

La accin de la bacteria tambin interacta con algunos factores como tipo de suelo,
temperatura, fertilidad del suelo, edad de la planta, humedad, etc., es decir que la severidad
de los sntomas y el desarrollo de la enfermedad causada por las especies de Meloidogyne
dependen de la respuesta de la planta a la infeccin, tipo de suelo y condiciones del medio
ambiente. Segn Cuervo (2010) la bacteria Bacillus subtilis es un gran controlador
biolgico, promueve el desarrollo de las plantas y previene las enfermedades del suelo
causadas por Sclerotium rolfsii, Fusarium sp., Verticillium sp, Sclerotinia sclerotiorum,
Phytophthora capsici, Pythium sp, y el nematodo nodulador de races Meloidogyne sp y
Rhizoctonia solani, agente causal de la enfermedad denominada mal del tallito del
algodonero.

La gallinaza utilizada a 30 t/ha (Tabla 2), (Fig. 9, 10 y 13); ha tenido un efecto positivo al
interactuar con la bacteria B. subtilis, esto se evidenci en los niveles de poblaciones de
Meloidogyne sp en el suelo, los cuales disminuyeron significativamente a los 90 das. Se
conoce que la actividad de las enmiendas orgnicas incorporadas al suelo contra nematodos
parsitos de plantas puede variar con la especie del nematodo, tipo de enmienda y
subproductos, de la poca de la aplicacin de la enmienda y de las propiedades fsicas,
qumicas y biolgicas del suelo; as el amonio liberado durante la descomposicin del
estircol, tiene accin txica contra nematodos parsitos. Segn Rodrguez, (1986); Kaplan
y Keen (1993); Esnard et al., (1998), estircoles de animal (slidos o lquidos) y mezclas
compostadas de materia animal y vegetal aplicadas en grandes cantidades antes de la
siembra incrementan las poblaciones de microorganismos antagonistas supresores de
nematodos.

La accin de gallinaza, ha interactuado en el efecto supresor de B. subtilis contra el
nematodo, favoreciendo el incremento del cultivo de C. annuum, alcanzando una
produccin final de 37 t/ha, segn Macas (2012), la aplicacin de gallinaza al suelo
representa una excelente alternativa en la produccin, pues incrementa el rendimiento,
30

precocidad y calidad del fruto, y Quezada (1999) en su investigacin en banano evidencia
que, la severidad del dao de los nematodos puede reducirse si se crean condiciones que
favorezcan el desarrollo de enemigos naturales que ya estn presentes en el suelo y que la
adicin de gallinaza incrementa sustancialmente la actividad microbial de los suelo, por
que proveen de carbono, energa, y nutrientes para favorecer el crecimiento, actividad y
nmero de microorganismos.

Llevar a cabo un control biolgico de nematodos ha permitido disminuir el uso de
qumicos, los cuales no son beneficiosos para el suelo; segn el manual de buenas prcticas
en el manejo orgnico del cultivo de Sacha inchik (Incagro, 2009), se afirma que la
agricultura orgnica es importante porque contribuye a reducir al mnimo la contaminacin
del ambiente, evitando los fertilizantes y plaguicidas sintticos lo que propicia un
ecosistema sostenible, alimentos seguros, buena nutricin, bienestar animal y desarrollo
rural. Garca (2008), afirma que la aplicacin de un control natural contra las plagas, tiene
ventajas como: son menos txicos que los qumicos, por lo general son inocuos, pueden
ayudar a disminuir notablemente el uso de qumicos, disminuyen la cantidad de residuos,
son efectivos en pequeas cantidades, frecuentemente se descomponen rpido y por lo
general afectan solo a la plaga objetivo.

Los resultados observados en el presente estudio (Tabla 2) demuestran que el control por B.
subtilis representa una alternativa natural dentro de un sistema de manejo integrado del
nematodo del nudo Meloidogyne sp., coincidiendo con la investigacin de Siddiqui, et al.
(2001) donde se reporta, que; plantas tratadas con B. subtilis redujeron el agallamiento y
multiplicacin del nematodo M. incgnita, dando como resultado crecimiento vegetal
mejorado.

La aplicacin de varianza para las poblaciones iniciales y finales de Meloidogyne sp., y la
tasa de reproduccin, explican la existencia de diferencia significativa (P0,05) (Tabla 3);
evidenciando ligeras variaciones, las cuales tendran relacin directa de acuerdo a los
tratamientos aplicados.

31


V. CONCLUSIONES

La cepa nativa de Bacillus subtilis tiene efecto supresor sobre poblaciones de
Meloidogyne sp. en cultivo de Capsicum annuum aj pimiento piquillo y la
Gallinaza al interactuar con la bacteria posiblemente favoreci la supresin del
nematode.

La accin supresora de Bacillus subtilis en Meloidogyne sp., aport a un incremento
de la altura de planta de Capsicum annuum entre 20 y 32 cm y tamao de fruto de
entre 9 a 19.5 cm.




















32

VI. RECOMENDACIONES


Para posteriores investigaciones y realizar un control efectivo, se recomienda la
determinacin especfica del nematodo, determinar la densidad poblacional y repetir
los bioensayos.

Se recomienda motivar hacia la aplicacin de programas de manejo integrado de
nematodos, para contribuir a la conservacin del ambiente.

Se debe enfatizar en la utilizacin de bacterias como control biolgico de
nematodos, y dejar como ltima alternativa el control qumico.

Se recomienda para el manejo integrado de nematodos, tomar en cuenta el historial
del campo, calidad del agua, tipo de suelo, nutricin.
















33


VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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Dr. Segundo Eloy Lpez Medina Nancy Mercedes Soto Deza
Cdigo N 2193. C.M. N 8011009-01








ASESOR
36








VIII. ANEXOS






37


Anexo 1
DESCRIPCIN DE Capsicum annuum

Reino : Plantae
Filo Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Asteridae
Orden : Solanales
Familia : Solanaceae
Gnero : Capsicum
Especie : Capsicum annuum

CARACTERSTICAS
Color rojo sangre de toro, sabor dulce, con dos caras planas y otras redondeadas a los lados,
finalizando con una punta tipo pico de loro, la cual da origen a su nombre: pimiento
piquillo.
El origen del pimiento se remonta a tiempos preincaicos y se sita en Amrica del Sur. En
su primer viaje, Cristbal Coln llev al viejo mundo los pimientos americanos. Con el
pasar de los aos se desarrollaron distintas variedades de pimientos en Espaa, uno de ellos
es el piquillo; por lo que solemos atribuir su "nacionalidad" a este pas, especficamente a la
ciudad de Lodosa, en donde se cultiva de forma artesanal. Entre 1994 y 1996 se importaron
semillas de dicha hortaliza a nuestro pas, que fueron sembradas y cosechadas por
empresarios peruanos. Gracias a la cercana de nuestro pas a la lnea ecuatorial, a que en la
costa del Per no existen extremos de temperatura y a que nos encontramos en la zona
tropical del mundo (entre el Trpico de Cncer y el de Capricornio), el resultado de la
siembra fue un pimiento piquillo con caractersticas tan excepcionales que est desplazando
al pimiento piquillo espaol en Espaa.
Fuente: http://www.comexperu.org.pe.





Fig. 1. Fruto de Capsicum annuum
38


Anexo 2
DESCRIPCIN DEL NEMATODO DEL NUDO Meloidogyne sp.

Reyno: Animal
Phylum: Nematoda
Clase: Secernentea
Orden: Tylenchida
Sub orden: Tylenchina
Super familia: Heteroderoidea
Familia: Meloidogynidae
Sub familia: Meloidogyninae
Gnero: Meloidogyne
Especie: Meloidogyne sp.

Caractersticas:

El ciclo de vida de M. incognita, es similar a la de todas las especies de este gnero, sin
embargo, la tasa de desarrollo depende de la temperatura y del hospedante.
Los huevos son puestos por la hembra en estado de clula simple; estos se encuentran
embebidos en una masa gelatinosa glicoprotenica (matriz), que los protege de la
deshidratacin; son ovalados, algunas veces elipsoidales, levemente cncavos y pueden
medir de 30 a 52 micras de ancho por 67 a 128 micras de largo, la hembra oviposita un
promedio de 500 a 1000 huevos, que breves horas despus comienzan el desarrollo hasta
que se observa una larva completamente formada, siendo este el primer estado larvario;
poco despus ocurre la primera muda y se produce el estado de larva infectivo la cual corta
con su estilete la cscara del huevo para migrar e invadir las races justamente sobre la
caliptra de la raz.
La larva presenta una segunda muda y da lugar a la tercera etapa larvaria, luego ocurre una
tercera muda y se desarrolla una cuarta etapa larvaria, en la cual es posible distinguirlo ya
como individuo macho o hembra. El macho sufre la cuarta y ltima muda y emerge de la
raz como un macho adulto vermiforme, el cual vive libremente en el suelo. La hembra de
la cuarta etapa larvaria contina aumentando de grosor y un poco ms de longitud, sufre la
ltima muda y se desarrolla en una hembra adulta, la cual contina hinchndose y,
fecundada o no por el macho, forma huevecillos que deposita en una cubierta protectora
(matriz). El ciclo de vida puede concluir al cabo de 3 o 4 semanas, bajo condiciones
ambientales ptimas.
Fig. 2. Melidogyne sp.
Fuente: http://www.plagasyenfermedadesvid.net/2011/10/genero-meloidogyne.html
39

Esta especie, Esta especie, al igual que todas las especies de nematodos, se reproduce
sexualmente, pero cuando las condiciones no son apropiadas o favorables lo hacen
partenogenticamente (asexual). Produce muchas generaciones durante el ciclo del cultivo,
incrementando su poblacin al final del mismo...
Funte: Puedmag Ruano, J. F. y col. (2007).

















Anexo 3








Fig. 3. Ciclo de vida de Meloidogyne sp.
40


Anexo 3
DESCRIPCIN DE LA BACTERIA Bacillus subtilis

Reino : Bacteria
Filo Firmicutes
Clase : Bacilli
Orden : Bacillales
Familia : Bacilliaceae
Gnero : Bacillus
Especie : Bacillus subtilis

Caractersticas:
Es una bacteria Gram positiva, produce endospora las que son termorresistentes y
tambin resiste factores fsicos perjudiciales como la desecacin la radiacin los
cidos y los desinfectantes qumicos, produce enzimas hidrofilicas extracelulares
que descomponen polisacridos, cidos nucleicos permitiendo que el organismo
emplee estos productos como fuente de carbono y electrones, producen
antibiticos como la bacitricina,polimixina,gramicidina y circulina,fermentan la
casena y el almidn, vive dentro de los limites de 55 a 70C. Es un gran
controlador biolgico, Bacillus subtilis promueve el desarrollo de las plantas y
previene las enfermedades del suelo causadas por Sclerotium rolfsii, Fusarium
spp., Verticillium spp, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophthora capsici, Pythium spp,
y el nematodo nodulador de races (Meloidogyne spp) y Rhizoctonia solani, agente
causal de la enfermedad denominada mal del tallito del algodonero. (Caldern et
al, .2002).
Fuente: Cuervo Lozada, J. P. (2010).








Fig. 4. Bacillus subtilis con tincin de Gram

41

Anexo 4
REA DE ESTUDIO












UBICACIN DEL ESTUDIO
Regin, Piura
Valle, medio Piura.
Zona, Santa ngela
Fundo acua-agroindustrial Ecoacucola SAC.






Fig. 6. Vista panormica del fundo Ecoacuicola SAC, Chapair, Piura.
Fuente: Len, 2008


Parcelas de cultivo de pimiento
Fig. 5. Preparacin de la parcela, distribucin de camas y tendido de
mangueras para sistema de riego tecnificado por goteo.
42

Anexo 5








Fig. 17: Observacin de clorosis en las hojas de Capsicum annuum en Fundo Ecoacuicola
SAC Chapair Piura, 2010.









.


Fig. 18. Raz de Capsicum annuum, con presencia de ndulos
(Fundo Ecoacuicola SAC Chapair Piura, 2010.)

43

Anexo 6
























Fig. 19. Observacin de no evidencia de clorosis en las hojas de
Capsicum annuum en Fundo Ecoacuicola SAC Chapair
Piura, 2011
44

Anexo 7
45


46


47

Anexo 8



















Fig. 20. Inoculacin de esporas de Bacillus subtilis, en
semillas de Capsicum annuum aj pimiento piquillo.
Fig. 21. Siembra directa de Capsicum annuum aj pimiento piquillo.
48


























Fig. 23. Recalce de Capsicum annuum
Fig. 22. Distribucin de Bloques I, II y III.
49


















Fig. 24. Raz de Capsicum annuum sin ndulos.
Fig. 25. Planta y fruto de Capsicum annuum.
50


























Fig. 26. Cultivo de Capsicum annuum a los 45 das.
Fig. 27. Altura de planta de Capsicum annuum a los 65 das.
51


























Fig. 28. Fruto de Capsicum annuum
52





Fig. 29. Cosecha de Capsicum annuum a los 90 das.