CCM Phospholipids

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N ordre : 850
THESE
prsente
lInstitut National des Sciences Appliques de Toulouse
par
Marlne COT
en vue de lobtention du
DOCTORAT
De Sciences Ecologiques, Vtrinaires, Agronomiques et Bioingnieries
Spcialit : Microbiologie et Biocatalyse industrielles
Etudes physiologiques de ladaptation et de la rsistance de la
levure Saccharomyces cerevisiaeau cours de la production
intensive dthanol
Thse soutenue le 10 novembre 2006 14h, salle des thses lInstitut National des Sciences
Appliques de Toulouse devant la commission d'examen :
M. Thierry BERGES......................................................................................................Prsident
M. Herv ALEXANDRE............................................................................................Rapporteur
M. Jean-Marie SABLAYROLLES.............................................................................Rapporteur
M. Mostapha SALHI................................................................................................Examinateur
M. Jean-Marie FRANCOIS......................................................................................Co-directeur
M. Laurent BENBADIS...........................................................................................Co-directeur
Cette thse a t prpare au Laboratoire de Biotechnologie-Bioprocds UMS-CNRS 5504,
UR-INRA 792 de lINSA de Toulouse, dpartement de Gnie Biochimique et Alimentaire.
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3
Remerciements
Je tiens tout dabord remercier M. Grard Goma de mavoir accueilli au sein du laboratoire
alors quil en tait le directeur et pour son enthousiasme pour ce projet.
Je remercie mes co-directeurs de thse Laurent BENBADIS et Jean Marie FRANOIS. Ils
ont su chacun leur tour me remotiver en mettant en valeur mon travail par leurs connaissances
scientifiques. Jai appris beaucoup de nos discussions, qui aurait du tre plus frquentes.
Cette thse a t ralise, avec les difficults que cela a comports, en collaboration avec
lquipe de Gnie microbiologique et lquipe de Physiologie Microbienne des Eucaryotes. Je
remercie donc lensemble des personnes de lquipe fermentation qui ont particip aux
longues nuits devant le fermenteur. En particulier, je suis redevable Carole Jouve et
Stphane Guillouet qui ont port leur part du projet et qui ont notamment fortement contribu
finaliser la collaboration avec lentreprise Amylum. Je remercie le JMFs lab pour leur
soutien plus que scientifique. Merci au personnel de la plateforme Transcriptome-biopuce de
Toulouse pour leurs conseils et leur contribution lobtention des donnes transcriptomiques.
Parmi, les personnes qui ont directement contribues ce travail, je remercie Kenza Boulahya
qui, dans le cadre de son stage de DESU, a permis la mise en place des mthodes dextraction
et de dosage des lipides cellulaires. Je remercie aussi N.ROZES, qui ma accueilli au sein de
son laboratoire lUniversit nologique de Tarragone afin de mapprendre les bases des
analyses lipidiques.
Jai une pense toute particulire pour les anciens et les actuels doctorants du laboratoire avec
qui jai partag mes joies et mes dceptions. Que lavenir vous soit favorable et bon courage
ceux qui suivent ! Et je remercie aussi toutes les personnes du laboratoire qui mont aid un
moment ou un autre, celles qui ont partag mon bureau ou les pauses-caf Je remercie
particulirement MarieOdile Loret qui ma coute et paule dans les moments difficiles.
Un grand merci Hlne, Lidwine et Delphine avec qui jespre avoir partage une relation
privilgie dans les bons et les mauvais moments. Jai grandement apprci nos longues
discussions refaire nos vies et celles beaucoup moins ambitieuses mais nettement plus
rigolotes.
Un grand merci Fred pour avoir su mcouter au moment opportun. Merci Lucile de me
faire apprcier, du haut de ces 7 mois, chaque moment de la vie.
Enfin, je tiens ddier cette thse aux personnes de ma famille disparues trop tt et plus
particulirement mon frre Philippe qui me manque normment.
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Sommaire
RESUME............................................................................................................................ 13
INTRODUCTION GENERALE................................................... 15
PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIE....................................... 21
I. CHAPITRE 1 : Production microbienne de (bio-)thanol ...................................... 23
I.1. Contexte conomique et environnemental ................................................. 24
I.2. Les microorganismes utiliss...................................................................... 25
I.3. Les substrats utiliss ................................................................................... 26
I.4. Les procds de fermentation alcoolique utilisant des levures.................. 27
I.4.i. Fermentation type batch .................................................................... 28
I.4.ii. Fermentation type fed-batch.............................................................. 28
I.4.iii. Fermentation type continu................................................................. 29
I.4.iv. Procd dtude dvelopp au sein du laboratoire Biotechnologie
Bioprocds........................................................................................................ 31
II. CHAPITRE 2 : Gnralits sur la croissance des levures et la composition lipidique
des membranes................................................................................................................... 32
II.1. Les diffrents types de mtabolismes ......................................................... 32
II.1.i. Mtabolisme fermentaire................................................................... 32
II.1.ii. Mtabolisme oxydatif........................................................................ 33
II.1.iii. Orientation du mtabolisme et effet glucose ...................................... 33
II.2. Les principaux produits de la fermentation alcoolique............................. 34
II.3. Les exigences nutritionnelles ...................................................................... 35
II.4. Les phnomnes dinhibition lors de la production dthanol .................. 37
II.4.i. Par le substrat.................................................................................... 37
II.4.ii. Par les co-mtabolites produits .......................................................... 37
II.4.iii. Par lthanol : notion de tolrance lthanol .................................... 38
a. Sur la croissance cellulaire .................................................................. 38
b. Sur la capacit fermentaire .................................................................. 39
c. Sur la viabilit ..................................................................................... 39
d. Modle dinhibition............................................................................. 39
e. Notion de tolrance lthanol : .......................................................... 39
f. Facteur influenant la tolrance lthanol .......................................... 40
II.5. Constitution et proprits de la membrane plasmique.............................. 41
II.5.i. Les diffrents lipides et leur rle........................................................ 42
a. Les acides gras et esters dacides gras.................................................. 42
b. Les glycrophospholipides .................................................................. 43
c. Les mono-, di- et triglycrides ............................................................. 45
d. Les strols ........................................................................................... 46
e. Glycolipides et sphingolipides ............................................................. 48
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II.5.ii. Effet de la structure des lipides sur les proprits membranaires........ 49
a. La fluidit membranaire ...................................................................... 50
b. La permabilit ................................................................................... 51
III. CHAPITRE 3 : Effet de lthanol sur les cellules de Saccharomyces cerevisiae..... 52
III.1. Effet direct de l'thanol : ............................................................................ 52
III.1.i. Ethanol intracellulaire et extracellulaire :........................................... 52
III.1.ii. Effet de lthanol sur les enzymes glycolytiques................................ 53
III.1.iii. Perturbation des transports et de la rgulation de lhomostasie......... 53
III.1.iv. Effet de lthanol sur les membranes ................................................. 54
III.2. Action indirecte et rponse de la cellule..................................................... 55
III.2.i. Lthanol comme stress cellulaire : le water stress............................. 56
a. Le glycrol .......................................................................................... 56
b. Le trhalose......................................................................................... 57
c. Effet de lthanol sur lADN et la rgulation gntique........................ 59
III.2.ii. Influx et efflux de protons travers la membrane : Rle de lATPase
membranaire....................................................................................................... 59
III.2.iii. Modification de la permabilit et de la fluidit membranaire............ 60
a. La composition en acides gras ............................................................. 60
b. La composition en strols.................................................................... 61
c. Les phospholipides .............................................................................. 62
d. Les protines membranaires et autres molcules.................................. 62
III.3. Rponse transcriptomique la prsence dthanol ................................... 63
III.4. Gnes impliqus dans la tolrance lthanol ........................................... 65
III.5. Conclusion................................................................................................... 67
7
PARTIE II : MATERIEL ET METHODES................................. 69
I. Fermentation............................................................................................................. 71
I.1. Souche ......................................................................................................... 71
I.2. Milieux de culture ....................................................................................... 71
I.2.i. Milieu de conservation ...................................................................... 71
I.2.ii. Milieu riche....................................................................................... 71
I.2.iii. Milieux de prculture et de fermentation ........................................... 71
I.3. Bioracteur et conditions de culture .......................................................... 73
I.3.i. Prparation de l'inoculum.................................................................. 73
I.3.ii. Prparation du bioracteur................................................................. 73
II. mthodes analytiques ................................................................................................ 74
II.1. Caractrisation de la biomasse................................................................... 74
II.1.i. Mesure de la densit optique ............................................................. 74
II.1.ii. Dtermination de la masse sche totale.............................................. 74
II.1.iii. Dtermination de la viabilit cellulaire .............................................. 75
a. Bleu de mthylne............................................................................... 75
b. Fun1 .................................................................................................. 75
II.1.iv. Caractrisation morphologique de la biomasse .................................. 76
II.2. Dosage du glucose extracellulaire............................................................... 78
II.2.i. Dosage par mthode enzymatique ..................................................... 78
II.2.ii. Dosage par HPLC ............................................................................ 78
II.3. Dosage glucose, thanol, actate, glycrol. ............................................. 78
III. Analyses des composants macromolculaires .......................................................... 79
III.1. Protines : mthode du Biuret ................................................................... 79
III.2. Carbohydrates .......................................................................................... 80
III.3. ADN+ARN ................................................................................................. 80
IV. Analyses des composants lipidiques.......................................................................... 81
IV.1. Extraction des lipides cellulaires ............................................................... 81
IV.2. Dosage des lipides totaux par gravimtrie ................................................ 83
IV.3. Dosage des lipides par Chromatographie Couche Mince ......................... 83
IV.3.i. Solutions talons ............................................................................... 83
IV.3.ii. Sparation des lipides neutres par CCM............................................ 84
IV.3.iii. Sparation des phospholipides par CCM .......................................... 85
IV.3.iv. Rvlation des lipides sur plaque de CCM......................................... 86
IV.4. Dosage phospholipides totaux par une mthode colorimtrique ............. 87
IV.5. Dosage des strols totaux par une mthode colorimtrique ..................... 88
IV.6. Dosage des acides gras par chromatographie gazeuse ............................. 89
8
V. Analyse des composants paritaux .......................................................................... 91
V.1. Extraction des parois cellulaires ................................................................ 91
V.2. Dosage sucres totaux................................................................................... 92
V.3. Dosage de la chitine .................................................................................... 93
V.4. Dosage des mannanes et des glucanes ........................................................ 94
V.4.i. Hydrolyse acide................................................................................. 94
V.4.ii. Dosage par HPAEC .......................................................................... 95
VI. Analyse du contenu en rserves intracellulaires ..................................................... 96
VI.1. Lyse des cellules .......................................................................................... 96
VI.2. Dgradation du trhalose en unit glucose ................................................ 96
VI.3. Dgradation du glycogne en unit glucose ............................................... 97
VI.4. Dosage du glucose libr............................................................................. 97
VII. Mtabolites intracellulaires....................................................................................... 98
VII.1. Extraction.................................................................................................... 98
VII.2. Quantification par HPAEC Dionex............................................................ 99
VIII. Analyse des profils dexpression des gnes par lutilisation de puces ADN de type
microarray ....................................................................................................................... 101
VIII.1. Obtention des ARNm................................................................................ 101
VIII.1.i. Echantillonnage des cellules............................................................ 101
VIII.1.ii. Extraction des ARN ........................................................................ 101
VIII.1.iii. Vrification de la qualit des ARN : ................................................ 102
VIII.2. Prparation des sondes et des lames......................................................... 102
VIII.3. Rtrotranscription en ADNc et marquage............................................... 103
VIII.4. Qualit de la rtrotranscription ............................................................... 105
VIII.5. Hydridation............................................................................................... 106
VIII.6. Lecture du signal....................................................................................... 106
VIII.7. Analyse des donnes.................................................................................. 106
VIII.7.i. Normalisation.................................................................................. 106
VIII.7.ii. Identification des gnes diffrentiellement exprims........................ 106
VIII.7.iii. Calcul du nombre de rptitions ncessaires .................................... 107
a. Estimation lerreur exprimentale moyenne....................................... 108
b. Estimation du ratio seuil et du nombre de lames ................................ 109
VIII.7.iv. Analyse approfondie des rsultats de lanalyse transcriptomique ..... 110
9
PARTIE III :CHOIX ET OPTIMISATION DE LA METHODE
DEXTRACTION NECESSAIRE A LA QUANTIFICATION
DES CONTENUS INTRACELLULAIRES EN LIPIDES......... 111
I. Choix de la mthode dextraction des lipides cellulaires ....................................... 114
I.1. Descriptif des diffrentes mthodes.......................................................... 114
I.1.i. Mthode 1 ...................................................................................... 114
I.1.ii. Mthode 2 : extraction des lipides totaux sur biomasse frache ....... 116
I.1.iii. Mthode 3 : dite de gradient de solvant ........................................... 117
I.1.iv. Mthode 4 : Extraction au soxhlet ................................................... 118
I.2. Critres de choix ....................................................................................... 119
II. Validation de la mthode dextraction aux gradients de solvant : mthode 3 ...... 121
II.1. Efficacit et optimisation des diffrentes tapes ...................................... 121
II.1.i. Optimisation du nombre dtapes et du temps dextraction.............. 121
II.1.ii. Optimisation de ltape de lavage.................................................... 124
II.1.iii. Antioxydant .................................................................................... 126
II.2. Reproductibilit ........................................................................................ 128
II.3. Evaluation du rendement dextraction .................................................... 130
II.3.i. Sur solution de standards seuls ........................................................ 130
II.3.ii. Sur solution de standards en prsence de cellules............................. 131
III. Conclusion de la partie III ...................................................................................... 134
10
PARTIE IV : DYNAMIQUE DADAPTATION DE LA LEVURE
SACCHAROMYCES CEREVI SI AE A SA PRODUCTION
DETHANOL : ASPECTS MACROCINETIQUE ET
MICROSCOPIQUE...................................................................... 135
I. Aspect macrocintique des fermentations alcooliques de type fed-batch ............. 137
I.1. Suivi cintique des fermentations alcooliques de type fed-batch ............ 138
I.2. Analyse des titres et des rendements 45h.............................................. 142
I.3. Conclusion................................................................................................. 144
II. Analyse de la viabilit cellulaire, de la morphologie des cellules et de la composition
macromolculaire de la biomasse.................................................................................... 145
II.1. Analyse de la viabilit cellulaire au cours des procds de production
intensive dthanol .................................................................................................. 145
II.1.i. Mthode de mesure de la viabilit cellulaire .................................... 145
II.1.ii. Etat des cellules pendant les fermentations alcooliques par mesure de la
coloration au bleu de mthylne........................................................................ 148
II.1.iii. Conclusion sur la viabilit cellulaire................................................ 149
II.2. Evolution de la morphologie des cellules pendant une fermentation...... 150
II.2.i. Accumulation de cellules brillantes au cours de la fermentation ...... 151
II.2.ii. Evolution de la rpartition des diffrentes catgories des cellules
(cellules non bourgeonnantes, cellules bourgeonnantes et bourgeons) au cours de
la fermentation.................................................................................................. 155
II.2.iii. Conclusion : .................................................................................... 155
II.3. Etat de la composition macromolculaire des cellules au cours de la
production dthanol en mode fed-batch................................................................ 157
III. Conclusion de la partie IV ...................................................................................... 158
11
PARTIE V : REPONSE TRANSCRIPTOMIQUE DES
LEVURES LORS DUNE FERMENTATION DE TYPE FED-
BATCH.......................................................................................... 161
I. Prsentation du plan exprimental :....................................................................... 163
I.1. Choix de la fermentation et des prlvements pour le suivi cintique.... 163
I.2. Stratgie et traitement statistique ............................................................ 165
II. Analyse des rsultats ............................................................................................... 166
II.1. Description globale des changements transcriptionnels.......................... 166
II.2. Approfondissement des tendances mtaboliques et localisation
cellulaire des produits des gnes sur-exprims et sous-exprims .......................... 170
II.2.i. Familles fonctionnelles intervenant dans ladaptation lthanol..... 170
II.2.ii. Localisation cellulaire des produits des gnes sur-exprims pendant la
fermentation alcoolique .................................................................................... 174
II.3. Etude dtaille des donnes dexpression pertinentes pour la
comprhension de ladaptation de la levure sa production dthanol................ 176
II.3.i. Synthse protique rprime et ralentissement de la croissance ....... 176
II.3.ii. La rponse aux stress et changements environnementaux : deux
facteurs de transcription impliqus ................................................................... 176
II.3.iii. Mtabolisme li aux alcools ........................................................... 178
II.3.iv. Mtabolisme des rserves : trhalose et glycogne .......................... 179
II.3.v. Mtabolisme parital ...................................................................... 180
II.3.vi. Mtabolisme lipidique .................................................................... 181
II.3.vii. Respiration et balance redox ........................................................... 182
II.3.viii. Homostasie et transport cellulaire .................................................. 182
III. Conclusion de la partie V........................................................................................ 187
12
PARTIE VI : ANALYSE DE LA PHYSIOLOGIE DES
LEVURES AU COURS DE DEUX FERMENTATIONS
CONDUISANT A DES DIFFERENCES SIGNIFICATIVES EN
TITRE ETHANOLIQUE ............................................................. 191
I. Impact de la production dthanol sur lactivit glycolytique et laccumulation de
sucres de rserves des levures.......................................................................................... 193
I.1. Evolution des mtabolites glycolytiques et nergtiques intracellulaires 194
I.2. Fuite extracellulaire de mtabolites ......................................................... 198
I.3. Evolution du contenu intracellulaire en sucres de rserves : trhalose et
glycogne.................................................................................................................. 200
II. Impact de la production dthanol sur le contenu lipidique et les structures
membranaires et paritales ............................................................................................. 203
II.1. Impact de la production dthanol sur le contenu lipidique ................... 203
II.1.i. Evolution du contenu cellulaire en strols et esters de strols........... 204
II.1.ii. Evolution du contenu cellulaire en phospholipides ......................... 206
a. Phospholipides totaux........................................................................ 206
b. Proportions des diffrents phospholipides cellulaires......................... 209
II.1.iii. Evolution des autres composs lipidiques : Glycrides, Acides gras et
esters dacides gras ........................................................................................... 210
II.1.iv. Evolution du contenu cellulaire en lipides totaux pendant les
fermentations.................................................................................................... 212
II.1.v. Evolution des compositions relatives dans les diffrents acides gras en
fonction du degr dinsaturation et de la longueur de la chane ......................... 214
II.2. Impact de la production dthanol sur le contenu en sucres paritaux .. 216
III. Conclusion de la partie VI ...................................................................................... 218
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES.................. 223
ANNEXE.......................................................................................................................... 225
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................ 237
LISTE DES FIGURES .................................................................................................... 255
LISTE DES TABLEAUX................................................................................................ 261
NOMENCLATURE......................................................................................................... 265
13
Rsum
Etudes physiologiques de ladaptation et de la rsistance de la levure S.cerevisiae au
cours de la production intensive dthanol
Dans le cadre de lintensification de la production dthanol par Saccharomyces cerevisiae,
une stratgie de fermentation alcoolique, qui a conduit un titre final en thanol de 120 147
g.l
-1
(15% 19 % v/v) en 45h, a t mise en place au sein du laboratoire. Une des
caractristiques de ce procd est de favoriser une phase de production dthanol dcouple
de la croissance cellulaire. La performance du procd dpend du maintien de lactivit
mtabolique des cellules aux fortes concentrations en thanol pendant cette phase. Durant ce
travail, ltat physiologique des levures pendant cette phase a pu tre caractris par
lintgration de donnes macrocintiques (taux de croissance, vitesse daccumulation,
rendement, productivit), microscopiques et mtaboliques. Cette tude a montr que
laccumulation de fortes concentrations en thanol provoque chez la levure un stress
environnemental et une perte de lintgrit membranaire. Une partie du contenu intracellulaire
se retrouve dans le milieu de culture. Ainsi, une part croissante de la population cellulaire du
fermenteur perd toute activit mtabolique. Les levures qui se maintiennent le plus longtemps
dans un tel environnement sont celles qui semblent acqurir un tat spcifique, proche dun
tat de quiescence.
Mots cl :
Fermentation alcoolique, Saccharomyces cerevisiae, tolrance lthanol, viabilit, lipides,
permabilit membranaire, physiologie
Physiologic study on yeast S.cerevisiae adaptation and resistance during intensive
production of ethanol
For ethanol intensive production with Saccharomyces cerevisiae, a specific alcoholic
fermentation strategy optimised in our laboratory leads to a production of 120 to 147 g.l
-1
of
ethanol (15 % to 19 % v/v) in 45h. At the end of the process, an ultimate phase allows
production of ethanol without biomass growth. The performance of the process depends on
maintaining the metabolic activity of cells exposed to high concentrations of ethanol during
this phase. During this work, the yeast physiology was characterized by integration of
macrokinetic (growth rate, ethanol production rate, yield, productivity), microscopic and
metabolic data. This work shows that intensive accumulation of ethanol induces an
environmental stress and a loss of membrane integrity in yeast. Part of the intracellular
content spreads in the culture medium. An increasing part of the cell population in the
fermentor loses their metabolic activity. Yeasts that are able to remain in such an extreme
environment seem to acquire a specific state, close to quiescent state.
Mots cl :
Alcoholic fermentation, Saccharomyces cerevisiae, ethanol tolerance, viability, lipids,
membrane permeability, physiology
14
15
Introduction gnrale
16
Introduction gnrale
17
Depuis une dizaine dannes, lUnion Europenne a revu totalement sa politique nergtique
et opte pour les nergies renouvelables. La directive 2003/30/CE vise promouvoir
lutilisation de biocarburants prsentant un double intrt : conomique (baisse de la
dpendance envers les pays dtenteurs des ressources fossiles, scurit dapprovisionnement,
valorisation des produits agricoles) et cologique (nergie renouvelable, rduction des gaz
effet de serre, impact environnemental des transports). Lthanol produit par fermentation
des sucres contenus dans des produits agricoles (betterave sucre, bl, mas, ), le plus
souvent par la levure Saccharomyces cerevisiae, fait partie des deux principales formes de
biocarburants encourages par lUnion Europenne (bio-thanol et bio-diesel). Il est
aujourdhui trs largement utilis au Brsil, o prs de 4,5 millions de vhicules lgers
fonctionnent avec un mlange riche en thanol (85%). La directive europenne vise
remplacer prs de 20% de la consommation europenne dessence et de diesel par du
biocarburant dici 2020. Il va donc falloir augmenter nos capacits de production pour
atteindre 9,3 millions de tonnes de bio-thanol dici 2010.
Ainsi, un effort particulier est fait sur la recherche de nouveaux procds plus performants,
notamment au niveau de la production dthanol par des microorganismes ou tape de
fermentation. Les performances des fermentations sont dpendantes de contraintes
technologiques (composition du substrat, taille de linstallation, difficult de mise en uvre et
de rcupration du produit ) et biologiques (notamment une inhibition par le produit form
lui-mme). Plusieurs stratgies ont dj permis dobtenir des titres en thanol, des rendements
et des productivits de plus en plus levs : une meilleure utilisation des sucres contenus dans
les substrats, des conditions de production mieux contrles, la conduite du procd (batch,
fed-batch, multi-tag, continu, continu recyclage.). Mais, lthanol devient, dans tous les
cas, toxique pour la cellule ce qui limite lobtention de productions forte concentration.
Ltude prsente ici se situe dans une logique de comprhension du phnomne de tolrance
lthanol de la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour raliser cette tude, nous avons choisi
dutiliser un procd de type fed-batch dvelopp au laboratoire (Alfenore et al. 2002) qui
nous a permis datteindre des concentrations comprises entre 120 et 147 g.l
-1
. Il sagit dun
procd relativement simple sur milieu synthtique optimis qui se caractrise par deux
phases distinctes :
Introduction gnrale
18
- Phase I : la production dthanol est couple la croissance
- Phase II : la croissance sarrte mais la production dthanol continue.
Cette dernire phase prsente un double intrt. Tout dabord, dun point de vue industriel, la
majorit des sucres consomms vont tre transforms en thanol. Dautre part, cest
lefficacit de production pendant cette phase qui semble dterminante dans la performance
du procd. Lefficacit de production pendant cette phase est lie la capacit pour la levure
de sadapter laccumulation dthanol.
De nombreux travaux ont dj t raliss pour essayer de comprendre le phnomne de
tolrance lthanol chez Saccharomyces cerevisiae. La diversit des conditions de cultures,
des souches, des mthodes utilises et enfin des phnomnes tudis ncessite tout dabord de
prciser la notion de tolrance lthanol. Il ny a pas de dfinition universelle, ni de
mthode unique pour la mesurer. La tolrance lthanol sera, pour nous, la capacit de la
levure sadapter et rsister leffet toxique de ce dernier, sachant que cette action peut
intervenir trois niveaux : linhibition de la croissance, linhibition de la production dthanol
et la perte de viabilit cellulaire. La littrature est trs exhaustive sur le sujet. Labondance des
donnes, parfois contradictoires, conduit des hypothses qui seront dveloppes dans ltude
Bibliographique (partie I).
Malgr labondance de la littrature, les mcanismes dadaptation de la levure des
concentrations toxiques en thanol, ne sont pas connus. Nous nous proposons ici daborder le
problme par une nouvelle approche. Cette tude se distingue des prcdents travaux sur deux
points. Nous tudions leffet de lthanol en condition de production et des concentrations
trs leves. Ce sont donc leffet dynamique de la production dthanol par la levure
Saccharomyces cerevisiae elle-mme et le comportement des levures en fin de fermentation
qui sont ici les points centraux de lanalyse et non leffet de lthanol ajout. Dautre part, le
milieu a t dfini pour viter toute carence nutritionnelle, les conditions sont matrises et
laccumulation de sous-produits est limite, contrairement aux fermentations nologiques,
brassicoles ou de production dthanol sur milieu complexe (mlasse, )
Mon travail a eu pour but dapporter une comprhension au phnomne dadaptation
de la levure Saccharomyces cerevisiae face sa production intensive dthanol afin
didentifier les processus physiologiques mis en uvre pour rsister laccumulation
dthanol et atteindre des performances de production de 147 g.l
-1
en 45 heures.
Introduction gnrale
19
En utilisant les diffrentes comptences du laboratoire, ltude sest construite autour de trois
niveaux dobservation. Au niveau du fermenteur, dans un premier temps, les donnes
macrocintiques permettent de quantifier les vitesses de consommation de substrat et de
production de produits et didentifier les diffrentes phases du processus de fermentation sur
lensemble des cellules. Au niveau de la cellule, diffrentes populations, en terme de viabilit
et de morphologie, sont mises en vidence par des analyses microscopiques quantitatives.
Enfin, lintrieur de la cellule, lanalyse du profil dexpression des gnes et de la
composition cellulaire en terme de lipides, de sucres paritaux, de sucres de rserves et des
principaux mtabolites intracellulaires rvle le comportement physiologique des levures dans
nos conditions de production intensive dthanol.
Les rsultats exprimentaux de cette thse ont dabord ncessit une approche
mthodologique approfondie pour obtenir des donnes quantitatives et fiables. Une partie
importante du travail a donc t consacre la slection et la mise au point de mthodes.
Pour le suivi des compositions lipidiques, les diffrentes mthodes testes et les critres de
choix, ainsi que les amliorations apportes sont dtailles dans la partie III.
La partie IV prsente le procd de fermentation et identifie le(s) paramtre(s) le(s) plus
important(s) pour la performance du procd de fermentation partir des donnes
macrocintiques obtenues pour quatre fermentations identiques lexception du mode
dapport de glucose, et ayant conduit des performances variables. Lobservation
microscopique des levures, couple aux donnes macrocintiques, nous a aussi permis de
mieux caractriser lvolution de la biomasse au cours de ce procd.
La rponse transcriptionnelle de la levure Saccharomyces cerevisiae, lors de la dynamique
daccumulation intensive dthanol produit au cours dune fermentation, a t dtermine par
la technologie des puces ADN. Le suivi cintique des profils dexpression de lensemble du
gnome, combin aux donnes de la littrature, a permis de mieux cerner des cibles
physiologiques potentielles de la rponse laccumulation dthanol dans nos conditions. Ces
donnes sont analyses dans la partie V.
Enfin, dans la partie VI, ltude se focalise sur lvolution des contenus intracellulaires des
diffrents lipides, des sucres de rserves et paritaux et de certains mtabolites glycolytiques
et nergtiques. Le suivi de la composition cellulaire met en vidence des changements
physiologiques lis laccumulation dthanol.
Introduction gnrale
20
Introduction gnrale
21
Partie I :
Etude bibliographie
Introduction gnrale
22
Partie I : Etude bibliographique
23
Dans les contextes cologique et conomique actuels, la production dthanol par voie
biologique connat un regain dintrt. Pourquoi Saccharomyces cerevisiae est-elle un
organisme de choix pour la production dthanol ? Quels sont les diffrents procds
envisags pour augmenter le titre final, le rendement ou la productivit ? Place dans les
bonnes conditions, avec le bon apport nutritionnel, la levure Saccharomyces cerevisiae peut
produire jusqu 20 GL (soit 20% v/v). Comme tout procd biotechnologique, il faut veiller
viter les inhibitions par le substrat et la formation de co-produits de fermentation. Mais
linhibition par lthanol produit est un frein majeur lobtention dun titre et dune
productivit leve en thanol. En effet, lthanol inhibe la croissance, la production dthanol
elle-mme et la viabilit. Aprs avoir dfini la notion de tolrance lthanol, je ferai un tour
dhorizon de la littrature qui nous donne des pistes sur les perturbations cellulaires
engendres par lthanol et sur les changements physiologiques et molculaires probablement
mis en place par la levure en rponse la prsence dthanol dans son environnement.
I. CHAPITRE 1 : Production microbienne de (bio-)thanol
Lutilisation de Saccharomyces cerevisiae pour la production dthanol comme produit
majoritaire a t fortement relance suite au contexte conomico-cologique actuel. En effet,
cet organisme eucaryote unicellulaire et non pathogne pour lhomme reprsente un modle
exprimental avec de nombreux avantages (la petite taille de son gnome, la facilit le
manipuler gntiquement, le squenage de son gnome en 1996 et labondance de la
littrature disponible). De plus, depuis des sicles, les proprits de fermentation de la levure
Saccharomyces cerevisiae sont utilises dans de nombreux procds de transformation :
vinification, brassage de la bire, Son utilisation pour la production dthanol-biocarburant
date de la fin du 19
me
sicle avec linvention de lautomobile. Dautres microorganismes,
dont Zymomonas mobilis, sont aussi de bons producteurs dthanol. Une multitude de
substrats dorigine vgtale, faible cot, peuvent tre ferments, du moment quils
contiennent une quantit importante de sucres assimilables. De plus, les outils de la gntique
permettent aujourdhui doptimiser les rendements dutilisation de la plante en tendant les
molcules assimilables. Aprs comparaison des diffrents procds de production, le
laboratoire a choisi de travailler sur la mise au point dun procd, appel bi-racteur
membrane.
24
I.1. Contexte conomique et environnemental
La production de biocarburants permet de rpondre lobjectif stratgique de diversifier nos
sources d'approvisionnement nergtique en dveloppant une nergie renouvelable partir de
matires agricoles (biomasse) produites en Europe. En effet, l'Union europenne connat une
dpendance nergtique croissante : aujourd'hui, nous dpendons 50 % des sources
d'nergie importes et, si rien n'est fait, ce pourcentage passera 70 % en 2030. Ds les
annes 1970, le souci de diversifier les sources dnergie devient une relle proccupation.
Les biocarburants ont tout dabord t carts car jugs peu rentables. Cependant, au vu de la
conjoncture conomique actuelle et du prix de plus en plus lev du ptrole, lthanol, produit
partir de la biomasse vgtale, apparat de plus en plus attrayant et a connu un regain
dintrt depuis les quinze dernires annes. Une tude, mene par lADEME et le ministre
de lindustrie, montre qu partir d'une unit d'nergie fossile 0,87 unit d'nergie est produite
sous forme d'essence, contre 2,05 sous forme d'thanol (ADEME/DIREM 2002). Les filires
biocarburants bnficient de plus de possibilits de progression significatives puisque
l'amlioration des techniques utilises, notamment lors de la fermentation et de la distillation,
permettrait de porter ce bilan nergtique de 2,05 3,3-3,5 dici 2009, alors que les marges de
progression sont moindres pour l'essence. L'tude montre aussi que pour chaque litre
d'essence remplac par un litre d'thanol, les missions de gaz effet de serre seraient rduites
de 75 % par rapport ce qu'aurait produit ce litre d'essence. Lutilisation dthanol permettrait
donc de rduire nos missions de gaz effet de serre, conformment aux engagements pris
dans le cadre du Protocole de Kyoto.
De nombreux progrs ont t raliss pour la rduction du cot des tapes des procds de
production d thanol partir de la biomasse (cf. Figure 1), notamment au niveau de ltape
de pr-traitement (cf. Figure 1). La distillation, qui tait au dpart une tape coteuse, a aussi
t fortement amliore (Wyman 2001). Les efforts de recherche se portent sur lamlioration
de ltape de fermentation, notamment par la recherche dorganismes ou de souches plus
rsistantes aux diffrents stress rencontrs lors de la fermentation alcoolique (temprature,
faible concentration en glucose, haute concentration en thanol). Des efforts sont aussi faits
pour diversifier les sources de carbones utilisables et amliorer les rendements, notamment
avec lutilisation des pentoses (Jeffries et Jin 2004).
25
Figure 1 : Schma regroupant les grandes tapes de lobtention dthanol biocarburant partir
de biomasse vgtale (Bothast et Schlicher 2005;Glazer et Nikaido 1993).
Les organismes les plus producteurs dthanol partir de sucres sont les levures de types
Saccharomyces ou Kluyveromyces et la bactrie Zymomonas mobilis. Au niveau mondial,
pour le moment, le bio-thanol est surtout produit partir de canne sucre au Brsil et de
mas aux USA. Le Brsil est le pays qui sinvestit le plus dans le bio-thanol, avec plus de
1 350 000 vhicules mixtes (qui peuvent fonctionner avec du carburant classique ou du
biocarburant) (Coelho 2005). Au niveau europen, la Directive europenne 2003/30/CE fixe
des objectifs de rfrence pour les biocarburants. Ceux-ci devront reprsenter 5,75% de
l'essence et du gazole mis la consommation d'ici 2010. La directive europenne 98/70/CE
rglemente lajout dthanol dans lessence sans modification des moteurs conventionnels :
soit sous forme dthanol hauteur de 5%, soit sous forme dETBE (Ethyl Tertio Butyl
Ether : additif lessence sous forme dester dthanol avec lisobutne) hauteur de 15 %.
I.2. Les microorganismes utiliss
Une grande varit de microorganismes produit de lthanol partir de polysaccharides.
Cependant peu sont rellement comptitifs en terme :
- de rendement en thanol par rapport au substrat consomm
- de capacit fermentaire
- de tolrance lthanol leve
- dadaptation aux conditions de fermentation
Etape 1
Etape 3
Culture
sucrire (canne
sucre)
Amidon (mas,
bl,sorgho, pomme
de terre, )
Lignocellulose
bois, dchets.)
Extraction du jus
par pressage
Hydrolyse
enzymatique
Broyage, vapeur
deau, Hydrolyse
acide, enzymatique
Fermentation : conversion des sucres
Rcupration de lthanol
Distillation
Dshydratation
Etape 1
Etape 2
Etape 3
Conversion de la biomasse en sucres
Culture
sucrire (canne
sucre)
Amidon (mas,
bl,sorgho, pomme
de terre, )
(rsidus agricoles,
Extraction du jus
par pressage
Hydrolyse
enzymatique
Broyage, vapeur
deau, Hydrolyse
acide, enzymatique
Dshydratation
26
Les levures (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces
pombe, Kluyveromyces sp.) et les bactries, comme Zymomonas mobilis, sont les plus
utilises, prsentant chacune des avantages et des dsavantages, notamment en fonction de la
composition du substrat et du procd employ. Les bactries produisent souvent dautres
sous-produits : dautres alcools, des acides organiques, des polyols, des ctones, ou des gaz
(mthane, dioxyde de carbone, hydrogne, ). Il existe quelques souches de Clostridium qui
peuvent avoir de bons rendements en thanol. Cependant, seule Zymomonas mobilis est
considre comme un strict producteur dthanol.
Dans les procds fermentaires utilisant la levure, loxygne est ncessaire pour des raisons
de maintenance de lintgrit cellulaire. Des conditions ares vont malheureusement
favoriser aussi la production de biomasse. Zymomonas prsente lavantage dtre anarobe
stricte et donc de produire peu de biomasse mais plus dthanol (Kosaric et Vardar-Sukan
2001c). Elle serait au moins aussi, voire plus, tolrante lthanol que Saccharomyces
cerevisiae suivant les souches (Glazer et Nikaido 1993). Zymomonas est trs efficace sur
glucose mais produit beaucoup de sous-produits lorsque le saccharose est la source de carbone
(notamment des acides organiques). Saccharomyces cerevisiae offre un plus large spectre
dutilisation de substrats. De plus, Saccharomyces cerevisiae est efficace en terme de
production dthanol bas pH (jusqu un pH de 4), ce qui vite les contaminations, alors que
la strilisation est encore ncessaire pour utiliser Zymomonas mobilis. Lutilisation de lun ou
de lautre de ces microorganismes va donc dpendre du substrat, de la facilit de mise en
uvre et surtout de la rentabilit totale du procd.
I.3. Les substrats utiliss
Les substrats utilisables pour la production dthanol sont trs varis : canne sucre, bl, riz,
mas, pomme de terre, sorgho, manioc Le choix va dpendre du cot et de la rentabilit du
procd.
Ces produits vgtaux dorigine agricole contiennent des rserves de glucides sous forme
damidon ou de saccharose. Les molcules damidon sont pralablement hydrolyses par voie
enzymatique le plus souvent, Saccharomyces cerevisiae ne possdant pas d-amylase
efficace. Les produits rsultant sont le glucose et le fructose, facilement assimilables par
Saccharomyces cerevisiae. Ce sont donc, en gnral les substrats riches en amidon et
saccharose qui sont privilgis pour la fermentation alcoolique.
27
Cependant, une part importante de la plante reste encore inexploite. Cest pourquoi, depuis
quelques annes, il a t envisag dutiliser aussi la lignocellulose, souvent abondamment
prsente dans les vgtaux. La lignocellulose se compose de molcules trs rsistantes qui
restent cependant plus difficiles hydrolyser en molcules assimilables par la levure. Elles
sont hydrolyses soit par hydrolyse acide, soit par hydrolyse enzymatique. Lhydrolyse de la
lignocellulose libre majoritairement du glucose, du galactose, du mannose, du xylose et de
larabinose. Or, Saccharomyces cerevisiae assimile peu ou pas les sucres cinq atomes de
carbones comme le xylose (Kosaric et Vardar-Sukan 2001b).
Pour palier leur dficience sur les sucres en C5, des approches dingnierie mtabolique
sont dveloppes pour lutilisation de composs lignocellulosiques :
- soit par intgration de gnes dutilisation des pentoses chez des microorganismes
producteurs dthanol : Saccharomyces cerevisiae (Jeffries et Jin 2004) ou Zymomonas
mobilis (Deanda et al. 1996;Gunasekaran et Chandra Raj 1999)
- soit en intgrant les gnes de production dthanol chez des organismes possdant les
enzymes pour mtaboliser ces composs (Ingram et al. 1998).
Ces modifications gntiques sont encore peu efficaces pour lactivit fermentaire et
demandent encore des amliorations. Une autre voie est lexploration et la comprhension du
mtabolisme de souches de levures peu connues qui fermentent naturellement le xylose
(comme Pichia stipitis) (Jeffries 2006).
Dans tous les cas, la production dthanol partir de produits vgtaux revient une
premire tape dhydrolyse en sucres monomriques facilement utilisables par le
microorganisme lors de ltape de fermentation. Le glucose, hexose majoritairement prsent,
peut donc servir de modle pour les tudes visant optimiser la production dthanol par voie
microbienne (cf. figure 1)
I.4. Les procds de fermentation alcoolique utilisant des levures
Avant ltape de fermentation, le substrat est dabord prpar (pressage, broyage,
vapocraquage, hydrolyse chimique ou enzymatique) afin den faire ressortir le jus qui pourra
tre ferment par les microorganismes (cf. figure 1). Des fermentations rapides avec des titres
et des rendements levs en thanol sont recherches pour minimiser les cots dexploitation
et lnergie ncessaire la distillation.
28
Dans cette partie, nous ne nous intresserons quaux procds technologiques de production
prioritaire dthanol par les levures, en faisant abstraction des mthodes usage agro-
alimentaire, comme la vinification et le brassage de la bire o de nombreuses autres
molcules sont galement produites (glycrol, actate, succinate, molcules aromatiques, ).
Lthanol en tant que molcule chimique est produit principalement par trois grands types de
procds : le batch, le fed-batch (ou semi-continu) et les procds continus. Les procds
batch et continu sont les plus utiliss lchelle industrielle.
I.4.i. Fermentation type batch
Cest le plus simple des procds utiliss en terme de mise en uvre et dinvestissement. Le
substrat et les levures sont initialement mis dans le racteur. Les fermentations se poursuivent
en gnral pendant 36 48h (Kosaric et Vardar-Sukan 2001a). Les performances dpendent
videmment des conditions de culture et des substrats utiliss. Les rendements de conversion
sont de lordre de 90 95% du rendement thorique pour une concentration finale en thanol
de 10 16 %(v/v) (environ 80 125 g.l
-1
) (Casey et Ingledew 1986). La productivit est en
moyenne assez faible sur tout le procd mais elle volue tout au long de la fermentation.
Un procd VHG (pour Very High Gravity) utilisant un substrat contenant plus de 300 g de
matires solides (origine : bl) par litre de milieu avec des enzymes de saccharification, a
permis datteindre des titre finaux maximum en thanol de 23,8 % v/v (environ 185 g.l
-1
) en
130 heures (Thomas et al. 1993).
Pour augmenter la productivit, les levures peuvent tre rcupres dun batch sur lautre : on
parle de batch recycl. La phase de latence peut ainsi tre rduite.
I.4.ii. Fermentation type fed-batch
Le fed-batch est un driv du batch, o le substrat est ajout au fur et mesure de la
fermentation, afin dviter les inhibitions par les substrats. La production dthanol se droule
selon deux phases : une phase de croissance cellulaire et de production dthanol et une phase
de production sans croissance.
Les concentrations finales en thanol peuvent atteindre 19% (v/v) (147 g.l
-1
) en 48h pour
Saccharomyces cerevisiae (Alfenore et al. 2002), ou 20,8 % (v/v) (environ en 160 g.l
-1
) en 20
jours pour Saccharomyces sake (Hayashida et Ohta 1981).
29
Lthanol peut tre retir au fur et mesure de sa production. Ainsi et grce un recyclage du
milieu de culture, Lu et al. (2003) ont atteint une productivit de 12 g dthanol.l
-1
.h
-1
.
I.4.iii. Fermentation type continu
A un tage
Le but est de bloquer les cellules en phase de croissance exponentielle et de production
dthanol. Cependant, le taux de production est difficile maintenir en raison de problmes de
stabilit du processus dans le temps (contamination, stabilit de la souche). La production
dthanol est aussi limite par une faible concentration en cellules et par linhibition par
lthanol lui-mme. La productivit dpend de lapport en substrat ; il convient donc de
trouver un optimum entre limitation et inhibition (Prenosil 1983).
A plusieurs tages
Plusieurs racteurs sont mis en cascade. A chaque tage, seffectue une phase diffrente de la
fermentation (croissance de la biomasse, production dthanol). Cette technique permet de
limiter linhibition par les produits finaux, daugmenter les titres de sortie en thanol et donc
la productivit (Maiorella et al. 1984). Une application dun procd continu plusieurs
tages (MCCF) conduit la production finale de 16,7 % (environ 130 g.l
-1
) dthanol
(Bayrock et Michael 2001).
A haute densit cellulaire et/ou recyclage de la biomasse
Pour augmenter la densit cellulaire, et donc la productivit, des systmes cellules recycles
sont utiliss. Il faut cependant purger une partie des cellules pour maintenir la viabilit
cellulaire. La concentration en biomasse peut atteindre jusqu plus de 100 g.l
-1
(Escobar et al.
2001), avec des productivits en thanol de lordre de 30-40 g.l
-1
.h
-1
(Ben Chaabane et al.
2006;del Rosario et al. 1979;Dellweg 1983;Prenosil 1983).
Dautres techniques consistent augmenter la productivit en soutirant lthanol au fur et
mesure de sa formation : soit par vaporation, soit par utilisation de membrane de dialyse,
mais son utilisation parat trop complexe pour une industrialisation.
Chaque type de procd prsente des avantages et des inconvnients. Les procds
discontinus sont faciles mettre en uvre et ont un faible cot dinvestissement. Mais la
productivit reste faible. Les procds continus permettent davoir des productivits plus
importantes mais connaissent des problmes de contamination et de stabilit de la souche dans
le temps, et de colmatage pour les procds cellules recycles (cf. tableau 1).
30
.
Tableau 1 : Principaux avantages, principaux inconvnients et ordre de grandeur de la
productivit atteinte par diffrents procds de production dthanol.
Avantages Inconvnients Productivit
g.l
-1
. h
-1
Batch
- Facilit dutilisation et de
mise en uvre
- Cot investissement
- Concentration finale en
thanol importante
- Phase de latence, faible
productivit,
- Temps de prparation et
de nettoyage important
2
Batch recycl
- Id batch mais phase de
latence raccourcie
- Temps de prparation et
de nettoyage important
15
Fed-batch ou
semi-continu
- Idem batch
- Limiter inhibition par le
substrat
- Productivit qui reste
faible
2-3
(1)
, 12
(2)
continu
- Gain de temps de
prparation
- Fermenteur souvent plus
petit
- Plus conomique
- Problme de stabilit
dans le temps :
contaminations, stabilit
des souches
- Faible concentration
cellulaire et en thanol
5
Continu haute
densit cellulaire
- Forte productivit
- Problme pour le
recyclage des cellules
(colmatage.)
40
(3)
Continu multi-
tag
- Sparation des tapes donc
limitation des inhibitions
- Beaucoup dquipement 12-18
(4)
Continu recycl
vaporation
biomasse
recycle
- Limite inhibition par thanol
- Forte productivit
- Problme pour le
recyclage des cellules
(colmatage.)
80
(5)
(1)
(Alfenore et al. 2002)
(2)
(Lu et al. 2003)
(3)
(Ben Chaabane et al. 2006;del Rosario et al. 1979)
(4)
(Bayrock et Michael 2001)
(5)
(Cysewski et Wilke 1978)
31
I.4.iv. Procd dtude dvelopp au sein du laboratoire Biotechnologie
Bioprocds
Chaque procd prsente des avantages et des inconvnients. Le choix dun type de procd
est un compromis entre le type de substrat, le cot dinvestissement et de fonctionnement, la
productivit et les rendements recherchs Le choix du laboratoire sest port sur un bio-
racteur bi-tag haute densit cellulaire (cf. figure 2) fonctionnant en continu avec
Saccharomyces cerevisiae comme organisme producteur afin doptimiser les rendements et la
productivit tout en minimisant les volumes traits (Ben Chaabane et al. 2006).
Figure 2 : a) schma de fonctionnement du BRM (Bi-Racteur Membrane),
s
: flux
dapport du substrat,
p
: flux de sortie du produit (thanol) ; b) rsultats cintiques dune
fermentation fed-batch avec lvolution de la viabilit (u ), de la vitesse spcifique de
production dthanol
p
( ) et du taux de croissance ( ) en fonction de la concentration
en thanol dans le milieu.
Un premier racteur R1 ar vise produire de la biomasse (Raction de croissance). Il
permet dobtenir des microorganismes dans un tat physiologique favorable la production
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 20 40 60 80 100 120 140 160
ethanol concentration g.l
-1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
g
r
o
w
t
h

r
a
t
e

h
-
1
e
t
h
a
n
o
l

p
r
o
d
u
c
t
i
o
n

r
a
t
e

g
.
g
-
1
.
h
-
1
,

v
i
a
b
i
l
i
t
y
Raction de croissance
Apport nutritionnel
Concentration en thanol
permissive
Aration
Raction de production
Faible aration
Concentrations en biomasse
et en produit leves
Gestion du dcs
purge
S

P
Boucle de rgnration
R1 R2
p
g
.
g
-
1
.
h
-
1
V
i
a
b
i
l
i
t
r
e
l
a
t
i
v
e
h
-
1
Ethanol g.l
-1
a)
b)
32
dthanol qui seffectuera dans le deuxime racteur R2 micro-ar (Raction de production),
limitant ainsi linhibition de la croissance par lthanol et lassimilation des vitamines. R2 est
coupl un systme de filtration tangentielle qui permet datteindre des hautes densits
cellulaires. La gestion de la viabilit et de lactivit des microorganismes est ralise par la
recirculation du milieu ractionnel de R2 vers R1. Lintrt dun tel systme est avant tout la
forte productivit lie la concentration en biomasse qui est trs leve. Il sagit donc
dobtenir de hautes concentrations en microorganismes actifs et viables dans les conditions de
concentrations en produit trs leves.
Les conditions optimales de fonctionnement de chaque tage peuvent tre dduites de ltude
dun systme de type fed-batch, plus facile mettre en uvre. En effet, dans ce type de
raction en continu, chaque tage du racteur est fig dans un tat de fonctionnement qui se
rapproche de ceux rencontrs dans une fermentation fed-batch (cf. figure 2). Dans le racteur
R1, ce sont des cellules en phase de croissance avec peu dthanol dans le milieu. Dans le
racteur R2, comme en fin de fermentation fed-batch, les cellules sont soumises un
environnement extrme. Les performances du procd dpendent donc en partie de la capacit
des levures tolrer les fortes concentrations en thanol. Dans le cadre du travail prsent
dans ce manuscrit, nous nous sommes focaliss sur le comportement des levures en fin de
fermentation fed-batch, afin de comprendre le phnomne dadaptation des levures aux hautes
concentrations en thanol.
II. CHAPITRE 2 : Gnralits sur la croissance des levures et la composition lipidique
des membranes
II.1. Les diffrents types de mtabolismes
II.1.i. Mtabolisme fermentaire
Comme il ny a pas chez la levure dautre accepteur dlectron que loxygne (O
2
), en
prsence de glucose et en absence doxygne, lATP ncessaire la cellule provient de la
production dthanol selon lquation suivante
C
6
H
12
O
6
+ 2 P
i
+ 2 ADP 2 C
2
H
6
O + 2 CO
2
+ 2 ATP
Le rendement thorique en thanol est de 0,51 g d'thanol par gramme de glucose consomm.
Cependant les ractions de maintenance, de synthse des infrastructures cellulaires et la
formation des composs secondaires (glycrol, acide actique, substances de rserve) limitent
33
ce rendement 80-90 % de sa valeur thorique. Le rendement en biomasse est de lordre de
0,10 g.g
-1
de glucose (Kappeli 1986).
En plus de lthanol, se forment dautres sous-produits dont le plus important est le glycrol.
Le but de la production de glycrol est de rquilibrer la balance rdox en rponse la
production de biomasse associe la raction fermentaire (Nevoigt et Stahl 1997;van Dijken
et Scheffers 1986).
II.1.ii. Mtabolisme oxydatif
En prsence doxygne, le glucose est en partie dgrad en H
2
O et CO
2
, aprs avoir emprunt
successivement la voie de la glycolyse, le cycle des acides tricarboxyliques et la chane
respiratoire, selon lquation bilan suivante :
C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
+ (4+12) P
i
+ (4+12) ADP 42 H
2
O + 6 CO
2
+ (4+12) ATP
Le rendement , aussi appel P/O car cest le nombre de moles dATP formes par mole
doxygne (1/2 O
2
) consomme, dpend de lefficacit de la chane respiratoire (Verduyn et
al. 1991). Le rendement P/O est en thorie de 1,5 mais in vivo, il est infrieur, de lordre de
1,2 1,3 (van Gulik et Heijnen 1995).
Au cours du mtabolisme oxydatif, une partie du glucose mtabolis gnre des
intermdiaires utiliss pour l'laboration de nouvelles cellules, en consommant lnergie
fournie par la chane respiratoire. Le rendement thorique en biomasse en conditions
oxydatives est denviron 0,5 g/g de glucose (Kappeli 1986).
Ce processus gnre beaucoup plus de moles d'ATP que lors de la fermentation.
II.1.iii. Orientation du mtabolisme et effet glucose
En anarobiose, la levure adopte un mtabolisme fermentaire indpendamment de la
concentration en substrat carbon. Cependant, des conditions danarobie stricte sont
difficiles mettre en place. La micro-aration est donc plus frquemment rencontre.
En prsence doxygne, cest le substrat carbon qui va tre dterminant dans l'orientation de
son mtabolisme. En mode batch sur glucose, la levure fermente, mme en prsence dO
2
. En
mode continu, les levures peuvent tre maintenues en rgime oxydatif des taux de dilution
trs faibles. Lorientation du mtabolisme est lie lefficacit glycolytique. Cest leffet
Crabtree. Certains avancent lhypothse que cest le flux glycolytique qui, lorsquil est trop
important sature la capacit respiratoire. Le surplus est rorient vers la production dthanol
34
(Sonnleitner et Kappeli 1986). Cependant des tudes plus rcentes montrent que le flux
travers le TCA est diminu en rgime oxydo-fermentaire par rapport un rgime purement
oxydatif (Frick et Wittmann 2005), concomitant une augmentation du flux glycolytique et
de la vitesse dassimilation du glucose. La baisse du flux au niveau du TCA pourrait tre due
la prsence de glucose qui induit la rpression dun certain nombre de gnes codant des
enzymes du TCA (Ronne 1995). Dautres gnes sont rprims au niveau transcriptionnel par
la prsence de glucose :
- Gnes de la gluconognse : FBP1 et PCK1
- Gnes codant des enzymes impliques dans la respiration
- Gnes codant des transporteurs et des enzymes dutilisation des autres sucres,
notamment les gnes MAL, SUC et GAL, dutilisation du maltose, du saccharose et du
galactose (Ronne 1995).
Bien que tout le phnomne ne soit pas encore lucid, le passage dun mtabolisme oxydatif
oxydo-fermentaire serait rgul au niveau traductionnel, mais aussi post-traductionnel
(Daran-Lapujade et al. 2004). Ce seraient les transporteurs de glucose qui serviraient de signal
de la prsence de glucose et induiraient ces rgulations (Carlson 1999).
II.2. Les principaux produits de la fermentation alcoolique
Les principaux produits de la fermentation alcoolique sont videmment lthanol et le dioxyde
de carbone. A eux deux, ils reprsentent entre 90 et 95% du glucose consomm. Le reste du
glucose est utilis lors de la croissance pour la production de biomasse et la production de
sous-produits. Les sous-produits majeurs de la fermentation alcoolique sont le glycrol, le
succinate et lactate (cf. figure 3) qui utilisent autour de 4 5% du substrat carbon restant
(Oura 1977). En plus petites quantits, peuvent tre aussi produits de lactaldhyde, des
acides gras (acide hexanoque, octanoque, dcanoque .. ), des alcools plus de deux
carbones.
35
Figure 3 : Schma rcapitulatif de la voie de production dthanol et des voies mtaboliques
annexes pouvant conduire la production de sous-produits.
II.3. Les exigences nutritionnelles
Les fermentations alcooliques se font sur des milieux riches en sucres. Saccharomyces
cerevisiae peut fermenter : le glucose, le maltose, le maltotriose, le trhalose, le galactose, le
mannose, le fructose, le saccharose, le raffinose. Elle ne fermente pas le lactose, le
melibiose, le cellobiose, le rhamnose, ni les sucres 5 atomes de carbones comme le xylose
ou larabinose (Jones et al. 1981)
L'azote, qui reprsente environ 10% du poids sec, joue un rle capital car il entre dans la
constitution de molcules simples (acides amins, nuclotides, vitamines et coenzymes)
Glucose
Fructose 1-6-P
Glycraldhyde-
3-P
Dihydroxy-
acttone-P
Glycrol
Pyruvate
Acetyl CoA
Actaldhyde
Ethanol
Actate
NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
Citrate
Isocitrate
-ctoglutarate
Succinate
Fumarate
Malate
oxaloactate
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
FADH
2
FAD
CO
2
Synthse acides
gras, strols
Acetyl CoA
Pyruvate
ATP
ADP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
H+
NAD
NADH
2
O
2
H
2
O
ATP
ADP
Chane
respiratoire
CYTOSOL
MITOCHONDRIE
Glucose
Fructose 1-6-P
Glycraldhyde-
3-P
Dihydroxy-
acttone-P
Glycrol
Pyruvate
Acetyl CoA
Actaldhyde
Ethanol
Actate
NADH
2
NAD NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
Citrate
Isocitrate
-ctoglutarate
Succinate
Fumarate
Malate
oxaloactate
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
FADH
2
FAD
FADH
2
FAD
CO
2
Synthse acides
gras, strols
Acetyl CoA
Pyruvate
ATP
ADP
ATP
ADP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
H+
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
O
2
H
2
O
O
2
H
2
O
ATP
ADP
ATP
ADP
Chane
respiratoire
CYTOSOL
MITOCHONDRIE
36
essentielles au fonctionnement cellulaire. La seule source d'azote minral utilisable par
Saccharomyces cerevisiae est l'ammonium (Jones et al. 1981).
Le phosphore se trouve principalement inclus dans les acides nucliques et les nuclotides di-
phosphate et tri-phosphate, mais aussi dans de nombreux constituants macromolculaires des
cellules, comme les phospholipides, ancres GPI, Le phosphore est assimilable par la levure
sous forme de phosphate par un mcanisme de transport actif (Jones et al. 1981).
Le soufre reprsente 0,4% du poids sec. Il peut tre assimil sous forme de mthionine ou
moindre cot de (NH
4
)
2
SO
4
(Jones et al. 1981).
Les oligo-lments sont essentiels tant sur le plan structural que catalytique. Les apports
minimaux en oligo-lments ncessaires la croissance et la production d'thanol par
Saccharomyces cerevisiae ont t dfinis (Suzuki et al. 1985).
Saccharomyces cerevisiae est incapable de synthtiser toutes les vitamines dont elle a besoin.
Par consquent, il est ncessaire de lui en apporter suffisamment. Les exigences vitaminiques
et les auxotrophies varient d'une souche l'autre. Les vitamines sont pour la plupart des
constituants des coenzymes ou des groupements prosthtiques denzymes :
- la biotine est implique dans le transport et lactivation du CO
2,
en tant que cofacteur
des enzymes de carboxylation
- le mso-inositol est un prcurseur de la synthse de lipides essentiels, tels que le
phosphatidyl-inositol et les sphingolipides
- l'acide nicotinique est un constituant du NAD, du NADP
- l'acide pantothnique est un constituant essentiel du CoenzymeA
- la pyridoxine se trouve dans les sites catalytiques denzymes et participe des
ractions de transamination et de dcarboxylation pour les mtabolismes des acides
amins, des lipides et des carbohydrates.
- la thiamine est un cofacteur des ractions de dcarboxylation
- lacide p-amino-benzoique est un coenzyme qui participe la synthse de purines et
des pyrimidines et de certains acides amins
L'oxygne joue un rle dans la production dthanol. Il va avoir une influence sur la
production de sous-produits. Plus le milieu va tre ar, moins il y a production de glycrol
37
(Alfenore et al. 2004;Kuriyama et Kobayashi 1993;Nissen et al. 2000). La production de
biomasse est fortement privilgie en conditions ares au dtriment du rendement
Y
ethanol/substrat
, mais le plus souvent en faveur dune meilleure productivit (Alfenore et al.
2004;Grosz et Stephanopoulos 1990;Ryu et al. 1984). La prsence doxygne aide aussi au
maintien de la viabilit et donc assure une meilleure tolrance lthanol, notamment par sa
participation au maintien de la composition lipidique des membranes. En absence doxygne,
il faut rajouter de lergostrol et des acides gras insaturs dans le milieu.
II.4. Les phnomnes dinhibition lors de la production dthanol
II.4.i. Par le substrat
De fortes concentrations en substrat induisent une inhibition de la croissance cellulaire et de la
capacit fermentaire. Linhibition de la capacit fermentaire devient significative entre 150 et
250 g.l
-1
de sucres, pour une inhibition complte rapporte 400 g.l
-1
de glucose, alors que
linhibition de la croissance commence des concentrations souvent plus faibles (Casey et
Ingledew 1986). Des concentrations en sucres suprieures 150 g.l
-1
inhibent gnralement
totalement la croissance cellulaire. Ce phnomne sexpliquerait par une inhibition des
enzymes de la glycolyse (Duntze et al. 1967) ou par une pression osmotique leve
accompagne d'une faible activit de l'eau (Nishino et al. 1985).
II.4.ii. Par les co-mtabolites produits
Leffet inhibiteur sur la croissance des principaux sous-produits a t test par Maiorella et al.
(1983) : acide actique, acide formique, acide lactique, actaldhyde, glycrol
(cf. tableau 2).
38
Tableau 2 : Concentrations inhibant 80% de la croissance cellulaire de Saccharomyces
cerevisiae pour les principaux sous-produits de la fermentation alcoolique (Maiorella et al.
1983) sur milieu synthtique glucose en mode continu pour la souche. Les sous-produits ont
t rajouts diffrentes concentrations dans lalimentation.
Sous-produit Concentration inhibitrice g.l
-1
Glycrol 450
Acide lactique 38
Acide actique 7,5
Actaldhyde 5
Acide formique 2,7
Linhibition de la croissance par les acides gras chane moyenne, tels que les acides
dcanoque et octanoque, est aussi connue notamment lors de fermentations nologiques
(Alexandre et al. 1998). Il semble y avoir une action nfaste sur le gradient de protons
transmembranaire. Lacide dcanoque induit une altration de la membrane en augmentant la
fluidit et donc linflux de proton (Alexandre et al. 1996).
Winter (1988) identifie les acides gras hexanoques, octanoques et dcanoques comme
principaux inhibiteurs en conditions de fermentation de type batch sur un milieu synthtique
proche de celui utilis dans notre tude. Il estime cette inhibition environ 1% par mg.l
-1
dacide gras, sachant que lacide dcanoque est plus toxique que loctanoque (Viegas et al.
1989). Il met aussi en vidence que la production de ces mtabolites peut-tre rduite de
manire importante par un apport adapt en vitamines.
II.4.iii. Par lthanol : notion de tolrance lthanol
L'effet ngatif de l'thanol se traduit par une inhibition gnrale de la cellule affectant aussi
bien la croissance cellulaire que la capacit fermentaire (D'Amore et Stewart 1987).
a. Sur la croissance cellulaire
Linhibition de la croissance par lthanol commence autour de 20 40 g.l
-1
(Casey et
Ingledew 1986). Chez Saccharomyces sp., la concentration inhibitrice (=0) pour la
croissance est de l'ordre de 70 110 g.l
-1
(Casey et Ingledew 1986) selon les souches et les
espces.
39
b. Sur la capacit fermentaire
Pour la production dthanol, la concentration inhibitrice peut aller jusqu plus de 20% (v/v)
pour Saccharomyces cerevisiae sake (Hayashida et Ohta 1981).
Linhibition par lthanol sur la capacit fermentaire est moins importante que sur la
croissance cellulaire. En effet, la production dthanol peut se poursuivre une fois la
croissance arrte.
c. Sur la viabilit
Leffet de lthanol sur la viabilit cellulaire ne se fait sentir que pour des concentrations plus
importantes que celles provoquant larrt de la croissance (Casey et Ingledew
1986;Kalmokoff et Ingledew 1985).
d. Modle dinhibition
Plusieurs modles peuvent tre proposs pour modliser ces inhibitions :
- modle linaire : ( )
Pcrit
Pi
G G = 1 max
- modle exponentiel : ( )
e
G G
kPi
= max
- modle hyperbolique : ( )
Pi Ki
Ki
G G
+
= max
O G est la grandeur tudie : soit le taux de croissance, soit la capacit fermentaire, soit la
viabilit. P
i
est la concentration en thanol et G
max
est cette mme grandeur pour P
i
=0 . P
crit
est
la concentration en thanol o la croissance est totalement inhibe. K et K
i
sont des constantes
dinhibition.
Il a t dcrit des relations, le plus souvent linaires, mais aussi exponentielles pour
linhibition de la croissance et de la capacit fermentaire (Casey et Ingledew 1986) et une
inhibition de type exponentiel pour la viabilit (Kalmokoff et Ingledew 1985).
e. Notion de tolrance lthanol :
Le phnomne de tolrance l'thanol est particulirement dlicat tudier dans la mesure o
il n'existe pas de technique universelle permettant de le quantifier. Certains auteurs s'appuient
40
sur les valeurs relatives la croissance cellulaire (Beavan et al. 1982;Thomas et Rose 1979),
la vitesse spcifique de production de l'thanol (Thomas et Rose 1979)ou encore la
viabilit cellulaire (Birch et Walker 2000;Dombek et Ingram 1987). Il est aussi possible
d'tudier le flux de protons travers la membrane plasmique (Jimnez et van Uden 1985).
En conclusion, la tolrance lthanol dpend du paramtre auquel on se rfre. Dans
cette tude, la tolrance lthanol sera dfinie comme la capacit des levures
maintenir leur viabilit de fortes concentrations en thanol.
f. Facteur influenant la tolrance lthanol
Dans ce cas, de nombreux facteurs peuvent influer sur la tolrance lthanol :
- La temprature : Plus la temprature de fermentation est leve (30-40C), plus la
croissance, la viabilit et la production dthanol sont sensibles lthanol (Aldiguier et
al. 2004;Casey et Ingledew 1986;D'Amore et Stewart 1987).
- Laration : laugmentation de laration amliorerait les vitesses de production
dthanol et diminuerait leffet inhibiteur de lthanol sur la croissance en condition de
production dthanol (Casey et Ingledew 1986). Leffet inhibiteur de lthanol ajout sur
le taux de croissance et la vitesse spcifique de production
p
dpend aussi des
conditions daration . Pour ces deux paramtres, leffet inhibiteur de lthanol diminue
en condition arobie par rapport lanarobiose (Aguilera et Benitez 1985). La prsence
de mitochondries et dun mtabolisme oxydatif actif dans les cellules semblent
essentiels au maintien dune plus faible inhibition par lthanol (Aguilera et Benitez
1985). De plus, loxygne est ncessaire la levure pour la synthse de certains
composs amliorant sa tolrance lthanol (acides gras insaturs, strols.)
- La composition du milieu : l'apport dans le milieu et la composition cellulaire en
lipides ont un impact sur la tolrance lthanol, tout comme loptimisation de lapport
en vitamines, surtout la biotine (Alfenore et al. 2002).
Lthanol est connu pour avoir un effet inhibiteur sur des enzymes, notamment celles de la
glycolyse (Pascual et al. 1988), mais cest surtout la membrane qui semble tre la plus
affecte.
41
II.5. Constitution et proprits de la membrane plasmique
La levure de boulanger est constitue de protines (45-60%), de carbohydrates (25-35%), de
lipides (5-15%) et de cendres (6-9%) (kockova-kratochvilova 1990). La composition des
levures en lipides varient beaucoup, en fonction de lespce (levure lipogne ou non), des
conditions de culture, de la composition des milieux et de la mthode de mesure (Sajbidor
1997), pouvant atteindre jusqu 80% pour certaines levures lipognes.
Pour Saccharomyces cerevisiae, les teneurs en lipides rpertories par Rattray (1988) vont de
3,5% 14,7% selon les souches et les conditions environnementales. Les lipides se retrouvent
surtout au niveau des membranes, mais peuvent aussi se retrouver au sein de particules de
lipides dans le cytosol. Ces particules de lipides sont constitues dun noyau de triglycrides
et desters de strols entour dune mono-couche de phospholipides dans laquelle se retrouve
quelques protines (Daum et al. 1998).
Toutes les membranes biologiques sont structures selon le mme modle : une bicouche de
phospholipides dans laquelle sont enchsses des molcules plus ou moins hydrophiles ou
hydrophobes. Ces molcules sont dautres lipides (strols, glycrides,.), des protines
membranaires et des parties glucidiques pour la plupart ancres sur des protines ou des
lipides. Les parties hydrophiles sorientent vers lextrieur de la membrane et les parties
hydrophobes vers lintrieur de la bicouche lipidique.
Les membranes:
- servent de barrire entre lintrieur et lextrieur de la cellule (membrane
plasmique) ou entre le cytosol et lintrieur des diffrentes organelles.
- contiennent des protines qui servent de transporteurs spcifiques, de senseurs, de
facteurs de transmission de signaux et qui interviennent dans des voies de
remodelage de la membrane
- exposent leur surface des rcepteurs qui participent au processus de
reconnaissance.
42
II.5.i. Les diffrents lipides et leur rle
a. Les acides gras et esters dacides gras
Les acides gras les plus prsents chez la levure sont les acides gras comportant 16 et 18
atomes de carbone. Le nombre de carbones est gnralement pair et compris entre 10 et 20.
Nanmoins, des acides gras avec un nombre impair datomes de carbone et des acides gras
allant de 6 26 atomes de carbone ont t identifis plus rarement (Daum et al. 1998). Les
acides gras insaturs les plus frquemment rencontrs sont : le C14:1 (cis 9), le C16:1 (cis 9),
le C18:1 (cis 9), le C18:2 (cis 9,12), le C18:3 (cis 9, 12, 15) (Pour les noms des acides gras se
rapporter au tableau 3). Les C16:1 et C18:1 reprsentent environ 80-90% des acides gras
totaux et les C16:0 et C18:0 entre 15 et 20%. Le reste est souvent infrieur 1% (Arnold
1980).
On peut aussi rencontrer dautres types dacides, comme lacide cyclopropne et lacide
cyclopropane, acides gras avec chanes carbones ramifies mais en trs petites quantits par
rapport aux autres dcrits ci-dessus.
Ils existent sous forme libre dans les cellules mais sont le plus souvent engags dans des
liaisons esters au sein des phospholipides, des mono-, di-, triglycrides et des esters de strols,
ou des liaisons amides dans le cas des sphingolipides. Les acides gras sont donc parmi les
premires molcules essentielles la structuration cellulaire. Lacide gras le plus rpandu
dans la famille des triglycrides est souvent lacide palmitique (C16:0), alors que pour les
esters de strols, lacide palmitolique (C16:1) et lacide olique (C18:1) sont souvent
prsents en grande quantit.
Les teneurs des diffrents acides gras varient selon les conditions de culture mais aussi selon
le genre et lespce pour des cultures ralises dans les mmes conditions. Le profil en acides
gras peut ainsi tre utilis en taxonomie (Rozs 1992).
La prsence doxygne est essentielle la synthse dacides gras insaturs. Il intervient au
niveau de lajout dune insaturation sur un ester CoA dacide gras satur par une dsaturase
(Ole1). L'apport en acide olique dans le milieu est essentiel pour une croissance en
anarobiose (Parks 1978).
43
Tableau 3 : Nom commun et systmatique des diffrents acides gras saturs et insaturs
prsents chez la levure.
Nombre carbones :
nombre insaturation
Nomcommun Nomsystmatique
6:0 Ac. caproque Ac. hexanoque
8:0 Ac. caprylique Ac. octanoque
10:0 Ac. caprique Ac. decanoque
12:0 Ac. laurique Ac. dodcanoque
14:0 Ac. myristique Ac. tetradecanoque
16:0 Ac. palmitique Ac. hexadcanoque
18:0 Ac. starique Ac. octadcanoque
Saturs
20:0 Ac. arachidique Ac. eicosanoque
14:1 (cis9) Ac. myristolique Ac. cis
9
ttradcanoque
16:1 (cis9) Ac. palmitolique Ac. cis
9
hexadcnoque
18:1 (cis9) Ac. olique Ac. cis
9
octadcnoque
18:2 (cis9,12) Ac. linolique Ac. cis
9,12
octadcadinoque
Insaturs
18:3 (cis9,12,15) Ac. linolnique Ac. cis
9,12,15
octadcatrinoque
b. Les glycrophospholipides
Sept glycrophospholipides (phospholipides) diffrents sont majoritairement rencontrs chez
Saccharomyces cerevisiae (cf. figure 4). Ce sont les constituants essentiels des membranes
biologiques. Ce sont eux qui forment la bicouche lipidique de la membrane plasmique. La
partie polaire est lextrieur de la bicouche et la partie hydrophobe est lintrieur. Ils
reprsentent entre 25 et 65% des lipides totaux et se rpartissent comme indiqu dans le
tableau 4. Sont aussi prsents en faible quantit les intermdiaires de la synthse de
phospholipides.
Les glycrophospholipides sont de la forme dcrite dans la figure 4 :
44
Figure 4 : Structure des diffrents phospholipides.
Les interactions entre phospholipides et protines et entre phospholipides et strols
influencent la structure et lactivit de la membrane. Suivant le type de phospholipides, les
parties polaires sont charges diffremment, donc la membrane va tre plus ou moins charge
suivant sa composition en phospholipides. La choline et lthanolamine donnent une charge
globale neutre (swittrion), alors que lacide phosphatidique, le phosphatidyl-glycrol et la
phosphatidyl-srine ont une charge ngative (anion). La phosphatidyl-choline est
frquemment le phospholipide le plus abondant (cf. tableau 4).
Acide gras 1
Acide gras 2
Partie hydrophile
Partie hydrophobe
R=
Phosphatidylcholine PC
Phosphatidylethanolamine PE
Phosphatidylinositol PI
Phosphatidylsrine PS
PG Phosphatidyglycerol
Cardiolipides CL
Acide phosphatidique PA
Acide gras 1
Acide gras 2
Acide gras 1
Acide gras 2
Partie hydrophile
Partie hydrophobe
R=
Phosphatidylcholine PC
Phosphatidylethanolamine PE
Phosphatidylinositol PI
Phosphatidylsrine PS
PG Phosphatidyglycerol
Cardiolipides CL
Acide phosphatidique PA
45
Tableau 4 : Teneur relative moyenne des diffrents phospholipides par rapport aux
phospholipides totaux.
Le phosphatidyl-inositol est un phospholipide essentiel probablement pour son rle dans la
signalisation cellulaire et comme senseur membranaire (Daum et al. 1998). Le phosphatidyl-
inositol participe la synthse des ancres GPI pour lancrage de nombreuses protines et la
synthse des sphingolipides.
La phosphatidyl-thanolamine, la phosphatidyl-choline et le phosphatidyl-inositol sont trs
prsents dans la membrane plasmique et dans lensemble des membranes subcellulaires. Par
contre, la phosphatidyl-thanolamine et les cardiolipides sont majoritairement prsents dans la
membrane plasmique et la membrane interne des mitochondries (Daum et al. 1998).
c. Les mono-, di- et triglycrides
Il sagit dune molcule de glycrol estrifie par un, deux ou trois acides gras.
Le triglycride est le glycride le plus prsent dans les levures (en gnral entre 7 et 15% des
lipides totaux pour Saccharomyces cerevisiae). Son rle nest pas clairement connu : il est
suppos servir de stockage dnergie et dacides gras. Il est prsent au sein de la membrane
plasmique et des membranes vacuolaires chez Saccharomyces cerevisiae (Rattray 1988). Une
partie peut saccumuler sous forme de granules. En cas daccumulation de triglycrides, ils
peuvent servir de prcurseurs aux phospholipides (Rattray 1988).
Les mono- et di-glycrides sont normalement beaucoup moins prsents dans les extraits
lipidiques des levures mais sont des constituants essentiels car intermdiaires dans la synthse
des triglycrides et des phospholipides.
% of total
phospholipids
Phosphatidylcholine PC 20-50
Phosphatidylethanolamine
PE
15-40
Phosphatidylinositol PI 10-40
Phosphatidyls rine PS 5-15
Phosphatidyglycerol PG < 3
Autres (cardiolipides )
% of total
phospholipids
Phosphatidylcholine PC 20-50
PE
15-40
Phosphatidylinositol PI 10-40
Phosphatidyls rine PS 5-15
Phosphatidyglycerol PG < 3
Autres (cardiolipides )
Phospholipides
% of total
phospholipids
% of total
phospholipids
20-50 20-50
PE
PE
15-40 15-40
Phosphatidylinositol PI Phosphatidylinositol PI 10-40 10-40
Phosphatidyls rine PS Phosphatidyls rine PS 5-15 5-15
Phosphatidyglycerol PG Phosphatidyglycerol PG < 3 < 3
Autres (cardiolipides ) Autres (cardiolipides )
< 20
% des phospholipides
totaux
46
d. Les strols
Les strols sont des constituants essentiels des membranes biologiques. Ils reprsentent en
gnral entre 0,1 et 1% du poids sec cellulaire. Lergostrol prsent plus de 90% est le
principal strol libre chez la levure (Rattray 1988). Les autres sont essentiellement des
intermdiaires entre le squalne et lergostrol (notamment le lanostrol). Ces strols libres se
retrouvent essentiellement au niveau des membranes, avec un ratio strols:phospholipides
gnralement compris entre 0,4 et 0,8. Les strols se caractrisent par une structure plane au
niveau des cycles, avec une extrmit (en du C3) une fonction hydroxyde non estrifie et
de lautre (C24) une longue chane carbone qui peut interagir avec les chanes carbones des
acides gras des phospholipides (cf. figure 5). Les strols libres ont probablement un rle
structural au sein des membranes, et en modifient ainsi considrablement les proprits. Ils
influenceraient ainsi la fluidit et la permabilit de la membrane, et par la mme occasion
lactivit des enzymes membranaires. Les strols vont condenser les phospholipides et donc
diminuer la fluidit de la membrane (Bottema et al. 1985).
Les teneurs en strols de la levure vont dpendre de la disponibilit de loxygne, des
conditions de culture dont la temprature, du milieu de culture et bien sur de la souche utilise
(Parks 1978). Le principal facteur influenant la composition en strols est laration.
Lergostrol nest pas synthtis en anarobiose, la prsence dergostrol dans le milieu est
donc essentielle pour assurer une croissance. En effet, loxygne intervient au niveau
de (Aries et Kirsop 1977;Aries et Kirsop 1978):
- la rgulation de la transcription des enzymes intervenant dans la conversion du 3-
hydroxy-3methyl-glutaryl CoA en acide mvalonique
- la cyclisation du squalne en lanostrol
- la dmthylation et dsaturation du lanostrol en ergostrol.
47
Figure 5 : Principaux intermdiaires de la voie de synthse de lergostrol. Dans lordre de la
voie de synthse, a) acide mvalonique, b) squalne, c) lanostrol, d) zymostrol, e)
5,7,24(28)-ergostatrienol, f) 5 ,7,22,24(28)-ergostatetraenol, g) ergostrol.
Plusieurs strols se retrouvent communment sous forme estrifie avec un acide gras :
essentiellement lergostrol, le zymostrol, le 5 ,7,24(28)-ergostatetrienol et le 5 ,7,22,24(28)-
ergostatetraenol. La diminution du taux de croissance semble tre un facteur daccumulation
des esters de strols chez Saccharomyces cerevisiae, ainsi que le passage en phase
stationnaire, la sporulation, la disponibilit en oxygne, certaines carences nutritionnelles
(glucose, phosphate) (Rattray 1988;Sandager et al. 2002). Les esters de strol sont
essentiellement localiss dans des vsicules de stockage de lipides, mais peu ou pas dans les
membranes. Cette observation suggre que les esters de strol servent de rserves dacides
gras et dintermdiaires de la synthse des strols libres, et vitent ainsi leur accumulation qui
peut tre toxique. La partie acide gras peut alors aussi tre utilise pour la synthse des
composants membranaires (Rattray 1988).
48
P-Inositol
P-Inositol-Mannose
P-Inositol-Mannose-P-Inositol
IPC
MIPC
M(IP)2C
e. Glycolipides et sphingolipides
Les glycolipides sont des lipides (diglycrides, strols) prsentant une ou plusieurs
glycosylations la surface de la membrane.
Les sphingolipides sont des composants essentiels des membranes des levures. Ils peuvent
reprsenter jusqu 30% des phospholipides totaux et 7% de la masse de la membrane
plasmique. Ils sont prsents en plus faible quantit dans les mitochondries (Patton et Lester
1991). Chez la levure, ils ont la structure dcrite dans la figure 6 :
Figure 6 : Structures des principaux sphingolipides. (van der Rest et al. 1995)
Les sphingolipides semblent jouer dabord un rle structural dans les membranes au mme
titre que les autres lipides. Ils joueraient aussi un rle de signal molculaire en rponse un
choc temprature (Dickson et al. 1997;Dickson et Lester 2002). Ils seraient aussi impliqus
dans les phnomnes dendocytose et dexocytose, de contrle de la croissance cellulaire, de
maintien de lintgrit cellulaire et de longvit cellulaire. Associs des strols, les
sphingolipides joueraient un rle de mdiateurs dans la transduction du signal et le bon
adressage la membrane plasmique de certaines protines (Ex :Gas1p, Pma1p, Nce2p)
(Dickson et al. 2006;Dickson et Lester 2002). En effet, les mannoprotines peuvent tre
49
ancres la membrane par lintermdiaire dune partie lipidique appele ancre GPI
(cf. figure 7).
Figure 7 : Structure des ancres GPI (Glycosylated Phosphatidyl-Inositol) rencontres pour les
protines de Saccharomyces cerevisiae (Fankhauser et al. 1993). La partie lipidique est le plus
souvent un cramide. Il y a en gnral quatre mannoses (M1 M4). M5 est optionnel en
(1-2) ou (1-3).
Certains sphingolipides sont aussi requis pour que lATPase vacuolaire soit fonctionnelle
(Chung et al. 2003).
II.5.ii. Effet de la structure des lipides sur les proprits membranaires
Les membranes ne sont pas des structures rigides. La bicouche lipidique constitue la fois
une structure suffisamment solide pour maintenir lintgrit cellulaire mais aussi assez fluide
pour permettre les mouvements des protines transmembranaires et membranaires et dautres
molcules. Les diffrents lments de la membrane bougent les uns par rapport aux autres. La
cohsion de la bicouche est assure par deux types dinteractions (cf. tableau 5) :
- les liaisons hydrognes : entre les parties polaires, soit directement entre les
phospholipides, soit par lintermdiaire de molcules deau
- les interactions de type Van der Walls entre les chanes carbones.
50
Tableau 5 : Nature et force des interactions au sein des membranes
Une membrane est donc caractrise par un quilibre entre les forces hydrophiles et
hydrophobes. Ces forces dpendent de la taille et de la charge de la partie polaire, de la
longueur, du nombre dinsaturations et de mthylations de la chane carbone.
A la temprature physiologique, la structure de la membrane biologique nest ni liquide ni
solide. Cet tat particulier de la matire est appel cristal liquide (Beney et Gervais 2001) :
cristal car ldifice est hautement organis et liquide car il confre la membrane sa
fluidit.
a. La fluidit membranaire
La fluidit de la membrane est la capacit des diffrentes molcules pouvoir se dplacer les
unes par rapport aux autres dans une mme couche (horizontalement).
Les interactions qui stabilisent le cur de la membrane concernent les parties apolaires des
constituants membranaires, il sagit de liaisons lectrostatiques de type Van de Walls, qui sont
beaucoup moins fortes que les liaisons qui unissent les ttes polaires et elles varient fortement
avec la distance entre les molcules (la force de linteraction est inversement proportionnelle
la distance puissance douze).
La nature hydrophobe de ces interactions est une barrire la diffusion passive des ions et aux
molcules polaires (Beney et Gervais 2001).
La labilit des interactions assure une fluidit plus forte au sein de la membrane qu
lextrieur ce qui permet le positionnement et lactivit enzymatique ou de transport des
protines intrinsques.
Les principaux facteurs agissant sur ces interactions sont :
- la prsence de chanes insatures car la prsence de doubles liaisons principalement de
configuration cis a pour effet dcarter les chanes hydrocarbones et donc de
diminuer les interactions de van der Walls.
- la prsence de strols : Les strols sintercalent dans la membrane et vont avoir
tendance en diminuer la fluidit. La configuration plane et volumineuse du noyau
strode et sa rigidit tend compresser les chanes aliphatiques des lipides
Partie de la molcule Nature de linteraction
lectrostatique
Ordre de grandeur de
lnergie dinteraction
ttes polaires Liaisons hydrognes 5 30 KJ/mol
chanes hydrocarbones Interaction de Van der Walls
diple instantan/diple induit
1 5 KJ/mol
51
environnants ce qui augmente la force des liaisons entre ces chanes (Bottema et al.
1985). Cet effet se rpercute jusquau carbone C
8
des phospholipides. Au-del de ce
carbone, la courte chane aliphatique des strols va avoir tendance augmenter la
fluidit entre les chanes des phospholipides adjacentes. Cet effet est plus important
lorsque la chane du strol est insature (comme cest le cas chez lergostrol qui est le
principal composant strode de la membrane de S. cerevisiae ou le stigmastrol) que
lorsque la chane est linaire (comme chez le cholestrol ou le campestrol). La
prsence dergostrol a donc tendance rigidifier la membrane.
- Les lipides longue chane diminuent la fluidit de la membrane : en effet, plus la
chane aliphatique des phospholipides est longue, plus les interactions de van der
Walls sont importantes et vont rigidifier la membrane.
b. La permabilit
La permabilit est la proprit que possde la surface cellulaire d'absorber directement des
substances du milieu extracellulaire et d'y liminer d'autres substances. Elle peut prendre deux
formes.
1. La permabilit passive ou diffusion. Elle dpend uniquement des lois physico-
chimiques et ne ncessite pas l'intervention active de la cellule. Le passage dun ct
lautre de la membrane suit les lois de la thermodynamique. On en distingue deux types :
La diffusion simple : elle nimplique aucun transporteur spcifique et dpend
du gradient de concentration, de lpaisseur et de la composition de la membrane, de
la taille de la molcule, du degr dionisation et de la liposolubilit : cest le cas des
molcules telles que les gaz (O
2
, N
2
, CO
2
), H
2
O, des petites molcules polaires non
charges (ure, )
La diffusion facilite : elle concerne la permabilit de diverses molcules
polaires (oses, ions, acides amins) qui passent travers la membrane plasmique sous
l'effet du gradient de concentration. Ces substances sont prises en charge par des
transporteurs (permases) qui les dlivrent l'intrieur de la cellule. Il s'agit d'un
mcanisme saturable.
2. La permabilit active ou transport actif. Celui-ci implique la participation de la cellule par
un apport d'nergie mtabolique. Ce mcanisme permet le transport contre le gradient de
52
concentration. Ce transport, relativement spcifique une molcule ou une famille de
molcules, se fait par laction dune enzyme dont lactivit est fortement dpendante de la
structure de la membrane. Le plus souvent, lnergie ncessaire est apporte par couplage
avec une molcule dATP (ABC transporteur, ATPase)
Les diffrentes proprits de la membrane, ainsi que leur composition lipidique sont
modifies en prsence dthanol. La membrane est-elle la seule cible de laction de
l thanol ? Comment se manifeste leffet toxique de lthanol sur la cellule? Et comment va
ragir la cellule ?
III. CHAPITRE 3 : Effet de lthanol sur les cellules de Saccharomyces cerevisiae
III.1. Effet direct de l'thanol :
III.1.i. Ethanol intracellulaire et extracellulaire :
La tolrance lthanol est en gnral dtermine pour de lthanol ajout, or il est souvent
dcrit que lthanol produit serait plus toxique que lthanol ajout sur la croissance cellulaire
(Casey et Ingledew 1986;D'Amore et al. 1990;Novak et al. 1981).
Une des hypothses pour expliquer la diffrence de toxicit entre lthanol ajout et produit
est laccumulation intracellulaire dthanol pendant la fermentation. Cependant, cette ide a
t contredite par dautres travaux (Dombek et Ingram 1986;Guijarro et Lagunas 1984) qui
trouvent des concentrations similaires en intracellulaire et en extracellulaire. Les artefacts des
travaux antrieurs seraient probablement dus la mthodologie employe pour le dosage de
lthanol intracellulaire.
Des travaux plus rcents utilisant une mthode adapte montrent une accumulation dthanol
intracellulaire en dbut de fermentation. Les concentrations entre thanol intracellulaire et
extracellulaire squilibrent au fur et mesure de lavancement de la fermentation (D'Amore
et al. 1988) (ds 15-20 g.l
-1
dthanol). Dombek et Ingram (1986) nont en effet travaill
quaprs 12 h de fermentation, moment o il ny a plus de diffrence entre thanol intra et
extracellulaire. Mais DAmore et al. (1988) nuancent leur conclusion, en laissant entrevoir de
possibles erreurs dues des concentrations trs faibles en thanol en dbut de fermentation et
un faible nombre de cellules. Par contre, Guijaro et Lagunas (1984) affirment que lthanol
pntre au travers des membranes par simple diffusion, sans utilisation dun transporteur. Ils
53
avancent plusieurs arguments pour cela : lquilibre entre lintrieur et lextrieur est
rapidement atteint et les vitesses dinflux et defflux dthanol sont insensibles au changement
de pH, la prsence danalogues structuraux de lthanol et dinhibiteurs de protines. Leffet
de laccumulation dthanol na donc pas pu tre clairement dmontr.
Une autre hypothse pour expliquer leffet plus toxique de lthanol produit est
laccumulation de sous-produits inhibiteurs pendant la fermentation et les changements de
conditions de culture (limitation nutritionnelle, pression osmotique) qui vont aussi avoir
une influence sur la croissance cellulaire (Casey et Ingledew 1986).
III.1.ii. Effet de lthanol sur les enzymes glycolytiques
Les enzymes les plus sensibles in vitro lthanol semblent tre : la phosphoglycrate kinase,
la phosphoglycrate mutase et la pyruvate dcarboxylase (Millar et al. 1982) pour des
concentrations en thanol infrieures 10% (v/v). Pour les autres enzymes de la glycolyse les
auteurs semblent saccorder sur le fait quil ny a pas dinhibition significative jusqu
pratiquement 12% (v/v) (Millar et al. 1982;Pascual et al. 1988).
Pour la majorit des enzymes glycolytiques, il semblerait y avoir une inhibition non-
comptitive, cest--dire que lthanol ne prend pas la place du substrat sur son site de
fixation, mais agit de manire plus gnrale sur la structure de lenzyme (Millar et al. 1982).
III.1.iii. Perturbation des transports et de la rgulation de lhomostasie
En utilisant le D-xylose (analogue non mtabolisable du glucose), Leao et van Uden (1982)
ont tudi leffet de lthanol et dautres alcools sur le transport de glucose. Aucun alcool ne
change laffinit du transporteur. Par contre, la vitesse maximale dassimilation dcrot avec
laugmentation de la concentration en alcool selon la relation :
S Km
S
e
V v
kx
+
=
.
0
max
V
0
max
= Vitesse maximale dassimilation en absence dthanol
,
x=concentration en alcool,
k=constante dinhibition, Km = constante daffinit et S= concentration en substrat
De plus, il existe une corrlation entre la constante dinhibition de chaque alcool et le
coefficient de rpartition entre la membrane et le tampon. Le degr dinhibition de chaque
54
alcool est dpendent de la solubilit de lalcool dans les lipides membranaires et de leur
volume molculaire (cf. figure 8). Leao et van Uden (1982) ont conclu que les alcools
inhibent le transport du glucose par changement de lenvironnement lipidique de la
membrane. Du fait de la perturbation des membranes cellulaires par lthanol, les systmes de
transport sen trouvent profondment perturbs.
Figure 8 : Relation entre la concentration en alcool qui inhibe de 50% lactivit du
transporteur du glucose et le coefficient de partage des alcools entre les membranes et le
tampon utilis pour lexprience (Leao et van Uden 1982).
Lapport dans le milieu dacides gras poly-insaturs (C18 :2) diminue leffet dun choc
thanol sur les transports de glucose, de glucosamine, dalanine et de lysine par rapport un
apport dacide gras mono-insaturs (C18 :1) (Thomas et Rose 1979).
En plus du transport des sucres, sont aussi affects par la prsence dthanol les transports
dacides amins (Ferreras et al. 1989;Garcia et Kotyk 1988) et dammonium (Cardoso et Leao
1992).
III.1.iv. Effet de lthanol sur les membranes
Lthanol, comme tout alcool, est une molcule amphiphile. La fonction hydroxyle est la
partie hydrophile de la molcule qui peut interagir avec les ttes polaires des phospholipides.
Coefficient de partage lipides/Tampon
[alcanol]
50%
mol/l
55
Paralllement, la fonction thyle, partie hydrophobe, peut potentiellement sintercaler entre
les chanes aliphatiques des phospholipides. Lthanol peut donc simmiscer et perturber la
structure de la membrane (Slater et al. 1993).
Les alcools linaires causeraient des dsordres au niveau de la chane glycrique de
phospholipides dans les membranes, suggrant que les groupements hydroxyles de ces
composs sancrent au niveau de linterface aqueuse des lipides (Weber et de Bont 1996). Les
liaisons hydrognes formes entre phospholipides et thanol sont moins fortes quavec leau.
Ces modifications se traduisent par une augmentation de la fluidit membranaire avec des
mouvements lipidiques (diffusion latrale et rotation) plus frquents (Ghosh 1988) et par une
altration du processus dinsertion de certaines protines, ncessitant la formation de liaisons
hydrognes (Ingram et Buttke 1984). Dautre part, la pntration de la molcule dthanol
lintrieur de la bicouche augmente la polarit de cette zone normalement impermable aux
molcules polaires (Alexandre et al. 1994a;Slater et al. 1993). Ainsi, la membrane deviendrait
plus permable aux ions et autres petites molcules polaires, comme leau et les protons.
Lthanol aurait donc pour effet de dissiper la force protomotrice, de diminuer les interactions
de van der Walls et donc daugmenter la fluidit membranaire.
III.2. Action indirecte et rponse de la cellule
Lthanol va crer localement une baisse de lactivit de leau, en sintercalant entre les ttes
hydrophiles des phospholipides. Leau devient ainsi moins disponible pour les fonctions
cellulaires ce qui va crer un stress cellulaire appel Water stress (Iwahashi et al. 1995).
La baisse de la disponibilit en eau se rpercute diffrents niveaux :
Au niveau membranaire : leau nest plus disponible pour stabiliser la face extracellulaire et
intracellulaire de la membrane ce qui augmente la fluidit membranaire.
Au niveau enzymologique : leau nest plus disponible pour maintenir le site actif des
enzymes et des transporteurs hydrophiles (transporteur du glucose, des acides amins) en
conformation native, ce qui va affecter leur activit. Lactivit des enzymes dont la raction
utilise directement la molcule deau est ainsi diminue.
Au niveau molculaire : notamment sur la configuration de lADN.
56
III.2.i. Lthanol comme stress cellulaire : le water stress
La molcule dthanol perturbe les liaisons hydrognes responsables de la stabilit des
interfaces qui sparent la bicouche lipidique et la phase aqueuse. Ces liaisons hydrognes
relient les parties hydrophiles des constituants membranaires en rseau.
Ces liaisons hydrognes peuvent tre distingues en deux catgories suivant quelles
ncessitent ou non lintervention de molcule deau. Les liaisons hydrognes
directes stablissent directement entre les ttes polaires des phospholipides tandis que les
liaisons hydrognes indirectes stablissent entre deux phospholipides via une ou plusieurs
molcules deau. Seules la phosphatidyl-srine et la phosphatidyl-thanolamine sont capables
via leur fonction amine dtablir des liaisons hydrognes directes, de ce fait les liaisons
indirectes sont les plus rpandues.
De part sa nature amphiphile, lthanol va monopoliser des molcules deau qui ne seront plus
disponibles pour dautres fonctions biologiques (Iwahashi et al. 1995). Le water stress
provient de la baisse de lactivit de leau, au moins localement, due la prsence de
molcules dthanol. Lactivit de leau diminue quand la concentration en thanol augmente
ce qui va avoir une influence sur les composs hydrats de la levure comme les enzymes et la
membrane (Hallsworth 1998). Les liaisons hydrogne de la membrane sen trouvent ainsi
perturbes. La permabilit et la fluidit de la membrane augmentent allant parfois jusqu la
lyse cellulaire (Hallsworth 1998;Kollar et al. 1993b).
En cas de water stress , la cellule accumule des composs qui sont supposs protger la
structure et la fonction des autres composs cellulaires dshydrats en remplaant les
molcules deau : les polyols comme le glycrol, les acides amins et le trhalose (Hallsworth
1998).
a. Le glycrol
Le glycrol qui a une masse molculaire plus faible que le trhalose va intervenir dans les
phnomnes dajustement osmotique (Edgley et Brown 1983). Lorsque la concentration en
sucre dans le milieu extrieur est trs leve (solution hypertonique) leau va avoir tendance
sortir de la cellule afin de tendre vers lquilibre osmotique des solutions. Pour contrebalancer
cette perte en molcules deau la cellule va augmenter losmolarit de son milieu
intracellulaire (Hallsworth 1998) en augmentant la synthse de glycrol et en diminuant la
permabilit de la membrane pour le glycrol ce qui permet laccumulation de glycrol dans
57
le cytoplasme. Laugmentation de losmolarit intracellulaire assure le rtablissement de la
pression de turgescence et du volume cellulaire.
Le glycrol va intervenir dans des chocs osmotiques modrs lorsque lactivit de leau Aw
atteint 0,98 (Hounsa et al. 1998). Le glycrol va principalement tre impliqu dans les
mcanismes lis ladaptation lthanol endogne. Lors de la production dthanol
endogne il y a augmentation progressive de la production de glycrol afin de maintenir
lquilibre osmotique des solutions, la fonction et lintgrit des enzymes. A laction du
glycrol sajoute gnralement la synthse des protines chaperonnes (les Hsp) qui sont
galement impliques lors de la rponse aux chocs thermiques (Lewis et al. 1995) et dans le
maintien de la stabilit membranaire. A de fortes concentrations en thanol endogne et lors
des chocs en thanol exogne, laction protectrice du glycrol sur la membrane est limite.
b. Le trhalose
Le trhalose est un disaccharide non rduit dunits glucose. Il est synthtis par un complexe
enzymatique : la trhalose synthase, code par quatre gnes (TPS1, TPS2, TPS3 et TSL1)
partir dUDP-glucose et de Glucose-6-phosphate. Il est hydrolys par deux voies distinctes :
par une trhalase neutre cytosolique (Nth1) (Kopp et al. 1993) et par une trhalase (ath1p)
dont 90% de lactivit est situe dans lespace priplasmique (Jules et al. 2004). Ces
trhalases sont rgules par un mcanisme de phosphorylation/ dphosphorylation catalys
par des protines kinases AMPc dpendantes (de Virgilio et al. 1991).
Le trhalose a un rle prpondrant lors de la rsistance la dshydratation de S. cerevisiae
(Gadd et al. 1987). Laccumulation de trhalose pourrait donc tre stimule en rponse la
baisse de lactivit de leau.
Le trhalose joue galement un rle prpondrant dans la protection de la cellule contre des
stress environnementaux de diverses natures (thermiques, osmotiques) (Alexandre et al.
1998;Franois et Parrou 2001;Parrou et al. 1997). Ces proprits sont utilises afin
daugmenter la tolrance de la levure aux oprations de conglation, de schage et de
rhydratation (Coutinho et al. 1988). Le trhalose va intervenir lorsque leau nest plus
disponible pour tablir des liaisons hydrognes : ce qui est notamment le cas lorsque les
molcules deau sont utilises pour solubiliser lthanol fortes concentrations ou bien
lorsque lactivit de leau est minimale comme cest le cas chez les organismes
anhydrobiotiques, pour lesquels la teneur en trhalose peut atteindre jusqu 20% de la masse
sche (Crowe et Crowe 1984). Le trhalose intervient donc en conditions de stress osmotique
58
intense lorsquil ne sagit plus seulement dquilibrer losmolarit des solutions mais de
compenser la chute de lactivit des molcules deau dans la cellule.
En absence de water stress lhydratation des ttes polaires des phospholipides et la
formation de liaisons hydrognes indirectes participent maintenir un espace entre les ttes
polaires des phospholipides de manire limiter les interactions de Van der Walls entre les
chanes aliphatiques en configuration de cristal liquide. Lorsque lactivit de leau est rduite,
le trhalose va se substituer leau en tablissant des liaisons hydrognes entre ses fonctions
OH et les groupes phosphates des phospholipides et ainsi maintenir les phospholipides en
conditions optimales de fluidit (Crowe et Crowe 1984) et de stabilit (Iwahashi et al. 1995).
Le trhalose va donc agir directement sur la membrane afin de maintenir cette dernire en
configuration de cristal liquide (Leslie et al. 1995).
Entre la prsence dthanol dans lenvironnement cellulaire et laccumulation de trhalose, il
doit ncessairement exister un signal intracellulaire transducteur. Par augmentation de la
permabilit de la membrane vis vis du gradient de protons, la prsence dthanol dans le
milieu induit une baisse du pH intracellulaire (pH
i
) (Jimnez et van Uden 1985), tout comme
avec la synthse dacide actique (Arneborg et al. 1997), dacide dcanoque, et une lvation
de temprature (Alexandre et al. 1998), c'est--dire la plupart des stress aboutissant une
lvation de la concentration en trhalose. La chute du pH
i
est un candidat pour tre llment
inducteur de la prsence de trhalose. Cette hypothse fut invalide lors de ltude de la
rponse un stress thanolique de mutants prsentant une activit rduite de lH
+
-ATPase
membranaire (principale enzyme rgulatrice du pH
i
in vivo) (Alexandre et al. 1998).
Des analyses gntiques ont montr que les deux principaux gnes impliqus dans la synthse
du trhalose (TPS1, TPS2) possdent au niveau de leur rgion promotrice de nombreuses
squences STRE. Ces gnes sont donc inductibles en condition de stress thanol, thermique,
osmotique. Ces squences STRE sont la cible de facteurs de transcription spcifiques qui
sont cods par deux gnes homologues MSN2 et MSN4 (Martinez-Pastor et al. 1996). Des
expriences ont montr que les chocs thermiques et les chocs alcooliques avaient deux
consquences communes : la premire est laugmentation du taux en acides gras insaturs au
sein de la membrane, la seconde est laugmentation de la teneur cellulaire en trhalose
(Odumeru et al. 1993). Une hypothse de travail consisterait corrler ces deux phnomnes.
De plus, des travaux ont montr que la sensibilit de lactivation des gnes STRE tait
fonction de la composition en acide gras insaturs de la membrane (Chatterjee et al. 2000).
59
c. Effet de lthanol sur lADN et la rgulation gntique
Chez E.coli, lthanol entrane un retard dans la synthse des ARN, de lADN et des
protines, mais nagirait pas comme un inhibiteur spcifique de ces processus (Ingram 1977).
Il a t dmontr que le statut nergtique de leau contrlait lexpression gntique (Balke et
Gralla 1987;Dorman et al. 1990). En effet, ce sont des liaisons hydrognes via des molcules
qui sont impliques dans la conformation super-enroule de la double hlice. Une baisse de
lactivit de leau va engendrer une transition structurale de la molcule dADN, ce qui va
avoir des effets au niveau de la rplication et de la transcription.
Au niveau gntique, le water stress nagit pas uniquement au niveau structural de la
molcule dADN, mais galement en affectant les protines responsables de la rgulation
gntique (Hallsworth 1998).
De plus, lthanol est un inducteur de mutants dficients de la respiration. Ce sont les
mitochondries et plus particulirement lADN mitochondrial qui sont affects (Ibeas et
Jimenez 1997) mais le mcanisme daction nest pas connu.
III.2.ii. Influx et efflux de protons travers la membrane : Rle de
lATPase membranaire
La prsence dthanol induit une augmentation de linflux de protons. Le gradient
transmembranaire sen trouve alors fortement affect (Cartwright et al. 1987;Leao et van
Uden 1984). Or une baisse de ce gradient lectrochimique peut tre critique pour la cellule.
Pour lutter contre la diminution du gradient de protons, lactivit de lATPase membranaire
est stimule chez des cellules cultives en prsence dthanol (Alexandre et al. 1994a). En
effet, lATPase membranaire est in vitro sensible la prsence dthanol, mais aprs culture
de Saccharomyces cerevisiae en prsence dthanol lactivit spcifique de lATPase dans les
membranes est active et la sensitivit de lenzyme lthanol baisse (Alexandre et al. 1994a)
afin de maintenir le pH intracellulaire (Dombek et Ingram 1987). Lors de cultures en prsence
dthanol, la consquence physiologique est donc une activation de lefflux de protons.
Lactivit spcifique de lATPase se trouve stimule alors quil semble que la quantit de
protines ATPase diminue dans les membranes cause de lthanol (Monteiro et al. 1994).
De plus, Aguilera et al. (2006) corrle 96,6% la tolrance lthanol (inhibition de 50% du
taux de croissance) avec lactivit ATPasique aprs un choc thanol 4% pour diffrentes
souches de levures vinicoles.
60
Le mcanisme par lequel lactivit de lATPase se trouve active peut tre d la
modification de la composition lipidique de la membrane. Plusieurs tudes ont report
linfluence de lenvironnement lipidique sur lactivit de lATPase. La prsence dacides gras
longue chane (Johannsson et al. 1981a;Johannsson et al. 1981b), dacides gras insaturs
(Aguilera et al. 2006), dergostrol (Aguilera et al. 2006) et le rapport strol :phospholipides
(Cooke et Burden 1990), ainsi que la composition en phospholipides (Dufour et Goffeau
1980) semblent avoir une influence sur lactivit de lATPase. De plus, HSP30, une
chaperonne membranaire induite en cas de stress thanol (Piper et al. 1994), pourrait avoir un
rle de conservation de lnergie en limitant la consommation excessive dATP par lATPase
membranaire (Piper et al. 1997)
III.2.iii. Modification de la permabilit et de la fluidit membranaire
La cellule rpond au stress thanol en augmentant ce que les auteurs appellent la pression
interne de la membrane (Conrad et Singer 1981). La pression interne est constitue de
toutes les molcules : strols, phospholipides insaturs, protines intrinsques prsentes dans
la membrane et qui sont absentes des bicouches synthtiques. Le rle de la pression
interne est de tamponner les proprits structurales et thermodynamiques des
phospholipides (Conrad et Singer 1981). La pression interne des membranes biologiques
permet de limiter la solubilit des molcules amphiphiles comme lthanol. En effet, la
concentration de petites molcules amphiphiles comme lthanol dans les membranes
biologiques nexcde pas 1/10
me
de la concentration dans la phase aqueuse ; alors que dans
les vsicules phospholipidiques synthtiques, le ratio [EtOH]
phase aqueuse
/ [EtOH]
vsicule
est
proche de lunit (Conrad et Singer 1981).
Il a t dmontr que lthanol modifiait la composition de la membrane plasmique chez les
microorganismes procaryotes (E.coli (Dombek et Ingram 1984) ; Zymomonas mobilis
(buchholz et al. 1987)) ainsi que chez les microorganismes eucaryotes tels que S. cerevisiae
(Thomas et al. 1978).
a. La composition en acides gras
Llvation de la concentration en thanol induit une diminution en acides gras saturs et une
augmentation en acides gras insaturs (principalement lacide olique C
18 :1
) (Beavan et al.
61
1982;Sajbidor et al. 1995). Le niveau dinsaturation en prsence dthanol (10 % v/v) peut
augmenter de 25 % (Alexandre et al. 1994a).
De plus, une complmentation en acide olique dans le milieu induit une augmentation de la
tolrance lthanol chez S.cerevisiae (Ghareib et al. 1988). Des expriences de
complmentation en acides gras de longueurs de chanes aliphatiques gales mais de degrs
dinsaturation diffrents (acide olque, acide linolque, acide linolnique) chez
S.cerevisiae montrent que la tolrance lthanol (efflux de protons, taux de fermentation et
assimilation de L-alanine) augmente avec le degr dinsaturation des acides gras (Mishra et
Prasad 1989;Thomas et al. 1978).
Plus rcemment, ltude de mutants de S. cerevisiae dficients pour le gne OLE1, codant une
acide gras dsaturase (transformant le C16:0 et le C18:0 en C16:1 et C18:1), et complments
par une dsaturase dinsecte, qui augmente la proportion de C18:1 par rapport au C16:1,
soulignent leffet des acides gras insaturs dans la tolrance lthanol et notamment leffet
plus important de lacide olique (You et al. 2003).
Certains auteurs suggrent aussi une influence des acides gras longue chane sur la tolrance
lthanol (Chi et Arneborg 1999)
b. La composition en strols
Selon certains auteurs, la proportion de strols dans les cellules augmente lors de cultures en
prsence dthanol (Sajbidor et al. 1995). Or, dautres travaux contredisent cette constatation
(Alexandre et al. 1994b;Koukkou et al. 1993;Walker-Caprioglio et al. 1990). Laccumulation
dergostrol peut aussi tre dpendante de la concentration dthanol dans le milieu (Del
Castillo Agudo 1992).
Cependant, une souche est dautant plus tolrante lthanol si son ratio
strols/phospholipides est lev (Chi et Arneborg 1999;Del Castillo Agudo 1992;Swan et
Watson 1998).
De mme que pour lacide olique, une complmentation en ergostrol dans le milieu de
culture induit une augmentation de la tolrance lthanol en terme de viabilit chez
S.cerevisiae (Thomas et al. 1978). Des rsultats identiques ont t obtenus lors dexpriences
de complmentation, en cholestrol, en ergostrol, en stigmastrol, et en campestrol, en
condition danarobiose. Laugmentation de la tolrance lthanol observe est cependant
62
suprieure avec les strols possdant une ramification insature (ergostrol et stigmastrol)
quavec les strols chane linaire (cholestrol, campestrol) (Thomas et al. 1978).
c. Les phospholipides
Linfluence de la composition en phospholipides est controverse, dautant que peu dtudes
ont t ralises.
Les cellules enrichies en PS semblent plus tolrantes lthanol que les cellules enrichies en
PC ou PE (Mishra et Prasad 1988). Un ratio anion:zwittrion de la membrane lev
entranerait une augmentation de la tolrance lthanol comme suggr par des travaux
raliss chez E.coli (Clark et Beard 1979). Cependant cette hypothse est contredite par
plusieurs auteurs qui notent plutt limportance de PC dans la tolrance a lthanol (Chi et
Arneborg 1999;Hayashida et Ohta 1980).
Mais la capacit des levures maintenir un taux de biosynthse des phospholipides suffisant
est aussi un facteur influenant la tolrance lthanol (Alexandre et al. 1994b;Koukou et al.
1990).
d. Les protines membranaires et autres molcules
Les protines intrinsques de la membrane participent galement la pression interne de
celle-ci. (Jimenez et Benitez 1987). Chez E.coli, il fut dmontr que le ratio lipides/protines
de la membrane influenait la tolrance lthanol : une diminution du ratio lipides/protines
provoque une augmentation de la tolrance de la bactrie lthanol (Dombek et Ingram
1984).
Laugmentation de la pression interne est galement observable lors de la prsence de
petites molcules amphiphiles comme le dinitrophnol et le dcanol, ce qui laisse suggrer
quune partie des effets de laccumulation de lthanol nest pas spcifique de la molcule
dthanol (Hallsworth 1998) mais commune toute molcule amphiphile de petite taille.
La cellule va galement ragir au stress thanol en modifiant lactivit des enzymes
membranaires. En effet, des analyses gntiques chez plusieurs levures (Schizosaccharomyces
pombe (Gille et al. 1993) et Saccharomyces sake (Ogawa et al. 2000)) ont montr que la
prsence dthanol exogne stimulait lexpression de gnes codant des catalases. Ces enzymes
sont impliques lors des stress oxydatifs causs gnralement par la prsence de peroxyde
dhydrogne (Ventsislava et al. 2002). Une autre enzyme semble tre implique dans
63
lacquisition de la tolrance lthanol : cest la superoxyde dismutase (Costa et al. 1993).
Elle agit lintrieur de la cellule au niveau de la mitochondrie et protgerait ainsi la cellule
en transformant les radicaux superoxydes en peroxyde dhydrogne, pris alors en charge par
les catalases. La prsence dthanol induirait donc un stress oxydatif mais les mcanismes ne
sont l encore pas connus (Costa et al. 1993;Costa et al. 1997).
Gnralement une cellule soumise un stress quelconque va rpondre en contrant les effets
responsables du stress. Lors du stress thanol, lthanol va fluidifier la membrane (Alexandre
et al. 1994b;Ghosh 1988) et augmenter la permabilit de la membrane (Slater et al. 1993).
Malgr cela, la cellule en condition de stress thanol augmente son taux dacides gras
insaturs (Thomas et al. 1978). Or les acides gras insaturs augmentent galement la fluidit
membranaire (Beney et Gervais 2001). Il y a donc une discordance entre leffet fluidifiant de
lthanol et la rponse de la cellule. En effet, on pourrait sattendre ce que la levure qui
peroit une augmentation de la fluidit de sa membrane plasmique, cherche contrer ce
phnomne en rigidifiant la membrane (Bottema et al. 1985). Au lieu de cela la levure
incorpore dans sa membrane des composs qui augmentent la fluidit de celle-ci. Les auteurs
expliquent cette discordance physiologique par le fait que les acides gras insaturs ne seraient
pas utiliss par la cellule pour contrler la fluidit membranaire (Jones et Greenfield 1987),
mais plutt la permabilit membranaire : ce qui sexplique par le fait que les doubles liaisons
vont provoquer des coudes dans les chanes hydrocarbones des phospholipides. Ces coudes
apolaires vont constituer des obstacles la diffusion passive des composs polaires engendre
par la prsence dthanol.
III.3. Rponse transcriptomique la prsence dthanol
La rponse de la cellule de levure la prsence dthanol a t tudie :
- aprs un ajout dthanol exogne (Alexandre et al. 2001;Fujita et al. 2004),
- pendant une fermentation alcoolique (Devantier et al. 2005a;Shima et al. 2005)
Lors dun choc thanol 7% (v/v) sur des levures en phase exponentielle (Alexandre et al.
2001), Alexandre et al.(2001) isolent 194 gnes induits de plus de trois fois, et 201 rprims
de plus de 3 fois aprs le choc thanol. La famille de gnes sur-exprims la plus importante
est la famille cell rescue defense and virulence (Alexandre et al. 2001), en rponse un
stress environnemental, notamment certains gnes connus dans la rponse au choc thermique
64
(Heat Shock Protein). Parmi les familles de gnes induits, il y a aussi le mtabolisme
nergtique, le maintien de lhomostasie cellulaire, la synthse et dgradation du trhalose et
la rponse au stress oxydatif (Alexandre et al. 2001).
(Fujita et al. 2004) ont tudi la rponse transcriptionnelle de la levure aprs incubation 2
heures dans diffrents alcools de toxicit croissante (thanol, 1-pentanol, 1-octanol) et un
hydrocarbure (n-pentane) moins toxique que lthanol. Les alcools pntrent lintrieur de la
cellule et endommagent les organelles cellulaires, contrairement lalcane. De mme la
rponse transcriptomique est beaucoup plus intense pour les alcools que pour le pentane.
Entre 176 et 373 gnes sont sur-exprims en prsence dun alcool contre seulement 35 en
prsence de pentane, avec de plus des ratios de sur-expression nettement plus faibles. Les
alcanes sont moins toxiques que les alcools pour les levures soulignant encore limportance de
la fonction hydroxyle dans le processus de toxicit (Fujita et al. 2004;Weber et de Bont 1996).
Une exposition aux diffrents alcools entrane, l aussi, linduction des gnes de rponse au
stress (HSP12, 26, 30, 78, 82, 104, SSA3, 4 et SSE2). La prsence de pentane ninduit pas ce
type de rponse. Linduction de gnes lis lnergtique cellulaire est aussi caractristique
de la prsence dalcool. Ils mettent lhypothse dune action des alcools au niveau des
fonctions hydrophiles des phospholipides des membranes qui perturberaient la fluidit
membranaire et le fonctionnement de lATPase membranaire. En prsence de pentanol et
doctanol (Fujita et al. 2004), quelques gnes lis la synthse et la dgradation des acides
amins sont sur-exprims.
Ces diffrentes tudes se sont attaches la comprhension de la rponse transcriptomique de
la levure aprs ajout dthanol exogne. Mais que se passe-t-il pendant la production
dthanol et comment la levure peut-elle se protger de son propre thanol produit ?
Linterprtation des rsultats transcriptomiques lors de fermentations alcooliques nest pas
aussi aise car plusieurs phnomnes se succdent voire se superposent. Dans les productions
de boissons fermentes, les levures sont aussi soumises des conditions particulires : milieu
complexe, anarobiose, carence nutritionnelle, forte pression, hautes densits cellulaires ou
encore basse temprature. Les fermentations oenologiques (Marks et al. 2003;Perez-Ortin et
al. 2002;Rossignol et al. 2003) et brassicoles (James et al. 2003;Olesen et al. 2002) ont t
explores. Mais ce nest pas avec ce type de procds, car trop complexes, que lon peut
mettre en vidence les gnes impliqus dans la tolrance lthanol. Il existe dautres
procds, comme le procd VHG (Very High Gravity), qui visent uniquement produire de
lthanol et qui ont t tudis dun point de vue transcriptomique (Devantier et al.
2005b;Devantier et al. 2005a;Shima et al. 2005).
65
Shima et al. (2005) comparent la mme souche de levure sur milieu synthtique et sur
mlasse en fed-batch. La levure tant plus rsistante aux stress sur mlasse, ils esprent ainsi
identifier les gnes impliqus dans cette rsistance. Ils ont russi, par lanalyse gnomique
fonctionnelle, mettre en vidence linduction de gnes lis la synthse et lassimilation
de vitamines (biotine, thiamine et pyridoxine) dans le milieu-mlasse, suggrant une plus
faible concentration en vitamines dans ce milieu. Inversement, il suppose une carence en fer
dans leur milieu synthtique car des gnes impliqus dans lutilisation du fer y sont sur-
exprims
De mme, Devantier et al. (2005a) ont compar, en procd batch VHG, une souche de
laboratoire et une souche industrielle, plus tolrante aux stress. Le milieu contient initialement
280 g.l
-1
de maltodextrine. La diffrence de comportement au niveau transcriptomique des
deux souches se situe surtout pendant la phase stationnaire. La souche industrielle, plus
tolrante que la souche de laboratoire sur-exprime plus de gnes lis au stress cellulaire. Les
deux souches expriment diffrentiellement ADH7 et GDH1, suggrant une meilleure
rgulation de la balance redox pour la souche industrielle et elles semblent rguler de manire
diffrente les transporteurs dhexose.
Les deux tudes prcdentes peuvent permettre doptimiser les procds mais nont
malheureusement pas permis de mettre directement en vidence les gnes impliqus dans la
tolrance lthanol.
III.4. Gnes impliqus dans la tolrance lthanol
Pour essayer de mettre en vidence les gnes impliqus dans la tolrance lthanol, plusieurs
stratgies ont dj t utilises :
- ltude de la tolrance de diffrents mutants (Inoue et al. 2000;Kajiwara et al.
2000;Novotny et al. 1992;Takahashi et al. 2001;van Voorst et al. 2006),
- la comparaison de lexpression gnique en phase de croissance de souches ou de
mutants prsentant des degrs de tolrance diffrents (Ogawa et al. 2000;Takahashi et
al. 2001),
La comparaison de lexpression gntique de souches mutantes tolrantes lthanol et de
lexpression gntique de souches sauvages sensibles lthanol a permis de rvler le rle
dans la tolrance au stress thanol de plusieurs gnes habituellement exprims lors des stress
thermiques, osmotiques ou oxydatifs. Ces gnes sont caractriss par des squences consensus
au niveau de leur rgion promotrice CCCCT, AAAAG : ces squences sont appeles
66
squence STREs par les auteurs (STress Reponsive Elements). Parmi ces gnes, on trouve des
gnes codant des enzymes de la synthse du trhalose (TPS1 (van Voorst et al. 2006) et
TPS2), des protines chaperonnes (la famille des HSP70, HSP12, HSP104) et du glycrol
(GPD1) et une enzyme implique lors des stress oxydatifs (CTT1) (Ogawa et al. 2000).
La dltion de ERG6, dont le produit est impliqu dans la synthse des strols, rend les
mutants plus sensibles (Inoue et al. 2000) et la sur-expression de OLE1, qui code une
-9-dsaturase dacide gras, diminue la sensibilit de la souche (Kajiwara et al. 2000). La
prsence de strols et dacides gras insaturs dans les membranes est dj connue pour avoir
une importance dans la tolrance lthanol.
Takahashi et al. (2001) isolent 5 mutants de dltion sensibles lthanol impliqus soit dans
lintgrit paritale (BEM2, ROM2 et VSP34), soit dans la conformation de lADN (PAT1 et
ADA2). Limportance de lintgrit paritale dans la tolrance lthanol est aussi dmontre
par van Voorst et al. (2006), aprs screening de la banque EUROSCARF sur 6% dthanol, en
plus des fonctions vacuolaires et mitochondriales.
Il y a donc relativement peu de choses connues sur la rponse gntique de la tolrance
lthanol chez Saccharomyces cerevisiae. Celle-ci semble trs difficile apprhender,
notamment par la nature probablement polygnique de cette rponse (D'Amore et al. 1990).
67
III.5. Conclusion
Figure 9 : Schma rcapitulatif du modle daction de lthanol sur une cellule de levure.
La premire cible de lthanol est donc la membrane plasmique, mais lthanol est aussi
prsent lintrieur de la cellule (cf. figure 9). Lthanol de part sa nature amphiphile
simmisce dans la bicouche de phospholipides. Les forces de liaisons qui maintiennent
lintgralit de la membrane sen trouvent alors perturbes ainsi que les proprits de la
membrane. Lthanol augmente la fluidit et la permabilit de la membrane et le gradient de
protons en est fortement affect. De manire plus indirecte, la baisse de lactivit de leau a
des consquences sur les activits enzymatiques impliques dans les voies de la glycolyse et
de la synthse dADN et plus particulirement celles prsentes au sein des membranes.
Lactivit de diffrents transporteurs membranaires (glucose, maltose, acides amins,
ammonium), ainsi que de lATPase membranaire est aussi perturbe par la prsence
dthanol.
Ethanol
ATPase membranaire
Systme de transport
Membrane plasmique
Paroi
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+ ATP
ADP
Glucose
Glucose-6-P
Voies des
pentoses
phosphate
Pyruvate
Glucose
ADN
Mitochondrie
Trhalose
Glycrol
Noyau
Transporteurs
membranaires
Lipides
membranaires
Gradient de protons
transmembranaire
68
En raction, la cellule modifie sa composition membranaire de manire contrecarrer laction
de lthanol. Les principales modifications tudies concernent linfluence des acides gras
insaturs et des strols sur la tolrance lthanol. Ladaptation de lenvironnement lipidique
des enzymes membranaires en modifierait aussi les proprits pour les rendre plus
performantes dans la lutte contre leffet inhibiteur de lthanol. Lthanol agit aussi comme un
stress cellulaire. Cet tat gnral de stress cellulaire se traduit par une accumulation de
trhalose, de glycrol et linduction de gnes impliqus dans les phnomnes de stress (HSP,
HOG, stress oxydatif ).
La tolrance lthanol est un phnomne qui a t et reste encore trs tudi. La littrature
est trs abondante dans le domaine ce qui implique parfois lapparition de rsultats
contradictoires. Ceci sexplique par la complexit de la rponse mise en place et la difficult
dtudier ce phnomne. En effet, lthanol exogne na pas la mme toxicit que lthanol
produit par la cellule elle-mme (thanol endogne) ; ladaptation peut donc tre diffrente.
Or, il apparat beaucoup plus simple dun point de vue pratique dtudier la tolrance
lthanol ajout (choc-thanol ou croissance en prsence dthanol). Cependant, la
transposition aux phnomnes observs pendant les fermentations nest pas aise, dautant
que la majorit des tudes ne va pas au-del de 12% dthanol. Mais, ltude en condition de
production dthanol et des fortes concentrations pose dautres problmes : notamment la
superposition des stress (thanol, osmotique, carence nutritionnelle), la ncessit de la
matrise du procd et lobtention dun titre lev en thanol. De plus, malgr la multitude des
publications, de nombreuses questions sont encore sans rponse. Y a-t-il des gnes
spcifiquement impliqus dans la tolrance lthanol ? Quels sont-ils ? Y a-t-il une rponse
unique la toxicit de lthanol ? Quel(s) est(sont) le(s) signal(aux) dclencheur(s) de la
rponse visant a contrecarrer leffet de lthanol ?.
Le laboratoire a fait le choix dune production par lintermdiaire dun racteur bi-tag
recyclage de la biomasse (BRM). Or, cest un systme trs complexe qui ncessite une longue
phase de mise au point. Ltude de leffet de lthanol produit par lintermdiaire dun tel
procds nous est apparu trop complexe. Dans un premier temps, nous disposons dun
procd de type fed-batch plus simple mettre en uvre et dj optimis au niveau
nutritionnel. De plus, les rsultats sur ce dernier ont servi de base la modlisation du BRM.
Cest donc par ltude des diffrents tats physiologiques de la levure au cours de
fermentations fed-batch que nous esprons mieux comprendre leffet des hautes
concentrations dthanol produit sur la levure.
69
Partie II :
Matriel et Mthodes
70
Partie II : Matriel et mthodes
71
I. Fermentation
I.1. Souche
La souche utilise au cours de ce travail est Saccharomyces cerevisiae CBS 8066. Il s'agit
d'une souche de laboratoire commercialise par le Centraal Bureau voor Schimmelcultures
(Hollande).
I.2. Milieux de culture
I.2.i. Milieu de conservation
La souche est conserve 80C, aprs ajout de 2 ml de glycrol 5 ml de culture sur le
milieu de composition suivante:
Tryptone: 10 g.l
-1
Extrait de levure: 5 g.l
-1
NaCl: 10 g.l
-1
Glucose: 2 g.l
-1
Eau distille
I.2.ii. Milieu riche
A partir de colonies isoles sur boite de ptri de la mme composition que le milieu de
conservation avec 15 g.l
-1
dagar, la souche est mise en culture dans un milieu riche de
composition :
Bactopeptone: 10 g.l
-1
Extrait de levure: 10 g.l
-1
NaCl: 9 g.l
-1
Glucose: 20 g.l
-1
Eau distille
I.2.iii. Milieux de prculture et de fermentation
Le milieu de fermentation est un milieu synthtique bas sur celui dcrit par BAUDET
(1990). Il est utilis pour les prcultures et les fermentations. Les concentrations en
oligo-lments ont t adaptes selon la mthode de EGLI et FIECHTER (1981) o les
72
auteurs dfinissent, partir de la composition cellulaire de Saccharomyces cerevisiae, les
rendements de conversion R
X/E
1
des oligo-lments (Mg, Zn, Mn, Co, Cu, Mo, Ca, Fe, et B)
(Egli et Fiechter 1981). Pour cette tude, les concentrations en oligo-lments ont t
calcules de faon ne pas limiter la croissance jusqu' 20 g.l
-1
de biomasse.
Composition du milieu salin de prculture :
Sels principaux : KH
2
PO
4
: 3,0 g.l
-1
(NH
4
)
2
SO
4
: 3,0 g.l
-1
Na
2
HPO
4
, 12H
2
O : 3,0 g.l
-1
Source azote : Glutamate de sodium : 1,0 g.l
-1
Oligo-lments : MgSO
4
: 0,5 g.l
-1
ZnSO
4
, 7H
2
O : 4,0.10
-2
g.l
-1
MnSO
4
: 3,8.10
-3
g.l
-1
CoCl
2
: 5,0.10
-4
g.l
-1
CuSO
4
: 9,0.10
-4
g.l
-1
Na
2
MoSO
4
: 6,0.10
-5
g.l
-1
CaCl
2
: 2,3.10
-2
g.l
-1
(NH
4
)
2
Fe(SO
4
)
6
: 2,3.10
-2
g.l
-1
H
3
BO
3
: 3,0.10
-3
g.l
-1
Vitamines : Acide pantothnique : 5,0.10
-3
g.l
-1
Acide nicotinique : 5,0.10
-3
g.l
-1
Mso-inositol : 125,0.10
-3
g.l
-1
Thiamine : 5,0.10
-3
g.l
-1
Pyridoxine : 5,0.10
-3
g.l
-1
Acide para-aminobenzoique : 1,0.10
-3
g.l
-1
biotine : 1,2.10
-5
g.l
-1
Eau du rseau de ville
2
Chaque oligo-lment est prpar sparment sous forme dune solution concentre puis
strilise sur filtre Minisart 0,2 m (SARTORIUS). Les solutions sont conserves 4C.
Les vitamines sont prpares sous forme d'une solution concentre (400X ou 1000X)
contenant l'ensemble des composs l'exception de la biotine. La biotine est prpare
sparment (concentre 5000X ou 10000X). Les solutions sont strilises sur filtre Minisart
0,2 m(SARTORIUS) et conserves 4C.
Composition du milieu salin de fermentation : le milieu de fermentation est le mme que le
milieu de prculture sauf pour les vitamines qui sont rajoutes de manire squence au cours
de la fermentation (Alfenore et al. 2002).

1
R
X/E
reprsente la quantit de biomasse (g) que l'on peut thoriquement obtenir avec un gramme
d'lment E.
2
Leau du rseau est utilise car la fermentation se droule plus rapidement quavec leau distille
73
I.3. Bioracteur et conditions de culture
Les cultures sont ralises dans un bioracteur de 20 litres de volume utile quip dun
systme de strilisation en place (BRAUN, Biostat E). Les diffrentes fonctions disponibles
sont :
- Les mesures et rgulations de temprature, pH, oxygne dissous, pression.
- La dtection de mousse avec ajout rgul d'antimousse.
- Le contrle de la procdure de strilisation par vapeur vive.
La vitesse d'agitation est fixe 400 tr.min
-1
jusqu' ce que la PO
2
atteigne 20 % puis
augmente de faon ne pas limiter la culture en oxygne. La temprature est rgule 30C
et le pH 4 l'aide d'une solution d'ammoniaque 14 % (v/v). La pression dans le racteur
est impose 0,2 bar (pression relative).
I.3.i. Prparation de l'inoculum
Deux tubes contenant chacun 5 ml de milieu riche sont ensemencs partir de colonies
isoles conserves sur glose. Les tubes sont incubs pendant 16 heures 30C sous agitation
(100 tr.min
-1
). Le contenu de chaque tube est ensuite transfr dans un erlenmeyer de 250 ml
muni de chicanes contenant 50 ml de milieu de prculture 40 g.l
-1
de glucose (pr-levain).
Ces erlenmeyers sont incubs 10 heures 30 C sous agitation (100 tr.min
-1
). Chaque
pr-levain sert ensemencer un erlenmeyer de 3000 ml muni de chicanes et contenant 500 ml
de milieu de prculture 40 g.l
-1
de glucose. Ces cultures sont alors incubes 10 heures
30C sous agitation (100 tr.min
-1
). Nous obtenons ainsi 1 litre de levain qui servira
ensemencer 9 litres de milieu de fermentation, soit un taux densemencement de 10 % (v/v).
I.3.ii. Prparation du bioracteur
Le milieu salin est prpar initialement. Il contient les sels d'ammonium, de potassium et de
sodium. 9 litres de milieu salin sont striliss in situ dans le racteur. Les vitamines et les
oligo-lments sont ajouts dans le racteur aprs strilisation.
Le glucose est apport partir d'une solution concentre 700 g.l
-1
par lintermdiaire d'une
pompe pristaltique (MASTERFLEX) pilote par ordinateur. Le mode dapport de sucre est
diffrent selon les fermentations. Il sera dtaill ultrieurement dans ce travail.
74
Le racteur est connect un micro-ordinateur. Un programme informatique ralise
lacquisition en ligne des paramtres de contrle du racteur (pH, temprature, pression
partielle en oxygne dissous, pression relative, ajouts dammoniaque et dantimousse). De la
mme manire, la masse de glucose ajoute dans le racteur est estime en temps rel par
lintermdiaire dune balance sur laquelle est place le bidon dalimentation de glucose.
Lensemble des autres paramtres est obtenu hors ligne par dosage (CO
2
produit, O
2
consomm, biomasse, mtabolites forms, glucose rsiduel, etc.).
II. mthodes analytiques
II.1. Caractrisation de la biomasse
II.1.i. Mesure de la densit optique
La croissance cellulaire est suivie par mesure de la densit cellulaire par spectrophotomtrie
620 nm (spectrophotomtre HITACHI U
-1
100) dans une cuve en verre de 2 mm de trajet
optique. La suspension cellulaire est dilue de faon obtenir une densit optique comprise
entre 0,05 et 0,8 unit dabsorbance, de manire toujours se situer dans la zone de linarit
de la mthode.
II.1.ii. Dtermination de la masse sche totale
La biomasse sche, exprime en g.l
-1
est mesure par une mthode gravimtrique.
Un volume connu de culture est filtr l'aide d'une pompe vide sur une membrane Sartolon
polyamide 0,45 m (SARTORIUS) pralablement sche et pese. Aprs filtration, les
membranes sont sches l'tuve 60C sous vide (200 mm de Hg) pendant 48 heures, puis
peses. La diffrence de masse avant et aprs filtration de la suspension cellulaire sur la
membrane ramene au volume filtr permet de dterminer la concentration en masse sche de
biomasse (g.l
-1
).
75
II.1.iii. Dtermination de la viabilit cellulaire
a. Bleu de mthylne
Le bleu de mthylne est une molcule organique, qui peut exister sous les deux
formes (cf. figure 10) :
forme Oxyde : bleue forme Rduite : incolore
Figure 10 : Molcule de bleu de mthylne sous forme oxyde et sous forme rduite. Cette
molcule va ragir avec les activits oxydorductases des cellules encore actives.
La viabilit cellulaire est dtermine par comptage sur cellule de THOMA aprs coloration au
bleu de mthylne. La solution colorante est prpare comme suit :
Diluer 10 mg de bleu de mthylne dans 10 ml d'eau distille.
Ajouter 2 g de tricitrate de sodium dihydrat.
Aprs filtration sur membrane Minisart 0,2 m (SARTORIUS), complter 100
ml avec de l'eau distille.
La technique consiste mlanger 200 l de solution de bleu de mthylne avec 200 l de
suspension cellulaire dilue. Aprs homognisation et 10 min dincubation temprature
ambiante, les cellules sont alors comptes au microscope sur la cellule de THOMA. Les
cellules viables apparaissent incolores tandis que les cellules non viables se colorent en bleu.
Le pourcentage de viabilit est calcul en faisant le rapport entre le nombre de cellules viables
et le nombre total de cellules.
a. Fun
1 (Molecular Probes)
Les membranes cellulaires sont permables au FUN
1 (cf. figure 11). Il sagit dun

fluorochrome qui, dans des cellules actives est internalis sous forme des structures
cylindriques intravacuolaires (appeles CIVS) rouge-orange ou jaune-orange. Les cellules
inactives diffusent uniformment dun vert-jaune intense et une absence de CIVS (Millard et
al. 1997).
76
Figure 11 : Molcule de FUN
1.
Lquivalent de 1 ml de suspension de levure DO
620
= 1 est centrifug 2 min 15000 rpm.
Le culot est lav avec 1 ml de tampon HEPES (10 mM Hps, pH = 7,2, 2% glucose), puis
recentrifug et resuspendu dans 1 ml de tampon HEPES (10 mM Hepes, pH = 7,2, 2%
glucose). 0,5 ml de cette suspension est alors utilis pour le marquage au colorant FUN
1.
Le marquage se passe dans une salle noire car les fluorochromes ne doivent pas tre exposs
la lumire. 1 l de FUN
1 est rajout et mlang la suspension de levure, puis le tout est

laiss 30 min 33C.
Lobservation se fait au microscope (Olympus BH2, objectif 40X, DplanApo40UVPL) quip
dune camera CCD (DXM 1200, Nikon), sous UV (avec un filtre dexcitation =470 nm). Les
images sont ensuite analyses grce au logiciel Lucia 4.6 (Laboratory imaging Ltd).
II.1.iv. Caractrisation morphologique de la biomasse
Ltude sur la morphologie des cellules a t ralise partir de photos prises au microscope
fond noir (cf. figure 12). La mesure des paramtres morphologiques se fait grce un
programme danalyse dimage ddi (Ohtani et al. 2004). Le programme permet, de manire
automatique, didentifier le contour des cellules et de distinguer les cellules seules des cellules
bourgeonnantes et aussi disoler le bourgeon. Certaines formes cellulaires (agrgats de
cellules) ne peuvent tre identifies : elles sont appeles formes complexes (cf. figure 12).
+
77
a
b
a/b = allongement de la cellule
Figure 12 : Exemple dimage de microscopie fond noir obtenue lors dune culture typique
de levure en bioracteur (120g.l
-1
dthanol produit), sur laquelle se superpose lanalyse par le
logiciel danalyse dimage dvelopp par Ohtani et al. (2004) et lidentification des
diffrentes formes.
Pour chaque cellule identifie, le programme adapte une ellipse passant au plus prs des
contours cellulaires. Il renvoie alors de nombreux paramtres parmi lesquels des donnes
concernant :
- le type de cellule : non-bourgeonnante, bourgeonnante, bourgeon
- les paramtres de forme des cellules
o a= axe long
o b=axe court
o Taille de la cellule = aire de lellipse (unit : pixel x pixel ;
1 pixel=0,129512 m)
petit : 100< taille cellule<350
moyen : 350< taille cellule <475
gros : 475< taille cellule <850
Cellule non bourgeonnante
Cellule mre
bourgeonnante
Cellule fille
ou bourgeon
Cellule brillante
Cellule sombre
Forme
complexe
78
- les paramtres concernant les bourgeons
o Taille = la taille du bourgeon est donne en rapport avec celui de la cellule
mre :
petit bourgeon: 0<
mre cellule taille
bourgeon taille
<0,5
bourgeon moyen : 0,5
mre cellule taille
bourgeon taille
<0,7
gros bourgeon : 0,7
mre cellule taille
bourgeon taille
o orientation ou direction de croissance du bourgeon (angle )
II.2. Dosage du glucose extracellulaire
II.2.i. Dosage par mthode enzymatique
Le glucose est dos au cours de la fermentation sur un analyseur automatique YSI 27 A
(YELLOW SPRINGS INSTRUMENTS). Son principe repose sur la dtection de l'eau
oxygne libre lors de la transformation du glucose en acide gluconique par une glucose
oxydase fixe sur une membrane. La concentration en glucose est directement donne en
mg.dl
-1
. La prcision de l'appareil est de l'ordre de 10 %, mais la mesure est rapide. Les
concentrations en glucose sont ensuite mesures de manire prcise par HPLC.
La suspension de levures est centrifuge (12000 g, 3 min). Le surnageant est spar du culot
cellulaire et dilu afin de se trouver dans la gamme de linarit de l'appareil (0 2,5 g.l
-1
).
II.2.ii. Dosage par HPLC : cf. III.3
II.3. Dosage glucose, thanol, actate, glycrol.
La mthode par HPLC dcrite ici permet de quantifier, en plus du glucose et de lthanol,
certains composs susceptibles dtre produits au cours dune culture (glycrol, actate,
malate, succinate et lactate).
La suspension cellulaire est centrifuge (12000 g, 3 min). Le surnageant est spar du culot
cellulaire et filtr avant d'tre analys dilu ou non dilu.

79
Appareil :
Chromatographe (WATERS, Alliance 2690) quip d'un rfractomtre
(WATERS) et d'un logiciel d'acquisition et de traitement des donnes.
Colonne Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm).
Conditions opratoires :
Temprature du four : 50C.
Volume d'chantillon inject : 20 l.
Solvant et condition de sparation : H
2
SO
4
5 mM
Dbit phase mobile (H
2
SO
4
5 mM) : 0,5 ml.min
-1
III. Analyses des composants macromolculaires
III.1. Protines : mthode du Biuret (Gornall et al. 1949;Lange et Heijnen 2001)
Les ions Cu
2+
(ajouts sous forme de sulfate de cuivre) se lient aux atomes dazote des liens
peptidiques de la protine dans des conditions de pH alcalin, produisant ainsi un complexe de
couleur mauve avec absorption maximale 540-550 nm.
Matriel spcifique :
Bain-marie 100C
- Tubes en verre
Solutions :
- solution de NaOH 3N (w/v)
- solution de sulfate de cuivre 2,5% (w/v)
- solutions standards de BSA (Bovin Serum Albumin) de 0 5 g.l
-1
Protocole :
- 2 ml de solution standard ou dchantillon contenant les cellules entires
- Ajouter 1 ml de solution de NaOH 3N
- homogniser
- 5 min au bain-marie 100C
- Ajouter 1 ml de CuSO
4
2,5 % : il se forme un prcipit
- centrifuger 5 min 14 000 rpm
- Lecture de la DO du surnageant =550nm.
80
III.2. Carbohydrates (Dubois et al. 1956;Herbert et al. 1971)
Le principe est bas sur la formation dune coloration jaune en prsence dacide sulfurique
concentr et de phnol , qui est mesure au spectrophotomtre 490 nm.
Matriel spcifique : tubes en verre bord pais.
Solutions :
- solution de phnol 5% (w/v)
- acide sulfurique concentr : solution commerciale 95%
- solutions standards de glucose de 0 200 g.l
-1
Protocole :
- 1 ml de solution standard ou dchantillon contenant les cellules entires
- Ajouter 1 ml de solution de phnol 5%
- homogniser
- Ajouter 5 ml dH
2
SO
4
concentr : attention, il faut les rajouter doucement car il y a
un fort dgagement de chaleur
- Attendre 30 min temprature ambiante, ensuite la couleur est stable pendant
plusieurs heures.
- Lecture de la DO =490nm.
III.3. ADN+ARN (Herbert et al. 1971)
Lextraction se fait laide dacide perchlorique 70 C. Ensuite, les quantits dacides
nucliques sont mesures au spectrophotomtre 260 nm.
Matriel spcifique : Tubes en verre centrifugeables.
Solutions :
- solution dacide perchlorique 0,25 N
- solution dacide perchlorique 0,5 N
81
Protocole :
- 25 mg masse sche de cellules entires
- Ajouter 5 ml de solution de HClO
4
0,25 N
- homogniser et laisser 0C pendant 20 min
- Centrifuger 3 min 5000 rpm, 4C. Jeter le surnageant
- Sur le culot de cellules, ajouter 3 ml de solution de HClO
4
0,5 N
- homogniser et laisser 70C pendant 15 min
- Centrifuger 3 min 5000 rpm, 4C.
- Faire deux extractions supplmentaires 70C, pendant 15 min sur le culot
rcupr aprs centrifugation
- Cumuler les trois extraits de 3 ml
- Lecture de la DO =260nm.
La composition des levures en acides nucliques est en moyenne de 10 % de la masse sche.
Sur ces 10 %, le contenu en ADN est trs faible (environ 0,3 %) (Oura 1983). La trs grande
majorit des acides nucliques tant des ARN, la concentration en acides nucliques sera
estime grce la relation 1UDO = 40 g/ml
IV. Analyses des composants lipidiques
La mthode dextraction des lipides a t optimise (cf. partie III). A partir de lextrait
lipidique obtenu, plusieurs quantifications peuvent tre effectues :
- mesure gravimtrique des lipides totaux
- mesure des diffrents lipides neutres et phospholipides par chromatographie
couche mince
- mesure colorimtrique des phospholipides totaux
- mesure colorimtrique des strols totaux
IV.1. Extraction des lipides cellulaires (adapte de la mthode de Stephan et al.,
2004)
La mthode dextraction des lipides sinspire de la mthode utilise par Stephan et al. (2004)
pour lextraction des lipides mycobactriens. Elle a t adapte pour les levures.
82
Matriel spcifique : Tout le matriel en contact avec les lipides doit tre en verre.
- Flacons en verre de 100 ml
- Tubes en verre centrifugeables
- Table agitante 250 rpm
- Rotavapor
- Ballons de 250 ml en verre
- Seringue en verre 250 l
Solutions :
- EDTA 0,1 M
- Mthanol contenant du BHT (butylated hydroxytoluene) 100 mg.l
-1
comme
antioxydant
- Chloroforme contenant du BHT (butylated hydroxytoluene) 100 mg.l
-1
Protocole :
- Le culot cellulaire est dabord lav 3 fois avec une solution dEDTA 0,1 M.
- Les lipides cellulaires sont extraits par 4 extractions successives dune journe,
sous agitation 250 rpm. Lextrait lipidique est rcupr aprs dcantation des
cellules ; les cellules sont alors prtes subir la prochaine extraction.
La proportion des solvants chloroforme (CHCl
3
) et mthanol (MeOH) sont diffrentes suivant
ltape dextraction :
Premire extraction : CHCl
3
/ MeOH (1V:2V)
Deuxime extraction : CHCl
3
/MeOH (1V:1V)
Troisime extraction : CHCl
3
/MeOH (2V:1V)
Quatrime extraction : CHCl
3
/MeOH (2V:1V).
Un volume V =15 ml pour 500 mg de cellules.
- Aprs la quatrime extraction, le culot cellulaire est centrifug et lav deux fois au
chloroforme.
- Toutes les phases organiques sont mlanges et le solvant est vapor au
rotavapor.
- Les lipides sont resuspendus dans 20 ml de CHCl
3
/MeOH (2:1 v/v). Deux lavages
au KCl 0,88% (w/v) sont effectus. Pour cela, est rajout 1 volume de KCl pour 4
volumes dextrait et aprs 10 min dans la glace, les deux phases sont spares par
centrifugation 5 min 3000 rpm.
- La phase organique est alors vapore au rotavapor et lextrait lipidique est
resuspendu dans un volume connu de chloroforme.
- Puis lextrait lipidique est conserv -80 C ou utilise pour lanalyse.
83
Remarque : Si lchantillon a t conserv -80C, il faut vaporer sous un courant dazote,
puis re-suspendre dans du chloroforme pour connatre avec prcision le volume avant
lanalyse des lipides.
IV.2. Dosage des lipides totaux par gravimtrie
Matriel : ballons pour rotavapor de 25 50 ml
Protocole :
Les extractions doivent tre faites sur des quantits importantes de cellules (500 mg).
La quantification par gravimtrie consiste tarer un ballon vide (masse initiale) , puis une fois
que lextraction est faite, lextrait lipidique aprs lavage est transvas dans le ballon puis les
solvants sont vapors au rotavapor. Le ballon doit revenir temprature ambiante avant
dtre pes (masse finale). Lvaporation et la pese sont rptes jusqu ce que deux peses
successives diffrent de moins de 0,5 mg. Par diffrence entre la masse initiale et finale, on
estime le pourcentage des lipides totaux.
IV.3. Dosage des lipides par Chromatographie Couche Mince : CCM
IV.3.i. Solutions talons
Une solution de mlange de tous les standards 0,25 g. l
-1
est prpare dans le chloroforme
partir de solutions mres 5 ou 10 g. l
-1
selon les diffrents standards (cf. tableau 6).
Les standards sont prpars avec prcision par pese des diffrents composs pour se placer
autour de la concentration thorique et les calculs seront faits avec la concentration relle.
La sparation des diffrentes classes lipides se fait sur gel de silice par chromatographie
couche mince. Les diffrents lipides cellulaires se classent en deux groupes : phospholipides
et lipides neutres. Ils sont spars sur deux plaques diffrentes.
84
Tableau 6 : Lipides standards utiliss pour lobtention de la solution standard 0,25 g. l
-1
pour la quantification par CCM, leur fournisseur et rfrence.
Nom du compos Rfrence
L- -Phosphatidylinositol SIGMA P-5766 5mg
Cardiolipin SIGMA C-1649 10mg
L- -Phosphatidyl-DL-glycerol, -oleoyl--palmitoyl (C18:1, [cis]-9/C16:0) SIGMA P-6956 5 mg
L- -Phosphatidyl-Choline, dioleoyl (C18:1, [cis]-9) SIGMA P-6354 25 mg
L- -Phosphatidyl-ethanolamine, dioleoyl (C18:1, [cis]-9) SIGMA P-1223 25 mg
L- -Phosphatidyl-L-srine SIGMA P-6641 5 mg
L- -Phosphatidic acid, dioleoyl (C18:1, [cis]-9) SIGMA P-2767 5 mg
Lanostrol SIGMA L-1504 25 g
Ergostrol SIGMA E 65109
Squalne SIGMA S 3626
Cholesteryl oleate SIGMA C 9253
Ethyl-oleate SIGMA O 9500
Acide Olique MERCK 1.00471
Diolein SIGMA D-8894 50 mg
Triolein SIGMA T-7140 100mg
IV.3.ii. Sparation des lipides neutres par CCM
Matriel :
- cuves en verre pour chromatographie couche mince
- plaque de silice 20x20 cm Alugram
Nano-SIL G/UV
254
pour CCM (Macherey-
Nagel,Germany) : 0,2 mm de nano gel de silice.
- Seringue en verre 10 l pour les dpts
Solutions :
- Solution de standards 0,25 g. l
-1
- Hexane
- Mthyl Tertio Butyl Ether
- Acide actique glacial
Protocole :
Comme leur nom lindique, les lipides neutres ne sont pas des composs chargs. Ils
comprennent : les acides gras libres ou estrifis, les mono-, di- et triglycrides, les strols
libres et estrifis. Ils sont spars en utilisant des solvants peu polaires : Hexane, Mthyl
Tertio Butyl Ether (MTBE),
La sparation des lipides neutres se fait dabord par une migration dans un solvant
hexane/MTBE/acide actique glacial (70 :30 :0,2, v/v) jusqu la moiti de la plaque. La
plaque est sche puis est ralise une deuxime migration jusqu 1 cm du bord de la plaque
avec de lhexane seul (cf. figure 13).
85
Figure 13 : Exemple de plaque obtenue aprs une premire migration avec un mlange
hexane/MTBE/acide actique (70 :30 :0,2, v/v) jusqu la moiti de la plaque, puis une
deuxime migration avec de lhexane seul jusqu 1 cm du bord de la plaque. Ceci permet de
sparer les diffrents lipides neutres. Les trois premiers dpts sont des talons. Les suivants
sont des extraits lipidiques de Saccharomyces cerevisiae CBS8066.
IV.3.iii. Sparation des phospholipides par CCM
Les phospholipides sont des molcules polaires spares en utilisant des combinaisons de
solvant trs polaires : eau, mthanol, chloroforme
La migration se fait en une seule fois avec un mlange :
Chloroforme/Actone/Mthanol/Acide actique/H
2
O (50/15/10/10/4 (v/v) (cf. figure 14). De
telles proportions sont la limite du mlange diphasique. Il faut rester en monophasique.
2
m
e
m
i
g
r
a
t
i
o
n
:

H
e
x
a
n
e
Dpt
Ergostrol
Squalne
Triglycrides
Ester de strol
Ester dacide gras
Acides gras
Lanostrol
Diglycrides
1
r
e
m
i
g
r
a
t
i
o
n
:

h
e
x
a
n
e
/
M
T
B
E
/
a
c
i
d
e

a
c
t
i
q
u
e

(
7
0
:
3
0
:
0
,
2
,

v
/
v
)
1 2 3 4 5 6
86
Figure 14 : Exemple de migration dans un solvant chloroforme/actone/mthanol/acide
actique/eau (50 :15 :10 :10 :5, v/v) permettant de sparer les diffrents phospholipides. Les
quatre premiers dpts sont des talons. Les suivants sont des extraits lipidiques de
Saccharomyces cerevisiae CBS8066.
Remarque : La sparation entre lacide phosphatidique et les cardiolipides nest pas toujours
aussi nette que sur la figure 14.
IV.3.iv. Rvlation des lipides sur plaque de CCM
La rvlation se fait par pulvrisation dune solution CuSO
4
10% (10g de CuSO
4
,5H
2
O dans
100ml de H
3
PO4 8% (v/v)). Une fois la plaque sche, elle est place environ 15 min dans un
four min 150C. Pour cette rvlation, la saturation des acides gras influe sur la coloration.
Elle donne une rponse plus faible avec des acides gras saturs quavec des acides gras
possdant une ou plusieurs insaturations (cf. figure 15). Mais, par rapport aux autres
rvlateurs utiliss (acide sulfurique, actate de cuivre, rhodamine, dichlorofluorescine,
bichromate de potassium dans H
2
SO
4
), il est celui qui prsente le meilleur rapport signal/bruit
de fond.
Dpt
Phosphatidylinositol
Acide Phosphatidique
Phosphatidylsrine
Phosphatidylthanolamine
Phosphatidylcholine S
e
n
s

d
e

m
i
g
r
a
t
i
o
n
Phosphatidylglycrol
Cardiolipides
1 2 3 4 5 6 7
87
Figure 15 : Comparaison du signal du dpt de 1 g dacide starique (18:0), olique (18:1),
et linolique (18:2) sur plaque de silice aprs rvlation au sulfate de cuivre (10% w/v dans
H
3
PO
4
8% v/v).
De plus, aprs analyse du profil dacides gras dans nos conditions, il y a prs de 80 %
dacides gras comportant une insaturation. Nous avons donc choisi des standards composs
dacide olique.
Les plaques sont ensuite scannes en haute rsolution et lintensit des taches est calcule
laide dun logiciel danalyse dimage : Quantity One (Bio-Rad) ou Image Quant (Molecular
Dynamics). Le bruit de fond est retir, toujours grce au logiciel de traitement dimage. Enfin,
pour chaque lipide, une courbe talon est ralise partir de huit dpts de quantits
croissantes (0,25 g 2 g).
IV.4. Dosage phospholipides totaux par une mthode colorimtrique (Rouser et al.
1970)
A partir des extraits lipidiques, les phospholipides totaux peuvent tre quantifis par dosage
du phosphore (P) pour avoir une estimation des phospholipides. Aprs digestion acide
chaud, le phosphore inorganique va ragir avec du molybdate dammonium en donnant une
couleur bleue dont la mesure 800 nm est proportionnelle la quantit de phosphore.
Matriel ncessaire :
- Bloc lectrique chauffant 180C
- Bain-marie deau bouillante 100C
- Tubes en verre : pour les nettoyer laisser pendant une nuit dans de lacide nitrique
30%, puis rincer leau mQ.
.
C18:0
C18:1
C18:2
- 30% + 30%
C18:0
C18:1
C18:2
C18:0
C18:1
C18:2
- 30% + 30% - 30% + 30%
88
Solutions :
- Acide perchlorique concentr (65%)
- Solution de molybdate dammonium (2,5 g dans 100 ml H
2
O mQ)
- Solution dacide ascorbique (10 g dans 100 ml H
2
O mQ, cette solution ne se
conserve pas plus dune semaine 4C)
- Solution stock de KH
2
PO
4
(439 mg.l
-1
dans H
2
O mQ , i.e. 100 g P.ml
-1
)
Protocole :
- 10 20 l dextrait lipidique sont placs dans un tube en verre. Il faut que le
chloroforme se soit totalement vapor.
- Rajouter 0,65 ml dacide perchlorique concentr 65%
- Placer les tubes dans un bain de sable 180C pendant au moins 1 h. Il faut
attendre que la coloration jaune-marron ait disparue.
- Une fois les tubes refroidis, ajouter 3,3 ml de H
2
O mQ, 0,5 ml de la solution de
molybdate et 0,5 ml dacide ascorbique les uns aprs les autres. Il faut vortexer
entre chaque ajout.
- Placer ensuite les tubes 5 min dans un bain-marie 100C
- Laisser refroidir et lire labsorbance 800nm.
Paralllement, les solutions dtalonnage sont prpares. A partir de la solution stock
KH
2
PO
4
, sont prpares diffrentes solutions pour obtenir 0 5 g P par tube dans 3,3 ml
dH
2
O mQ. 0,65 ml dacide perchlorique est rajout et les standards suivent le mme
protocole que les chantillons, sauf quils ne sont pas chauffs 1h 180C. Normalement,
5 g P donne une absorbance de 0,9.
IV.5. Dosage des strols totaux par une mthode colorimtrique (Zak 1957)
Le principe est bas sur la solubilisation des strols par addition dune solution de chlorure de
fer dacide sulfurique et dacide actique glacial. Il se forme une coloration rouge-pourpre qui
est mesure au spectrophotomtre 450 nm.
89
Matriel ncessaire : Tubes en verre : pour les nettoyer laisser pendant une nuit dans de
lacide nitrique 30%, puis rincer leau mQ.
Solutions :
- Acide actique glacial
- Solution de chlorure ferrique de composition suivante :
o 4 ml dune solution 2,5 % FeCl
3
,6H
2
O dans 85 % dacide
O-phosphorique.
o 46 ml avec lacide sulfurique. Lacide sulfurique est additionn juste avant
lutilisation de la solution de chlorure ferrique
- Une gamme talon de 0,1 1 mg.ml
-1
dergostrol est prpare dans le
chloroforme (le chloroforme est sch sous azote )
Protocole :
- 100 l dextrait lipidique ou de solution talon sont schs sous azote
- Rajouter 3 ml dacide actique glacial et 2 ml dune solution de chlorure ferrique
dans chaque tube
- Les tubes sont agits et la coloration est mesure au spectrophotomtre la
longueur donde de 450 nm, contre un tmoin blanc (seulement les solutions
dacide actique et de chlorure de fer).
.
La quantit de strols est ensuite dtermine partir de la gamme talon, puis ramene la
masse sche de biomasse.
IV.6. Dosage des acides gras par chromatographie gazeuse (Rozs 1992;Rozs et al.
1992)
Les acides gras sont saponifis en prsence de mthanol en milieu alcalin 100C. Les esters
mthyliques obtenus sont doss par Chromatographie en Phase Gazeuse.
Matriel :
- tubes en verre
- Seringue en verre 250 l
- Chromatographie en phase gazeuse : Hewlet-Packard 5890 connect un
ordinateur HP Vectra. Le logiciel dacquisition est le Software Chemstation
(Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA). La colonne utilise est une
FFAP-HP 30m x 0,25mm x 0,25 m (Agilent). Linjection de lchantillon se fait
par lintermdiaire dun injecteur automatique HP 7673 (Agilent).
90
Solutions :
- Solution de NaOH 5% (w/v) dans mthanol/H
2
O (v/v)
- Solution de HCl 5N
- Solution de Hexane/MTBE (v/v)
- Solution de standard et dtalons internes : les diffrents standards sont donns
dans le tableau 7. Les talons internes sont donns dans le tableau 8.
Tableau 7 : Noms communs, rfrences, nombre de carbones et dinsaturations (C nombre de
carbones :nombre dinsaturations) des standards dacides gras utiliss pour la quantification
par chromatographie gazeuse
Nomde lacide gras Rfrence Nombre de C : Nombre dinsaturations
Acide caproque SIGMA C2250 C6
Acide octanoque SIGMA 15,375-3 C8
Acide Caprique SIGMA C1875 C10
Acide Laurique SIGMA L4250 C12
Acide Myristique SIGMA M3128 C14
Acide Myristolque SIGMA M3525 C14 :1
Acide Palmitique SIGMA P5585 C16
Acide Palmitolque SIGMA P9417 C16:1
Acide Straque SIGMA S4751 C18
Acide Olique MERCK 1.00471 C18:1
Acide Linolique SIGMA L1376 C18:2
Acide Linolnique SIGMA L2376 C18:3
Acide Arachidique SIGMA 13631 C20
carbones : nombre dinsaturations) des talons internes dacides gras utiliss pour la
quantification par chromatographie gazeuse
Nomde lacide gras Rfrence Nombre de C : Nombre dinsaturations
Acide Heptanoque SIGMA H9378 C7
Acide Heptadcanoque SIGMA H3500 C17
Le C7 est utilise pour la quantification des acides gras de moyenne chane (C6 C14). Le
C17 est utilis pour quantifier les acides gras de longue chane (C16 C20).
91
Protocole :
- Entre 10 et 15 mg masse sche de cellules sont placs dans un tube en verre,
pralablement nettoy lacide nitrique 30 % pendant plusieurs heures, puis rincs
leau mQ.
- Ajouter 1 ml NaOH 5% (w/v) dans mthanol/H
2
O (v/v) et 10 l dtalon interne
- Vortexer
- Placer 30 min 100C
- Laisser refroidir
- Ajouter 500 l de HCl 5N pour neutraliser le mlange
- Vortexer
- Deux extractions successives avec 300 l de Hexane/MTBE (v/v) : 3 intervalles de
30 secondes dagitation et 1 min de repos, avant de rcuprer la phase organique
(phase suprieure) laide dune seringue en verre de 250 l. La phase organique
est ensuite place dans un vial.
Condition de lanalyse chromatographique :
- Le programme de temprature est : 140C + 4C.min
-1
jusqu 240C
- Temprature injecteur : 250C
- Temprature dtecteur : 280C
- Gaz vecteur : Hlium, dbit 1,2 ml.min
-1
V. Analyse des composants paritaux (Aguilar-Uscanga et Franois 2003a;Dallies et
al. 1998)
V.1. Extraction des parois cellulaires
Les cellules sont casses avec des billes de verre. Aprs plusieurs lavages avec du tampon TE,
les parois sont rcupres par centrifugation.
Matriel :
- Billes de verre (diamtre compris entre 0,2 et 0,5 mm)
- Appareil de cassage FastPrep
et tubes adapts
Solutions :
- Tampon TE froid (Tampon Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM)
- Eau distille
92
Protocole:
- Environ 50 mg masse sche de cellules sont transfrs dans un tube eppendorf
vis et lav 3 fois leau distille.
- Resuspendre le culot dans 50 l de TE froid
- Rajouter 0,45 g de billes de verre
- Broyer alors les chantillons au bead-beater par run de 20s la vitesse maximale.
Au moins 6 run sont raliss. Le taux de broyage se vrifie au microscope.
- Transfrer la suspension cellulaire alors dans un tube de 15 ml.
- Laver les billes au moins 5 fois avec du TE.
- Les lavages et la suspension initiale sont mlangs et centrifugs 4000tr.min
-1
pendant 5 min.
- Reprendre le culot dans 1ml de TE et le transfrer dans un tube eppendorf
- Centrifuger 2 min 5000 tr.min
-1
. Le culot est alors lav plusieurs fois avec du TE
(jusqu ce que le surnageant soit clair).
- Les parois ainsi obtenues sont resuspendues dans 0,5 ml de tampon TE et
conserves 20C.
V.2. Dosage sucres totaux
Le principe est bas sur la formation dune coloration jaune en prsence dacide sulfurique
concentr et de phnol , qui est mesure au spectrophotomtre 490 nm (Dubois et al. 1956).
Matriel :
- Tube hmolyse
- Bain-marie 30C
Solutions :
- Solution de phnol 5% (w/v)
- H
2
S0
4
concentr 95%
- solutions standard de glucose/mannose (50/50) de 5 200 g/ml
Protocole:
- 200 l de suspension de paroi (ou 200 l de solution standard) sont placs dans un
tube hmolyse
- Rajouter 200 l de Phnol 5% (w/v)
93
- Puis, 1 ml de H
2
S0
4
concentr est lentement rajout car la raction est
exothermique
- Aprs homognisation et refroidissement des tubes, les placer dans un bain-marie
20 min 30C
- Lire ensuite labsorbance =490 nm
V.3. Dosage de la chitine (Molano et al. 1977;REISSIG et al. 1955)
Aprs hydrolyse de la chitine en N-actyl-glucosamine de manire enzymatique, le
N-actyl-glucosamine est dos grce au ractif de Reissig. Il se forme une coloration violette
dont lintensit, proportionnelle la quantit de N-actyl-glucosamine, se mesure au
spectrophotomtre 585 nm.
Matriel :
- Tubes hmolyse
- Bain-marie 80C
- Bain-marie 100C
- Bain-marie 37C
- Table agitante 37C
Solutions :
- Solution de KOH 6% (w/v)
- Tampon phosphate 50 mM pH 6,5
- Solution de ttraborate de potassium 0,27 M, pH 9,0
- Ractif de Reissig obtenu par dilution du ractif de Reissig 10X : 10 g
4-dimethylaminobenzaldehyde, 12,5 ml HCl 10 N et 87,5 ml Acide actique
glacial. Le Reissig 10X est stable pendant plusieurs mois 4C et labri de la
lumire.
- Eau distille
- Solutions de N-actyl-glucosamine (0 10 mM) pour la calibration
- Zymolyase 20 T (Seikagaku corporation)
- chitinase de Serratia marcescens (SIGMA))
Protocole :
- 50 mg masse sche de cellules sont centrifugs 4000 g, 3 min
- Le culot est lav plusieurs fois leau
- 1 ml de KOH 6% (w/v) est rajout au culot et le tout est transfr dans un tube en
verre pyrex.
- Le tube est plac 80C pendant 90 min.
94
- Ajouter alors 0,5 ml acide actique glacial
- Refroidir le tube dans la glace
- Centrifuger 4000g pendant 3 min
- Laver le culot 2 fois avec de leau, puis avec du tampon phosphate.
- Resuspendre le culot dans 0,5 ml de tampon phosphate
- Rajouter 5U de zymolyase 0,1 unit.l
-1
et 250 mU de chitinase en solution 5
units.ml
-1

- La raction se fait sous agitation douce 37C pendant une nuit.
- A 100 l de milieu ractionnel, sont ajouts 150 l de H
2
O et 250 l de ttraborate
de potassium
- Placer le tube dans un bain-marie 100C pendant 8 min
- Laisser refroidir dans la glace.
- Rajouter 3 ml de ractif de Reissig 1X
- Aprs incubation 37C pendant 20 min, labsorbance est lue 585 nm
V.4. Dosage des mannanes et des glucanes
Aprs hydrolyse acide des mannanes et des glucanes, le mannose et glucose respectivement
forms sont doss par HPAEC (High performance Anion-exchange Chromatography).
V.4.i. Hydrolyse acide
Les parois obtenues prcdemment sont hydrolyses en milieu acide chaud.
Matriel :
- Etuve 30C
- bain-marie 100C
Solutions :
- Solution de H
2
SO
4
72%
- Solution dhydroxyde de baryum sature
- Eau distille
Protocole :
- 100 l de paroi sont transfrs dans un tube eppendorf vis
- Eliminer le surnageant aprs centrifugation 10000 tr.min
-1
pendant 30s
95
- Rajouter 50 l de H
2
SO
4
72%
- Laisser 3h 30C
- La concentration en acide est ramene 2N par ajout de 650 l deau.
- Placer alors les tubes dans un bain-marie 100C. La raction est arrte dans la
glace au bout de 4 h.
- Diluer lacide par ajout de 6 ml deau
- Neutraliser lacide par ajout dune solution dhydroxyde de baryum sature. 5,5 ml
de la solution de baryum sont ajouts goutte goutte en homognisant
rgulirement. Il se forme alors un prcipit de sulfate de baryum. Les ions sulfate
perturberaient lanalyse HPAEC. Il faut donc vrifier que lon a bien tout
neutralis en mesurant le pH qui doit dpasser 7. Si le pH est infrieur 7, il faut
rajouter du sulfate de baryum.
- Ajuster le volume avec de leau pour avoir une concentration en sucres de
50 g.ml
-1
au maximum.
- Eliminer le prcipit par centrifugation une premire fois 4000 g pendant 10 min,
puis, une deuxime fois, aprs une nuit 4C.
V.4.ii. Dosage par HPAEC (High Performance Anion-Exchange
Chromatography)
Les contenus en glucose et mannose des chantillons de parois hydrolyses ont t analyss
en chromatographie haute performance changeuse danion (HPAEC), couple une
dtection par ampromtrie pulse.
Matriel :
- HPAEC (High performance Anion-exchange Chromatography) :
Chromatographe DX 500 avec dtection ampromtrique
Logiciel : Dionex chromeleon
Colonne : CarboPac PA-10 (250 mm x 4 mm)
Conditions opratoires :
- Volume d'chantillon inject : 20 l
- Phase mobile : NaOH 18mM
- Dbit phase mobile (NaOH 18 mM) : 1 ml.min
-1
96
Cette technique permet de sparer le glucose (rsultat de lhydrolyse des glucanes), le
mannose (rsultat de lhydrolyse des mannanes) et glucosamine (rsultat de lhydrolyse de la
chitine). Le temps dhydrolyse ntant pas le mme pour la chitine et pour les glucanes et les
mannanes, la chitine sera estime par dosage enzymatique (Aguilar-Uscanga et Franois
2003b).
VI. Analyse du contenu en rserves intracellulaires (Parrou et Franois 1997)
Les rserves intracellulaires sont hydrolyses par des enzymes spcifiques :
l-amyloglucosidase pour le glycogne et la trhalase pour le trhalose. Le glucose libr est
ensuite dos par la mthode de la glucose oxydase.
VI.1. Lyse des cellules
La lyse des cellules permet d'extraire les rserves intracellulaires.
Matriel : bain-marie 95C
Solutions :
- Solution de carbonate de calcium 0,25 M
- Solution d'acide actique 1M
- Solution d'actate de sodium 0,2 M pH 5,2.
Protocole:
- centrifuger 12000 g, 5 min un volume de suspension cellulaire quivalent 7 mg
de biomasse sche.
- Le culot cellulaire est alors suspendu dans 250 l de carbonate de calcium 0,25 M
et incub 3 heures 95C.
- Rajouter 150 l d'acide actique 1M et 600 l d'actate de sodium 0,2 M pH 5,2.
VI.2. Dgradation du trhalose en unit glucose
La dgradation du trhalose en unit glucose est de type enzymatique.
Matriel : table agitante 37C
97
Solutions :
- Trhalase (SIGMA) 0,1 U/ml (prpare dans de l'actate de sodium 0,2 M pH
5,2)
Protocole:
- Prlever 500 l de l'extrait prcdemment prpar
- Ajouter 20 l de trhalase et laisser incuber une nuit 37C
- Centrifuger 12000 g, 3 min
- Doser le glucose libr dans le surnageant par la mthode de la glucose oxydase.
VI.3. Dgradation du glycogne en unit glucose
Matriel : chambre dincubation 56C
Solutions :
- d' -amyloglucosidase (BOEHRINGER MANHEIM) 8 UI/mL (prpare dans
de l'actate de sodium 0,2 M pH 5,2)
Protocole:
- Prlever 500 l d'extrait et ajouter 20 l d'-amyloglucosidase
- Incuber une nuit 56C
- Centrifuger 12000 g pendant 3 min
- Doser le glucose libr dans le surnageant par la mthode de la glucose oxydase
VI.4. Dosage du glucose libr
Le glucose est dos l'aide du kit enzymatique 510 A (SIGMA) par la mthode de la
glucose oxydase.
Matriel :
- Etuve 37C
- Plaque de microtitration 96 puits
98
Solutions :
- Kit enzymatique 510 A (SIGMA)
- Solutions talons de 0 300 mg.l
-1
de glucose partir de la
solution de glucose fournie 1 g.l
-1
Protocole :
- 20 l d'chantillon ou d'talon sont dposs dans une plaque de microtitration
- 200 l de ractif contentant les enzymes et la o-dianisine sont dposs dans chaque
puit
- Laisser incuber 30 minutes 37 C
- L'absorbance est mesure 490 nm sur un lecteur de plaques (Labsystem,
Multiscan Ascent) par rapport une solution tmoin constitue de 20 l d'eau
distille et de 200l de ractif.
VII. Mtabolites intracellulaires
Les cellules sont rcoltes directement la sortie du fermenteur dans une solution de
mthanol 60% 40C pour bloquer instantanment le mtabolisme. Les mtabolites sont
extraits avec de lthanol 80C (Gonzalez et al. 1997). Ils sont ensuite quantifis par
HPAEC.
VII.1. Extraction : selon la mthode de Gonzalez et al. 1997
Matriel :
- Bain-marie 80C
- Rotavapor
Solution :
- Solution de mthanol 60% (v/v), HEPES 10mM pH 7.5 40C
- Eau distille
- Solution dthanol dilue 75% (v/v) avec de lHepes, 70 mM pH 7.5
Protocole:
- Au moins 10 mg de cellules sont recueillies le plus rapidement possible par
quenching dans une solution de mthanol 60% 40C. Le volume dchantillon
ne doit pas dpasser 1/5 de la solution de quenching (habituellement, 5 ml
dchantillon pour 25 ml de solution 40C)
99
- Centrifuger rapidement 5000 rpm pendant 5 min 10C
- Eliminer le surnageant
- 5 ml de solution dthanol sont aussitt rajouts
- Placer 3 min dans un bain-marie 80C
- Les chantillons sont alors concentrs avec un rotavapor
- Resuspendre les chantillons dans 1 ou 2 ml deau
- Centrifuger 5000 rpm pendant 10 min 4C
- Le surnageant peut alors tre analys ou congel 20C (viter plus de deux
conglations/dconglations cause de la dgradation de certains mtabolites
(ATP, PEP, pyruvate).
VII.2. Quantification par HPAEC Dionex
Cette technique permet de dterminer les contenus intracellulaires en terme de :
- sucres phosphoryls : Glucose-6-P, Fructose-6-P, Fructose-1-6-P, Trehalose-6-P,
Fructose-1-P,
- nuclotides phosphates : AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, UDP, UTP,
UDP-glucose, UDP-acttylglucosamine.
- acides organiques : actique, formique, pyruvique, malique, fumarique, citrique, PEP,
-cetoglutarate
Matriel :
Le systme utilis est un systme DX 500 avec Chromeleon comme logiciel de commande
(Dionex, Sunnidale, CA , USA). Le gradient est assur par un systme de pompes GP40.
Lchantillonneur AS50 permet de garder les chantillons 4C. Les dtections se font grce
un dtecteur lectrochimique ED40 coupl un dtecteur barrette de diode PDA100.
100
35 65
100
Temps min
Actate de Na mM
0
500
0 75
350
0
30
60
0 30 60 45
12
Temps min
NaOH mM
0
20
40
0 30 60 45
8
Temps min
NaOH mM
Protocoles:
1. Nuclotides et nuclotides glycosyls
- Colonne : IonPac AS11 avec AG11 comme pr-colonne.
- Phase mobile : NaOH
Dbit : 1,5 ml.min
-1
- Dtection : conductimtrie couple une quantification 260 nm
2. Acides organiques
- Colonne : IonPac AS11H avec AG11H comme pr-colonne.
- Phase mobile : NaOH + 10 % mthanol
Dbit : 1,5 ml.min
-1
- co-lution Dtection : conductimtrie couple une dtection UV
3. Sucres phosphoryls
- Colonne : CarboPac PA1.
- Phase mobile : Actate de sodium + NaOH 50 mM
Dbit : 1 ml.min
-1
- Dtection : ampromtrie couple dtection UV
101
VIII. Analyse des profils dexpression des gnes par lutilisation de puces ADN de
type microarray
VIII.1. Obtention des ARNm
VIII.1.i. Echantillonnage des cellules
Les cellules sont rcoltes dans lazote liquide pour bloquer instantanment le mtabolisme.
VIII.1.ii. Extraction des ARN
Matriel :
- MicroDismenbrator (Braun, Melsungen)
- Midi kit Rneasy Qiagen
Solution :
- H
2
0-DEPC
- Solution de LiCl-DEPC 4M (LiCl 4M dans H
2
0-DEPC)
- Solution dthanol 70 % (v/v)
Protocole:
- Lextraction commence par un cassage mcanique des cellules (environ 10 mg masse
sche). Le matriel utilis est pralablement plac dans lazote liquide afin dviter
toute dconglation des cellules pouvant perturber leur profil transcriptionnel. Le
cassage se fait laide dune bille de tungstne de 7 mm de diamtre sur environ
10 mg de masse sche de cellules, avec un microDismenbrator dont la vitesse
dagitation est fixe 2600 rpm pendant 2 min.
- La purification des ARN est ralise grce au Rneasy midi kit de QIAgen. Tout
dabord, les fragments de cellules sont rcuprs dans un tube falcon contenant 1,9 ml
de tampon RLT et 19 l de -mercaptothanol par une centrifugation 4000 rpm
pendant 5 min. Le surnageant est ensuite purifi selon le protocole fournit avec le kit.
les ARN sont dabord fixs sur une colonne RNeasy et aprs plusieurs lavages avec
les tampons fournis pour enlever les fragments de cellule, une tape dlution leau
traite au DEPC permet de dcrocher lARN.
- Ces ARN sont alors transfrs dans un tube eppendorf et gards dans la glace
102
- Afin dliminer un maximum des protines restantes, il faut prcipiter pendant 1 heure
-20C aprs action de 500 l de LiCl-DEPC 4M.
- Centrifuger 15 000 rpm, 4C, 30 min
- Le culot est lav deux fois avec 250 l dthanol 70 %.
- Centrifuger 5 min, vitesse maximale
- Lthanol est enlev laide dune pipette et le culot est sch lair
- Redissoudre le culot dans 50 l de H
2
O-DEPC.
VIII.1.iii. Vrification de la qualit des ARN :
La qualit et la quantit de lARN extrait sont alors vrifies par lecture de labsorbance
280 nm (absorbance des protines) et 260 nm (absorbance des nuclotides), puis par
migration sur un gel dagarose (0,8 %).
La qualit et la concentration en ARN sont aussi mesures grce lAgilent 2100 bioanalyzer.
Le principe de cet appareil est de faire migrer les chantillons par lectrophorse capillaire sur
gel de polyacrylamide. Les ARN sont visualiss et quantifis par fluorescence. Il faut diluer
les chantillons au 1/50
me
pour se situer dans la fourchette danalyse de 5 500 ng.l
-1
dARN total.
Pour des ARN de bonne qualit :
- en terme de contamination protique : 1 , 2 8 , 1
280
260

nm
nm
DO
DO
- en terme de dgradation des ARNm: partir de laspect des ARNs ribosomiques
(Agilent 2100 Bioanalyzer) : 7 , 1
18
28
S
S
ARN
ARN
VIII.2. Prparation des sondes et des lames
Aprs extraction de lADN gnomique de la levure, les ORFs (Open Reading Frame) sont
amplifies par PCR avec des amorces spcifiques. Ces amorces prsentent des tag leur
extrmit. Ces tag sont des squences identiques pour les amorces de tous les gnes.
Pour chaque amplification, lenzyme utilise varie selon la taille des fragments amplifier
mais le programme reste le mme (cf. tableau 9).
103
Tableau 9 : Procdure damplification des ORFs de levure.
Fragments < 3kb Fragments >3kb
ADN gnomique 1 l 1 l
Tampon 10 l de tampon 10X buffer
(10mM TRIS-HCL, 500mM KCl,
15mM MgCl
2
)
10 l
tampon 1 du kit long expand
(Boehringer Mannheim)
dNTP
(25mM chacun)
1 l 1 l
Amorce 1
Amorce 2
2 l
2 l
2 l
2 l
Enzyme 0,3 l de Taq polymrase (Sigma)
0,3 l de pfu polymrase (Promega)
1l denzyme mix du kit long
expand (Boehringer Mannheim)
H
2
O mQ Complter 100l
Le programme damplification est le suivant : 94C pendant 2min, suivi de 10 cycles (10 sec 94 C, 30 sec 55
C, 8 min 68 C) et de 25 cycles (10 sec 94 C, 30 sec 55 C, 8 min 68 C + 20 sec par cycle supplmentaire
68C) et enfin 7 min 68C
La prsence du fragment dADN amplifi est contrle sur gel dagarose 0,8 %.
Les lames utilises sont des dendrilames (Le Berre et al. 2003). Les sondes ont t spottes
la Plateforme Transcriptome-Biopuce de Toulouse. Les dpts ont t faits par un jeu de 4x4
aiguilles sur la lame de verre pralablement active, puis fixs de manire covalente (Le Berre
et al. 2003). Chaque aiguille spotte un bloc de 21 lignes sur 20 colonnes. Chaque ORF est
spott en duplicat, lun cot de lautre sur la mme ligne. Il y a en tout 32 blocs (8 lignes de
blocs x 4 colonnes) de 420 dpts (soit 210 ORFs diffrents environ car il y a des spots
vides). En tout, il y a 6074 ORFs en duplicat soit 12148 dpts sur chaque lame.
VIII.3. Rtrotranscription en ADNc et marquage
Les ARN messagers sont retrotranscrits laide dune transcriptase reverse en prsence de
nuclotides dCTP marqus par un fluorochrome Cy5 ou Cy3. Les ADN complmentaires
marqus ainsi obtenus sont les cibles hybrids sur lame de verre.
Matriel : bain-marie 37C, 42C et 70C.
104
Solutions :
- Ractifs fournis dans le kit CyScribe First-Strand cDNA Labelling (Amersham
Biosciences)
- NaOH 2,5 M
- HCl 2M
Protocole :
Les ARN sont gards dans la glace tout au long du mlange des ractifs.
Un premier mlange est ralis, tel que le volume final soit 11 l.
20 g dARN totaux X l
Random nonamers 1 l
Oligo(dT) 1 l
Eau (fournie dans le kit) Y l
Total 11 l
X est le volume de solution dARN prlev pour avoir 20 g dARN totaux. Il est calcul
partir de la concentration en ARN totaux de lchantillon donne par lAgilent 2100
bioanalyzer. Y est le volume deau ajoute qui est ajust en fonction de X.
Le mlange ainsi obtenu est homognis par pipetages successifs et plac 70C pendant
5 min. Puis, il est laiss 10 min temprature ambiante : les primers shybrident aux ARNm.
Lchantillon est centrifug 30 s pour collecter tout le mlange, puis est plac dans la glace.
Sont alors rajouts les lments suivants dans lordre :
5 x CyScript buffer 4 l
0.1 M DTT 2 l
dCTP nucleotide mix 1 l
dCTP CyDye-labelled nucleotide 1 l
CyScript reverse transcriptase 1 l
Total 20 l
Aprs avoir vortexer et centrifuger 30 s, les tubes sont incubs 2 h 42C pour la synthse
des cDNA marqus.
Les ARN sont ensuite hydrolyss par ajout de 2 l de NaOH 2,5 M et laisss 15 min 37C.
Pour neutraliser, 10 l de solution acide chlorhydrique 2M sont ajouts.
105
Les ADNc marqus sont ensuite purifis sur colonne CyScribe GFX (Amersham
Biosciences). Les colonnes permettent de purifier des fragments de taille suprieure 50
bases.
Tout le mlange est plac dans une colonne, o ont t dposs au pralable 500 l de
Capture buffer fournit dans le kit. Aprs centrifugation vitesse maximale pendant 30 s dans
une microcentrifugeuse, la colonne est lave trois fois avec 600 l de tampon de lavage
fournit dans le kit. Les ADNc sont enfin lus avec 60 l de tampon dlution fournit.
VIII.4. Qualit de la rtrotranscription
La purification sur colonne permet de se dbarrasser des nuclotides non incorpors. La
qualit du produit, ainsi obtenu aprs rtrotranscription et purification, a pu tre estime par :
- la quantit dacides nucliques prsents
- la quantit de Cy3 et de Cy5 incorpor dans les acides nucliques
Pour avoir une ide des quantits dacides nucliques prsents, le flurochrome Ribogreen a
t utilis. Dans le kit Ribogreen (Molecular Probes) est fournie une solution de TE 20X qui
sera dilue dans H
2
O DEPC, et le ribogreen 200X qui sera dilu dans du TE.
4 l dchantillon sont dilus dans 80 l dH
2
O DEPC et placs dans une plaque de
microtitration de 96 puits. Le Ribogreen est rajout 5 min avant la lecture.
Pour la quantification de la fluorescence des Cy3 et des Cy5, 6 l dchantillon sont dilus
dans 14 l H
2
O DEPC et placs dans une plaque de microtitration de 384 puits.
La lecture se fait grce au Typhoon 9400 (Amersham bioscience) en ajustant les longueurs
donde dexcitation et dmission des diffrents fluorochormes (cf. tableau 10).
Tableau 10 : Longueurs donde dexcitation et dmission des diffrents fluorochromes
utiliss
Excitation (nm) Emission (nm)
Ribogreen 500 525
Cy3 532 570
Cy5 633 670
Ces techniques nont t utilises ici que pour comparer des quantits relatives entre
chantillons. Pour avoir des quantits absolues, il faudrait tablir des courbes dtalonnage.
106
VIII.5. Hydridation
10 l de cibles sont mlangs 300 l de RibeHybe (Ventana), avant dtre dposs sur lame.
Lhybridation se fait par hybridation automatique grce au systme Discovery (Ventana),
avec les paramtres suivants :
- temprature hybridation : 42C
- temps dhybridation : 10h
- Rincage : 2X SSC
VIII.6. Lecture du signal
Les lames sont scannes avec le Scanner GenePix 4000 (AXON INSTRUMENT) et le
logiciel GenePix Pro 3.0 (AXON INSTRUMENT).
VIII.7. Analyse des donnes
VIII.7.i. Normalisation
Aprs traitement des images et avant toute utilisation des donnes, il faut passer par une tape
de normalisation pour palier aux diffrences entre les lames et entre les marquages. La
normalisation se fait par lintermdiaire du logiciel Bioplot (http://biopuce.insa-toulouse.fr).
VIII.7.ii. Identification des gnes diffrentiellement exprims : test de
Student
Ensuite, pour comparer deux conditions A et B, il faut identifier les gnes qui varient dune
condition lautre. Pour cela, on commence par calculer les moyennes m
A
et m
B
. m
A
et m
B
sont les moyennes associes aux deux lots de donnes comparer pour un gne donn.
Une analyse du rapport
B
A
m
m
de sous ou sur-expression ne suffit pas pour conclure. Pour
poursuivre lanalyse, il faut appliquer un test statistique pour savoir si le gne est
significativement diffrent entre les deux conditions, cest--dire si la diffrence entre m
A
et
m
B
nest pas due aux erreurs exprimentales. Le test utilis est le test de Student.
107
Le test de Student permet de comparer deux lots de donnes. Il renvoie une probabilit qui
permet de dire pour chaque gne, si le test est significatif, cest--dire si les deux lots de
donnes peuvent tre considrs comme diffrents.
Pour calculer la probabilit de Student associe chaque gne, il faut dabord calculer le
nombre Ts selon la formule suivant :
( )
n
s s
m m
Ts
B A
B A
2 2
+
=
O n= nombre de valeurs servant au calcul de m et s
m= moyenne sur les n spots correspondant un mme gne
s= cart-type associ aux n valeurs. Il value lerreur exprimentale.
A partir de Ts, il existe des tables qui renvoient la probabilit de Student associe.
Dans nos conditions, nous travaillons avec les ratios dintensit des fluorochromes et nous
utilisons des valeurs logarithmiques.
Ensuite, un seuil pour que le test soit significatif est fix 5%. La probabilit de Student
calcule pour un gne donn est alors compare au seuil : si P>5%, le test nest pas
significatif et si P<5% le test est significatif. Si le test est significatif, alors il y a moins de 5%
de chance de se tromper en disant que m
A
et m
B
sont diffrentes.
Lapplication du test de Student se fait via logiciel Bioplot (http://biopuce.insa-toulouse.fr).
VIII.7.iii. Calcul du nombre de rptitions ncessaires
Pour tenir compte des variabilits exprimentales de la technique, il est ncessaire de faire des
rptitions. Plus il y aura de rptitions, plus nous aurons de prcision sur la mesure. Mais il
sagit de technologies onreuses donc il faut limiter le nombre dexpriences. Nous avons
donc mis en place une stratgie pour estimer un nombre de lames suffisant en fonction de la
prcision souhaite sur le ratio dexpression. En utilisant le test de Student et lerreur
moyenne sur lensemble du processus exprimental, nous pouvons estimer le ratio seuil de
sous- ou sur-expression pertinent pour un nombre de rptitions donn.
108
a. Estimation lerreur exprimentale moyenne
Lvaluation de lerreur exprimentale repose sur la comparaison de lames obtenues dans les
mmes conditions. Pour chaque condition, trois extractions indpendantes sont effectues.
Afin de cumuler lensemble des erreurs du processus, chaque extraction suit un processus
indpendant de rtrotranscription et dhybridation (cf. figure 16).
Figure 16 : Schma rcapitulatif de la dmarche exprimentale aboutissant lestimation de
lerreur exprimentale globale du processus.
Un calcul de rsidu va permettre destimer lerreur exprimentale moyenne entre lames
indpendantes. Un rsidu reprsente la diffrence entre la valeur observe et la valeur
attendue. Le calcul se fait en comparant les lames deux deux. Il faut dabord tracer les
corrlations entre les valeurs exprimentales yi = f((xi) o yi= valeur normalise du ratio des
intensits de chaque fluorochrome du spot i pour la lame 2 et xi = valeur normalise du ratio
des intensits de chaque fluorochrome du spot i pour la lame 1. yi et xi sont des valeurs
logarithmiques. Sans erreur exprimentale, les points (xi,yi) se trouveraient sur la droite
dquation y=x. Le principe de dtermination du rsidu est donc de calculer lcart entre les
points (xi,yi) et la droite y=x.
Enfin, le rsidu moyen r
moyen
sobtient par la formule suivante :
1
2
r
=
n
xi yi
moyen
o n=le nombre de spots sur la lame.
Le pourcentage derreur exprimentale sobtient partir du rsidu moyen :
% derreur exprimentale = (1- 10
rmoyen
)x100.
Dendrilame 1
Dendrilame 2
Dendrilame 3
R.T. B-1
R.T. B-2
R.T. B-3
R.T. A-2
R.T. A-3
R.T. A-1 ARN A-1
ARN A-2
ARN A-3
ARN B-2
ARN B-3
ARN B-1
Echantillon A
Echantillon B
Dendrilame 1
Dendrilame 2
Dendrilame 3
R.T. B-1
R.T. B-2
R.T. B-3
R.T. A-2
R.T. A-3
R.T. A-1 ARN A-1
ARN A-2
ARN A-3
ARN B-2
ARN B-3
ARN B-1
Echantillon A
Echantillon B
109
Les erreurs cumules pour les lames de verre conduisent un pourcentage derreur
exprimentale moyen denviron 30%.
Remarque : Dans cette stratgie, nous navons pas tenu compte des diffrences de marquage
entre les fluorochromes. Nous aurions du faire "un dye switch" sur les donnes, cest--dire
de marquer chaque chantillon alternativement avec lun et lautre des fluorochromes.
b. Estimation du ratio seuil et du nombre de lames
Aprs le calcul de lerreur exprimentale, le test de Student est appliqu avec une probabilit
seuil de 5%. A cette probabilit de 5% est associ un nombre de Student Ts qui va dpendre
du nombre de rptitions. En effet, soit N le nombre de lames, Ts sexprime de la manire
suivante :
=
N
rmoyen
M M
Ts
B A
2
o M
A
et M
B
sont les moyennes des intensits des spots de toutes les
lames pour les conditions A et B et rmoyen reflte lerreur exprimentale moyenne, il a t
calcul plus haut.
Ainsi, une diffrence M
A
-M
B
est associe un nombre de lames donn et un seuil de
probabilit donn. Comme nous travaillons, en valeurs logarithmique: ) log( / B A B A R M M = .
O R
A/B
est le ratio des intensits entre les deux conditions.
Il est vident que plus il y aura de rptitions, plus on pourra abaisser le seuil de dtection du
ratio de sur ou sous-expression. Il faut alors trouver un bon compromis entre un minimum de
lames et un rapport seuil intressant.
Tableau 11 : Relation entre le nombre de rptitions ncessaires et le ratio seuil
statistiquement dtectable au-del duquel un gne peut-tre rationnellement dclar
diffrentiellement exprim entre deux conditions, avec une erreur exprimentale estime
30%.
Nombre de lames N 9 6 5 4 3 2
Rapport seuil R 1,3 1,4 1,5 1,6 1,8 3
110
Il semble donc que 3 lames par condition soit un bon compromis entre nombre de lames
et niveau de sous- ou sur-expression mis en vidence. Le ratio seuil dtectable est alors
de 1,8.
VIII.7.iv. Analyse approfondie des rsultats de lanalyse transcriptomique
Le reste de lanalyse se fait par la combinaison de diffrents outils :
- des logiciels : R, Genespring (Silicon Genetics), Cluster et Treeview (Eisen et al.
1998), FUNSPEC (http://funspec.med.utoronto.ca/).
- des bases de donnes : SGD (Saccharomyces genome database), CYGD
(Comprehensive Yeast Genome Database) de MIPS (Munich Information center for
Protein Sequences), GO (Gene Ontology), YPD (Yeast Proteome Database).
111
Partie III :
Choix et optimisation de la mthode
dextraction ncessaire la
quantification des contenus
intracellulaires en lipides
Partie III
112
Partie III
113
Les mthodes utilises pour extraire les lipides microbiens sont inspires de mthodes mises
au point sur des chantillons biologiques tels que des denres alimentaires (poisson,) ou des
tissus animaux (cerveau, muscle.). Les mthodes de rfrence en la matire sont celles de
Folch et al. (1957) et Bligh et Dyer (1959). Ces deux mthodes reposent sur des extractions
avec un mlange de solvants mthanol/chloroforme, suivies dune tape de
lavage/purification. Il existe aussi des mthodes dextraction chaud (type soxhlet). Ces
mthodes ont d tre adaptes des chantillons de cellules de levure.
Seront prsentes ici quatre mthodes testes afin de trouver la mthode la plus adapte dans
notre cas. Les deux premires mthodes sont dj utilises sur des cellules de levures. La
mthode 3 est inspire dtudes sur des mycobactries et la dernire est une adaptation de la
mthode au soxhlet :
- mthode 1 (Rozs 1992) : inspire de la mthode de Folch et al. (1957)
- mthode 2 : mthode inspire de la mthode de Bligh et Dyer (1959)
- mthode 3 : mthode dite de gradients de solvant inspire de la mthode de
Stephan et al. (2004)
- mthode 4 : mthode au soxhlet
Pour valuer les performances de chaque mthode, il faut avoir des mthodes de
quantifications fiables. Plusieurs techniques de mesure soffrent nous pour quantifier
lextrait lipidique :
- La gravimtrie qui mesure des lipides totaux (erreur exprimentale de lordre de
7%)
- Deux mthodes colorimtriques : une pour la quantification des phospholipides
totaux par dosage du phosphore (erreur exprimentale de lordre de 7%) et lautre
pour le dosage des strols totaux (erreur exprimentale de lordre de 5%)
- la Chromatographie Couche Mince : sparation et quantification des diffrents
composs (erreur exprimentale de lordre de 10 %)
Dans un premier temps, les quatre principales mthodes seront compares et une mthode
sera retenue. La meilleure mthode nos yeux a t choisie selon plusieurs critres :
- Rendement dextraction sur standards de lipides
- Efficacit dextraction sur cellules de levures
- Reproductibilit
- Rapidit et simplicit de mise en uvre
Ensuite, je prsenterai comment la mthode retenue a t optimise.
Partie III
114
=> permettraient dinactiver les phospholipases
I. Choix de la mthode dextraction des lipides cellulaires
I.1. Descriptif des diffrentes mthodes
I.1.i. Mthode 1 (Folch et al. 1957;Rozs 1992) : cf. figure 17
Cette mthode consiste en une extraction mthanol /chloroforme (2:1 v/v) avec un cassage
des cellules, suivie par une tape de lavage. Elle a t dcrite par Rozs (1992). Lextraction a
d tre adapte au matriel disponible.
Elle est dcrite pour un chantillon de 25 mg de cellules en masse sche. Mais elle peut tre
adapte pour des plus gros volumes. Les cellules sont rcupres par centrifugation 5000 g
pendant 5 min. Le culot est lav plusieurs fois. Lchantillon peut tre conserv -80C pour
une utilisation ultrieure ou bien tre utilis immdiatement.
Sur un culot humide sont rajouts :
- 25 l dEDTA 0,1 M
- 125 l de mthanol froid (+4c)
- des billes de verre de diamtre 0,50 mm jusquau mnisque.
- 125 l de mthanol froid et 500 l de chloroforme froid
Les cellules sont broyes en utilisant un vortex treize fois 20 secondes et mises sous agitation
250 rpm pendant 2 heures. Puis lextrait est centrifug 5000 g pendant 2 min et la phase
organique est rcupre.
Sur les dbris cellulaires, deux extractions successives sont faites en plus dans les mmes
conditions.
Apres ces trois extractions, les trois phases organiques sont runies et purifies au moyen
dune solution aqueuse de KCl 0,88% (w/v) (25% du volume total). Le lavage consiste
vortexer, laisser reposer 10 min dans la glace, puis rcuprer la phase organique. Ce lavage
est ralis deux fois.
La phase chloroformique est ensuite sche sur une colonne de NaSO
4
anhydre pour liminer
toute trace deau. La phase chloroformique purifie est ramene sec sous un courant dazote,
puis lextrait lipidique est repris dans 50 l de chloroforme. Lextrait est ensuite conserv
-80 C ou utilis pour lanalyse.
Partie III
115
Figure 17 : Schma descriptif de la mthode n1 (Rozs 1992). TA = temprature ambiante,
HCCl
3
= chloroforme.
25 l EDTA 0,1M
250 l Mthanol
500 l HCCl
3
Billes de verre
Agitation 2H TA 250rpm
2 lavages au KCl
0,88% (w/v)
X2 Vortex
Phase organique
(cumul des 3
extractions)
Cellules
Phase aqueuse
Coton
Na
2
SO
4
anhydre
Schage phase
organique sous
azote
Resuspension dans
un volume connu de
chloroforme
25 mg de masse sche
Phase organique
Partie III
116
I.1.ii. Mthode 2 : extraction des lipides totaux sur biomasse frache : (Bligh
et Dyer 1959)
Lextraction est inspire de la mthode de Bligh et Dyer (1959) avec un solvant contenant
Mthanol/Chloroforme/H
2
O dans les proportions 2:1:0,8 (v/v), puis les proportions sont
ramenes 2:2:1,8 (v/v) pour obtenir deux phases bien distinctes : lune contenant le
chloroforme et les lipides ; lautre, leau, le mthanol et les restes de cellules.
Figure 18 : Schma descriptif de la mthode n2
Pour les levures, lextraction se fait directement sur une suspension de cellules :
- A 10 mg de masse sche de cellules resuspendues dans 0,8 ml deau, rajouter 3ml de
chloroforme/mthanol 2:1 (v/v)
- Vortexer : on obtient une phase
- Laisser en contact une heure
- Ajouter 1 ml de chloroforme, et 1 ml deau distille
- Vortexer : on obtient deux phases
- Rcuprer la phase chloroformique contenant les lipides
- Scher sous vide ou sous azote.
- Reprendre dans 50 l de chloroforme.
3 ml Mthanol/chloroforme 2:1
Vortex
Phase organique
Cellules + mthanol+H
2
0
Schage phase
organique sous
azote
Resuspension dans
un volume connu de
chloroforme
0,8 ml de suspension cellulaire UDO=10
1 heure de contact
1 ml chloroforme
1 ml H
2
O
Vortex
1 phase
2 phases
Partie III
117
I.1.iii. Mthode 3 : dite de gradient de solvant (Stephan et al. 2004)
Nous avons adapt une mthode utilise initialement pour extraire des lipides mycobactriens
(Stephan et al. 2004).
La mthode est dcrite en dtail dans la partie Matriel et Mthodes et dans la figure 19.
Quatre extractions successives sont ralises sur le mme chantillon de cellules. Le solvant
dextraction est un mlange mthanol/chloroforme de plus en plus enrichi en chloroforme
(Premire extraction : mthanol/chloroforme (2V:1V) ; Deuxime extraction :
mthanol/chloroforme (1V:1V) ; Troisime extraction : mthanol/chloroforme (1V:2V) ;
Quatrime extraction : mthanol/chloroforme (1V:2V). Les quatre extractions sont ensuite
regroupes et laves avec une solution de KCl 0,88% (cf. figure 19).
Lutilisation dun gradient de solvant permet desprer extraire un plus large spectre de
lipides. Cette mthode assez simple peut-tre adapte nimporte quelle quantit de cellules
au dpart.
Figure 19 : Schma descriptif de la mthode n3. Vm/Vc= (2:1), puis une fois (1:1) et enfin
deux fois (1:2). TA= temprature ambiante, Vm/Vc=volume de mthanol/volume de
chloroforme.
Vm Mthanol
Vc HCCl3
Agitation 1 journe TA 325 rpm
Lavage leau
Phase organique
Cellules + Phase
aqueuse
Phase organique
Phase aqueuse
Schage phase
organique sous
azote
X mg de masse sche
Vm/Vc
4 fois
Partie III
118
I.1.iv. Mthode 4 : Extraction au soxhlet
Il faut une quantit consquente de cellules (500 mg de masse sche) pour utiliser cette
mthode. Lextraction par solvant (100 ml de chloroforme/mthanol (2 /1)) chaud avec un
appareil de type Soxhlet est faite pendant 20 heures. Les cellules de prfrence lyophilises
sont places dans la cartouche (3) (cf. figure 20). Le ballon (2), contenant le solvant
dextraction est chauff. La condensation des vapeurs de solvant se ralise au niveau du
rfrigrant (1), le liquide retombe et saccumule dans la partie contenant les cellules (3).
Grce un systme de siphon (4), quand le solvant (charg de lipides) atteint le niveau du
coude, tout le liquide est vidang dans le ballon o saccumulent les lipides au fur et mesure
des vidanges.
A la fin de lextraction, aprs lavage de la phase organique, le solvant est vapor au
rotavapor, puis le rsidu de lipides est pes. Lextrait est ensuite stock dans du chloroforme.
Figure 20 : Schma descriptif de lappareillage soxhlet de la mthode n4.
rfrigrant (1)
cartouches
contenant les
cellules (3)

Ballon (2)
siphon (4)
Partie III
119
I.2. Critres de choix
La mthode retenue doit tre quantitative. Dune part, il ne doit pas y avoir perte ou
dgradation de matriel lipidique pendant lextraction. De plus, elle doit tre reproductible. Et
enfin, elle doit extraire un maximum des lipides cellulaires. Cela dfinit donc trois critres
auxquels jai rajout une notion de rapidit et simplicit de mise en uvre. Les quatre critres
sont donc :
- Le rendement dextraction sur standards de lipides
Le rendement dextraction est obtenu en effectuant la totalit de lextraction sur des
solutions contenant les standards (dcrits dans la partie II Matriel et Mthodes ) en
concentrations connues. Les quantits de standards recueillies aprs extraction sont
quantifies par CCM et ramenes au pourcentage de lipides thoriquement introduit au
dpart.
- Efficacit dextraction sur les cellules de levures
Lefficacit est value par la quantit de lipides totaux extraits sur un chantillon de
cellules. La quantit de lipides contenue dans les cellules ntant pas connue au
pralable, lefficacit absolue dextraction ne peut tre quantifie. La meilleure
efficacit relative est dtermine par comparaison des quantits de lipides extraits pour
chaque mthode. Les efficacits pour les diffrentes mthodes sont calcules
relativement la quantit maximale extraite qui est donc assimile une efficacit de
100%.
- La reproductibilit
La reproductibilit consiste faire au moins trois extractions par mthode sur le mme
chantillon de cellule. On estime alors un pourcentage de variabilit.
- La rapidit et la simplicit de mise en uvre
Chacun des trois premiers critres a t valu sur lensemble des quinze lipides
potentiellement identifiables par CCM. Une synthse de ces rsultats est prsente dans le
tableau 12.
Partie III
120
Tableau 12 : Evaluation des diffrents critres dans le choix parmi les quatre mthodes
dextraction dcrites ci-dessus.
Critre de choix Mthode 1 Mthode 2 Mthode 3 Mthode 4
Rendement
dextraction (%)
-
(80-100%)
+
(90-100%)
+
(90-100%)
+
(90-100%)
Efficacit (%) +
90%
-
70%
++
100%
++
100%
Reproductibilit - ++ ++
Rapidit
(dure)
++
(1 journe)
+++
(quelques
heures)
-
(une semaine)
+
(2 jours)
Mise en uvre + + + -
La mthode 1 prsente linconvnient dune succession de plusieurs tapes qui affaiblissent le
rendement global et lefficacit de lextraction. Malgr nos tentatives doptimisation de la
mthode ce problme persiste.
La mthode 2 prsente lnorme dsavantage dtre peu efficace. En allongeant le temps
dextraction trois extractions de 2 heures, on gagne en efficacit mais celle-ci reste toujours
infrieure aux mthodes 3 et 4. Lajout dune tape de cassage des cellules namliore pas
lefficacit et diminue la reproductibilit.
Les mthodes 3 et 4 prsentent des performances comparables en terme de rendement,
defficacit et de reproductibilit. Le choix entre ces deux mthodes a t fait sur le critre de
mise en uvre. La technique au soxhlet prend deux journes mais un seul chantillon peut
tre trait la fois par appareil. Lextraction par la mthode 3 prend une semaine mais
beaucoup dchantillons peuvent tre raliss en parallle. Cest donc la mthode utilisant
des gradients de solvant (n3) qui a t retenue.
Partie III
121
II. Validation de la mthode dextraction aux gradients de solvant : mthode 3
II.1. Efficacit et optimisation des diffrentes tapes
La mthode finalement retenue (cf. figure 19) est celle qui utilise des gradients de solvant.
Nous avons dcid dtudier les diffrentes tapes de lextraction, afin doptimiser cette
mthode. Tout dabord, le temps et le nombre dtapes dextraction ont t optimiss. Ensuite,
nous nous sommes intresss ltape de lavage, puis, lutilit de rajouter un antioxydant
lors de lextraction.
II.1.i. Optimisation du nombre dtapes dextraction et du temps
dextraction
Nous avons souhait apprcier le nombre dtapes dextraction ncessaires. Sur un mme
chantillon, les diffrentes tapes dextractions ont t analyses sparment. Il a t effectu
six extractions successives de 1 journe chacune sur le mme chantillon. Les quatre
premires sont faites comme dcrites dans la figure 19. La cinquime et la sixime sont faites
avec un mlange mthanol/chloroforme 1V/2V. La quantit de lipides totaux extraits a t
estime dans un premier temps par gravimtrie (cf. figure 21). Comme nous pouvons
lobserver sur la figure 21, des lipides sont extraits au moins jusqu la quatrime extraction.
Il semblerait donc que pour quatre extractions, prs de 97% des lipides soient extraits.
Cependant, pour la cinquime et la sixime, les valeurs se trouvent dans la limite de
sensibilit de la mthode par gravimtrie. Donc, nous avons utilis une mthode plus sensible
pour estimer plus prcisment les quantits extraites sur les deux dernires extractions : la
chromatographie couche mince (cf. figure 22).
Partie III
122
Figure 21 : Estimation par gravimtrie du contenu total en lipides, rapport la masse sche
(MS) de cellules, aprs chaque tape dextraction (E1 E6)
Les lipides neutres sont rapidement extraits. Trois extractions seulement semblent ncessaires.
Par contre pour les phospholipides, la quatrime extraction permet encore dextraire des
quantits non ngligeables, notamment de PC (cf. figure 22).
Quatre extractions semblent suffisantes car 99,7% des lipides mesurables sur CCM sont
extraits au bout de ces quatre extractions, pour seulement 0,3% pour les deux dernires
(cf. figure 22).
0
1
2
3
4
5
6
7
E1 E2 E3 E4 E5 E6
Extractions
l
i
p
i
d
e
s

e
n

%

M
S

Etapes dextraction
Partie III
123
Figure 22 : Estimation du contenu en lipides, rapport la masse sche (MS) de cellules,
aprs chaque tape dextraction (E1 E6), mesur par Chromatographie Couche Mince.
ERG=ergostrol, AG=acides gras libres, TG=triglycrides, ES=esters de strol,
LAN=lanostrol, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PI=phosphatidyl-inositol, PS= phosphatidyl-srine, CL+PA= cardiolipides et acide
phosphatidique.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
E1 E2 E3 E4 E5 E6
Extractions
L
i
p
i
d
e
s

n
e
u
t
r
e
s

e
n

%

M
SERG
AG
TG
ES
LAN
0
0,1
0,2
0,3
0,4
E1 E2 E3 E4 E5 E6
Extractions
P
h
o
s
p
h
o
l
i
p
i
d
e
s

e
n

%

M
S
PC
PE
PI
PS
CL+PA
Etapes dextraction
Etapes dextraction
Partie III
124
Ensuite, nous voulions essayer de rduire le temps 4 heures pour les deux premires et la
dernire tape dextraction et une nuit pour la troisime extraction, de manire pouvoir
compiler la totalit de lextraction sur deux jours. Les rsultats du tableau 13 indiquent une
meilleure efficacit de la plus longue extraction. Nous avons donc gard quatre extractions
dune journe.
Tableau 13 : Quantit de lipides totaux ramens au pourcentage de la masse sche (% MS) de
cellules et extraits suivant deux temps dextraction : quatre tapes dune journe ou deux
tapes de 4h + une tape dune nuit + une tape de 4h.
4 extractions dune
journe
2 extractions 4h +
1 nuit + 4h
Lipides totaux (% MS)*
dtermins par gravimtrie
7,07% (+/-0,3) 6% (+/-0,2)
*moyenne sur 3 extractions
II.1.ii. Optimisation de ltape de lavage
De part la technique utilise, une quantit non ngligeable de dbris cellulaires et dacides
amins se retrouve avec lextrait lipidique aprs extraction. Il faut donc effectuer une tape de
lavage. Ltape de lavage est importante car elle doit purifier lextrait sans perte de lipides.
Nous avons test deux types de lavages :
- Deux lavages successifs leau mQ
- Deux lavages successifs au KCl 0,88%
Les deux types lavages sont comparables pour enlever les dbris cellulaires. Cependant, il y a
une nette diffrence quant lefficacit sur la prsence dacides amins (cf. figure 23). Les
acides amins ont t visualiss par chromatographie couche mince. Le solvant de migration
est un mlange butanol/acide actique/H
2
O (40/20/20). La rvlation se fait la ninhydrine
qui rvle tout compos ayant un NH
2
libre, comme les acides amins mais aussi la
phosphatidyl-tanolamine (PE). Sur la figure 23, deux zones de migration se distinguent : la
zone a o se sparent au moins deux acides amins prsents dans les extraits lipidiques ; la
zone b qui est la zone de migration de PE o certains acides amins ventuellement prsents
nont pu tre observs.
Sur les deux taches quantifiables attribues des acides amins (cf. figure 23), les
pourcentages dacides amins limins par les diffrents ont t estims. Le lavage leau a
Partie III
125
permis dliminer environ 40% des acides amins, contre plus de 90% pour le lavage au KCl.
Au vu de son efficacit sur llimination des acides amins, cest le lavage au KCl qui a t
retenu pour la suite des expriences.
Figure 23 : Comparaison de leffet du type de lavage sur llimination des acides amins
prsents dans lextrait lipidique. A) Chromatographie couche mince avec butanol/acide
actique/H
2
O (40/20/20) comme solvant de migration et rvlation la ninhydrine. B)
Tableau rcapitulatif des pourcentages dlimination des acides amins aprs deux lavages
soit leau, soit au KCl 0,88% (w/v).
Il faut que ce type de lavage nlimine pas en mme temps les lipides recherchs. Pour cela,
les tapes de lavage ont t ralises sur un mlange de standards. Les lipides rcuprs ont
t quantifis par CCM. Les tableaux 14 et 15 prsentent les pourcentages de rcupration
aprs deux lavages au KCl 0,88%. Compte-tenu de lerreur de mesure par la technique utilise
qui est de lordre de 10%, la totalit des lipides prsents avant lavage se retrouve aprs lavage
au KCl 0,88%.
b : zone de migration de certains acides amins +
phosphatidylethanolamine
a : zone identifie comme ne contenant que des
acides amins
1 2 3 4
Lavage l'eau lavage au KCl
Acide amin a1 35 92
Acide amin a2 42 100
% limination
1 : Phosphatidylethanolamine
2 : Extraction sans lavage
3 : Extraction + lavage leau
4 : Extraction + lavage au KCl 0,88%
a1
a2
A)
B)
Partie III
126
Tableau 14 : Pourcentage de rcupration des diffrents lipides neutres aprs deux lavages au
KCl 0,88%. DG=diglycrides, ERG=ergostrol, LAN=lanostrol, TG=triglycrides,
ES=esters de strol.
Tableau 15 : Pourcentage de rcupration des diffrents phospholipides aprs 2 lavages au
KCl 0,88%. PI=Phosphatidyl-inositol, PS= Phosphatidyl-srine, PC=Phosphatidyl-choline,
PG= Phosphatidyl-glycrol, PE=Phosphatidyl-thanolamine, CL=cardiolipides et PA=acide
phosphatidique.
II.1.iii. Antioxydant
Compte tenu des temps dextraction relativement longs, nous avons tudi lutilit de rajouter
un antioxydant, le BHT (Butyl-Hydroxy-Tolune), pour limiter, notamment, loxydation des
phospholipides. Le BHT est rajout hauteur de 100 mg.l
-1
dans le solvant dextraction.
Il ny a pas dinterfrence de lantioxydant sur les rsultats (cf. figure 24). Nous continuerons
rajouter le BHT, mme si la figure 24 montre quil ny a pas de diffrence de composition
entre les extraits avec antioxydant et les extraits sans antioxydant.
DG ERG LAN TG ES
% Rcupration* 108 105 94 107 109
* Moyenne sur 2 essais
PI PS PC PG PE CL PA
% Rcupration* 100 96 99 98 110 112 106
Partie III
127
Figure 24
F
i
g
u
r
e

2
4
:

C
o
m
p
a
r
a
i
s
o
n

d
u

p
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

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l
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s

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x
t
r
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i
t
s

r
a
m
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n

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a
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s
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s
c
h
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(
%

M
S
)

d
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v
e
c

o
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s
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t
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d
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t
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x
y
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t

(
B
H
T
)
.

a
)

l
i
p
i
d
e
s

t
o
t
a
u
x

o
b
t
e
n
u
s

p
a
r

g
r
a
v
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Phospholipides % MS
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n
s

B
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T
A
v
e
c

B
H
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d
)
P
A
+
C
L
Partie III
128
II.2. Reproductibilit
Nous devons valuer la reproductibilit de notre mthode dextraction en prenant en compte
la fois, les variabilits dues la mthode dextraction, et celles dues la mthode de
quantification choisie. Un mme chantillon de cellules a t partag en six chantillons de
500 mg chacun (cf. figure 25). Sur chacun de ces chantillons, lextraction complte a t
effectue. Plusieurs techniques de mesure soffrent nous pour quantifier lextrait lipidique.
La reproductibilit mesure va donc dpendre de la mthode de mesure :
- La gravimtrie : mesure des lipides totaux
- Deux mthodes colorimtriques : une pour le dosage des phospholipides totaux,
lautre pour le dosage des strols totaux
- La CCM: sparation et quantification des diffrents composs
Figure 25 : Schma rcapitulatif de ltude de la reproductibilit de
lextraction+quantification.
En cumulant les erreurs dextraction avec les erreurs de mesure lors des quantifications, les
variabilits restent raisonnables (cf. tableau 16). En effet, avec les mesures des lipides totaux,
3 g MS de cellules
500 mg MS
de cellules
500 mg MS
de cellules
Extrait
E1
Extrait
E2
Extrait
E3
Extrait
E4
Extrait
E5
Extrait
E6
Gravimtrie
Extractions
Strol totaux Phospholipides
totaux
CMM
3 g MS de cellules
500 mg MS
de cellules
500 mg MS
de cellules
Extrait
E1
Extrait
E2
Extrait
E3
Extrait
E4
Extrait
E5
Extrait
E6
Gravimtrie
Extractions
Strol totaux Phospholipides
totaux
CMM
Partie III
129
strols totaux et phospholipides totaux, les variabilits sont infrieures 8%. Pour la mesure
par CCM, les variabilits dpendent des composs et atteignent au maximum 12%.
De plus, les valeurs obtenues par les mthodes colorimtriques concordent avec les valeurs
obtenues par CCM.
Par contre, il existe une diffrence non ngligeable entre les lipides totaux obtenus par
gravimtrie (12,4 % MS) et par cumul des diffrents composs par CCM (6,7 % MS). Cette
diffrence est toujours observe quelles que soient les expriences.
Tableau 16 : Tableau rcapitulatif des valeurs exprimentales pour chaque chantillon (E1
E6), de la moyenne et de lcart-type de ces valeurs, ainsi que le pourcentage que reprsente
cet cart-type par rapport la moyenne. Les lipides totaux sont obtenus par mthode
gravimtrique. Les strols totaux et les phospholipides totaux (PL totaux) sont obtenus par
mthodes colorimtriques. Les lipides individuels sont quantifis par CCM:
PI=phosphatidylinositol, PC=phosphatidylcholine, PE=phosphatidylthanolamine,
CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique, ERG=ergostrol, AG=acides gras libres,
TG=triglycrides, ES=esters de strol. Les valeurs sont exprimes en pourcentage de la masse
sche de cellules (%MS)
Ecart-type estim:
1
2
2
1

=
n
x n x
i
n ; n=6 ; x
i
= valeur de la grandeur pour lchantillon Ei ;
moyenne
n
x
x
n
i
=
1
E1 E2 E3 E4 E5 E6
12,48 11,80 13,64 11,20 13,28 11,90 12,38 0,93 7,5
1,07 1,04 1,14 1,01 1,09 1,05 1,07 0,04 4,1
1,43 1,34 1,42 1,52 1,42 1,43 1,43 0,11 7,6
PI 0,83 0,87 0,82 0,90 0,76 0,79 0,83 0,05 6,3
PC 0,21 0,22 0,22 0,21 0,22 0,22 0,004 2,0
PE 0,29 0,29 0,29 0,31 0,31 0,25 0,29 0,02 6,9
CL+PA 0,18 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,004 2,5
ERG 1,02 1,14 1,17 0,96 1,10 0,95 1,06 0,09 8,1
AG 2,83 2,86 3,24 3,34 3,81 3,04 3,19 0,37 11,5
TG 1,47 1,30 1,37 1,57 1,55 1,44 1,45 0,10 7,1
ES 0,05 0,05 0,05 0,05 0,04 0,06 0,05 0,00 10,5
CCM
Moyenne
% MS
Ecart-type
% MS
Ecart-type
% de la
moyenne
Valeurs exprimentales % MS
lipides totaux
(gravimtrie)
Strols totaux
PL totaux
Partie III
130
II.3. Evaluation du rendement dextraction
II.3.i. Sur solution de standards seuls
Lextraction complte est effectue sur une solution contenant tous les standards de
concentrations connues. Aprs extraction, les diffrents standards sont quantifis par CCM.
Cette exprience a t reproduite trois fois. Les rsultats sont prsents dans les tableaux 17 et
18.
Tableau 17 : Rendements dextraction sur solution de standards pour les diffrents lipides
neutres. Il sagit des quantits de standards recueillies aprs extraction exprimes en
pourcentage des quantits de standards introduites au dpart. DG=diglycrides,
ERG=ergostrol, LAN=lanostrol, TG=triglycrides, ES=esters de strol
Tableau 18 : Rendements dextraction sur solution de standards pour les diffrents
phospholipides. Il sagit des quantits de standards recueillies aprs extraction exprimes en
pourcentage des quantits de standards introduites au dpart. PI=phosphatidyl-inositol, PS=
phosphatidyl-srine, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PG=phosphatidyl-glycrol, CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique.
Les pourcentages de rcupration des diffrents lipides se situent entre 89 et 112%. Sachant
que lerreur de mesure par CCM est de lordre de 10%, nous considrons que lefficacit de
rcupration est correcte sur des solutions de standards seuls.
DG ERG LAN TG ES
% Rcupration* 90 98 89 101 89
PI PS PC PG PE CL + PA
% Rcupration* 89 102 112 105 96 109
Partie III
131
II.3.ii. Sur solution de standards en prsence de cellules
Comme vu prcdemment, lextraction ninduit pas de perte de standards sur des solutions
contenant uniquement ces standards. Nous voulons maintenant confirmer que la prsence de
cellules lors de lextraction ne va pas perturber lefficacit de rcupration des lipides.
Pour cela, des cellules sont mises en contact avec des quantits croissantes de standards. Une
solution mre de chaque standard est utilise 10 g.l
-1
. De 0 5 l de ces solutions sont
rajouts aux cellules (cf. tableau 19).
Tableau 19 : Mlange initial de chaque chantillon contenant des cellules de levures et
diffrentes quantits de solution mre de chaque standard de lipides.
Echantillon
Masse sche de
cellules (mg)
Quantit rajoute de chaque
solution mre de standards (g)
A 21,7 0
B 21,7 10
C 21,7 20
D 21,7 30
E 21,7 40
F 21,7 50
Lchantillon A sert connatre la composition des levures. Les quantits globales de chaque
compos rcupres aprs lextraction sur les mlanges sont prsentes dans la figure 26 pour
les lipides neutres et pour les phospholipides. Le volume (en l) de solution standard rajoute
est report en abscisse. Les ordonnes correspondent la quantit de lipides obtenue aprs
extraction et quantification par plaque de CCM. La valeur lorigine correspond la
composition de la biomasse utilise, et la pente correspond la concentration de la solution de
standards rajoute en g.l
-1
, soit autour de 10. Nous avons des droites avec de bons
coefficients de corrlation (R
2
>0,95), et avec une pente proche de la valeur attendue pour la
concentration des solutions standards. Les tableaux 20 et 21 donnent une ide de lcart entre
la valeur thorique de la concentration de la solution de standards et la valeur exprimentale
trouve sur les graphiques.
En conclusion, la prsence des cellules na pas perturb la rcupration des standards de
lipides introduits avant lextraction.
Partie III
132
Figure 26 : Quantits de lipides rcuprs aprs extraction complte en fonction du volume de
solution de standards rajout : a) pour les lipides neutres ; b) pour les phospholipides.
SQ=squalne, ES=esters de strols, TG=triglycrides, AG=acides gras libres,
LAN=lanostrol, ERG=ergostrol, PI=phosphatidyl-inositol, PS=phosphatidyl-srine,
PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine, PG=phosphatidyl-glycrol,
CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique.
y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
Volume de solution standard
(l)
q
u
a
n
t
i
t
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l
i
p
i
d
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s

r
c
u
p
s
(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
u
a
n
t
i
t
d
e
l
i
p
i
d
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s

r
c
u
p
s
(
g
)
SQ
EEAG
TG
AG
LAN
ERG
a)
b)
y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
u
a
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l
i
p
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s

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p
s
(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
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g
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SQ
EEAG
TG
AG
LAN
ERG
y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
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q
u
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l
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i
d
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s

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c
u
p
s
(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
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i
d
e
s

r
c
u
p
s
(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
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g
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SQ
EEAG
TG
AG
LAN
ERG
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
(l)
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g
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SQ
EEAG
TG
AG
LAN
ERG
a)
b)
ES
Partie III
133
Tableau 20 : Rapport entre les concentrations des standards mesures exprimentalement et
les valeurs thoriques introduites pour les diffrents lipides neutres. ERG=ergostrol,
LAN=lanostrol, AG=acides gras libres, TG=triglycrides, ES= esters de strols,
SQ=squalne,
ERG LAN AG TG ES SQ
exprience/thorie 1,02 1,00 0,89 1,09 1,06 1,04
les valeurs thoriques introduites pour les diffrents phospholipides. PI=phosphatidyl-inositol,
PS=phosphatidyl-srine, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PG=phosphatidyl-glycrol, CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique.
PI PS PC PG PE CL+PA
exprience/thorie 0,89 1,09 1,07 0,93 0,91 0,97
Partie III
134
III. Conclusion de la partie III
Parmi les quatre mthodes que nous avons testes, nous avons choisi la mthode dextraction
par gradients de solvant (mthode 3) car elle rpondait aux critres que nous nous tions fixs.
Il ny a pas de perte de lipides lorsque lextraction est faite sur des solutions de standards (en
prsence ou non de cellules). Une quantit maximale de lipides est extraite des cellules. La
reproductibilit est correcte. Et enfin, cette mthode propose un bon compromis au niveau de
la rapidit et la simplicit de mise en uvre.
Cette mthode a t optimise en terme de temps dextraction, de nombre dtapes
dextraction, de la qualit du lavage et de lajout dun antioxydant. La reproductibilit a t
estime pour chacune des mthodes de dosage utilises. Pour la mthode gravimtrique nous
avons eu une variabilit de 7,5%. Les variabilits lies aux mthodes colorimtriques sont
respectivement de 4,1% et 7,6% pour les strols totaux et pour les phospholipides totaux.
Pour les dosages par chromatographie couche mince (CCM), les variabilits dpendent du
compos et varient en 2 et 12%.
Paralllement, cette tude a permis de valider nos mthodes de quantification. Les dosages
colorimtriques sont cohrents avec les quantits mesures par CCM. Cependant, la somme
des composs identifis par CCM ne correspond pas aux lipides totaux quantifis par
gravimtrie. Sur CCM, se retrouvent entre 50 et 70% des lipides totaux. En effet, nous ne
quantifions pas tous les composs prsents dans lextrait. Il reste peut-tre une petite quantit
dacides amins que nous nenlevons pas avec les lavages. De plus, certains lipides ne sont
pas quantifis, comme les glycolipides ou encore les protolipides. En effet, lutilisation des
diffrents gradients de concentration en mthanol et en chloroforme doit permettre dextraire
un large spectre de lipides.
Partie III
135
Partie IV :
Dynamique dadaptation de la levure
Saccharomyces cerevisiae sa
production dthanol : aspects
macrocintique et microscopique
Partie IV
136
Partie IV
137
Lhypothse de dpart de mon travail repose sur lide quun meilleur titre final en thanol est
dpendant de la capacit des cellules rsister leur propre production leve en thanol. Par
consquent la problmatique sous-jacente dveloppe dans cette thse est lidentification et la
comprhension des modifications physiologiques permettant ladaptation des levures leur
propre accumulation en thanol. Pour atteindre cet objectif, cette partie explore le
comportement macrocintique des levures au cours du processus de fermentation. Ce
comportement dpend des conditions des fermentations. Les fermentations sont suivies par les
donnes macrocintiques, que sont les concentrations en substrat (glucose) et produits
(biomasse, thanol, glycrol, actate, succinate, lactate, ..) et par la viabilit cellulaire mesure
par coloration au bleu de mthylne. A partir de ces donnes sur plusieurs fermentations, nous
avons identifi un paramtre important li la performance du procd : la mesure de viabilit
cellulaire au bleu de mthylne. Nous avons alors complt cette analyse microscopique par
une mesure de lactivit mtabolique des cellules par coloration au FUN 1 et par une analyse
morphologique qui nous a permis de quantifier le comportement de plusieurs sous-
populations de levures au cours de la production intensive dthanol.
I. Aspect macrocintique des fermentations alcooliques de type fed-batch
Les fermentations alcooliques prsentes dans cette thse ont t ralises en mode fed-batch
sur milieu synthtique (dcrit dans la partie Matriel et Mthodes) utilisant le glucose comme
substrat carbon et lammoniaque comme source dazote. Outre les sels et les oligo-lments
initialement introduits dans le racteur, des vitamines (acide pantothnique, acide nicotinique,
mso-inositol, thiamine, pyridoxine, acide para-aminobenzoique et biotine) sont aussi
ajoutes de manire squence pendant la phase de croissance (cf. Matriel et Mthodes).
Pendant la fermentation, plusieurs paramtres sont contrls et rguls : le pH 4, la
temprature 30C et lagitation et laration pour maintenir une pression partielle en
oxygne au-dessus de 20 %.
Ce type de fermentation se caractrise par un profil particulier en deux phases (cf. figures 27
et 28). Lors de la premire phase, la production dthanol et de glycrol sont couples la
croissance cellulaire. Le taux de croissance maximum est atteint dans les premires heures de
la fermentation. Ensuite, le taux de croissance ne cesse de diminuer pour sarrter autour de
100 g.l
-1
dthanol (cf. figure 28). On observe ensuite le dbut de la seconde phase pendant
laquelle la croissance cellulaire est arrte mais la production dthanol se maintient encore
Partie IV
138
pendant plusieurs heures. Cette dernire phase est appele la phase de dcouplage
croissance-production .
Quatre fermentations seront exploites dans le cadre de cette thse. Les quatre fermentations
ont t conduites de manires trs similaires. Le mode dapport de glucose est le seul
paramtre avoir chang :
- Fermentation 1 : apport continu pour maintenir la concentration autour de 50 g.l
-1
dans
le racteur
- Fermentation 2 : apport discontinu en trois ajouts de 100 g.l
-1
et trois ajouts de 50 g.l
-1
- Fermentation 3 : apport discontinu identique la fermentation 2
- Fermentation 4 : apport discontinu en cinq ajouts de 100 g.l
-1
et un ajout de 50 g.l
-1
Il est remarquer que les fermentations 2 et 3 sont censes avoir t conduites de la mme
manire, or elles conduisent des performances trs diffrentes (cf. figures 27 et 28 et
tableaux 22 et 23). La productivit de la fermentation 2 est de 3,3 g.l
-1
.h
-1
pour un titre final de
147 g.l
-1
alors que pour la fermentation 3, le titre final est de 120 g.l
-1
pour une productivit de
2,7 g.l
-1
.h
-1
. Cette tude ne permet donc pas de mettre en vidence une influence du mode
dapport de substrat sur la performance. Par contre, elle rvle des problmes de
reproductibilit au niveau du procd. Nous nous sommes donc focaliss sur les
caractristiques dune bonne performance alcoolique.
La performance de ce type de procd se caractrise dun point de vue cintique par la
productivit et dun point de vue plus globale par la concentration finale en thanol obtenue.
Jai choisi de prsenter dabord laspect cintique de ces fermentations afin de donner une vue
densemble des diffrentes tapes du procd. Puis, je me focaliserai sur les performances de
ces fermentations au bout de 45h et les performances finales, cest--dire quand la production
dthanol sarrte.
I.1. Suivi cintique des fermentations alcooliques de type fed-batch
Les cintiques de fermentations sont reprsentes ici par deux types de figures. La
reprsentation classique consiste tracer lvolution des concentrations en substrats et
produits de la fermentation en fonction du temps (cf. figure 27). La deuxime reprsentation,
plus spcifique notre tude, consiste tracer lvolution des vitesses de production en
fonction de la concentration en thanol (cf. figure 28).
Partie IV
139
Figure 27
F
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2
7
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Partie IV
140
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p
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-1
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-1
h
-1
Partie IV
141
La vitesse spcifique de production
p
est la vitesse de production dthanol ramen lunit
de biomasse. Le taux de croissance est la vitesse de production de biomasse ramene
lunit de biomasse. Tracer les vitesses spcifiques de production dthanol
p
et de biomasse
(taux de croissance) dans le milieu en fonction de la concentration en thanol permet de voir
directement ladaptation des levures la prsence dthanol et facilite la comparaison des
performances du procd en terme dthanol produit.
Sur cette dernire reprsentation, les deux phases du procd apparaissent plus clairement. La
premire phase de croissance cellulaire couple la production dthanol dure environ 13
15 heures suivant les fermentations. La croissance sarrte entre 95 et 111 g.l
-1
dthanol
(cf. tableau 22). Cette phase est relativement similaire pour chaque fermentation que ce soit
pour sa dure ou pour la concentration en thanol atteinte au moment de larrt de croissance.
La concentration en thanol atteinte au moment la croissance sarrte sappelle la
concentration critique ou [thanol]
crit
. Les fermentations 2 et 3 ont la mme [thanol]
crit
. En
effet, ces deux fermentations ont des comportements macrocintiques trs semblables pendant
la phase de croissance (cf. figures 27 et 28). Il ny a pas de corrlation entre la performance
du procd et la dure de cette phase, ni avec la valeur de la concentration critique en thanol,
ni avec le taux de croissance moyen. En effet, Les taux de croissance moyens sont proches les
uns des autres (comprise entre 0,182 et 0,192 h
-1
). La productivit moyenne pendant la
croissance est la mme quelles que soient les fermentations tudies (1,7 g.l
-1
.h
-1
)
(cf. tableau 22).
Tableau 22 : Pour chacune des quatre fermentations dcrites ci-dessus, ce tableau indique le
taux de croissance moyen sur 45h, la vitesse spcifique de production dthanol
p
moyenne
sur 45h, la productivit sur 45h, la productivit depuis larrt de la croissance jusqu 45h et
la concentration en thanol [thanol]
crit
pour laquelle la croissance sarrte.
Fermentation ([thanol]
45h
)
moyen
sur 45h
h
-1
p
moyen
sur 45h
g.g
-1
h
-1
Productivit
sur 45h
g.l
-1
.h
-1
Productivit
pendant le
dcouplage
g.l
-1
.h
-1
[thanol]
crit
g.l
-1
Fermentation 1 (120 g.l
-1
) 0,187 0,32 2,8 1,1 95
-1
) 0,182 0,56 3,3 1,6 111
-1
) 0,184 0,47 2,7 1,0 109
-1
) 0,192 0,38 3,1 1,4 100
Partie IV
142
En revanche, les diffrences deviennent notables au cours de la seconde phase de la
fermentation. La phase de dcouplage est intressante car la majorit du substrat consomm
est transform en thanol. La productivit moyenne sur 45h varie entre 2,7 g.l
-1
.h
-1
pour la
fermentation 3, la moins performante, et 3,3 g.l
-1
.h
-1
pour la fermentation 2, la plus
performante. Comme les productivits sont les mmes pendant la phase de croissance (1,7 g.l
-
1
.h
-1
), les diffrences de productivit sur 45h sexpliquent donc par des diffrences de
productivit pendant la phase de dcouplage (cf. tableau 22). Cette phase apparat donc
primordiale pour la performance du procd.
La productivit est caractristique du procd en terme de titre alcoolique et de rapidit pour
lobtenir. Par contre, les vitesses de production dthanol moyennes renvoient lefficacit de
production de la biomasse. Elles ne corrlent pas ncessairement avec les performances en
terme de productivit (cf. tableau 22). En effet, la fermentation 2 affiche une forte
productivit moyenne (3,3 g.l
-1
.h
-1
) et une bonne vitesse spcifique de production (0,56 g.g
-1
h
-
1
), mais la fermentation 4 a permis datteindre aussi une bonne productivit (3,1 g.l
-1
h
-1
) mais
la vitesse spcifique de production dthanol est beaucoup plus faible (0,38 g.g
-1
h
-1
). Plus de
biomasse a t ncessaire pour maintenir la productivit dans la fermentation 4.
I.2. Analyse des titres et des rendements 45h
La fermentation la plus performante en terme de concentration finale en thanol est la
fermentation 2, avec un titre final de 147 g.l
-1
. La moins performante est la fermentation 3,
avec 120 g.l
-1
(cf. tableau 23), pourtant identique la fermentation 2 concernant le mode de
conduite. La fermentation 4 donne une bonne performance proche de la fermentation 2, avec
141 g.l
-1
. Le mode dapport du glucose est trs similaire pour ces deux dernires
fermentations. La fermentation 1, avec 127 g.l
-1
, prsente une performance suprieure la
fermentation 3, mais nettement infrieure aux fermentations 2 et 4.
Dans la fermentation 1, la production de biomasse a trs nettement t privilgie avec 21,6
g.l
-1
. Pour les autres fermentations, elles sont comprises entre 15,4 g.l
-1
pour la fermentation 3
et 16,7 g.l
-1
pour la fermentation 4. Les rendements par rapport la biomasse confirment une
orientation de lutilisation de glucose vers la biomasse plus prononce pour la fermentation 1
avec un rendement de 0,050 g.g
-1
. Ces rendements sont sensiblement les mmes pour les trois
autres fermentations caractrises par un apport squenc de glucose (entre 0,037 et
Partie IV
143
0,040 g.g
-1
; cf. tableau 24). Lorientation du mtabolisme vers la production de biomasse ne
permet pas dexpliquer les diffrences de performances.
Tableau 23 : Pour chacune des quatre fermentations dcrites ci-dessus, ce tableau indique la
concentration maximale en biomasse obtenue [X]
max
, le titre en thanol au bout de 45 h de
fermentation [thanol]
45h
, le titre maximal atteint [thanol]
final
et la concentration en glycrol
au bout de 45 h de fermentation [Gly]
45h
.
[X]
max
g.l
-1
[thanol]
45h
g.l
-1
[thanol]
final
g.l
-1
[Gly]
45h
g.l
-1
Fermentation 1 21,6 120 127 2,8
Fermentation 2 16,0 147 147 3,8
Fermentation 3 15,4 120 120 7,3
Fermentation 4 16,7 138 141 4,2
Tableau 24 : Pour chacune des quatre fermentations dcrites ci-dessus, ce tableau indique les
rendements Biomasse/Substrat (Y
X/S
) et Glycrol produit/Substrat (Y
gly/S
) au moment de
larrt de croissance et le rendement Ethanol produit/Substrat (Y
P/S
) 45h.
Fermentation ([thanol]
45h
) Y
X/S
g.g
-1
Y
P/S
g.g
-1
Y
Gly/S
g.g
-1
-1
) 0,050 0,41 0,009
-1
) 0,037 0,44 0,011
-1
) 0,039 0,39 0,024
-1
) 0,040 0,39 0,011
Le glycrol est le principal sous-produit de la fermentation alcoolique qui doit tre au
maximum minimis pour optimiser la production dthanol. Dans tous les cas, la production
de glycrol est couple la croissance. La production de glycrol est lie la production de
biomasse, car son rle principal est le rquilibrage de la balance redox (van Dijken et
Scheffers 1986). Laccumulation de glycrol est minimale pour la fermentation 1. Le glycrol
est aussi connu pour saccumuler en cas de choc osmotique (Edgley et Brown 1983). En
vitant les chocs osmotiques provoqus par lapport de substrat, comme dans la fermentation
1, la concentration finale en glycrol est faible. Cependant, les fermentations 2, 3 et 4, qui ont
les mmes conditions de culture pendant la phase de croissance, nont pas le mme
comportement en terme de production de glycrol : 3,8 g.l
-1
pour la fermentation 2 contre 7,3
g.l
-1
pour la fermentation 3 et 4,2 g.l
-1
pour la fermentation 4. Donc lapport de sucre et les
chocs osmotiques quil engendre ne semble pas tre ici le seul facteur influenant
laccumulation de glycrol. Lorientation du mtabolisme vers la production de glycrol peut-
Partie IV
144
elle expliquer les diffrences de performance? La diffrence de rendement Y
Gly/S
entre les
fermentations 2 et 3 de 0,013 g.g
-1
ne suffit pas expliquer la diffrence de rendement Y
P/S
de
0,05 g.g
-1
. De plus, la fermentation 1 produit peu de glycrol (2,8 g.l
-1
) pour une faible
performance thanolique (127 g.l
-1
).
Donc, la performance en titre thanolique ne corrle ni avec lorientation du mtabolisme vers
la biomasse, ni vers le glycrol.
I.3. Conclusion
Dans notre cas, la performance dune fermentation est value par sa productivit
moyenne et son titre final en thanol car ils refltent au mieux la capacit dadaptation
de la levure. Ce type de fermentation se droule en deux phases : une phase de croissance et
de production dthanol et une phase de dcouplage o lthanol continue dtre produit sans
croissance cellulaire. Le titre final en thanol est au moins de 120 g.l
-1
. Cependant, deux
fermentations, effectues dans des conditions apparemment similaires, peuvent aboutir des
diffrences significatives de performances (titres finaux en thanol compris entre 120 et 147
g.l
-1
). Pour toutes les fermentations tudies, nous avons observ que la phase de croissance
est relativement similaire. La phase de dcouplage entre croissance cellulaire et production
dthanol est par contre trs diffrente entre ces fermentations. Lefficacit de production
pendant cette ultime phase corrle avec les performances finales des fermentations. Bien que
lorientation de lutilisation du glucose vers la formation de sous-produits, notamment le
glycrol, diffre entre les fermentations, elle ne suffit pas expliquer les diffrences de
production dthanol. Les diffrences de performances peuvent alors tre expliques par un
probable meilleur maintien de lactivit mtabolique des cellules en prsence dthanol
pendant la phase de dcouplage. Pour valider cette hypothse, il nous apparat ncessaire de
caractriser ltat physiologique des levures pendant la phase de croissance et la phase de
dcouplage.
Partie IV
145
II. Analyse de la viabilit cellulaire, de la morphologie des cellules et de la
composition macromolculaire de la biomasse
II.1. Analyse de la viabilit cellulaire au cours des procds de production
intensive dthanol
II.1.i. Mthode de mesure de la viabilit cellulaire
Il existe plusieurs mthodes pour valuer la viabilit cellulaire (Jones 1987a). Elles peuvent
tre bases sur la mesure de lactivit mtabolique et/ou lintgrit membranaire. Dautres
mthodes se basent sur la capacit rplicative des cellules, comme le comptage sur boite de
ptri qui mesure la capacit de cellules pouvoir former des colonies sur milieu glos. Dans
le cas des fermentations tudies, il est plus intressant pour nous de connatre la part de
population mtaboliquement active, donc susceptible de produire encore de lthanol. Jones
(1987a) conseille lutilisation du bleu de mthylne dans le cas de fermentation alcoolique.
Mais que mesure-t-on exactement avec le bleu de mthylne ? Le principe de cette mthode
repose sur le fait que le bleu de mthylne est une molcule organique, qui peut exister sous
les deux formes : une forme oxyde (bleue) et une forme rduite (incolore). En contact avec le
bleu de mthylne, certaines cellules se colorent en bleu, dautres restent incolores ou
blanches (cf. figure 29). Les cellules blanches sont dites viables, alors que les cellules
bleues sont dites non viables.
Certains auteurs prtendent que ce colorant nentre pas dans les cellules dont la membrane est
intacte contrairement des cellules dont la membrane est altre (Bonora et Mares
1982;Kucsera et al. 2000). Une autre hypothse suggre que le bleu de mthylne diffuse
lintrieur des membranes et que les cellules encore mtaboliquement actives sont capables
soit dexcrter le bleu de mthylne, soit de loxyder (Millard et al. 1997). Lhypothse de
Jones et al. (1987a) est de considrer que le bleu de mthylne diffuse au travers des
membranes et que cette diffusion dpend de la composition lipidique de la membrane. A
lintrieur des cellules, le colorant est alors oxyd par les activits oxydo-rductases si les
cellules sont encore actives. La coloration des cellules dpend donc de lquilibre entre le flux
de pntration du bleu au travers des membranes et la vitesse daction des enzymes cellulaires
(Jones 1987b).
Partie IV
146
Au cours de lavancement de la fermentation alcoolique, nous observons une augmentation de
la proportion de cellules colores en bleu par le bleu de mthylne (cf. figure 31). Nous ne
pouvons pas conclure si cette coloration provient dune perte dactivit mtabolique et/ou
dune perte dintgrit membranaire. La mesure au bleu de mthylne comporte donc une
incertitude sur son mode daction, sans compter que certains auteurs dcrivent un effet
toxique de la molcule de bleu de mthylne (Bonora et Mares 1982). Cest pourquoi, nous
avons dcid de comparer les rsultats obtenus au bleu de mthylne avec un autre colorant
mesurant lactivit cellulaire : le FUN
1.
Les membranes cellulaires sont permables au FUN
1. Il sagit dun fluorochrome qui, dans

des cellules actives, est internalis sous forme de structures cylindriques intravacuolaires
(appeles CIVS) rouges-oranges ou jaunes-oranges. Les cellules inactives sont colores
uniformment en vert-jaune intense et on nobserve pas de CIVS colores en rouge-orange
(Millard et al. 1997).
Par analyse dimage, nous pouvons identifier les cellules comportant des CIVS rouge-orange,
correspondant aux cellules actives et les cellules considres comme inactives qui fluorescent
uniformment dans le vert (cf. figure 30).
La mesure de la viabilit par le FUN
1 repose donc uniquement sur lactivit mtabolique de

la cellule (Millard et al. 1997).
Figure 29 : Exemple de coloration au bleu de mthylne. La photo a t prise lors dune
fermentation alcoolique, avec 116 g.l
-1
dthanol.
Figure 30 : Exemple de coloration au FUN
1. La photo a t prise lors dune fermentation

alcoolique, avec 116 g.l
-1
dthanol.
Cellules non
actives
Cellules actives
Cellules non
viables
Cellules viables
Partie IV
147
Nous avons dcid de comparer les deux colorations lors dune fermentation alcoolique de
type fed-batch. Comme le montre la figure 31, il existe une bonne corrlation entre les deux
colorations. La proportion de cellules qui se colorent en bleu en prsence de bleu de
mthylne est la mme que celle des cellules qui apparaissent verte par coloration au FUN 1.
Ceci confirme que la coloration des cellules par bleu de mthylne est associe une perte de
lactivit mtabolique des cellules, dans nos conditions. Pour la suite de nos analyses, nous
continuerons donc utiliser le bleu de mthylne en raison de sa simplicit de mise en uvre.
Figure 31 : Evolution de la proportion de cellules non colores par bleu de mthylne () et
de la proportion de cellules prsentant des CIVS aprs coloration au FUN
1 (u ) au cours
dune fermentation alcoolique.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 10 20 30 40 50 60
Dure h
-1
v
i
a
b
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t

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n

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u

F
U
N
1

u
Partie IV
148
II.1.ii. Etat des cellules pendant les fermentations alcooliques par mesure de la
coloration au bleu de mthylne
Quelle que soit la fermentation tudie, la proportion de cellules non colores au bleu de
mthylne diminue surtout en fin de fermentation. Laccumulation de cellules colores au
bleu de mthylne semble beaucoup plus rgulire pour la fermentation 1 o le glucose est
amen en continu que pour les fermentations avec apport discontinu de glucose o la viabilit
fluctue beaucoup plus (cf. figure 32). Un apport continu de glucose semble maintenir plus
longtemps la proportion de cellules non colores au-dessus de 90%. En effet, pour les trois
autres fermentations avec ajout squenc de glucose, il semble quil y ait une premire
diminution de cette proportion autour de 80 et 90 % puis elle se stabilise jusqu
laccumulation de 100 g.l
-1
dthanol dans le milieu. Par contre ds quelle passe au-dessous
de 80%, sa chute est irrmdiable et provoque larrt de la fermentation.
La performance finale en terme de titre thanolique semble lie au maintien de la proportion
de cellules non colores par le bleu de mthylne. En effet, lordre dans lequel les courbes de
la figure 32 passent au-dessous de 80%, est aussi lordre croissant des performances.
Partie IV
149
II.1.iii. Conclusion sur la viabilit cellulaire
En fin de fermentation, la proportion de cellules qui se colorent par le bleu de mthylne
augmente fortement. Par corrlation avec la coloration au FUN 1, nous pouvons conclure que
ces cellules subissent une baisse de leur activit mtabolique qui provoque larrt de la
production dthanol. Plus le moment o les cellules se colorent est retard, plus la
fermentation est performante. Donc, lorsque les levures sadaptent mieux laccumulation
dthanol, lactivit mtabolique des levures se maintient. Lactivit mtabolique, par mesure
de la coloration par le bleu de mthylne, sera assimile dans notre cas la mesure de la
viabilit cellulaire.
Cependant, nous ne pouvons pas conclure sur les causes exactes de cette baisse de lactivit
mtabolique. Est-ce lthanol qui rentre dans les cellules et qui inhibe les activits
enzymatiques ? Ou, est-ce que lthanol provoque des perturbations au sein de la membrane
qui entraneraient une disparition du gradient transmembranaire de protons ncessaires au
maintien de lactivit mtabolique ?
Figure 32 : Evolution de la proportion de cellules non colores par le bleu de mthylne en
fonction de la concentration en thanol, pour chacune des quatre fermentations 1 4 :
Fermentation 1 () : apport continu pour rester autour 50 g.l
-1
dans le racteur
Fermentation 2 ( ) : apport discontinu en trois ajouts de 100 g.l
-1
et trois ajouts de 50 g.l
-1
Fermentation 3 (r ): apport discontinu identique la fermentation 2
Fermentation 4 ( ): apport discontinu en cinq ajouts de 100 g.l
-1
et un ajout de 50 g.l
-1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 20 40 60 80 100 120 140
ethanol g/l)
V
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b
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l
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fermentation 1 fermentation 2 fermentation 3 fermentation 4

Ethanol g.l
-1
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Partie IV
150
II.2. Evolution de la morphologie des cellules pendant une fermentation
Le maintien dune biomasse active, notamment au cours de la phase de dcouplage, semble
tre la cl dune bonne performance. Pour cela, nous avons voulu mieux caractriser ltat
morphologique de la population de levures au cours du procd fermentaire.
Comme dj dcrit dans le premier chapitre de cette partie, les fermentations alcooliques par
le procd fed-batch se droulent en deux phases. La premire phase est la phase
daccumulation de la biomasse, couple la production dthanol. Lors de la deuxime phase,
la croissance est arrte mais il y a toujours production dthanol. Pendant cette dernire
phase, de plus en plus de cellules se colorent par le bleu de mthylne. La viabilit cellulaire
se met chuter ce qui va provoquer larrt de la fermentation. Au moment o la viabilit
chute, la population de levures devient de plus en plus htrogne au niveau de la
morphologie (taille, forme, bourgeonnement.). Lidentification des diffrentes populations
et leur volution pendant les phases de fermentation procurent des indices quant la
comprhension des phnomnes physiologiques mis en place par la levure.
Nous avons utilis un logiciel danalyse dimage dvelopp par Ohtani et al. (2004) qui
permet didentifier et de quantifier automatiquement le type de la cellule (cellule seule, cellule
bourgeonnante et bourgeon) et la taille des cellules. A ces paramtres, nous avons rajout un
paramtre de brillance de la cellule (cf. partie 2 Matriel et Mthodes). En effet, lors dune
observation par microscopie fond noir, certaines de nos cellules apparaissaient blanches (ou
brillantes) et dautres plus sombres avec juste le contour brillant (cf. figure 33).
Figure 33 : Exemple de photos prises laide dun microscope fond noir (Olympus BH2,
objectif 40X, DplanApo40UVPL) quip dune camra CCD (DXM 1200, Nikon). Photo
prise pendant la fermentation 3. Lors de la prise de la photo la concentration dans le racteur
tait de 118 g.l
-1
.
Cellules brillantes
Cellules sombres
Partie IV
151
Cette tude morphologique a t ralise uniquement sur la fermentation 3. Cette
fermentation, avec apport squenc de glucose, a permis datteindre 120 g.l
-1
dthanol en 45h
(cf. figures 27 et 28 et tableau 22). Nous avons retenu les points de la fermentation o
suffisamment de cellules ont pu tre identifies par le logiciel. Sept prlvements (1 7), qui
comptaient entre 170 et 350 cellules ayant une forme caractrise, ont t retenus (cf. figure
34). Les prlvements 1, 2 et 3 correspondent la phase de croissance. Le prlvement 4 se
situe juste aprs larrt de la croissance mais la proportion de cellules non colores par le bleu
de mthylne est encore au-dessus de 80%. Les prlvements 5, 6 et 7 correspondent des
proportions de cellules non colores par le bleu de mthylne de plus en plus faibles,
respectivement 47, 37 et 20%.
II.2.i. Accumulation de cellules brillantes au cours de la fermentation
Les cellules brillantes apparaissent au fur et mesure de la production dthanol. Lvolution
de la proportion de cellules brillantes suit lvolution de la proportion de cellules colores par
le bleu de mthylne (cf. figure 34). Ltude en microscopie fond noir des cellules brillantes
ou sombres pourrait aussi permettre de suivre la perte de viabilit pendant la fermentation.
Cependant, la proportion de cellules sombres semble toujours tre lgrement suprieure la
proportion de cellules non colores par le bleu de mthylne.
Partie IV
152
Figure 34 : Evolution, en fonction de la production dthanol au cours de la fermentation, du
taux de croissance (), de la vitesse spcifique de production dthanol
p
(), de la
proportion relative de cellules non colores au bleu de mthylne (u ) et de la proportion
relative de cellules sombres ().
Toutes les familles de cellules contiennent une part importante de cellules brillantes
(cf. tableau 25). Il semble que les cellules non bourgeonnantes soient lgrement plus
rsistantes que les cellules bourgeonnantes, les plus fragiles tant les bourgeons. En effet, les
premires cellules brillantes, qui apparaissent pendant la phase de croissance, appartiennent
la catgorie des cellules bourgeonnantes et des bourgeons. Pendant la phase de croissance,
pour les prlvements 2 et 3, 1 et 2 % respectivement des cellules bourgeonnantes et des
bourgeons sont brillants (cf. tableau 25). Aprs larrt de la croissance, des cellules non
bourgeonnantes brillantes commencent apparatre. 7% des cellules non bourgeonnantes sont
brillantes au prlvement 4. Dans toutes les familles, la proportion de cellules brillantes
augmente avec lavancement de la fermentation et de la coloration par le bleu de mthylne.
Au dernier prlvement, 65% des cellules non bourgeonnantes, 70 % des cellules
bourgeonnantes et 72% des bourgeons sont brillants. Le pourcentage de cellules non colores
par le bleu de mthylne est alors de 20%. A partir de lchantillon 4, juste aprs larrt de
croissance, il y a plus de bourgeons brillants que de cellules bourgeonnantes brillantes. Cela
sexplique par lapparition dune classe de population o la cellule mre est sombre alors que
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ethanol g.l
-1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
h
-
1
1
2
3 4
5
6
7
p
g
.
g
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1
.
h
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1
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Partie IV
153
son bourgeon est brillant. Cette classe reste minoritaire et ne reprsente au maximum que 7 %
des cellules bourgeonnantes, au prlvement 6 (cf. tableau 25).
Tableau 25 : Evolution du pourcentage de cellules brillantes dans les chantillons n1 7
(cf. figure 34) pour chacune des familles : cellules non-bourgeonnantes, bourgeonnantes et les
bourgeons.
Echantillon n
(Ethanol g.l
-1
)
1
(25,6)
2
(54,3)
3
(75,4)
4
(114)
5
(120)
6
(118)
7
(120)
Cellules non-bourgeonnantes 7 37 53 65
Cellules bourgeonnantes 0 1 2 6 44 62 70
Bourgeons 0 1 2 10 51 75 72
La taille moyenne des cellules, calcule par le logiciel sans distinction de la brillance, passe
de 358 pixelspixels en tout dbut de fermentation 441 pixelspixels au prlvement 4.
Puis, elle rediminue jusqu 364 pixelspixels au prlvement 7. Il y a donc des changements
dans la taille des cellules.
Les cellules sombres ont tendance tre de plus en plus grosses en avanant dans la
fermentation. En effet, pour les cellules bourgeonnantes sombres, le pourcentage de grosses
cellules augmente pendant la phase de croissance de 5 12 % et continue augmenter aprs
larrt de la croissance plus de 30% (prlvements 4, 6 et 7) (cf. figure 35). Laugmentation
de la taille des cellules sombres jusquau prlvement 4 doit donc faire augmenter la valeur de
la taille moyenne.
De plus, les cellules brillantes sont plutt petites. En effet, pour des cellules bourgeonnantes,
entre 50 et 100% des cellules brillantes sont petites (cf. figure 35). Pour les cellules non
bourgeonnantes, il y a peu de petites cellules pendant la phase de croissance (8% des cellules
sombres au prlvement 3). Par contre, en fin de fermentation, entre 18 et 36% des cellules
brillantes sont petites (cf. figure 35). Laugmentation des cellules brillantes qui sont de petite
taille a donc tendance faire baisser la valeur de la taille moyenne en fin de fermentation.
Partie IV
154
Figure 35 : Evolution des pourcentages de petites ( ), moyennes ( ) et grosses ( ) cellules
pour chaque catgorie de cellules en fonction de leur brillance pour les prlvements n1 7
(1 : 25,6 g.l
-1
dthanol ; 2 : 54,3 g.l
-1
-1
dthanol ; 4 : 114 g.l
-1
-1
-1
-1
dthanol)
(cf. figure 34). a) cellules non bourgeonnantes sombres ; b) cellules non bourgeonnantes
brillantes ; c) cellules bourgeonnantes sombres ; d) cellules bourgeonnantes brillantes ; e)
bourgeons sombres ; f) bourgeons brillants. ------ : arrt de croissance qui spare la phase de
croissance de la phase de dcouplage.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1 2 3 4 5 6 7
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1 2 3 4 5 6 7
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1 2 3 4 5 6 7
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1 2 3 4 5 6 7
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1 2 3 4 5 6 7
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1 2 3 4 5 6 7
prlvement
prlvement
prlvement prlvement
prlvement
prlvement
Cellules non
bourgeonnantes
Cellules
bourgeonnantes
bourgeons
Cellules sombres Cellules brillantes
a)
c)
e)
b)
d)
f)
Partie IV
155
II.2.ii. Evolution de la rpartition des diffrentes catgories des cellules (cellules
non bourgeonnantes, cellules bourgeonnantes et bourgeons) au cours de la
fermentation
Les cellules sont presque exclusivement bourgeonnantes en dbut de fermentation pendant la
phase de croissance. 97% des cellules bourgeonnent au prlvement 1 (cf. tableau 26). Les
cellules sont de moins en moins bourgeonnantes suite larrt progressif de la croissance.
Cependant, il reste prs de 60% des cellules ayant un bourgeon en fin de fermentation, alors
que la croissance est arrte.
Tableau 26 : Pourcentage de cellules bourgeonnantes en fonction des prlvements n1 7
(cf. figure 34) au cours de la fermentation alcoolique en mode fed-batch. Le pourcentage de
cellules bourgeonnantes est calcul de la manire suivante :
100
. . . . .
. .
. .
+
=
ntes bourgeonna non cellules Nb ntes bourgeonna cellules Nb
ntes bourgeonna cellules Nombre
ntes bourgeonna cellules e pourcentag
Echantillon n
(Ethanol g.l
-1
)
1
(25,6)
2
(54,3)
3
(75,4)
4
(114)
5
(120)
6
(118)
7
(120)
Cellules bourgeonnantes 97% 82% 76% 67% 58% 55% 61%
La proportion de gros bourgeons sombres diminue en fin de fermentation. Elle passe de 46%
en dbut de fermentation (prlvement 1) 12 % en fin de fermentation (prlvement 7)
(cf. figure 34). Donc, les cellules bourgeonnantes en fin de fermentation ne sont-elles pas
bloques un certain stade de division ? Les bourgeons arrivent-ils rellement maturit ?
II.2.iii. Conclusion :
Nous avons pu mettre en vidence la prsence de cinq populations distinctes de cellules en
toute fin de fermentation : des cellules non-bourgeonnantes, sombres ou brillantes; des
cellules bourgeonnantes et leur bourgeon, sombres ou brillants et des cellules bourgeonnantes
sombres avec un bourgeon brillant. Cette dernire population est trs minoritaire et ne
reprsente quau maximum 7 % des cellules totales. Or, en dbut de fermentation, la
population de levures est homogne avec prs de 97% de cellules bourgeonnantes. De plus,
chaque population peut se subdiviser en trois sous-populations chacune en fonction de la taille
des cellules : petites, moyennes, grosses. Nous avons tudi comment ces populations
voluaient au cours dune fermentation.
Partie IV
156
A travers lanalyse microscopique, les changements dans la rpartition des populations
correspondent bien aux deux phases prcdemment dcrites (cf. tableau 27). Pendant la phase
de croissance les cellules sont presque exclusivement sombres et bourgeonnantes avec une
bonne rpartition de la taille des bourgeons. A partir de larrt de la croissance, des cellules
brillantes commencent apparatre en quantit non ngligeable. Lapparition de ces cellules
brillantes suit la coloration des cellules par le bleu de mthylne et donc ce que nous appelons
la perte de viabilit cellulaire. De plus, ces cellules brillantes sont de petite taille. Nous
faisons lhypothse que les cellules apparaissant brillantes sont des cellules permabilises et
vides de tout ou dune grande partie de leur contenu cellulaire, cest pourquoi elles
apparatraient brillantes. Ces cellules mortes et vides dune partie de leur contenu cellulaire
sont alors plus petites.
En fin de fermentation, les cellules sombres restantes sont plus grosses que les cellules
sombres pendant la phase de croissance. Or un ajout de 6% dthanol dans le milieu cre un
retard dans le cycle cellulaire des levures ce qui provoque une augmentation de leur taille
(Kubota et al. 2004).
Tableau 27 : Tableau rcapitulatif des populations rencontres au court de chacune des phases
de la fermentation alcoolique.
0 =>Phase de croissance =0 =>Phase de non-croissance
et perte de viabilit
- Population homogne : trs grande majorit
de cellules bourgeonnantes et sombres, de
taille moyenne :
- toute taille de bourgeons
=> observation caractristique dune phase de
croissance cellulaire.
- population beaucoup plus htrogne :
o des cellules brillantes et petites :
o des cellules sombres moyennes
et grosses :
- trs peu de gros bourgeons et de plus en plus
de cellules non bourgeonnantes.
- de plus en plus de formes complexes qui
correspondent des agglomrats de cellules
=> La croissance est arrte et la
viabilit chute : les cellules apparaissant
brillantes sont supposes permabilises pour
expliquer leur diminution de volume
Partie IV
157
II.3. Etat de la composition macromolculaire des cellules au cours de la
production dthanol en mode fed-batch
Afin de complter la caractrisation de la biomasse, nous avons dtermin des principaux
composants macromolculaires des levures au cours dune fermentation (fermentation n4,
partie 4), en terme de teneurs totales en protines, carbohydrates, lipides, et acides nucliques
(ADN+ARN). Les rsultats sont prsents sur la figure 36.
Figure 36 : Evolution du taux de croissance (), de la vitesse spcifique de production
dthanol
p
(), de la viabilit relative de cellules au bleu de mthylne (u ) et des
composants macromolculaires en pourcentage de la masse sche (% MS) en fonction de la
concentration en thanol : protines ( ), carbohydrates ( ), ADN/ARN ( ), lipides ( ). Le
reste pour faire une somme de 100% est assimil aux cendres ( ).
Les carbohydrates saccumulent au dtriment des protines et des acides nucliques
(ADN+ARN). Ils passent de 35% en dbut de fermentation 50 % de la masse sche quand la
viabilit commence chuter. Puis, cette teneur reste constante jusqu larrt du processus
(cf. figure 36). Les deux principales sources de carbohydrates qui pourraient faire varier la
teneur de manire aussi significative sont les sucres de rserves et les sucres paritaux. Les
contenus en sucres de rserves et paritaux ont t mesurs afin de connatre lorigine de cette
accumulation. Les rsultats sont prsents dans la partie VI de cette thse.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ethanol g.l
-1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
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-
1
p
g
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g
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1
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1
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10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
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%

M
S
Partie IV
158
Les lipides diminuent pendant la phase de croissance. Ils passent de 9,2 6,3 % de la masse
sche, puis leurs teneurs raugmentent 8% pendant la phase de perte de viabilit.
Les cendres se calculent par rapport aux mesures de teneurs en macromolcules :
% cendres = 100 - (% protines + % acides nucliques + % carbohydrates + % lipides)
Pendant la phase de perte de viabilit, il y a peu de cendres, alors quelles peuvent atteindre
prs de 10% pendant la phase de croissance. Il faut noter que les dosages de macromolcules
donnent une estimation du contenu car pour chaque dosage nous prenons une molcule de
rfrence (par exemple, la BSA pour le dosage des protines) qui ne peut pas reflter la
composition exacte de la biomasse. Les teneurs en cendres dpendent donc du dosage de tous
les autres composants. Cette diminution de la teneur en cendres pourrait tre due la fuite
dune partie du contenu intracellulaire cause dune permabilisation des membranes en fin
de fermentation.
III. Conclusion de la partie IV
Avec le type de fermentation fed-batch utilis dans ce travail, nous pouvons atteindre de trs
importantes productions dthanol, pouvant aller jusqu 19 % (v/v) en 45 h (147 g.l
-1
dthanol). Ce mode de culture impose cependant un environnement trs stressant pour la
cellule. En consquence, la performance de notre procd en terme de production dthanol
est fortement dpendante de la capacit de la levure sadapter ces conditions extrmes.
Une caractristique intressante de ce procd est le dcoupage possible en deux phases : une
premire phase de croissance de la biomasse et de production dthanol et une deuxime
phase de dcouplage croissance-production (
biomasse
=0 mais
thanol
0) durant laquelle prs
dun tiers de lthanol peut tre produit (cf. I ; (Alfenore et al. 2002)). Une amlioration
possible du procd repose sur la capacit maintenir cette phase de dcouplage. En effet, le
dcouplage a toujours lieu quand lthanol atteint une concentration autour de
100 g.l
-1
10 g.l
-1
et les diffrences de performances sont dpendantes du maintien de la
viabilit cellulaire mesure par coloration par le bleu de mthylne pendant la phase de
dcouplage (Alfenore et al. 2002;Alfenore et al. 2004).
Dans ce travail, nous avons donc caractris des levures pendant cette phase par les
colorations par le bleu de mthylne et le FUN
1. Nous en concluons que les cellules

subissent une perte dactivit mtabolique qui est, du moins en partie, la cause de larrt de
production dthanol en fin de fermentation. Mais pour le moment, nous ne pouvons pas
conclure sur la cause de cette perte dactivit. Dune part, lthanol est connu pour inhiber les
Partie IV
159
activits enzymatiques (Millar et al. 1982;Pascual et al. 1988). Dautre part, il perturbe au
sein de la membrane le gradient transmembranaire de protons ncessaire au maintien de
lactivit mtabolique des cellules (Leao et van Uden 1984). Nous ne savons pas non plus si
ces cellules sont dfinitivement mortes ou si elles maintiennent une activit rsiduelle trs
faible.
Pendant la phase de perte de viabilit, la biomasse est de plus en plus htrogne. Il y a trs
peu de dbris cellulaires, les cellules gardent leur forme arrondie, seule leur taille et leur
brillance en microscopie fond noir voluent : il ny a pas lyse ou clatement des cellules.
Les cellules brillantes sont majoritairement des cellules petites, et leur accumulation dans le
fermenteur suit la perte de viabilit mesure au bleu de mthylne. Nous faisons lhypothse
que ce sont des cellules mortes ou non actives, permabilises et vides de tout ou partie de
leur contenu intracellulaire. Cependant, cette diminution de volume pourrait aussi tre
attribue une augmentation de losmolarit du milieu (Blomberg 2000).
Les donnes prsentes dans cette partie sur lvolution de la morphologie des cellules
pendant une fermentation ne sont quune premire approche qui apporte des informations
nouvelles sur lenrichissement de populations au sein du fermenteur au cours de la production
intensive dthanol. Cependant, il faudrait poursuivre ces investigations en utilisant le mme
outil didentification automatique (avec le logiciel de Ohtani et al., 2004) et en automatisant
la prise de photos par microscopie en ligne pendant la fermentation (Zalewski et Buchholz
1996)
Partie IV
160
161
Partie V :
Rponse transcriptomique des levures
lors dune fermentation de type fed-
batch
162
Partie V
163
Les fermentations de type fed-batch tudies dans ce travail sarrtent par perte de lactivit
mtabolique de cellules en fin de fermentation. Nous supposons que le maintien de cette
activit dpend de la capacit de la levure sadapter aux fortes concentrations en thanol.
Mais quels sont les mcanismes que la levure met en place pour sadapter de telles
concentrations en thanol ? Une partie de la rponse peut tre obtenue en tudiant la rponse
transcriptionnelle de la levure au cours des fermentations. Pour cela, un suivi des profils
dexpression de lensemble des ORFs au cours dune fermentation alcoolique nous a permis
de connatre les changements induits au niveau molculaire par la levure lors de son
adaptation des concentrations croissantes de son propre thanol produit. Aprs un traitement
statistique des donnes, nous avons utilis des mthodes de classification (par familles
fonctionnelles, par localisation cellulaire, par clustering hirarchique et par Self Organization
Map), pour nous aider faire ressortir les tendances mtaboliques et physiologiques des
mcanismes mis en place. Enfin, je me suis focalise sur quelques points de ces donnes
transcriptomiques qui me sont apparus pertinents en rapport avec la littrature et avec les
modifications des caractristiques de la biomasse dcrites dans la partie IV.
I. Prsentation du plan exprimental :
I.1. Choix de la fermentation et des prlvements pour le suivi cintique
La fermentation choisie pour cette tude est une des fermentations de type fed-batch
prsentes dans la partie IV. Il sagit de la fermentation 1. La souche CBS8066 est cultive
sur milieu synthtique avec un apport squenc de vitamines. Lapport de glucose a permis de
maintenir une concentration en glucose dans le racteur autour de 50g.l
-1
, en vitant les chocs
osmotiques. La concentration maximale de 127 g.l
-1
dthanol a t obtenue aprs 52 heures
de fermentation (cf. figure 37).
Le choix de la fermentation a t orient par le mode dapport de glucose. En limitant les
chocs osmotiques, nous souhaitions viter de rajouter des lments perturbateurs au systme
dtude.
Lanalyse globale des profils dexpression des gnes a t ralise grce la technique des
puces ADN. Les donnes macrocintiques nous ont guids sur le choix des prlvements
analyser afin de dcrire la dynamique dadaptation de la levure aux fortes concentrations en
thanol. Six prlvements successifs (1 6) ont t choisis. Le prlvement 1 est
Partie V
164
lchantillon de rfrence. Les cellules sont en croissance faible concentration dthanol
(17 g.l
-1
). Le prlvement 2 est intermdiaire. La concentration en thanol est plus importante
(65 g.l
-1
), mais les cellules sont encore en phase de croissance. Les prlvements 3, 4 et 5
entourent larrt de la croissance cellulaire, avec respectivement 90, 95 et 100 g.l
-1
dthanol.
Au prlvement 6, le taux de croissance est nul (=0), et la vitesse de production dthanol
p
est faible mais pas nulle. La concentration en thanol est de 125 g.l
-1
mais la viabilit nest
plus que de 60 %.
dthanol
p
() et de la viabilit mesure par coloration au bleu de mthylne ( -) en
fonction de la concentration en thanol.
Le choix de lchantillon de rfrence est crucial pour linterprtation des rsultats. Les
changements observs seront tudis par rapport rfrentiel. Comme nous tudions une
cintique, il semble plus intressant de comparer les diffrents temps de fermentation avec un
temps de rfrence en dbut de fermentation, quand les cellules sont en pleine croissance.
Lidal serait de choisir des cellules lorsque la croissance est maximale. Le taux de croissance
est maximal trs tt dans la fermentation. Or, il ne faut pas prendre le rfrentiel trop tt
cause de linfluence de ltat physiologique dans linoculum et de la phase de dmarrage. De
plus, lorsque est maximal, la concentration cellulaire dans le racteur est trs faible. Il ne
Ethanol g.l
-1
p
g
.
g
-
1
.
l
-
1
V
i
a
b
i
l
i
t

r
e
l
a
t
i
v
e
h
-
1

p
Viabilit

90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
Reference
[Ethanol]=
Ethanol g.l
-1
p
g
.
g
-
1
.
l
-
1
V
i
a
b
i
l
i
t

r
e
l
a
t
i
v
e
h
-
1

p
Viabilit

90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
Reference
[Ethanol]=
Ethanol g.l
-1
p
g
.
g
-
1
.
l
-
1
V
i
a
b
i
l
i
t

r
e
l
a
t
i
v
e
h
-
1

p
Viabilit

90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
Reference
[Ethanol]=
Partie V
165
doit pas non plus tre pris trop tard car cet chantillon doit correspondre une concentration
faible en thanol. Le choix de lchantillon 1 nous est apparu comme un bon compromis
(cf. figure 37).
I.2. Stratgie et traitement statistique
Les lames utilises pour ce travail sont des dendrilames (Le Berre et al. 2003). Ce sont des
lames de verres sur lesquelles ont t dposs 6074 ORFs en duplicat, sous forme de
fragments PCR qui reprsentent lensemble du gnome de Saccharomyces cerevisiae.
Pour chaque chantillon, trois lames indpendantes ont t ralises en comparant la
condition choisie la condition de rfrence prise en dbut de fermentation (cf. figures 37 et
38). Ce type de lame permet en marquant chaque condition avec un fluorochrome diffrent de
visualiser directement le diffrentiel sur la lame. Nous avons toujours marqu la condition de
rfrence avec du Cy5 et les autres conditions avec du Cy3. Or, par cette mthode, nous ne
tenons pas compte des diffrences dincorporation de chaque fluorochrome au sein dun gne.
Il aurait fallu faire des rptitions en inversant les marquages Cy5 et Cy3 pour la condition de
rfrence et la condition compare, cest--dire faire un dye swap .
Figure 38 : Schma exprimental de la stratgie adopte pour le marquage et lhybridation des
six chantillons (1 6).
1
2
3
4
5
6
Partie V
166
De part la stratgie adopte, tous les ratios sont exprims par rapport lchantillon de
rfrence (chantillon n1) 17 g.l
-1
dthanol.
Sur chaque lame et pour chaque ORF, le ratio Cy3/Cy5 a t normalis. Ensuite la moyenne
de ces ratios a t calcule sur les trois lames identiques pour chaque condition. Sur les
donnes normalises, un test de Student a t appliqu afin didentifier les gnes
diffrentiellement exprims de manire significative. Le seuil de significativit choisi a t
un seuil de probabilit de 5%.
Le gne est diffrentiellement exprim de manire significative si la probabilit associe est
infrieure 5%. A ce moment-l, il y a moins de 5% de chance que les gnes apparaissent
diffrentiellement exprims cause du hasard ou des erreurs exprimentales.
II. Analyse des rsultats
II.1. Description globale des changements transcriptionnels
Les premiers rsultats montrent que prs de 25% des 6074 ORFs prsents sur la puce se
retrouvent diffrentiellement exprims (test de Student significatif 5%) (cf. tableau 28) au
moins un moment de la fermentation.
Tableau 28 : Nombre de gnes diffrentiellement exprims (test de Student significatif 5%)
et % du gnome correspondant aux diffrents temps compars au temps de rfrence.
Echantillons temps 2/1 temps 3/1 temps 4/1 temps 5/1 temps 6/1
Nombre de gnes 750 1540 1495 1690 1750
% du gnome 12% 25% 25% 28% 29%
Pour diffrencier les gnes sur-exprims et sous-exprims, nous ne nous sommes intresss
quaux gnes significativement diffrents et ayant un ratio de sur-expression suprieur 1,8
ou de sous-expression infrieur 0,55. En effet, par une exprience prliminaire, nous avons
montr quavec une erreur exprimentale globale moyenne de 30%, une diffrence
dexpression peut tre dtecte partir dun ratio de 1,8 (cf. partie II Matriel et mthodes
pour le choix de ce seuil).
Partie V
167
Pour la majorit des gnes sous-exprims, ils sont rprims trs tt dans la fermentation, car
le nombre de gnes sous-exprims volue peu au cours de la fermentation (cf. tableau 29 et
figure 39). Ils reprsentent entre 2 et 3 % du gnome.
Par contre, peu de gnes sont sur-exprims aux chantillons 2 et 3, voire 4. Le nombre de
gnes sur-exprims explose aprs larrt de la croissance, au niveau de lchantillon 5
(cf. tableau 29 et figure 39). A ce moment-l, prs de 5,5 % des ORFs prsentent une sur-
expression.
dont le ratio est soit >1,8 pour les gnes sur-exprims, soit <0,55 pour les gnes sous-
exprims.
Echantillons temps 2/1 temps 3/1 temps 4/1 temps 5/1 temps 6/1
ratio>1,8 45 75 130 337 223
ratio<0,55
122 183 146 171 194
Figure 39 : Courbes : volution du taux de croissance (), de la vitesse spcifique de
production dthanol
p
() et de la viabilit mesure ( -) au bleu de mthylne en
fonction de la concentration en thanol. Histogrammes : reprsentation du nombre de gnes
sur-exprims (n) et du nombre de gnes sous-exprims (n), en fonction de la concentration
en thanol.
Ethanol g.l
-1
p
g
.
g
-
1
.
l
-
1
V
i
a
b
i
l
i
t

r
e
l
a
t
i
v
e
h
-
1

p
Viabilit

90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
Reference
[Ethanol]=
N
o
m
b
r
e

d
e

g
n
e
s

s
u
r
-
e
t

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o
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-
e
x
p
r
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m
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Ethanol g.l
-1
p
g
.
g
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1
.
l
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1
V
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a
b
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l
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l
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-
1

p
Viabilit

90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
Reference
[Ethanol]=
N
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m
b
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g
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s
Ethanol g.l
-1
p
g
.
g
-
1
.
l
-
1
V
i
a
b
i
l
i
t

r
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l
a
t
i
v
e
h
-
1

p
Viabilit

90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
Reference
[Ethanol]=
N
o
m
b
r
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d
e

g
n
e
s

s
u
r
-
e
t

s
o
u
s
-
e
x
p
r
i
m
s
Partie V
168
La sparation de la fermentation en deux phases se retrouve nettement avec lapplication
dune classification hirarchique par le logiciel Cluster sur les temps de fermentation
(cf. figure 40). Les chantillons 3 et 4, correspondant la toute fin de la phase de croissance
sont proches entre eux et plus proches de lchantillon 2, milieu de phase de croissance, que
des chantillons 5 et 6, mme si 3,4 et 5 sont trs proches temporellement et en concentration
en thanol. Les chantillons 5 et 6 sont donc eux plus caractristiques de la phase de
dcouplage. Ces rsultats confirment bien limportance des perturbations transcriptomiques et
donc probablement physiologiques qui se produisent aprs larrt de croissance.
Figure 40 : Dendogramme du cluster hirarchique sur les prlvements de la fermentation
(prlvements 2, 3, 4, 5 et 6 par rapport la rfrence 1, cf. figures 37 et 38) effectu avec
lensemble des ratios dexpression.
Le clustering hirarchique sur les ratios dexpression nas pas permis de mettre en vidence
de familles de gnes co-rguls. Une analyse plus fine par un clustering de type SOM (Self
Organizing Maps), nous a permis de distinguer uniquement deux profils (cf. figure 41).
Le premier profil regroupe les gnes sous-exprims ayant le mme comportement. Il suit le
ralentissement puis larrt du taux de croissance. Ceci sexplique car nous comparons des
cellules en ralentissement puis arrt de croissance, avec des cellules en pleine croissance
(chantillon de rfrence).
Le deuxime profil est caractristique des gnes sur-exprims, qui le sont essentiellement
aprs larrt de la croissance (condition 5/1).
La trs grande majorit des gnes a un profil dexpression correspondant au profil n1 ou au
profil n2. Cette distinction correspond la sparation entre gnes sur-exprims et gnes sous-
exprims. Il existe cependant quelques exceptions au profil atypique qui pourront tre
tudies individuellement.
2/1 3/1 4/1 5/1 6/1
Partie V
169
Figure 41 : Profil n1 et n2 des changements globaux dexpression en fonction de la
concentration en thanol par clustering de type SOM.
Les rsultats des classifications par clustering ne sont pas surprenants car nous tudions ici
une cintique dans des conditions bien contrles o les concentrations en substrat, en
biomasse et en produits voluent mais sans changement brusque.
Pour lchantillon 6, la diminution du nombre de gnes diffrentiellement sur-exprims
(cf. tableau 29) ainsi que de leur intensit (cf. figure 41) pourrait sexpliquer par la faible
viabilit ce prlvement (seulement 60%). Nous ne connaissons pas ltat des ARN
messagers dans les cellules non viables. Le mlange de cellules viables et non viables peut
donc perturber les rsultats exprimentaux.
0,1
1
10
0 20 40 60 80 100 120 140
Ethanol g.l
-1
r
a
t
i
o

(
c
h
e
l
l
e

l
o
g
a
r
i
t
h
m
i
q
u
e
)
profil n2
profil n1
2/1 3/1
4/1
5/1 6/1
Echantillo
Partie V
170
II.2. Approfondissement des tendances mtaboliques et localisation cellulaire des
produits des gnes sur-exprims et sous-exprims
II.2.i. Familles fonctionnelles intervenant dans ladaptation lthanol
Afin de mieux dcrypter les donnes transcriptomiques, nous avons donc dcid dexplorer
les catgories fonctionnelles, dfinies par la classification MIPS, dans lesquelles sont
impliqus les gnes sur-exprims et sous-exprims (cf. figure 39 et tableau 29).
La figure 42 prsente le nombre de gnes, diffrentiellement exprims de manire
significative et ayant des ratios de sur- ou sous-expression suprieurs 1,8, rpartis dans les
diffrentes catgories fonctionnelles (base MIPS), en fonction des concentrations en thanol
dans le racteur. Pour complter cette analyse, nous avons estim les familles qui sont
statistiquement enrichies grce au logiciel FUNSPEC (Robinson et al. 2002). Ce logiciel
permet de confronter une liste de gnes aux bases MIPS et Gene Ontology. Le logiciel
renvoie une probabilit associe chaque famille pour que le nombre de gnes soumis et
associs cette famille puisse tre d au hasard. Plus cette probabilit est faible, moins il y a
de chance que la famille apparaisse comme enrichie par le fait du hasard. Le seuil de la
probabilit est en gnral fix au-dessous de 0,01. En entre du logiciel FUNSPEC, jai
dcid de mettre les gnes qui sont diffrentiellement exprims aux stades 2,3,4 et/ou 5.
Lchantillon 6 nest pas exploit car, au vu des rsultats des profils cintiques (cf. figure 41)
nous supposons que la prsence de 40% de cellules non viables dans lchantillon introduit un
biais dans les rsultats.
Partie V
171
Figure 42 : Rpartition dans les diffrentes catgories fonctionnelles du nombre A.) de gnes
sous-exprims (P<0,05 et Ratio>1,8) et B.) de gnes sur-exprims (P<0,05 et Ratio<0,55) en
fonction du temps de fermentation (2, 3, 4, 5 ou 6 par rapport au temps de rfrence 1). Sur la
droite, est indiqu le pourcentage maximal que ces nombres reprsentent lintrieur de la
famille.
2/1 [Ethanol]= 65 g l
-1
[Ethanol]= 95 g l
-1
4/1
0 40 80
CELL CYCLE AND DNA PROCESSING
CELL FATE
CELL RESCUE, DEFENSE AND
VIRULENCE
CELLULAR TRANSPORT AND
TRANSPORT MECHANISMS
ENERGY
METABOLISM
PROTEIN FATE (folding, modification,
destination)
PROTEIN SYNTHESIS
REGULATION OF / INTERACTION
WITH CELLULAR ENVIRONMENT
TRANSCRIPTION
TRANSPORT FACILITATION
Number of over-expressed genes
4%
10%
13%
6%
10%
7%
5%
2%
9%
6%
10%
4%
10%
13%
6%
10%
7%
5%
2%
9%
6%
10%
Nombre de gnes sur-exprims
Pourcentage de gnes
correspondant dans
la famille
0,0 40,0 80,0
CELL CYCLE AND DNA PROCESSING
CELL FATE
CELL RESCUE, DEFENSE AND
VIRULENCE
CELLULAR TRANSPORT AND
TRANSPORT MECHANISMS
ENERGY
METABOLISM
PROTEIN FATE (folding, modification,
destination)
PROTEIN SYNTHESIS
REGULATION OF / INTERACTION
WITH CELLULAR ENVIRONMENT
TRANSCRIPTION
TRANSPORT FACILITATION
Number of under-expressed genes
[Ethanol]= 90 g l
-1
[Ethanol]=125 g l
-1
[Ethanol]= 65 g l
-1
[Ethanol]= 95 g l
-1
[Ethanol]= 100 g l
-1
Nombre de gnes sous-exprims
3%
3%
1%
2%
3%
1%
3%
22%
1%
3%
1%
Pourcentage de gnes
correspondant dans
la famille
6/1 5/1 4/1
3/1 2/1
A.
B.
[Ethanol]= 90 g l
-1
[Ethanol]=125 g l
-1
[Ethanol]= 100 g l
-1
6/1 5/1
3/1
Partie V
172
La figure 42 permet de se rendre compte du dsquilibre entre les gnes sur-exprims et les
gnes sous-exprims.
Pour les gnes sous-exprims, une famille est essentiellement implique : la synthse
protique. 22% des gnes de cette famille sont sous-exprims en fin de croissance (chantillon
4, 95 g.l
-1
dthanol). FUNSPEC identifie aussi cette famille avec une probabilit infrieure
10
-14
(cf. tableau 30). Ce sont essentiellement des gnes impliqus dans la synthse des
ribosomes.
Pour les gnes sur-exprims, beaucoup de familles de la base MIPS semblent affectes lors de
ladaptation de la levure laccumulation dthanol et surtout au moment o la croissance
sarrte. FUNSPEC permet de mettre en vidence les plus pertinentes dentre elles
(cf. tableau 31). Il y a un enrichissement significatif des familles de stress et de dfense
cellulaire, du mtabolisme carbon, de lnergtique cellulaire, des transports et de la
diffrentiation cellulaire. Parmi les sous-familles du mtabolisme carbon, les mtabolismes
paritaux et des rserves nergtiques (trhalose et glycogne) sont mis en vidence. La
confrontation la base de Gene Ontology permet de mettre en vidence dautres fonctions
molculaires (cf. tableau 32), notamment celles concernant le transport dhexoses et le
mtabolisme lipidique.
Tableau 30 : Analyse statistique par le logiciel FUNSPEC des catgories fonctionnelles de la
base MIPS enrichies pour les ORFs sous-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5.
Catgories P value
a
Gnes sous-exprims dans les chantillons 2, 3, 4 ou 5
Ribosome biogenesis
And protein synthesis
< 10
-14
RPL30 RPS26A RPS25A RPL26B RPS23A
RPL24B RPS20 RPS27B RPS4B RPS24B
RPL16A RPL40A RPL39 RPS4A RPL40B
RPS0B RPS31 RPL37A RPS28B RPL38 RPL31B
RPL6B RPS17A RPS18B RPS1B RPS16A
RPS10B RPL20A MRPL33 RPL9B RPS7B
RPL42A RPS3 RPS15 RPL3 RPS7A RPL33B
RPS12 RPL5 RPS23B
a
La Pvalue permet destimer la probabilit que le set de gnes de la famille donne ressorte par effet du hasard.
Partie V
173
base MIPS enrichies pour les ORFs sur-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5.
Catgories P value
a
Gnes sur-exprims dans les chantillons 3, 4 ou 5
METABOLISM 2,1.10
-10
YAL061W YAT1 OSH1 BNA4 NTH2 TIP1 BAP2 FAT2 HIS7 SUL1 GLK1
PHO87 GIT1 AAD3 FAD1 HXT15 GAL3 NRG1 ADR1 MTH1 HXT7 HXT6 HXT3
SSN2 SNF1 LPP1 GLC3 GLC7 ADK2 FAU1 HSP12 GAT1 AAD6 PHO4 HXK1
SCS3 GSC2 ATF2 TDH3 ENO1 MAL11 LAG1 OPI1 PUT2 IRE1 HXT4 GRE3
ENO2 PIG2 AYR1 IMP2' MET28 TDH1 RPE1 KRE9 HXT8 HXT9 TES1 BAT2
GFA1 YBT1 ASP3-1 ASP3-2 DPH5 AAC1 ISF1 PGM2 FSH2 GPI12 GLC8
IDH1 RNH35 RHO2 NPR1 MET2 ERG24 WSC2 PFK27 GAC1 HIS3 SNF2
PHO85 ISU1 ICL2 ROX1
C-compound and
carbohydrate
metabolism
3,8.10
-10
YAL061W NTH2 GLK1 AAD3 HXT15 GAL3 NRG1 ADR1 MTH1 HXT7 HXT6
HXT3 SSN2 SNF1 GLC3 GLC7 HSP12 AAD6 HXK1 GSC2 ATF2 TDH3 ENO1
MAL11 HXT4 GRE3 ENO2 PIG2 AYR1 IMP2' TDH1 RPE1 KRE9 HXT8 HXT9
GFA1 PGM2 GLC8 IDH1 RHO2 WSC2 PFK27 GAC1 SNF2 PHO85 ICL2
C-compound,
carbohydrate
transport
4,2.10
-05
GLK1 HXT15 HXT7 HXT6 HXT3 MAL11 HXT4 HXT8 HXT9
C-compound and
carbohydrate
utilization
6,9.10
-05
YAL061W NTH2 GLK1 AAD3 GLC3 HSP12 AAD6 HXK1 GSC2 ATF2 TDH3
ENO1 GRE3 ENO2 PIG2 AYR1 TDH1 RPE1 KRE9 GFA1 PGM2 IDH1 WSC2
PFK27 ICL2
metabolism of energy
reserves (glycogen,
trehalose)
0,0001
NTH2 GLC3 GLC7 PIG2 PGM2 GAC1 PHO85 HSP82
regulation of C-
compound and
carbohydrate
utilization
0,0004
GAL3 NRG1 ADR1 MTH1 SSN2 SNF1 GLC7 IMP2' GLC8 RHO2 PFK27 GAC1
SNF2 PHO85
cell wall 0,004
TIP1 TIR1 PIR3 DAN2 ASP3-1 ASP3-2
CELL RESCUE, DEFENSE
AND VIRULENCE
2,2.10
-09
SSA1 SSA3 TIP1 HSP26 SSE2 GRX1 HSP30 SED1 HSP78 SNF1 ECM10
CYC7 TIR1 SSA4 HSP12 HSF1 MPT5 TPO2 CUP1-1 CUP1-2 IRE1 GRE3
TIR3 GPX1 PIR3 HSP104 AHP1 HSP60 DDR48 YCK2 YGP1 CRS5 MKK1
SRL1 HSP82
stress response 8,8.10
-11
SSA1 SSA3 TIP1 HSP26 SSE2 GRX1 HSP30 SED1 HSP78 SNF1 ECM10
CYC7 TIR1 SSA4 HSP12 HSF1 MPT5 IRE1 GRE3 TIR3 PIR3 HSP104 AHP1
HSP60 DDR48 YCK2 YGP1 MKK1 HSP82
ENERGY 4,4.10
-06
YAL061W NTH2 GLK1 AAD3 NDE2 COX20 GLC3 CYC7 GLC7 AAD6 HXK1
TDH3 ENO1 ENO2 PIG2 COX5B TDH1 RPE1 QCR8 PGM2 IDH1 COX5A
GAC1 PHO85 HSP82 FDH2 ICL2
metabolism of energy
reserves
0,0001
NTH2 GLC3 GLC7 PIG2 PGM2 GAC1 PHO85 HSP82
REGULATION OF /
INTERACTION WITH
CELLULAR
ENVIRONMENT
0,0005
FUS3 SCO1 SUL1 PCA1 HSP30 PHO87 STE5 HSP12 FET5 MPT5 GIC1
KHA1 FAR1 UTR1 CNB1 AHP1 TFS1 CRS5 TPK2
TRANSPORT
FACILITATION
0,001
YAT1 BAP2 SUL1 PCA1 PHO87 GIT1 HXT15 DNF2 HXT7 HXT6 HXT3 KRE30
FET5 MEP1 TPO2 MAL11 HXT4 KHA1 HXT8 HXT9 YBT1 AAC1 DNF3 MAS6
AQY1
cellular import 5,6.10
-05
BAP2 SUL1 GLK1 HXT7 HXT6 HXT3 FET5 MEP1 HXT4 PAN1 HXT8 HXT9
YCK2 SCD6
C-compound,
carbohydrate
transport
4,2.10
-05
GLK1 HXT15 HXT7 HXT6 HXT3 MAL11 HXT4 HXT8 HXT9
CELL FATE 0,005
FUS3 SEF1 HMRA1 SIR2 STE5 SPR6 GLC7 ADK2 MPT5 GSC2 LAG1 RIM4
GIC1 AYR1 AXL2 PAN1 FAR1 KRE9 IME1 PHD1 GFA1 CNB1 NAP1 RHO2
YCK2 BNI1 MKK1 SNF2 HSP82
fungal cell
differentiation
0,004
FUS3 SEF1 HMRA1 SIR2 STE5 SPR6 GLC7 MPT5 GSC2 RIM4 GIC1 AYR1
AXL2 PAN1 FAR1 KRE9 IME1 PHD1 GFA1 CNB1 NAP1 RHO2 YCK2 BNI1
MKK1 SNF2 HSP82
cell differentiation 0,004
FUS3 SEF1 HMRA1 SIR2 STE5 SPR6 GLC7 MPT5 GSC2 RIM4 GIC1 AYR1
AXL2 PAN1 FAR1 KRE9 IME1 PHD1 GFA1 CNB1 NAP1 RHO2 YCK2 BNI1
MKK1 SNF2 HSP82
a
Partie V
174
Tableau 32 : Analyse statistique par le logiciel FUNSPEC des fonctions molculaires de Gene
Ontology enrichies pour les ORFs sur-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5.
a
II.2.ii. Localisation cellulaire des produits des gnes sur-exprims pendant la
fermentation alcoolique
La base MIPS permet aussi de connatre la localisation du produit du gne au sein de la
cellule, lorsque celle-ci est connue. Sur lensemble des gnes du gnome de la levure, la
localisation de leur produit est connue pour 2469 dentre eux. Par exemple, 32,7 % se situent
dans le noyau, 22,4% dans le cytoplasme et 5,9% dans la membrane plasmique (cf. tableau
33).
A partir des donnes obtenues sur la fermentation tudie, il semble y avoir un enrichissement
des gnes dont le produit se situe dans la membrane plasmique. En effet, ceux-ci reprsentent
environ 5,9 % du gnome mais entre 10 et 18% des gnes sur-exprims dans nos conditions.
Cette hypothse est confirme par lapplication du logiciel FUNSPEC. En effet, le logiciel
donne un enrichissement de la localisation dans la membrane plasmique avec une probabilit
de 4,4.10
-7
, ainsi que dans une plus faible mesure dans la membrane interne de la
Catgories P value
a
Gnes sur-exprims dans les chantillons 2, 3, 4 ou 5
heat shock protein
[GO:0003773]
<1.10
-14
SSA1 SSA3 HSP26 SSE2 HSP30 HSP42 HSP78 ECM10 SSA4 HSP12
HSP104 HSP60 HSP82
chaperone [GO:0003754] 4,9.10
-08
SSA1 SSA3 HSP26 SSE2 HSP30 HSP42 COX20 HSP78 ECM10 SSA4
HSP12 HSP104 HSP60 SCJ1 HSP82
hexose transporter
[GO:0015149]
6,4.10
-06
HXT15 HXT7 HXT6 HXT3 HXT4 HXT8 HXT9
transporter [GO:0005215] 5,6.10
-05
BAP2 FAT2 SUL1 PCA1 PHO87 GIT1 NDE2 HXT15 DNF2 HXT7 HXT6
HXT3 CYC7 KRE30 FET5 MEP1 MAL11 LAG1 SMF2 HXT4 COX5B
KHA1 QCR8 HXT8 HXT9 YBT1 AAC1 DNF3 COX5A MAS6 HSP82 AQY1
ion transporter
[GO:0015075]
0,0001
SUL1 PCA1 DNF2 FET5 MEP1 SMF2 COX5B KHA1 QCR8 YBT1 DNF3
COX5A HSP82
oxidoreductase
[GO:0016491]
0,0005
BNA4 GRX1 AAD3 NDE2 FET5 AAD6 TDH3 PUT2 GRE3 COX5B AYR1
TDH1 QCR8 GPX1 AHP1 IDH1 COX5A NAR1 ERG24 FDH2
structural constituent of cell
wall [GO:0005199]
0,0007
TIP1 SED1 TIR1 PIR3
carrier [GO:0005386] 0,0009
PCA1 PHO87 DNF2 CYC7 KRE30 FET5 MAL11 SMF2 COX5B KHA1
QCR8 YBT1 AAC1 DNF3 COX5A HSP82
phosphotransferase, alcohol
group as acceptor
[GO:0016773]
0,001
FUS3 GLK1 KIN82 CDC7 FMN1 SNF1 ADK2 HXK1 PCL5 IRE1 UTR1
PRR1 YCK2 PFK27 MKK1 PHO85 TPK2
lipid binding [GO:0008289] 0,001
OSH1 GIT1 DNF2 TFS1 DNF3
phospholipid binding
[GO:0005543]
0,002
OSH1 GIT1 DNF2 DNF3
lipid transporter
[GO:0005319]
0,002
FAT2 GIT1 DNF2 DNF3
Partie V
175
mitochondrie et dans la paroi (cf. tableau 34).
Tableau 33 : Localisation cellulaire des produits des gnes soit pour lensemble du gnome,
soit pour les gnes sur-exprims aux diffrents temps de fermentation (chantillons 2, 3, 4,
et/ou 5). La rpartition dans les diffrentes localisations est indique par le nombre de gnes,
dont le produit est localis dans la classe, exprim en pourcentage du nombre de gnes dont le
produit est localisable.
Fermentation
Classes Gnome temps 2/1 temps 3/1 temps 4/1 temps 5/1 temps 6/1
PAROI 1,5 3,0 3,3 3,6 2,3
CENTROSOME 1,3 1,7 1,5 1,1
CYTOPLASME 22,4 23,8 39,4 23,3 20,4 20,5
CYTOSQUELETTE 4,4 9,5 3,0 3,3 3,6 5,7
RETICULUM
ENDOPLASMIQUE 6,4 9,5 6,1 6,7 3,6 3,4
ENDOSOME 0,5
EXTRACELLULAIRE 0,8 3,0 3,3 1,5 1,1
APPAREIL DE GOLGI 3,3 4,8 3,0 1,7 2,2 1,1
TRANSPORT
INTRACELLULAIRE 1,7 3,0 1,7 1,5 1,1
MITOCHONDRIE 14,8 23,8 9,1 10,0 14,6 13,6
NOYAU 32,7 14,3 6,1 26,7 30,7 34,1
PEROXISOME 1,6 3,0 3,3 2,2 3,4
MEMBRANE
PLASMIQUE 5,9 9,5 18,2 13,3 13,1 11,4
VESICULE
/LYSOSOME 2,4 4,8 3,0 1,7 1,5 1,1
Nombre de gnes dont
le produit est
localisable 2469 21 33 60 137 87
Tableau 34 : Analyse statistique par le logiciel FUNSPEC de la localisation cellulaire fournie
par la base MIPS enrichies pour les ORFs sur-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5.
Catgories P value
a
Gnes sur-exprims dans les chantillons 3, 4 ou 5
Plasmic membrane 4,4.10
-7
BAP2 SUL1 HSP30 GIT1 HXT15 SED1 HXT7 HXT6
HXT3 FET5 GSC2 MEP1 APM2 HXT4 AXL2 HXT8
HXT9 YPS1 YPS3 YCK2 TPK2
Inner membrane of
mitochondria
1,5.10
-3
YAT1 SCO1 NDE2 COX20 PET122 ADK2 SMF2
COX5B QCR8 AAC1 COX5A MAS6
Cell wall 3,1.10
-3
TIP1 SED1 TIR1 PIR3 ASP3-1 ASP3-2
a
Partie V
176
II.3. Etude dtaille des donnes dexpression pertinentes pour la comprhension
de ladaptation de la levure sa production dthanol
II.3.i. Synthse protique rprime et ralentissement de la croissance
Au vu des rsultats prsents ci-dessus, ladaptation des levures au cours de cette
fermentation saccompagne dune rpression dun pool de gnes impliqus pour la majorit
dans la transcription (sous-units des ARN polymrases I, II et III) et la synthse de protines
(synthse des ribosomes et des ARN
t
et initiation de la traduction). La rgulation ngative de
ces gnes est corrle avec le ralentissement de la croissance. En effet, pour lchantillon de
rfrence (temps 1) le taux de croissance est de 0,26 h
-1
, alors quil nest dj plus que de 0,09
h
-1
pour lchantillon 2 et quil est nul pour les autres chantillons 3, 4 et 5 (qui correspondent
larrt de la croissance et lentre en phase de dcouplage croissance-production).
La rpression de gnes appartenant ces catgories fonctionnelles est aussi observe aprs un
choc thanol (Alexandre et al. 2001), mais aussi en rponse des changements
environnementaux (choc, limitation) (Causton et al. 2001;Gasch et Werner-Washburne
2002). Cependant, les mcanismes par lesquels la prsence dthanol induit une rpression
des gnes de synthse protique sont encore inconnus.
Contrairement aux gnes rprims, les gnes induits sont impliqus dans une large varit de
processus cellulaires. La cellule ragit dune part pour se protger et dautre part adapte sa
physiologie son nouvel environnement.
II.3.ii. La rponse aux stress et changements environnementaux : deux
facteurs de transcription impliqus (cf. annexe 1)
Un systme de rponse au stress et de dfense cellulaire semble se mettre en place ds
lchantillon 2 (qui correspond une concentration en thanol de 65 g.l
-1
). La rponse
sintensifie avec laccumulation dthanol dans le milieu. Nous retrouvons des gnes mis en
vidence lors de la rponse commune plusieurs stress et changements environnementaux
(Environment Stress Response ESR (Gasch et al. 2000), Response to Environmental Change
REC (Causton et al. 2001)), notamment le gne du facteur de transcription Hsf1p.
Rcemment, Hahn et al. (2004) ont identifi un certain nombre de cibles des HSF (heat shock
factor) par immuno-prcipitation de la chromatine combine aux puces ADN. Nous avons
Partie V
177
remarqu que 30% de cette liste de gnes se retrouvent sur-exprims dans nos conditions
(cf. figure 43 et annexe 1). Les HSF sont des facteurs de transcription qui activent
lexpression de gnes en rponse un stress. Ces gnes activs contiennent dans leur
promoteur des motifs de rponse au stress thermique (Heat Shock Element HSE). Ils jouent
diffrents rles biologiques : le repliement des protines, la prvention des agrgations de
protines, ladressage et la dgradation des protines, lactivation et la maturation des
protines de la transduction du signal et des facteurs de transcription (cf. figure 43).
A partir de la base YPD (Garrels 1996), un certain nombre de gnes rguls par les facteurs
de transcription Msn2p/Msn4p, facteurs gnraux du stress, a aussi t identifi (cf. figure
43). Les gnes activs par Msn2/4p contiennent dans leur promoteur des lments de rponse
au stress (STRE) (lannexe 1 renvoie les gnes de la famille cell rescue defense and
virulence significativement sur-exprims lors de la fermentation et sils font partie de la
rponse commune au stress (Causton et al. 2001) et/ou de la rponse un choc thanol
(Alexandre et al. 1994a))
Figure 43 : Gnes cibles des facteurs de transcription (a) (Heat Shock Factor) HSF et (b)
Msn2/Msn4 induits dans nos conditions. Les cibles HSF et Msn2/Msn4p sont classes selon
leur fonction connue ou hypothtique en se basant sur la base YPD.
Les cibles des HSF et de Msn2/Msn4p sont impliques dans beaucoup de processus
cellulaires. La plupart des gnes sur-exprims dans nos conditions codent pour des protines
aux fonctions de chaperonnes, de maintenance de la paroi cellulaire et du cytosquelette, de la
HSF
Chaperone
HSP10, HSP12, HSP26,
HSP78, HSP82, HSC82,
HSP104, SSA1, SSA2,
SSA3, SSA4, KAR2,
ERO1, SSE2, STI1,
SGT2, CPR6, AHA1
SIS1, HLJ1, JEM1,
YBR101C, YNL077W
Cell wall and
cytoskeleton
BUD7, SPI1, CWP1,
PIR3, HOR7, YAP1801
Signal
transduction and
regulation
HSF1, IXR1, REB1, ADR1,
ASF2, MET28, PNC1
Energy generation
TYE7, ENO2, TDH3,
CYC3, COX20, YLR327C
Defense against
oxidative stress
CUP1-1, CUP1-2, AHP1 Ubiquitination
and proteolysis
RPN4, UBC4
Small molecular
transport
SNG1, ESBP6, PMC1,
YAH1
Metabolism
Carbohydrate : GRE3,
ADR1
DNA/RNA: SOL1,
NAT4
Vesicular
transport
BTN2, TRS23
HSF HSF
Chaperone
HSP78, HSP82, HSC82,
HSP104, SSA1, SSA2,
SSA3, SSA4, KAR2,
ERO1, SSE2, STI1,
SGT2, CPR6, AHA1
SIS1, HLJ1, JEM1,
YBR101C, YNL077W
Cell wall and
cytoskeleton
BUD7, SPI1, CWP1,
PIR3, HOR7, YAP1801
Signal
transduction and
regulation
HSF1, IXR1, REB1, ADR1,
ASF2, MET28, PNC1
Energy generation
TYE7, ENO2, TDH3,
CYC3, COX20, YLR327C
Defense against
oxidative stress
CUP1-1, CUP1-2, AHP1 Ubiquitination
and proteolysis
RPN4, UBC4
Small molecular
transport
SNG1, ESBP6, PMC1,
YAH1
Metabolism
Carbohydrate : GRE3,
ADR1
DNA/RNA: SOL1,
NAT4
Vesicular
transport
BTN2, TRS23
Msn2/
Msn4
Chaperone and
stress response
HSP42, HSP78, SSA3,
SSA4, YNL077W, DDR48,
HSP104, ALD3, APJ1,
DCS2,
Cell wall and
cytoskeleton
SPI1, SPS100
Signal
transduction and
regulation
CDC25, CYR1, GIS1,
PNC1, TFS1, TPK2
Other Metabolism
Lipid : GIS1, SUR1, TES1
DNA : EDC2
Defense against
oxidative stress
AHP1, CCP1, CTT1,
GRX1, MCR1, SOD2,
Ubiquitination
and proteolysis
PPH21
Small molecular
transport
GNP1, HXT7
Carbohydrate
Metabolism :
ALD3, ALD4, GAC1,
GLK1,GRE3, HXK1,
NTH2, PGM2, SOL4,
TPK2, TSL1
Defense against
osmotic stress
YGP1
Energy generation
CYC7, STF2
Msn2/
Msn4
Msn2/
Msn4
Chaperone and
stress response
HSP42, HSP78, SSA3,
SSA4, YNL077W, DDR48,
HSP104, ALD3, APJ1,
Cell wall and
cytoskeleton
SPI1, SPS100
Signal
transduction and
regulation
CDC25, CYR1, GIS1,
Other Metabolism
Lipid : GIS1, SUR1, TES1
DNA : EDC2
Defense against
oxidative stress
AHP1, CCP1, CTT1,
GRX1, MCR1, SOD2,
Ubiquitination
and proteolysis
Small molecular
transport
GNP1, HXT7
Carbohydrate
Metabolism :
ALD3, ALD4, GAC1,
GLK1,GRE3, HXK1,
NTH2, PGM2, SOL4,
TPK2, TSL1
Defense against
osmotic stress
Energy generation
CYC7, STF2
a b
a b
Partie V
178
dfense contre des stress oxydatifs et osmotiques. Certains gnes sont aussi lis au
mtabolisme carbon, lipidique et celui des acides nucliques, aux systmes de transports,
de transduction du signal, de gnration dnergie, dubiquitination et de protolyse.
Certaines chaperonnes sont dj connues pour avoir un lien avec la rsistance la prsence
dthanol : Hsp12p, Hsp14p, et Hsp104p (Piper et al. 1994;Piper 1995). Hsp30p est connue
pour tre implique dans la rgulation du pH intracellulaire, notamment dans lactivation de
lATPase membranaire en prsence dthanol (Piper et al. 1997).
De manire surprenante, peu de gnes sont impliqus dans la rponse des stress osmotiques
(SIP18, HOR7) mais beaucoup plus de gnes codent pour des protines qui jouent souvent un
rle dans des phnomnes de dtoxification ou de rponse aux stress oxydatifs :
metallothionine (Cup1-1p, Cup1-2p), alkyl hydroperoxyde reductase (Ahp1p), cytochrome-c
peroxydase (Ccp1p), glutathione peroxydase (Grx1p, Gpx1p), catalase (Ctt1p), NADH-
cytochrome b5 reductase (Mcr1p) et manganese superoxyde dismutase (Sod2p), thioredoxine
(Trr2p), Crs5p, Ubc4p.
Plus des deux tiers de ces gnes cibles de HSF ou Msn2/4p sont sur-exprims dans dautres
analyses de gnomique fonctionnelle globale : par exemple, dans le cadre dun choc thanol
(Alexandre et al. 2001), dans la rponse commune aux changements environnementaux
(Causton et al. 2001)ou lors dune fermentation vinicole (Rossignol et al. 2003).
II.3.iii. Mtabolisme li aux alcools (cf. tableau 35)
Pour la levure Saccharomyces cerevisiae, il existe cinq isoformes de lalcool dshydrognase.
ADH1 et ADH2 codent pour des enzymes qui, en thorie, peuvent la fois conduire la
raction dans le sens de la rduction et de loxydation. De part ses proprits cintiques,
Adh1p qui est une protine cytoplasmique, catalyse spcifiquement la raction dans le sens de
la production dthanol partir dactaldhyde. En effet, la constante daffinit pour lthanol
est de lordre de 17 20 mM pour adh1p, contre 600 800 M pour Adh2p (Thomson et al.
2005). Adh2p a donc plus daffinit pour lthanol et donc favoriserait la raction dans le sens
de loxydation.
Nos donnes transcriptomiques indiqueraient que ADH2 est drprim partir de larrt de la
croissance, alors quil est normalement rprim en prsence de glucose (Walther et Schuller
2001). Dautres alcool-dshydrognases sont aussi induites au fur et mesure de
lavancement de la fermentation. Il sagit principalement de gnes codant pour des aryl-alcool
Partie V
179
dshydrognases : AAD3, AAD6, AAD10 et AAD15 (cf. tableau 35). FUN50, dont le produit
prsente des similarits avec une alcool/sorbitol dshydrognase, et ATF2, codant pour une
alcool O-actyltransfrase, prsentent aussi le mme profil. Ces changements dexpression
suggrent une production dautres alcools plus complexes que lthanol.
II.3.iv. Mtabolisme des rserves : trhalose et glycogne (cf. tableau 36)
Le profil daccumulation des rserves de cette fermentation se compose de deux phases
(cf. figure 44a) : une phase daccumulation et une phase de stagnation, voire reconsommation
pour le glycogne. Au niveau de lexpression des gnes de cette voie (cf. figure 44b),
pendant la phase daccumulation, PGM2 est fortement sur-exprim. Il code pour lenzyme
rversible dentre dans la voie de synthse de rserves. Il y a aussi sur-expression de GLC3
dont le produit participe la synthse du glycogne. Au moment o la croissance sarrte, les
gnes codant pour le complexe Glc7p-Gac1p-Pig2p-Gip2p, qui participe la rgulation
positive de la synthse du glycogne, commencent tre sur-exprims. Mais paradoxalement,
PHO85 qui code pour un rgulateur ngatif de la synthse de glycogne est aussi sur-exprim
en mme temps quune diminution de lexpression de PGM2 (cf. tableau36).
Pour le trhalose, il y a activation de NTH2, codant pour une trhalase, ce qui pourrait
expliquer larrt daccumulation du trhalose lchantillon 5 (cf. figure 44a). Cependant, la
principale trhalase qui permet la mobilisation du trhalose est Nth1p (Franois et Parrou
2001) dont lexpression du gne ne semble pas varier. Toutefois, de rcents travaux au sein du
laboratoire indiquent que Nth2p serait active dans des conditions particulires de stress, ce qui
serait confirm par nos rsultats (Jules M., Parrou, J.L., Franois J., non publi)
Le glycogne et le trhalose sont connus pour saccumuler dans les conditions de stress et de
limitation nutritionnelle (Parrou et al. 1997;Parrou et al. 1999). Lactivation de gnes de
synthse et de dgradation des rserves a dj t mis en vidence dans des phnomnes de
stress ou de changements environnementaux (exemple : choc thanol (Alexandre et al. 2001),
stress salin (Blomberg 2000)). Ceci peut permettre une rgulation plus fine du contenu
intracellulaire en rserves. Certains auteurs font lhypothse de lexistence de cycle futile
consommateur dATP, pour avoir une meilleure rgulation du pool nergtique (Blomberg
2000). En effet, la formation de trhalose partir de glucose et sa redgradation en units
glucose consomment deux ATP et un UTP. Dans nos conditions, la prsence dun cycle futile
nest pas vidente car NTH2 est le seul gne de dgradation des rserves qui est sur-exprim
Partie V
180
et seuls les gnes de synthse du glycogne sont activs. Des informations ont pu tre perdues
cause des erreurs exprimentales lors du traitement statistique. Nous ne pouvons donc pas
conclure sur ce point. De plus, les prlvements 3, 4 et 5 correspondent toujours la phase
daccumulation de rserves (cf. figure 44). Seul le prlvement 6 correspond la phase de
stagnation voire reconsommation. Or, nous avons dj mis lhypothse que la prsence de
40% de cellules non viables ce moment-l pourrait entraner un biais dans les rsultats.
Figure 44 : a) Taux de croissance (), vitesse spcifique de production dthanol
p
(),
viabilit cellulaire mesure au bleu de mthylne () et accumulation des rserves
intracellulaires en trhalose ( ) et en glycogne (r ) exprimes en pourcentage de la masse
sche (% MS) en fonction de la concentration en thanol dans le milieu pour la fermentation
n1. Rfrence (1), 2, 3, 4, 5 et 6 correspondent aux chantillons dARN pour lanalyse des
profils dexpression des gnes. b) schma de synthse et dgradation des rserves.
II.3.v. Mtabolisme parital (cf. tableau 37)
Dix-sept gnes sur-exprims sont classs dans la famille du mtabolisme parital. Parmi eux,
GSC2 code pour une protine qui permet llongation des -1,3-glucanes et KRE9 est
impliqu dans la synthse des -1,6-glucanes. De plus, GFA1 et GNA1 qui codent pour les
enzymes qui catalysent les premires tapes de synthse du N-actyl-glucosamine, prcurseur
de la chitine, sont induits surtout en fin de fermentation (cf. tableau 37).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ethanol g.l
-1
p
g
.
g
-
1
.
h
-
1
v
i
a
b
i
l
i
t
r
e
l
a
t
i
v
e
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
h
-
1
T
r
h
a
l
o
s
e
e
t
g
l
y
c
o
g
n
e
%
M
S
rfrence 2 5 3
4
6
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Gsy1/2p Gsy1/2p Gph1p
Glc7p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Pho85p
Tre-6P
Glc3p
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Glc7p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Tre-6P
Glc3p
PGM2p 2glucose
NTH2p
NTH1p
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Glc7p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Tre-6P
Glc3p
Pig1/2p
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Gip2p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Gac1p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Pcl8/10p
Tre-6P
Glc3p
PGM2p 2glucose
NTH2p
NTH1p
Glc7p
lments rgulateurs
Enzymes de synthse ou dgradation
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Glc7p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Pho85p
Tre-6P
Glc3p
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Glc7p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Tre-6P
Glc3p
PGM2p 2glucose
NTH2p
NTH1p
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Glc7p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Tre-6P
Glc3p
Pig1/2p
Glg1/2p
UTP
PPi
Glc-6P
Glc-1P
Tps2p
Tps1p
Gip2p
Glycogen
n+1
Glycogen
n
UDP
Glc-1P
Pi
Gac1p
Gdb1p
Gph1p
UDP-Glc
Trehalose
Pcl8/10p
Tre-6P
Glc3p
PGM2p 2glucose
NTH2p
NTH1p
2glucose
NTH2p
NTH1p
Glc7p
lments rgulateurs
Enzymes de synthse ou dgradation
a)
b)
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ethanol g.l
-1
Partie V
181
Mais MUC1, qui est un gne de dgradation des glucanes codant pour une -1,4-glucosidase,
est aussi sur-exprim pendant la phase de dcouplage. Les gnes de plusieurs
mannoprotines sont aussi induits : Tip1p est une estrase, qui se fixe la structure
polysaccharidique de la paroi par son ancre GPI ; Srp1p est une exo--1,3-glucanase alors que
Pir1p est une protine paritale qui formerait un complexe avec Srp1p et Dan2p qui est trs
similaire a la famille Srt1p/Tir1p.
Ces donnes semblent indiquer que la structure paritale de la levure subit des modifications
au cours du processus de production intensive dthanol. Nous vrifierons ce point plus tard
en analysant les composants paritaux (cf. partie VI).
II.3.vi. Mtabolisme lipidique (cf. tableau 38)
Plusieurs gnes sur-exprims sont des gnes de dgradation lipidique : TIP1 et TES1 codent
pour des estrases ; le produit de YAT1 contribue la dgradation des acides gras dans le
peroxysome.
Paralllement, un certain nombre de gnes de synthse des phospholipides et des strols
semblent sous-exprims trs tt dans la fermentation mais pas de manire importante donc il
napparaissent pas significatifs dans nos rsultats. Seuls ERG24 est sur-exprim.
MCT1 qui code pour une des premires tapes de synthse des acides gras est fortement sous-
exprim.
Linduction de OPI1, rgulateur ngatif de la synthse de phosphatidyl-inositol, semble aller
contresens de la sur-expression de SCS3, impliqu dans la synthse de phosphatidyl-inositol.
De plus, deux gnes sur-exprims sont impliqus dans la synthse dacides gras longue
chane (FAA1 et FAT2).
Les gnes de lipides sur-exprims sont plutt lis aux mtabolismes des sphingolipides et du
phosphatidyl-inositol : DLP1, GPI12, INP52, GIT1, LCB1, LPP1 et SUR1. Le produit de
SUR1 est impliqu dans la mannosylation des sphingolipides (IPC) et celui de GPI12
intervient dans la synthse des ancres GPI.
Se retrouvent aussi sur-exprims des gnes impliqus dans les transports lipidiques : DNF2,
DNF3, FAT2, GIT1
Les donnes transcriptomiques suggrent donc aussi des remaniements au sein de la
composition cellulaire en lipides au cours de ladaptation des levures leur propre production
intensive dthanol. Ce point sera explor par lanalyse de la composition lipidique dans la
partie VI.
Partie V
182
II.3.vii. Respiration et balance redox (cf. tableau 39)
Les lments de la chane respiratoire qui sont surexprims interviennent surtout au niveau
des sous-units du cytochrome c et de la cytochrome c-oxydase : CYC7, COX5B, COX5A,
QCR8. Ils correspondent la fin de la chane respiratoire.
De plus, NDH2, codant pour une NADH dshydrognase mitochondriale qui catalyse
loxydation du NADH cytosolique, est fortement induit (plus de 4 fois). Lactivation de la
chane respiratoire et de NDH2 pourrait entraner une augmentation de la consommation de
NADH par ces voies, ce qui serait dfavorable la production dthanol. Lactivit
respiratoire semblerait sintensifier en fin de fermentation. Plus de NADH serait donc roxyd
par cette voie au dtriment de la production dthanol.
II.3.viii. Homostasie et transport cellulaire
Un grand nombre de gnes sur-exprims sont lis au maintien de lhomostasie et au transport
cellulaire. Environ une trentaine de gnes lis au transport sont activs. Sont concerns les
transports danions (SUL1, 2, PHO87, MEP1, SCO1), de cations (FET5, SFM2, PMC1),
dhexoses (HXT3, 4, 6, 7, 8, 9), de lipides (cf. II.3.vi) et la famille des transporteurs ABC
(MDL2, KRE30).
Lthanol est connu pour inhiber les transporteurs membranaires (Cardoso et Leao
1992;Ferreras et al. 1989;Garcia et Kotyk 1988;Leao et van Uden 1982). La surexpression
des gnes codant pour ces transporteurs est peut-tre un effet compensatoire des levures afin
de sadapter la production intensive dthanol.
Partie V
183
Tableau 35 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme des alcools et diffrentiellement sur-exprims au moins un moment dans nos conditions.
Echantillon
ORF Gne Fonction 2 3 4 5 6
YJR155W AAD10 strong similarity to aryl-alcohol dehydrogenase + + +
YOL165C AAD15 putative aryl alcohol dehydrogenase + + +
YCR107W AAD3 strong similarity aryl-alcohol reductases of P. chrysosporium + + + + +
YFL056C AAD6 strong similarity to aryl-alcohol dehydrogenases + + + ++ +
YOL086C ADH1 alcohol dehydrogenase I +
YMR303C ADH2 alcohol dehydrogenase II + + +
YAL061W FUN50 similarity to alcohol/sorbitol dehydrogenase + + + +
+ : induit 1,5 2,5 fois; ++ : induit 2,5 to 3,5 fois; +++ : > 3,5 fois; ++++, > 7 fois; +++++ : > 20 fois ; Pvalue<0,05
Tableau 36 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme des sucres de rserve et diffrentiellement sur-exprims au moins un moment dans nos conditions.
Echantillon
YOR178C GAC1 ser/thr phosphoprotein phosphatase 1, regulatory chain + + ++ +
YER054C GIP2 GLC7P-interacting protein +
YER133W GLC7 ser/thr phosphoprotein phosphatase 1, catalytic chain + + +
YLR258W GSY2 UDP-glucose--starch glucosyltransferase, isoform 2 +
YPL240C HSP82 heat shock protein + + +
YBR001C NTH2 alpha,alpha-trehalase + + +
YMR105C PGM2 phosphoglucomutase, major isoform + ++ + +
YPL031C PHO85 cyclin-dependent protein kinase + + +
YIL045W PIG2 Protein Interacting with GSY2P + + +
YEL011W GLC3 1,4-glucan branching enzyme (glycogen branching enzyme) +
+ : induit 1,5 2,5 fois; ++ : induit 2,5 to 3,5 fois; +++ : > 3,5 fois; ++++, > 7 fois; +++++ : > 20 fois.
P
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r
t
i
e

V
1
8
1
Partie V
184
Tableau 37 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme parital et diffrentiellement sur-exprims au moins un moment dans nos conditions.
Echantillon
ORF name Gne Fonction
2 3 4 5 6
YIL154C (IMP2) sugar utilization regulatory protein + + + ++ ++
YLR155C ASP3A L-asparaginase II + + ++ +
YLR157C ASP3B L-asparaginase II + + +
YLR158C ASP3C L-asparaginase II + + + +
YLR160C ASP3D L-asparaginase II + + +
YLR037C DAN2 strong similarity to members of the SRP1P/TIP1P family + +
YEL030W ECM10 heat shock protein of HSP70 family + + + +++ ++
YKL104C GFA1 glucosamine--fructose-6-phosphate transaminase + + +
YFL017C GNA1 essential acetyltransferase +
YGR032W GSC2 1,3-beta-D-glucan synthase subunit + +
+
YJL174W KRE9 cell wall synthesis protein + + + +
YIR019C MUC1 extracellular alpha-1,4-glucan glucosidase + + +
YKL163W PIR3 member of the PIR1P/Pir2p/PIR3P family + + + + +
YER150W SPI1 Stationary Phase Induced + + ++ +++ +++
YOR190W SPR1 exo-1,3-beta-glucanase precursor + +
YBR067C TIP1 esterase + + +
YER011W TIR1 cold-shock induced protein of the TIR1P,TIP1P family + + + +
+ : induit 1,5 2,5 fois; ++ : induit 2,5 to 3,5 fois; +++ : > 3,5 fois; ++++, > 7 fois; +++++ : > 20 fois.
P
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Partie V
185
Tableau 38 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme des lipides et diffrentiellement sur-exprims au moins un moment dans nos conditions.
Echantillon
YDR093W DNF2
similarity to P.falciparum ATPase 2 + + + +
YMR162C DNF3
similarity to ATPases + + ++ ++ ++
YDR294C DPL1
dihydrosphingosine phosphate lyase + +
YNL280C ERG24
C-14 sterol reductase +
YOR317W FAA1
long-chain-fatty-acid--CoA ligase + +
YBR222C FAT2
AMP-binding protein, peroxisomal + + + +
YCR098C GIT1
glycerophosphoinositol transporter + + + +
YMR281W GPI12
N-acetylglucosaminyl phosphatidylinositol deacetylase + +
YFL014W HSP12
heat shock protein + + + + +
YNL106C INP52
phosphatidylinositol phosphate phosphatase + +
YHR079C IRE1
protein kinase +++ + +
YER019W ISC1
weak similarity to human and mouse neutral sphingomyelinase + +
YHL003C LAG1
longevity-assurance protein + + ++
+
YMR296C LCB1
serine C-palmitoyltransferase subunit + +
YDR503C LPP1
lipid phosphate phosphatase + +
YOR370C MRS6
geranylgeranyltransferase regulatory subunit + +
YHL020C OPI1
negative regulator of phospholipid biosynthesis pathway + + + +
YAR044W OSH1
similarity to human oxysterol binding protein (OSBP) + +
YHR001W OSH7
similarity to KES1P ++ +
YGL126W SCS3
inositol phospholipid synthesis protein + + + + +
YPL057C SUR1
required for mannosylation of sphingolipids + +
YJR019C TES1
thioesterase, peroxisomal + + + ++
YLR178C TFS1
CDC25-dependent nutrient- and ammonia-response cell-cycle regulator + + + +
YBR067C TIP1
esterase + + +
YAR035W YAT1
carnitine acetyltransferase, mitochondrial +
YLL048C YBT1
yeast bile transporter ++ + ++ +++ +++
YJL068C
strong similarity to human esterase D + + ++ +
YOR221C MCT1
malonyl-CoA:ACP transferase -- -- --- --- ---
+ : induit 1,5 2,5 fois; ++ : induit 2,5 to 3,5 fois; +++ : > 3,5 fois; ++++, > 7 fois; +++++ : > 20 fois
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Partie V
186
Tableau 39 : Niveau dexpression des gnes lis la chane respiratoire et la balance redox et diffrentiellement sur-exprims au moins un
moment dans nos conditions.
Echantillon
ORF Gne Fonction
2 3 4 5 6
YEL039C CYC7 cytochrome-c isoform 2 + +++ ++ +++ +++
YDL085W NDH2
mitochondrial NADH dehydrogenase that catalyzes the oxidation of
cytosolic NADH + + + +++ +++
YPL271W ATP15 F1F0-ATPase complex, F1 epsilon subunit ++ +
YNL052W COX5A cytochrome-c oxidase chain V.A precursor + + +
YIL111W COX5B cytochrome-c oxidase chain Vb + +
YML120C NDI1 NADH-ubiquinone-6 oxidoreductase + + +
+ : induit 1,5 2,5 fois; ++ : induit 2,5 to 3,5 fois; +++ : > 3,5 fois; ++++, > 7 fois; +++++ : > 20 fois
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V
1
8
4
Partie V
187
III. Conclusion de la partie V
Cette tude constitue une approche transcriptomique prliminaire la comprhension du
phnomne dinhibition par lthanol en condition de production intensive. Lavancement de
la raction a t suivi par rapport un chantillon de rfrence pris en dbut de fermentation.
Ainsi nous disposons dune vue densemble de linduction ou de la rpression des gnes au
cours de la production intensive dthanol dans nos conditions.
En accord avec les donnes cintiques, la fermentation se spare en deux phases. Pendant la
phase de croissance, peu de gnes sont induits, mais beaucoup de gnes sont rprims trs
rapidement. Le ralentissement de la croissance entrane une diminution des besoins en
synthse protique. Ainsi, la part nergtique conomise pourrait servir dautres processus.
Pendant la phase de dcouplage, les gnes sur-exprims sont de plus en plus nombreux et le
nombre de gnes rprims nvolue plus.
Une rponse gnrale au stress se met trs nettement en place. Cette rponse sintensifie,
surtout aprs le dcouplage. Le nombre de gnes induits appartenant la fonction de rponse
au stress et de dtoxification augmente, ainsi que leur intensit dexpression, avec ltat
davancement du procd vers de fortes teneurs en thanol dans le milieu. La rponse semble
essentiellement dpendante de deux types de facteurs de transcription : Mns2/4p et les Hsf.
Cette rponse est caractristique de cellules soumises des changements environnementaux
(Environment Stress Response ESR (Gasch et al. 2000), Response to Environmental Change
REC (Causton et al. 2001)). Elle englobe plusieurs familles fonctionnelles dont notamment
les gnes codant pour les enzymes participant au mtabolisme des rserves intracellulaires,
la balance redox, la rgulation de lhomostasie cellulaire et lintgrit des structures
cellulaires, en plus des traditionnels gnes dit de stress (Gasch et Werner-Washburne
2002). La rponse au stress commence se mettre en place pendant la phase de croissance.
Mais les autres changements importants semblent arriver tard dans la fermentation, alors que
la croissance est arrte et que la viabilit commence chuter
De plus, notre tude suggre des remaniements paritaux et lipidiques. A cela sajoute
linduction de gnes codant des protines de transport de molcules de plus en plus varies
(hexose, lipidique, ionique) et un enrichissement en gnes dont le produit sera localis
Partie V
188
surtout dans la membrane plasmique mais aussi dans la membrane interne des mitochondries.
Ces remarques confirment limportance de la membrane plasmique en tant que cible de
lthanol, comme le dcrit la littrature (cf. partie I : tude bibliographique). Lthanol est
connu pour modifier les proprits de la membrane et notamment perturber lactivit de
lATPase membranaire (Alexandre et al. 1996). HSP30, qui code un rgulateur suppos de
lH
+
-ATPase membranaire (Piper et al. 1997), est activ comme lors dun choc thanol
(Alexandre et al. 2001) et aussi dans nos conditions. Lthanol inhibe certains transporteurs
(Leao et van Uden 1982;Thomas et Rose 1979). Lors de lajout dthanol dans le milieu
(Alexandre et al. 2001;Fujita et al. 2004) ou dautres solvants hydrophiles (Fujita et al.
2004;Zhang et al. 2003), certains gnes de la famille des transports sont aussi induits.
Linduction de nombreux gnes codant pour des transporteurs viserait contrebalancer
linhibition de ces derniers par lthanol. Lhomostasie de la cellule est perturbe et la cellule
ragit en modifiant ses enveloppes cellulaires. La paroi aussi semble jouer un rle dans la
tolrance lthanol dans nos conditions, comme suggr par la littrature (Ogawa et al.
2000;Takahashi et al. 2001).
Nous retrouvons quelques similarits avec dautres expriences ralises en prsence
dthanol ou dautres solvants hydrophiles (Alexandre et al. 2001;Fujita et al. 2004;Zhang
et al. 2003). 38 gnes seulement sont sur-exprims en commun avec un choc thanol
(Alexandre et al. 2001). Il sagit de gnes lis au stress, au mtabolisme des rserves et au
transport. Ethanol et DMSO sont tous les deux des solvants hydrophiles, ils sont donc
susceptibles davoir des effets similaires sur les cellules, notamment au niveau de la
membrane et de la paroi. En effet, la rponse de la levure sa propre production dthanol
peut prsenter des similitudes avec la rponse dune levure pendant une croissance en
prsence dun autre solvant organique, le DMSO (Zhang et al. 2003). Seulement 19 gnes
sont sur-exprims dans les deux cas mais nous retrouvons les mmes familles fonctionnelles :
la rponse un changement environnemental, la synthse et lutilisation des lipides, le
mtabolisme des acides amins, la synthse paritale, les transports. Finalement, peu de gnes
sont induits en commun entre ces expriences et la notre, ce qui souligne bien loriginalit de
ce travail et lintrt de travailler en condition de production dthanol pour tudier
ladaptation des levures lthanol.
Enfin, dans notre cas, comme attendu, il ny a pas de mise en vidence dune quelconque
limitation nutritionnelle. Par exemple, les gnes contrls par le systme TOR ne sont pas
Partie V
189
affects contrairement ce qui est observ lors des fermentations vinicoles qui subissent une
limitation en azote (Rossignol et al. 2003). Il est difficile de comparer nos rsultats avec
dautres fermentations alcooliques car les conditions tudies par ailleurs peuvent tre trs
diffrentes. Dans la plupart des cas, il est trs difficile disoler leffet de la prsence dthanol
car de nombreux phnomnes se superposent, comme dans les conditions nologiques
(Marks et al. 2003;Perez-Ortin et al. 2002;Rossignol et al. 2003), brassicoles (James et al.
2003;Olesen et al. 2002) ou sur milieu complexe (Shima et al. 2005) : carence nutritionnelle,
proprits physico-chimiques variables, diffrence daration, ..
Partie V
190
Partie V
191
Partie VI :
Analyse de la physiologie des levures
au cours de deux fermentations
conduisant des diffrences
significatives en titre thanolique
Partie VI
192
Partie VI
193
Afin de cerner les mtabolismes cls dune bonne adaptation des levures des
concentrations en thanol suprieures 120 g.l
-1
, jai choisi de comparer deux fermentations
de performances diffrentes. Ces deux fermentations sont prsentes dans la partie IV. Il
sagit des fermentations 3 et 4. La premire a atteint un titre final de 141 g.l
-1
et la seconde de
120 g.l
-1
(cf. figure 45). Cette diffrence de performance repose sur une plus grande phase de
dcouplage. Cette phase est dautant plus longue que la viabilit cellulaire se maintient. La
perte de viabilit semble tre associe une perte dactivit mtabolique, ce que nous allons
confirmer par le suivi des concentrations intracellulaires de certains mtabolites glycolytiques
et nergtiques. Lvolution du contenu intracellulaire en sucres de rserves (trhalose et
glycogne) va aussi nous donner des indications sur ltat physiologique des levures aux
diffrents stades des deux fermentations. De plus, lthanol est connu pour induire des
perturbations au niveau de la membrane affectant le gradient transmembranaire de protons
(Leao et van Uden 1984) pour des concentrations en thanol infrieure 10 % v/v (soit
environ 80 g.l
-1
). Que se passe-t-il dans nos gammes de concentrations encore plus leves ?
Les enveloppes cellulaires semblent tre les premires cibles de laction de lthanol (cf.
partie I tude bibliographique ), comme le confirment les rsultats transcriptomiques de la
partie V. Cest pourquoi, nous avons dtermin les contenus lipidiques et en sucres paritaux
des cellules.
I. Impact de la production dthanol sur lactivit glycolytique et laccumulation de
sucres de rserves des levures
Les deux fermentations 3 et 4 nont pas eu les mmes comportements au niveau de la viabilit
cellulaire (cf. figure 45). Lors de la fermentation 3 la viabilit sest effondre trs rapidement
aprs larrt de la croissance, alors que pour la fermentation 4, elle sest maintenue pendant
plus de 10 h aprs larrt de la croissance entranant une meilleure production dthanol, qui
se traduit par une augmentation de 17% du titre final en thanol par rapport la fermentation
3. La perte de viabilit mesure semble tre en fait une perte dactivit mtabolique, ce que
nous souhaitons confirmer par le suivi de mtabolites glycolytiques (Glucose-6-P, Fructose-6-
P et fructose-1-6-P) et nergtique (ATP, ADP, AMP).
Partie VI
194
I.1. Evolution des mtabolites glycolytiques et nergtiques intracellulaires
Les contenus en glucose-6-phosphate et fructose-6-phosphate sont en quilibre dans la cellule
grce la phosphoglucoisomrase qui catalyse une raction rversible. Le terme
hexose-6-phosphste renverra donc la somme du glucose-6-phosphate et du fructose-6-
phosphate. Les contenus en sucres phosphoryls diminuent progressivement jusqu larrt de
la croissance (cf. figure 45). Cette baisse est en accord avec une diminution de lactivit
glycolytique suivant le ralentissement de la croissance. Aprs larrt de la croissance, le pool
de mtabolites glycolytiques est en faible quantit et varie peu.
Nous observons, en fin de croissance, un pulse dhexose-6-phosphate aprs un ajout de
glucose (cf. figure 45). Ce comportement est caractristique de cellules ayant dj un flux
glycolytique fortement ralenti (Franois et al. 1984). Dans nos conditions, les importantes
variations de glucose dans le milieu induisent dimportantes variations du pool de mtabolites
intracellulaires. Corrler ces variations au pulse de glucose nest pas le propos ici.
Les contenus cellulaires en ATP, en ADP et en AMP sont lis par ladnylate kinase:
ATP + AMP D ADP + ADP. Donc, la somme des nuclotides adnosines ATP+ADP+AMP
doit tre constante sil ny a ni synthse de novo, ni dgradation ou fuite cellulaire. La somme
ATP+ADP+AMP reste sensiblement constante jusqu la perte de viabilit. Les pools
nergtiques diminuent exactement en parallle la perte de viabilit des cellules au cours du
processus de fermentation (cf. figure 46). Il y a donc disparition de ces rservoirs nergtiques
au sein de la cellule. Ceci peut tre d soit une dgradation intracellulaire, soit une fuite de
ces mtabolites lextrieur de la cellule. Les teneurs intracellulaires en mtabolites
glycolytiques sont aussi faibles aprs larrt de la croissance. Y at-il aussi dgradation ou
fuite extracellulaire ?
Partie VI
195
Figure 45
Hexose-6-P r , Fructose-1-6-P
mol.g
-1
MS
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Hexose-6-P r , Fructose-1-6-P
mol.g
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Partie VI
196
Partie VI
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Partie VI
198
I.2. Fuite extracellulaire de mtabolites
Afin de vrifier lhypothse de fuite des nuclotides hors de la cellule, nous avons mesur les
mtabolites prsents dans le surnageant de culture (cf. figure 47).
Les adnines nuclotides se retrouvent en effet dans le surnageant (cf. figure 47). Il y a
majoritairement de lAMP (50 90%), un peu dADP (10 50 %) et peu dATP (0 20%),
contrairement au contenu intracellulaire (ATP : 40-60%). LATP qui se retrouve dans le
milieu de culture est peut-tre hydrolys en ADP et AMP.
De plus, des sucres phosphoryls, tels que le glucose-6-phosphate (cf. figure 47), sont aussi
prsents dans le milieu. Laccumulation de mtabolites intracellulaires dans le milieu corrle
avec la perte de viabilit mesure par coloration au bleu de mthylne. Ces observations
suggrent, donc quen plus dune perte dactivit mtabolique, les cellules doivent subir des
altrations membranaires qui permabilisent la membrane et induisent la fuite du contenu
cellulaire dans le milieu.
Partie VI
199
Figure 47
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4
Partie VI
200
I.3. Evolution du contenu intracellulaire en sucres de rserves : trhalose et
glycogne
Nous nous intressons au contenu intracellulaire en rserves de carbohydrates (trhalose et
glycogne) pour deux raisons. Dune part, des changements de la teneur en carbohydrates des
levures ont t identifis (cf. partie IV) pendant la fermentation alcoolique. Ils peuvent tre
dus des modifications des sucres de rserves ou des sucres paritaux. Dautre part, le
trhalose et le glycogne sont des marqueurs connus de ladaptation physiologique lors de
certains changements environnementaux : stress, carence nutritionnelle(Franois et Parrou
2001).
Pendant la phase de croissance, peu de rserves saccumulent (environ 1 2 % MS dans
chaque cas). Ces accumulations sont relativement similaires dans chaque fermentation
tudie.
Par contre, il y a une deuxime phase daccumulation des rserves pendant la phase de
dcouplage et de perte de viabilit qui diffre selon les performances du procd. Dans la
fermentation 3, la performance finale en thanol est de 120 g.l
-1
, pour une viabilit qui chute
trs rapidement aprs larrt de la croissance, et il ny a pratiquement pas daccumulation ni
de trhalose, ni de glycogne. Les valeurs restent autour de 1 % MS pour chacune des
rserves. Pour la fermentation 4, la plus performante (141 g.l
-1
), le glycogne saccumule ds
la fin de la phase de croissance, jusqu prs de 8 % MS, avec une lgre reconsommation
pendant la perte de viabilit. Pour le trhalose, il saccumule surtout pendant la phase de
dcouplage en corrlation avec la perte de viabilit, jusqu environ 4 % MS.
Laccumulation de carbohydrates saccompagne dune diminution des intermdiaires
glycolytiques intracellulaires (par exemple, glucose-6-Phosphate, cf. figure 48) en accord
avec lannulation du taux de croissance et donc la forte rduction du flux glycolytique. De
plus, laccumulation de trhalose est concomitante une accumulation de trhalose-6-
Phosphate. LUDP-glucose saccumule transitoirement dans les deux cas mais sans influence
apparente sur le dclenchement de laccumulation de trhalose ou de glycogne.
Partie VI
201
Figure 48 : Evolution, en fonction de la concentration en thanol, du taux de croissance
(), de la vitesse spcifique de production dthanol
p
(), de la viabilit ( ) ; des
contenus intracellulaires rapports la masse sche (% MS) de cellules en trhalose ( ) et
glycogne () ; et en trhalose-6-P (), glucose-6-P ( ) et UDP-glucose (p ), pour les
fermentations 3 et 4. - - - - : arrt de la croissance sparant la phase de croissance de la phase
de dcouplage.
Ethanol g l
-1
Ethanol g l
-1
0
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0 20 40 60 80 100 120 140 160
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Partie VI
202
Partie VI
203
II. Impact de la production dthanol sur le contenu lipidique et les structures
membranaires et paritales
La conduite en mode fed-batch implique forcment des changements de conditions
environnementales pour les levures, notamment au niveau de laccumulation de lthanol. Ces
modifications induisent une adaptation des cellules leur environnement et donc des
modifications au niveau de la composition cellulaire. Nous avons vu prcdemment que
lthanol engendre des changements transcriptomiques au niveau de gnes dont le produit se
situe dans les enveloppes cellulaires (membrane et paroi). A la vue des mtabolites qui se
retrouvent dans le milieu de culture, lthanol semble provoquer une permabilisation
importante des membranes dans nos conditions. De plus, daprs la littrature, la levure
adapte sa composition lipidique la prsence dthanol, principalement sa composition en
ergostrol, phospholipides et acides gras (cf. partie I : tude bibliographique). Cest pourquoi
nous nous sommes intresss au contenu lipidique et parital des cellules en condition de
production intensive dthanol.
II.1. Impact de la production dthanol sur le contenu lipidique
La mthode dextraction des lipides totaux a t mise au point (cf. partie III) et des mthodes
de quantification fiables ont t choisies. Plusieurs mthodes de quantification ont t
utilises pour analyser la composition lipidique des extraits. La gravimtrie permet dobtenir
la quantit de lipides totaux par pese de lextrait lipidique. La technique de chromatographie
couche mince (CCM) permet de quantifier dune part les lipides neutres (les acides gras
libres ou estrifis, les mono-, di- et triglycrides, les strols libres et estrifis) et dautre part
les phospholipides (Phosphatidyl-tanolamine PE, Phosphatidyl-inositol PI,
Phosphatidyl-srine PS, Phosphatidyl-glycrol PG, Phosphatidyl-choline PC, Cardiolipide
CL, Acide Phosphatidique PA). Les dosages colorimtriques ne seront pas prsents ici car ils
napportent pas dinformations supplmentaires par rapport la CCM.
Comme discut dans la partie bibliographique, chaque lipide un rle particulier au sein de la
cellule. Nous allons, ici, nous intresser lvolution de leurs teneurs cellulaires au cours des
fermentations alcooliques et la relier aux vnements macrocintiques qui se produisent lors
du processus : accumulation dthanol, arrt de la croissance et perte de viabilit.
Les phospholipides et les strols sont connus pour leur influence en cas de prsence dthanol
(Chi et Arneborg 1999;Del Castillo Agudo 1992;Koukou et al. 1990;Swan et Watson
Partie VI
204
1998;Thomas et al. 1978). Leur contenu au cours des fermentations 3 et 4 sont rsums sur
les figures 49 et 50. Cependant, ce ne sont pas les seuls lipides dont les teneurs cellulaires
varient lors des fermentations. Il y a trois phases dans lvolution du contenu lipidique des
cellules : une phase de dmarrage (les deux premiers chantillons pour la fermentation 3 et le
premier pour la fermentation 4), une phase qui correspond la phase de croissance cellulaire
jusqu la perte de viabilit et une phase qui correspond la perte de viabilit.
II.1.i. Evolution du contenu cellulaire en strols et esters de strols
Dans nos chantillons, lergostrol et les esters de strols reprsentent plus de 95% des strols
totaux. Le lanostrol est prsent mais en faible quantit et peu de squalne a t dtect.
Pour les deux fermentations, les strols voluent suivant le mme profil. Pendant la phase de
croissance, la teneur en strols totaux stagne autour de 0,7% pour la fermentation 3 et autour
de 1% pour la fermentation 4. Elle augmente au moment de la perte de viabilit. Les
proportions entre esters de strol et ergostrol restent constantes pendant cette phase. Cette
augmentation peut tre due une accumulation de strols par les cellules viables pour lutter
contre lthanol. Mais elle peut aussi sexpliquer par la fuite dune partie du contenu
intracellulaire qui diminue la masse sche des cellules (cf. figure 49). Les teneurs des
lments restants, comme les strols, sen trouvent proportionnellement augmentes.
Par contre, ds le dbut de la fermentation, les compositions lipidiques des deux
fermentations sont diffrentes. Il y a nettement plus de strols dans la fermentation 4 que dans
la fermentation 3 (1% de la masse sche contre 0,7% de la masse sche). Cette diffrence se
situe surtout au niveau des rserves de strols sous forme desters.
Partie VI
205
Figure 49
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Partie VI
206
II.1.ii. Evolution du contenu cellulaire en phospholipides (cf. figure 50)
a. Phospholipides totaux
Lvolution des phospholipides totaux prsente le mme profil dans les deux fermentations
tudies. Le contenu en phospholipides diminue lentement pendant la phase de croissance,
puis cette diminution sacclre pendant la phase de dcouplage, surtout pendant la perte de
viabilit (cf. figure 50).
Partie VI
207
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Partie VI
208
En fait, en traant lvolution du contenu intracellulaire en phospholipides en fonction de la
viabilit cellulaire mesure au cours du procd (cf. figure 51), une nette corrlation linaire
apparat entre les deux paramtres mesurs. Les premiers points de fermentation nont pas t
pris en compte pour la figure 51 (le premier pour la fermentation 4, les deux premiers pour la
fermentation 3) car ils prsentent des teneurs plus leves en phospholipides. Ils
correspondent la phase de dmarrage o les cellules issues de linoculum sacclimatent aux
conditions dans le racteur.
Comme pour les strols, lvolution des teneurs intracellulaires en phospholipides est
similaire pour les deux fermentations 3 et 4. Mais, ds le dbut des fermentations, les teneurs
absolues en phospholipides sont diffrentes ( de lordre de 1,8 % de la masse sche pour la
fermentation 3 et de 1 % de la masse sche pour la fermentation 4).
Figure 51 : Corrlation entre le contenu intracellulaire en phospholipides, rapport la masse
sche (% MS) de cellules, et la viabilit cellulaire relative mesure au bleu de mthylne pour
les fermentations 3 ( ) et 4 ( ) (R
2
=0,9).
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Partie VI
209
b. Proportions des diffrents phospholipides cellulaires
La phosphatidyl-choline PC est de loin le phospholipide le plus abondant dans nos extraits.
Elle reprsente entre 60% et 90% des phospholipides totaux.
Les teneurs de tous les phospholipides nvoluent pas de la mme manire (cf. figure 50). Le
contenu cellulaire en phosphatidyl-choline PC et phosphatidyl-thanolamine PE diminue au
cours du temps. Les proportions de PC et PE se maintiennent jusquau dbut de la perte de
viabilit. A la fin du procd, il ny a pratiquement plus que de la PC et des cardiolipides
CL+acide phosphatidique PA. En effet, PA+CL sont les seuls composs saccumuler en
toute fin de procd. Malheureusement, la sparation de ces deux composs sur plaque est
difficile donc nous navons pu mesurer que la teneur cumule CL+PA et nous ne savons donc
pas lequel de ces composs saccumule en fin de fermentation.
En revanche, le phosphatidyl-inositol PI a un comportement diffrent entre les deux
fermentations. Prsent en plus faible quantit dans la fermentation 4 (0,15 % MS au
maximum, contre 0,3 % MS pour la fermentation 3), il saccumule transitoirement avant
larrt de la croissance puis diminue rapidement, ce qui nest pas le cas dans la fermentation
3, o il diminue plus lentement en suivant le mme profil que PC et PE.
Partie VI
210
II.1.iii. Evolution des autres composs lipidiques : Glycrides, Acides gras
et esters dacides gras
Seuls les acides gras, les triglycrides et les esters dacides gras se retrouvent en quantit
importante dans les extraits cellulaires (cf. figure 52). Les diglycrides reprsentent dans les
deux fermentations moins de 0,1 % MS et cette teneur nvolue pas au cours du temps.
Pour les triglycrides, les mmes profils se retrouvent dans les deux fermentations : peu de
modifications pendant la phase de croissance et accumulation pendant la phase de dcouplage.
Pour la fermentation 4 (la plus performante), les triglycrides saccumulent fortement ds
larrt de la croissance, passant de 0,6 1,1% MS. Comme pour les strols et les
phospholipides, mme si les profils dvolution des teneurs intracellulaires en triglycrides
sont similaires dans les deux fermentations, il existe une diffrence de teneurs absolues
pendant la phase de croissance (0,3 % MS pour la fermentation 3 et de 0,5 % MS pour la 4).
Dans les deux fermentations apparaissent des esters dacides gras en fin de fermentation,
pendant la phase de perte de viabilit.
Par contre pour les acides gras libres, nous obtenons des profils diffrents pour les deux
fermentations. Dans la fermentation 4, les acides gras libres diminuent pendant la phase de
croissance, de 1,2% 0,6% MS. Ils se stabilisent autour de 0,4% MS au moment de la chute
de viabilit. Par contre pour la fermentation n3, ce contenu est dj de 0,4 % MS au dpart
de la fermentation et oscille ensuite autour de cette valeur. La teneur initiale en acides gras
libres est donc plus leve dans la fermentation 4 que dans la fermentation 3, ce qui pourrait
tre en relation avec les diffrences de performances.
Partie VI
211
Figure 52
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2
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Viabilit relative
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-1
Partie VI
212
II.1.iv. Evolution du contenu cellulaire en lipides totaux pendant les
fermentations
La figure 53 illustre lvolution des contenus cellulaires en lipides totaux. Ces contenus ont
t mesurs par gravimtrie.
Ce contenu diminue pendant la phase de croissance pour raugmenter dans la phase de
dcouplage linverse de la perte de viabilit. Le mme profil est obtenu lorsque sont ajouts
les diffrents lipides quantifis par CCM (cf. figure 53). Donc, ce profil peut tre en partie
expliqu par les observations dcrites ci dessus. Cependant, en faisant la somme des lipides
identifis par CCM, nous ne retrouvons quenviron 45 65% des lipides totaux mesurs par
gravimtrie. Nous savons que nous ne mesurons pas tous les lipides contenus dans lextrait
par CCM. Il y a potentiellement des strols non identifis par CCM, des lipides
complexes (glycolipides, protolipides) et probablement des acides amins (cf. partie III).
Il pourrait aussi y avoir des protines hydrophobes. Cependant, nous navons pas russi en
identifier la prsence.
En utilisant une migration sur CCM (chloroforme/mthanol /eau, 40/10/1 v/v) avec lorcinol
(0,2g dorcinol dans lacide sulfurique 1,5 N) comme rvlateur spcifique des sucres, nous
avons mis en vidence la prsence de sucres provenant probablement de glycolipides. Mais
les glycolipides prsents nont pas pu tre identifis.
Partie VI
213
Figure 53
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.
Partie VI
214
II.1.v. Evolution des compositions relatives dans les diffrents acides gras
en fonction du degr dinsaturation et de la longueur de la chane
Une analyse des profils dacides gras totaux a t ralise aprs estrification (mthylation)
sur les extraits lipidiques, et quantification des produits obtenus par chromatographie gazeuse.
Nous nous sommes intresss deux paramtres : le degr dinsaturation et la longueur de la
chane carbone des acides gras. Le degr dinsaturation a t estim par le calcul du ratio
dacides gras insaturs sur acides gras saturs :
0 : 18 0 : 16 0 : 14 0 : 12 0 : 10
3 : 18 2 : 18 1 : 18 1 : 16 1 : 14 1 : 12 1 : 10
. .
) . . (
/ .
C C C C C
C C C C C C C
saturs gras acides
insaturs gras acides
saturs insaturs ratio
+ + + +
+ + + + + +
= =
Lvolution de la longueur de la chane carbone en acides gras est value par le calcul du
ratio des acides gras les plus prsents C16 et C18
3 : 18 2 : 18 1 : 18 0 : 18
1 : 16 0 : 16
) 18 . . (
) 16 . . (
18 / 16
C C C C
C C
C gras acides
C gras acides
C C
+ + +
+
= =
Nos chantillons contiennent entre 50 et 60 % de C16 (saturs et insaturs) et entre 35 et 45 %

de C18 (insaturs et saturs). Le reste comprend des acides gras plus courte chane (C10:0,
C12:0, C14:0 et C14:1). Dans nos conditions, nous navons pas identifi dacide gras longue
chane C20 et plus. Les acides gras poly-insaturs sont absents des extraits sauf la fin de la
fermentation 4.
Les deux fermentations 3 et 4 prsentent les mmes modifications en terme de composition en
acides gras (cf. figure 54). Il semblerait y avoir une augmentation de la longueur de la chane
pendant la phase de croissance. Le ratio C16/C18 diminue denviron 30% pour les deux
fermentations, puis il se maintient pendant la phase de dcouplage.
Le degr dinsaturation semblerait lui-aussi augmenter lgrement pendant la phase de
croissance. Il semble dcrotre ensuite pendant la phase de dcouplage pour revenir
pratiquement aux valeurs initiales. Cependant, dans les deux cas, les erreurs exprimentales
ne nous permettent pas de conclure sur des modifications significatives du degr
dinsaturation et de la longueur de la chane carbone. Il faudrait refaire les analyses sur plus
dchantillons et sur plusieurs fermentations.
De plus, la diffrence de composition en acides gras est assez minime entre les deux
fermentations. On ne peut pas conclure sur le rle de ces derniers dans les diffrences de
performances observes entre les deux fermentations.
Partie VI
215
p
(), de la viabilit ( ), des ratios
intracellulaires en acides gras insaturs/saturs ( ), et en acides gras C16/C18 (r ) pour les
de dcouplage
h
-
1
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0,6
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0
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0,4
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0,8
1
1,2
1,4
1,6
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2
0 20 40 60 80 100 120 140 160
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Fermentation 4
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Partie VI
216
II.2. Impact de la production dthanol sur le contenu en sucres paritaux
Lors de lanalyse transcriptomique dune fermentation alcoolique (cf. partie IV), nous avions
mis en vidence quun certain nombre de gnes dont les produits sont impliqus dans la
synthse paritale, taient sur-exprims surtout au moment de larrt de la croissance. Cela
suggrait des modifications au sein de la paroi cellulaire. Cest pourquoi, nous avons
dtermin les teneurs en sucres paritaux de ces parois.
Trs peu de changements paritaux se produisent au cours de la fermentation. Les teneurs en
chitine restent constantes tout au long de la fermentation. Seul le rapport glucanes/mannanes
volue au profit dune accumulation des glucanes au dtriment des mannanes, pendant la
phase de croissance. Le contenu en glucanes passe de 49 % 59 % de la masse sche pour la
fermentation 4 et 30 % 51 % de la masse sche pour la fermentation 3. Il y a peu de
remaniements des principaux sucres paritaux lors des deux fermentations tudies.
Cependant, il faut souligner que nous ne nous sommes intresss quaux grandes familles de
sucres paritaux. Il peut y avoir des remaniements au niveau de larchitecture paritale,
comme par exemple dans les liaisons -1-6 et -1-3 des glucanes.
Pour la fermentation 4, la teneur totale en sucres de paroi reste toujours autour de 20 % MS au
cours du processus de production dthanol. Pour la fermentation 3, cette teneur est autour de
15 % MS pendant la phase de croissance et elle augmente pendant la phase de dcouplage
pour atteindre les 20 % MS (cf. figure 55). Les diffrences de teneurs totales en sucres
paritaux et de rpartitions glucane/mannane pourraient tre lies la diffrence de
performance. Mais il faudrait faire des expriences complmentaires sur dautres
fermentations pour confirmer cette hypothse.
Partie VI
217
Figure 55
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Sucres Paritaux % MS
Rpartition des sucres
paritaux en % de la paroi
Partie VI
218
III. Conclusion de la partie VI
Afin de comprendre les mcanismes mis en place par la levure pour sadapter sa propre
production dthanol, nous avons choisi de comparer deux fermentations de performances
diffrentes. Les fermentations 3 et 4 ont des modes dapport du glucose lgrement diffrents.
Mais les diffrences de performances entre les fermentations 3 et 4 ne peuvent sexpliquer par
la diffrence dapport du glucose car la fermentation 3 est sense tre la reproduction de la
fermentation 2, qui avait donn des performances similaires la fermentation 4 (cf. partie IV).
Il est cependant intressant de comparer ces deux fermentations car elles nont pas atteint les
mmes performances et nous pouvons esprer identifier des diffrences mtaboliques et
physiologiques qui pourraient rendre compte de ces diffrences de performances du procd.
Il est connu que lors de fermentations alcooliques dans nos conditions, linhibition par
lthanol est prpondrante mais nest pas toujours reproductible (Baudet 1990). A travers ces
deux fermentations, nous pouvons identifier des mcanismes communs vis--vis de
laccumulation dthanol et diffrents qui peuvent tre lies la diffrence de performances.
Pour les deux fermentations, la perte de viabilit des cellules est concomitante une fuite
massive des mtabolites intracellulaires hors de la cellule. Salgueiro et al. ont dj observ un
relargage dacides amins et de composants absorbant 260 nm, aprs addition de 18% (v/v)
dthanol dans le milieu (Salgueiro et al. 1988). De mme, Gonzales et al. (1997) observent la
prsence de mtabolites intracellulaires dans le surnageant et rejettent lhypothse de
lexcrtion de ces mtabolites. Ils privilgient lhypothse dune permabilisation et/ou dune
lyse cellulaire, surtout quils observent au mme moment 20% de cellules colores en bleu
aprs par le bleu de mthylne. Dans notre cas, il sagit aussi probablement dune
permabilisation des cellules due une perte dintgrit membranaire provoque par la
prsence dthanol. Cette perte dintgrit membranaire va induire une perte du gradient de
protons. Cet effet est alors plus consquent quune simple perturbation du gradient de protons
travers la membrane plasmique et que linactivation des systmes de transport, dcrits dans
la littrature sur leffet de lthanol sur la membrane (Alexandre et al. 1996;D'Amore et al.
1990;Jones et Greenfield 1987;Leao et van Uden 1984;Walker-Caprioglio et al. 1990).
Cependant, nous ne pouvons pas conclure exactement sur lenchanement entre perte de
viabilit et perte dintgrit membranaire. La perte dactivit mtabolique peut-tre la
consquence dune inhibition des activits enzymatiques par lthanol, et survenir avant la
permabilisation. La permabilisation proviendrait alors dune inhibition des enzymes lies
Partie VI
219
la formation des membranes cellulaires ou dune dgradation post-mortem (par exemple, de
type autolyse (Arnold 1981;Kollar et al. 1993a;Kollar et al. 1993b;Pueyo et al. 2000).
Mais cela peut aussi tre d la dgradation de la membrane par action de lthanol qui
conduit larrt de toute activit mtabolique.
Une tude prliminaire de la composition macromolculaire des levures au cours des
fermentations alcooliques, nous a permis de mettre en vidence une accumulation des
carbohydrates au dtriment des protines et des acides nucliques. Aprs analyses plus
approfondies, cette accumulation de carbohydrates correspond laccumulation de rserves
par la cellule sous forme de glycogne et de trhalose, mais elle nest pas en relation avec la
composition en sucres (mannose, glucose) de la paroi cellulaire. Il est probable que les
changements paritaux se situent plus au niveau structurel quau niveau de leur composition.
Trhalose et glycogne sont tous les deux appels sucres de rserves, cependant ils ont des
rles diffrents au sein de la cellule ; cest pourquoi ils ne saccumulent pas ncessairement de
la mme manire. La fonction majeure du glycogne semble tre le stockage de carbone et
dnergie pour la maintenance des activits cellulaires en cas denvironnement dfavorable
(Franois et Parrou 2001). Le trhalose peut aussi servir de stockage de carbone et dnergie.
Mais, il semble quil ait un rle cl dans la rsistance au stress. Il a t prouv que le trhalose
est impliqu dans la protection contre des variations de pression osmotique (Blomberg 2000).
Le trhalose peut aussi protger contre lautolyse (Franois et Parrou 2001), contre les fortes
tempratures et contre la dessiccation, en stabilisant les protines et en maintenant lintgrit
membranaire en interagissant avec la fois les protines et les phospholipides (Blomberg
2000;Felix et al. 1999). Dans nos expriences, le trhalose et le glycogne saccumulent
diffremment suivant les fermentations tudies. Plus ils saccumulent, plus la fermentation
est performante : la perte de viabilit est repousse vers des concentrations en thanol plus
leves et la concentration finale en thanol est suprieure. Lhypothse du rle du trhalose
comme protecteur des levures en prsence dthanol a dj t mise. Certains auteurs
suggrent que le trhalose permet dempcher, ou de ralentir certains effets perturbateurs de
lthanol au niveau de la membrane plasmique (Mansure et al. 1997). Il aurait une action
protectrice contre les fuites dions en prsence dthanol sur des liposomes artificiels
(Mansure et al. 1994). Cependant, dautres tudes remettent en cause une corrlation directe
entre la tolrance au stress et le contenu intracellulaire en trhalose lors de choc thanol et
thermique (Alexandre et al. 1998;Nwaka et al. 1994;Swan et Watson 1998). Dans notre cas,
pour la fermentation la plus performante o la viabilit se maintient plus longtemps, le
Partie VI
220
trhalose saccumule fortement en fin de fermentation de trs hautes concentrations en
thanol quand la viabilit cellulaire commence chuter. Le trhalose ne serait donc pas le
facteur dterminant de la rsistance des levures dans nos conditions. Il semble tre seulement
la consquence dautres changements physiologiques de la levure.
Dans la fermentation la plus performante (n4), les donnes cintiques sur les rserves
rappellent laccumulation de trhalose et de glycogne lors dune culture de type batch, au
moment de la limitation en glucose (Lillie et Pringle 1980;Parrou et al. 1999). Dans ce cas,
ces changements sont interprts comme une capacit de la levure anticiper la limitation en
glucose et donc stocker des rserves avant que la source de carbone du milieu ne spuise.
Ces rarrangement mtaboliques conduisent lacquisition dun tat de quiescence ou de
phase stationnaire (Werner-Washburne et al. 1996). Cependant, dans notre procd fed-batch,
ces changements physiologiques ne sont pas dus une limitation en source carbone, car la
concentration en glucose dans le milieu reste toujours suprieure 5 g.l
-1
. Ils ne peuvent pas
tre la consquence dune limitation en source azote car lammonium est rajout dans le
milieu de manire excdentaire. Nous mettons lhypothse que la permabilisation de la
membrane des cellules et laction inhibitrice de lthanol sur les systmes de transport
simuleraient une carence dans le milieu car les lments ne peuvent plus tre assimils. Ces
perturbations induiraient alors une rponse de la cellule en partie semblable celle rencontre
en cas de carence. Il est intressant de noter que cette accumulation de rserves en
carbohydrates na pas t pas observe dans la fermentation la moins performante (n3),
mme si une faible induction de glycogne et de trhalose est visible avant la phase de
dcouplage. Ces rsultats suggrent que la population de cellules de cette fermentation na pas
pu acqurir cet tat physiologique qui semble donc ncessaire une production dthanol plus
importante.
Dans la fermentation la plus performante, en plus daccumuler des rserves sous forme de
carbohydrates, les cellules accumulent aussi des rserves sous formes de triglycrides, ce qui
est aussi connu pour tre caractristique des cellules en phase stationnaire (Rattray
1988;Sandager et al. 2002). La dltion de gnes empchant la synthse de ces rserves
lipidiques na pas dinfluence sur la phase de croissance mais influence la survie long terme
en phase stationnaire (Sandager et al. 2002). Paralllement ces accumulations, le contenu en
phospholipides cellulaires diminue fortement, lors de la phase de dcouplage de nos
fermentations alcooliques. Les tudes faites sur lthanol suggrent limportance de certains
lipides, notamment les acides gras insaturs, les phospholipides et lergostrol. Certains
Partie VI
221
permettent de contrecarrer leffet fluidifiant de lthanol sur la membrane plasmique en la
rigidifiant, et de maintenir lintgrit membranaire face la prsence dthanol. La perte du
contenu en phospholipides cellulaires en corrlation avec la perte de viabilit pourrait tre une
cause de la perte dintgrit de la membrane plasmique. En effet, nous avons vu que leffet de
lthanol en fin de fermentation semble plus spectaculaire que ce qui a dj t dcrit dans la
littrature, cest--dire une permabilisation des membranes qui perturbe le gradient de
protons et inhibe les systmes de transport actif (Alexandre et al. 1996;D'Amore et al.
1990;Jones et Greenfield 1987;Leao et van Uden 1984;Walker-Caprioglio et al. 1990). En
effet, dans notre cas, il y a fuite du contenu intracellulaire ce qui dnote une importante perte
dintgrit membranaire. De plus, cette hypothse est renforce par dautres tudes qui
soulignent limportance du contenu membranaire en lipides, en particulier le maintien des
phospholipides dans la tolrance lthanol (Alexandre et al. 1994b;Chi et Arneborg
1999;Koukou et al. 1990), et par le fait que la complmentation du milieu en phospholipides
amliore la rsistance des levures lthanol (Mishra et Prasad 1988). Pourquoi le contenu en
phospholipides diminue-t-il ? Nous sommes dans une phase de non-croissance donc cette
diminution ne peut tre directement due une inhibition de la synthse de novo des
phospholipides. Une hypothse, dj mise par certains auteurs (D'Amore et al. 1990), est la
possibilit que lthanol puisse extraire ces lipides et/ou se substituer eux dans les
membranes. Dans notre cas, nous navons pas pu vrifier la prsence de phospholipides dans
le milieu de fermentation, donc nous ne pouvons pas conclure si les phospholipides sont
dgrads ou librs dans le milieu. Cependant, lors de ltude des phnomnes dautolyse
dans des conditions de fermentation vinicole, les levures sont mises en contact pendant
plusieurs jours avec un milieu modle synthtique contenant 10 % (v/v) dthanol (Pueyo
et al. 2000) et les auteurs ont recherch la prsence de lipides cellulaires dans le milieu. Ils
retrouvent ds le premier jour dincubation des quantits non ngligeables de lipides. Ils
trouvent en majorit des triglycrides et des esters de strols mais aussi des mono- et
diglycrides , des acides gras libres et des strols. Par contre, il ny a aucune trace de
phospholipides. Ils supposent donc que ces derniers sont hydrolyss pendant le phnomne
dautolyse. De mme, Casey et al., 1986 parle dj dune lypolyse des membranes suite
laction de 20% dthanol. Cette hypothse na pas t dveloppe dans la littrature car les
fermentations natteignent que trs rarement ces performances.
En conclusion, pendant la phase de dcouplage de la fermentation la plus performante, les
levures acquirent des caractristiques de cellules en phase stationnaire ou tat de quiescence
Partie VI
222
(arrt de croissance, accumulation de rserves lipidiques et carbones), classiquement
obtenues aprs limitation en nutriments essentiels (Gray et al. 2004). Or, dans notre cas,
aucune limitation nutritionnelle na pu tre mise en vidence. Nous faisons donc lhypothse
que ce passage un tat particulier proche de ltat de quiescence est d laccumulation
dthanol. Il est connu que les cellules ayant atteint cet tat physiologique sont plus rsistantes
une varit de stress environnementaux (Herman 2002). Pour la fermentation la moins
performante, il ny a peu daccumulation de rserves et de triglycrides. Lacquisition de cet
tat physiologique semble donc important dans le maintien dune activit cellulaire pendant la
phase de dcouplage. Nous sommes en prsence dune population mixte en fin de
fermentation : il y a des cellules viables ayant encore une activit mtabolique et des cellules
mortes ou en train de mourir. Or nous mesurons des paramtres globaux. Deux hypothses se
prsentent. Premirement, les cellules viables sont celles qui doivent acqurir cet tat
particulier avec accumulation de rserves carbones et lipidiques leur permettant de rsister
plus longtemps lthanol. Les cellules mortes ou mourantes nont pu acqurir cet tat,
lintgrit membranaire est perdue ce qui conduit la permabilisation de la membrane.
Deuximement, les cellules non viables se vident dune partie de leur contenu intracellulaire
et leur masse sche senrichit artificiellement en certains composs non librs dans le milieu.
Les diffrences de performances peuvent sexpliquer par des difficults reproduire
exactement les mmes conditions de culture. Mais, la comparaison des contenus cellulaires
des deux fermentations suggre un rle primordial de la qualit de linoculum. En effet, les
teneurs initiales en lipides ou sucres paritaux diffrent dune fermentation lautre. Mme si
les profils dvolution sont par la suite similaires dans les deux fermentations, la diffrence
dans la teneur de ces macromolcules se conserve jusqu la fin du procd. Par exemple, il y
a plus de strols et moins de phospholipides dans la fermentation la plus performante (n4) ce
qui est en accord avec le fait quune souche soit dautant plus tolrante lthanol que son
ratio ergostrol/phospholipides est lev (Chi et Arneborg 1999;Del Castillo Agudo
1992;Swan et Watson 1998). Ltat des cellules dans linoculum doit donc avoir une
influence sur le droulement de la fermentation et notamment sur la capacit des levures
sadapter laccumulation dthanol. A lavenir, il serait donc intressant de caractriser
linoculum de plusieurs fermentations afin de rechercher lexistence dun paramtre
physiologique, morphologique ou mtabolique qui corrlerait avec la performance de la
production finale en thanol. Ce paramtre pourrait alors servir de baromtre pour la qualit
des fermentations.
223
Conclusion gnrale
et perspectives
224
Conclusion gnrale et perspectives
225
Beaucoup de travaux ont t raliss pour comprendre les phnomnes de tolrance
lthanol mais peu ont t effectus en conditions de production dynamique. Ltude de
ladaptation dynamique de la levure des concentrations croissantes en thanol est un sujet
difficile et complexe. Loriginalit, mais aussi la difficult de ce travail tait dapprhender la
notion de tolrance lthanol en conditions de productions intensives proches des conditions
industrielles. Nous disposions dun procd de fermentation fed-batch ar qui permettait
datteindre la production de 147 g.l
-1
dthanol en 45h (Alfenore et al. 2002). Ce type de
fermentations est sensible la matrise de chaque tape ce qui entrane une certaine variabilit
dans le titre final, mais il garantit datteindre au moins 120 g.l
-1
dthanol. Les variations dans
les performances de ces fermentations dpendent de ltat physiologique de la levure, lequel
sera conditionn par lorigine de linoculum, la conduite du racteur, la faon dalimenter les
cultures, la composition du milieu de culture. Comment stabiliser la production un niveau
lev ? Le titre final peut-il tre encore augment ? Est-il possible de prparer les levures
mieux tolrer les fortes concentrations en thanol produit?
Pour rpondre ces questions, il a dabord fallu caractriser ces fermentations dun point de
vue physiologique afin de comprendre les phnomnes observs. La levure est soumise des
contraintes extrmes dues la production leve dthanol. La performance du procd va
donc dpendre de la capacit de la levure mieux sadapter ces conditions.
La performance du procd est lie au maintien de lactivit mtabolique
A ce niveau de performance, lorientation du mtabolisme vers la production de biomasse et
de glycrol ne suffit pas expliquer les diffrences de titre thanolique. La performance du
procd est lie au maintien de la production dthanol pendant la phase de dcouplage entre
la croissance et la production dthanol o la cellule produit exclusivement de lthanol. La
phase de dcouplage se caractrise par une perte de viabilit qui semble due une perte
dactivit mtabolique des cellules et qui provoque larrt de la fermentation. Cette perte
dactivit mtabolique va engendrer la perte des gradients osmotiques et donc conduire la
mort cellulaire. On peut supposer que la cellule constitue encore un sac denzymes pouvant
transformer le glucose en thanol mais avec une efficacit de plus en plus rduite. La
comparaison de plusieurs fermentations, nous indique que les cls dune performance rsident
dans la capacit de la levure maintenir le plus longtemps possible une activit mtabolique
leve. Ceci revient dire que la levure doit dmontrer une meilleure capacit rsister aux
conditions stressantes induites par laccumulation dthanol.
226
La perte dactivit mtabolique corrle avec une permabilisation de la membrane
La perte dactivit mtabolique, que nous assimilons une perte de viabilit , est corrle
la fuite de mtabolites intracellulaires (ATP, ADP, AMP, sucres phosphoryls.). Une telle
fuite ne peut-tre due une excrtion volontaire des levures. Lthanol est dj connu pour
provoquer des perturbations au sein de la membrane (Alexandre et al. 1996;D'Amore et al.
1990;Jones et Greenfield 1987;Leao et van Uden 1984;Walker-Caprioglio et al. 1990). Mais
ce niveau de concentrations, il ne sagit plus de simple modification du flux de protons ou des
activits des transporteurs membranaires, mais bien dun problme pour la levure retenir son
contenu intracellulaire qui ne peut sexpliquer que par une perte de lintgrit membranaire de
la cellule.
Les dommages membranaires pourraient sexpliquer par une perte du contenu en
phospholipides
Lanalyse des contenus en lipides montre clairement une nette corrlation entre le contenu en
phospholipides des membranes et la viabilit. Ces dommages membranaires sont
probablement irrversibles. Le maintien des activits cellulaires semble donc dpendre de la
capacit de la levure lutter contre laction de lthanol sur sa membrane. Ladaptation de la
levure doit dpendre de sa capacit maintenir son contenu en phospholipides (Alexandre et
al. 1994b). Mais les questions encore sans rponse sur le mode daction de lthanol sont
entre autres : lthanol agit-il comme un solvant pour extraire les lipides de la membrane ? De
part sa nature amphiphile sintercale-t-il dans les membranes la place des phospholipides ?
Induit-t-il un processus dactivation qui engendre la dgradation des phospholipides ?
La cellule adapte-t-elle sa composition lipidique la prsence dthanol ?
Pendant la phase de croissance, en dehors de la composition en phospholipides, la
composition lipidique des levures varie peu. Pendant la phase de dmarrage (5-6h de
fermentation), la composition lipidique volue, puis elle stagne jusqu larrt de la
croissance. Malgr laccumulation dthanol dans le milieu jusqu environ 100 g.l
-1
, nous
navons pas mis en vidence de changements significatifs au niveau de la composition en
strols. Par rapport aux donnes de la littrature (Ghareib et al. 1988;Sajbidor et al. 1995),
nous nous attendions des changements beaucoup plus significatifs. Dans la fermentation la
plus performante, les levures sont plus riches en strols donc il se peut quune
complmentation du milieu en strols permette dobtenir un titre final en thanol lev. Aprs
227
arrt de la croissance, les lipides neutres saccumulent, sous forme dergostrol, mais surtout
de rserves lipidiques (triglycrides et esters de strol).
Lacquisition dun tat physiologique particulier au moment du dcouplage croissance-
production pourrait tre un lment dterminant pour ladaptation aux fortes
concentrations en thanol
Le suivi de lexpression des gnes rvle la mise en place dune rponse gnrale au stress,
qui commence pendant la phase de croissance mais qui prend toute son ampleur au moment
du dcouplage entre croissance et production o la croissance du microorganisme est arrte.
A ce moment du procd, qui se situe autour de 100 g.l
-1
dthanol, les cellules semblent
entrer dans un tat physiologique particulier proche dun tat de quiescence mais la cellule
continue exprimer une activit cellulaire suffisante pour rendre compte de la production
dthanol. Au niveau microscopique, les cellules sont de moins en moins bourgeonnantes. Les
gnes lis la transcription et la traduction sont sous-exprims. Les rserves en
carbohydrates et lipides saccumulent et certains gnes caractristiques de lentre en tat de
phase stationnaire sont induits (SSA3, SPI1, HSP12, HSP26) Lacquisition de cet tat par
une partie de la population de levures semble dterminante pour la longueur de la phase de
dcouplage et donc la performance du procd. Il est en effet connu que des cellules en tat de
phase stationnaire sont plus rsistantes au stress (notamment la prsence dthanol.)
(Herman 2002).
Cependant, l aussi il reste des questions sans rponse : Quel est le signal qui provoque cette
acquisition dtat physiologique et comment se met-il en place ? De quel type de signal sagit-
il ? Plusieurs signaux sont peut-tre ncessaires diffrents stades de la fermentation pour
lacquisition de cet tat. Ltat de quiescence se rencontre souvent aprs une carence
nutritionnelle en un nutriment essentiel (carbone, azote, soufre, phosphate) (Gray et al.
2004). Or ces lments sont prsents en excs dans nos conditions. Mais, lthanol est connu
pour inhiber les systmes de transports actifs (Alexandre et al. 1996;D'Amore et al.
1990;Jones et Greenfield 1987;Leao et van Uden 1984;Walker-Caprioglio et al. 1990).
Lthanol simule-t-il une carence nutritionnelle par inhibition des transporteurs, comme le
suggre la sur-expression de nombreux gnes de transport ?
228
Un projet a dj t initi afin de comparer deux fermentations de performances diffrentes
dun point de vue transcriptomique. Lhypothse est que dans la premire fermentation, une
majorit de cellules arrive maintenir lactivit mtabolique et acqurir cet tat, ce qui nest
pas le cas pour la deuxime fermentation. La technologie des puces ADN nous fournira les
gnes qui sont diffrentiellement exprims entre les deux cas. Nous esprons ainsi mettre en
vidence linduction de gnes connus pour tre caractristiques de ltat de quiescence dans
une fermentation mais pas dans lautre.
Lors de cette thse nous nous sommes heurts un problme rcurent, savoir lhtrognit
de la population de levures en fin de fermentation. En effet, nous avons identifi au moins
cinq populations distinctes. De mme, en phase stationnaire, aprs carence en glucose, Allen
et al. (2006) identifient deux populations quils arrivent sparer : les cellules quiescentes et
non quiescentes. Elles prsentent des proprits diffrentes. Les cellules quiescentes sont plus
denses, accumulent du glycogne, sont des cellules filles (sans cicatrice pour 91%) et ne
prsentent pas le mme profil transcriptomique que les cellules non-quiescentes. Dans notre
cas, il serait aussi intressant de pouvoir sparer, par cytomtrie en flux ou par gradient de
densit, les diffrentes populations pour pouvoir les tudier indpendamment. Certaines sont
responsables du maintien de lactivit mtabolique, dautres sont dfinitivement mortes. Nous
pourrons ainsi envisager de rpondre quelques questions : Quelle(s) population(s)
contribue(nt) la production dthanol ? Les modifications lipidiques (perte de
phospholipides, accumulation de lipides neutres) touchent-t-elle les cellules actives ? Les
cellules, apparemment bourgeonnantes, sont-elles bloques dans leur cycle ou
continuent-elles leur division ? Quelle(s) population(s) a(ont) les caractristiques de cellules
en tat de quiescence ? Quels sont les gnes diffrentiellement exprims spcifiquement
chaque population ?
De plus, pour approfondir la caractrisation de la biomasse, il faudrait sintresser aux
proprits de la membrane car la membrane semble tre la cible privilgie de lthanol. Il est
connu pour agir sur la fluidit membranaire (Alexandre et al. 1994b;Ghosh 1988). De plus, la
perte dintgrit membranaire doit aussi se traduire au niveau des protines prsentes dans la
membrane. Il serait donc intressant de suivre lvolution du protome de la membrane
plasmique (Delom et al. 2006) afin didentifier si des protines disparaissent, voire
apparaissent, dans la membrane.
229
Une autre perspective dapproche de la rsistance lthanol est dessayer de comprendre
comment les levures, par variations gntiques naturelles, parviennent dvelopper des
proprits intressantes pour la fermentation alcoolique. Pour cela, une tude a dj t initie
au sein du laboratoire pour slectionner des souches plus rsistantes diffrents stress, dont la
prsence dthanol, par volution dirige. Ensuite, la relation gnotype-phnotype des mutants
slectionns sera analyse par des mthodes gntiques, microscopiques, gnomiques,
transcriptomiques, biochimiques et mtaboliques.
230
231
Annexe
232
233
Annexe 1
Niveaux dexpression
*
dans nos conditions de fermentation (pour les prlvements 3, 4 et 5),
en cas de choc thanol (Alexandre et al. 2001) et lors la Rponse Commune aux changements
Environnementaux CER (Causton et al. 2001) pour les gnes sous contrle des facteurs de
transcription Msn2/4 et HSF
Echantillon
Choc Ethanol CER
ORF Gne 3 5 6
(Alexandre et
al. 2001)
(Causton et
al. 2001)
YDR216W ADR1 + + ++
YLR109W AHP1 + + +
YLR109W AHP1 + + +
YMR169C ALD3 + ++
YOR374W ALD4 + + + ++ ++
YNL077W APJ1 + ++ ++
YDL197C ASF2 + + ++
YKR066C CCP1 + +
YLR178C CDC25 + + +
YDR155C CPR1 - - -
YLR216C CPR6 + + + +++
YGR088W CTT1 + +++ ++++
YML101C CUE4 + +
YHR053C CUP1-1 + +++ +++
YHR055C CUP1-2 ++ +++ +++
YEL039C CYC7 +++ +++ ? ++ ++++
YJL005W CYR1 + +
YOR173W DCS2 + + + ++ +++
YMR173W DDR48 +++ + + ++
YER035W EDC2 + +
YHR174W ENO2 + + +
YAL061W FUN50 + + + ++ +++
YOR178C GAC1 + ++ +
YDR096W GIS1 +
YCL040W GLK1 + + + +++++ ++
YDR508C GNP1 + +
YHR104W GRE3 + + + ++ ++++
YCL035 GRX1 +++ +++ ++ ++ ++
YMR251WA HOR7 + +++ +++ +++
YMR185W HSC82 + + ++
YGL073W HSF1 + +
YOR020C HSP10 +++ +++
*+ : induit 1,5 2,5 fois; ++ : induit 2,5 to 3,5 fois; +++ : > 3,5 fois; ++++, > 7 fois; +++++ : > 20 fois
234
Echantillon
Choc Ethanol CER
ORF Gne 3 5 6
(Alexandre et
al. 2001)
(Causton et
al. 2001)
YLL026W HSP104 ++ + + +++ ++
YFL014W HSP12 + ++ ++ ++++ ++++
YBR072W HSP26 +++ +++ +++ +++++ +++++
YCR021C HSP30 + +++ +++ ++ ++
YDR171W HSP42 + +++ ++ +++++ ++
YLR259C HSP60 + + +
YDR258C HSP78 + + +++ ++
YPL240C HSP82 + + + +
YFR053C HXK1 + + + ++ ++
YDR342C HXT7 + + +
YKL032C IXR1 + + +
YJL034W KAR2 + + + ++
YKL150W MCR1 + + + ++
YIR017C MET28 + + +
YML128C MSC1 + +++ +++
YLR219W MSC3 + + +
YBR001C NTH2 + + ++
YOR360C PDE2 - - -
YMR105C PGM2 ++ + + +++ +++
YER037W PHM8 + + +++ ++
YKL163W PIR3 + + + +
YGL006W PMC1 + + ++ ++
YGL037C PNC1 + + + +++ ++
YDL134C PPH21 + +
YBR049C REB1 + +
YDL020C RPN4 + + ++ ++
YOR184W SER1 - - -
YMR175W SIP18 - - -
YNL007C SIS1 + + +++
YHR008C SOD2 + + +
YNR034W SOL1 +++ +++ +++ + ++
YGR248W SOL4 + + + ++ +++
YDR504C SPG3 - -
YER150W SPI1 + +++ +++ + ++++
YHR139C SPS100 + +++ ++
YAL005C SSA1 + + + ++
YLL024C SSA2 + + +
YBL075C SSA3 + + ++ ++
YER103W SSA4 + ++ + +++++ ++++
YBR169C SSE2 + + + ++ ++
235
Echantillon
Choc Ethanol CER
ORF Gne 3 5 6
(Alexandre et
al. 2001)
(Causton et
al. 2001)
YGR008C STF2 +++ ++++ ++++ +++ +++
YPL057C SUR1 +
YJR019C TES1 + ++ ++
YLR178C TFS1 + + + ++ +++
YPL203W TPK2 + ++ ++ ++ +
YDR246W TRS23 ++ + +
ML100W TSL1 + + +++ ++
YLL039C UBI4 - - - ++
YPL252C YAH1 + +
YNL160W YGP1 + + + +++ ++
YBR101C + +
YER067W + ++ + +++
YGR146C + + +
YJL144W +++ +++ ++ ++
YKL151C + + +++ ++
YLR327C +++ ++++ ++++ + ++++
YMR069W + ++ ++
236
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255
Liste des figures
Figure 1 : Schma regroupant les grandes tapes de lobtention dthanol biocarburant
partir de biomasse vgtale (Bothast et Schlicher 2005;Glazer et Nikaido 1993). ________ 25
Figure 2 : a) schma de fonctionnement du BRM (Bi-Racteur Membrane),
s
: flux
dapport du substrat,
p
: flux de sortie du produit (thanol) ; b) rsultats cintiques dune
fermentation fed-batch avec lvolution de la viabilit (u ), de la vitesse spcifique de
production dthanol
p
( ) et du taux de croissance ( ) en fonction de la concentration
en thanol dans le milieu. ____________________________________________________ 31
Figure 3 : Schma rcapitulatif de la voie de production dthanol et des voies mtaboliques
annexes pouvant conduire la production de sous-produits. _________________________ 35
Figure 4 : Structure des diffrents phospholipides. ________________________________ 44
Figure 5 : Principaux intermdiaires de la voie de synthse de lergostrol. Dans lordre de la
voie de synthse, a) acide mvalonique, b) squalne, c) lanostrol, d)zymostrol, e)
5 ,7,24(28)-ergostatetrienol, f) 5 ,7,22,24(28)-ergostatetraenol, g) ergostrol. ___________ 47
Figure 6 : Structures des principaux sphingolipides. (van der Rest et al. 1995) __________ 48
Figure 7 : Structure des ancres GPI (Glycosylated Phosphatidyl-Inositol) rencontres pour
les protines de Saccharomyces cerevisiae (Fankhauser et al. 1993). La partie lipidique est le
plus souvent un cramide. Il y a en gnral quatre mannoses (M1 M4). M5 est optionnel en
(1-2) ou (1-3).___________________________________________________________ 49
Figure 8 : Relation entre la concentration en alcool qui inhibe de 50% lactivit du
transporteur du glucose et le coefficient de partage des alcools entre les membranes et le
tampon utilis pour lexprience (Leao et van Uden 1982).__________________________ 54
Figure 9 : Schma rcapitulatif du modle daction de lthanol sur une cellule de levure. _ 67
Figure 10 : Molcule de bleu de mthylne sous forme oxyde et sous forme rduite. Cette
molcule va ragir avec les activits oxydorductases des cellules encore actives.________ 75
Figure 11 : Molcule de FUN
1. _____________________________________________ 76
Figure 12 : Exemple dimage de microscopie fond noir obtenue lors dune culture typique
de levure en bioracteur (120g.l
-1
dthanol produit), sur laquelle se superpose lanalyse par le
logiciel danalyse dimage dvelopp par Ohtani et al. (2004) et lidentification des
diffrentes formes. _________________________________________________________ 77
Figure 13 : Exemple de plaque obtenue aprs une premire migration avec un mlange
hexane/MTBE/acide actique (70 :30 :0,2, v/v) jusqu la moiti de la plaque, puis une
deuxime migration avec de lhexane seul jusqu 1 cm du bord de la plaque. Ceci permet de
sparer les diffrents lipides neutres. Les trois premiers dpts sont des talons. Les suivants
sont des extraits lipidiques de Saccharomyces cerevisiae CBS8066.___________________ 85
256
Figure 14 : Exemple de migration dans un solvant chloroforme/actone/mthanol/acide
actique/eau (50 :15 :10 :10 :5, v/v) permettant de sparer les diffrents phospholipides. Les
quatre premiers dpts sont des talons. Les suivants sont des extraits lipidiques de
Saccharomyces cerevisiae CBS8066. ___________________________________________ 86
Figure 15 : Comparaison du signal du dpt de 1 g dacide starique (18:0), olique (18:1),
et linolique (18:2) sur plaque de silice aprs rvlation au sulfate de cuivre (10% w/v dans
H
3
PO
4
8% v/v). ____________________________________________________________ 87
Figure 16 : Schma rcapitulatif de la dmarche exprimentale aboutissant lestimation de
lerreur exprimentale globale du processus. ____________________________________ 108
Figure 17 : Schma descriptif de la mthode n1 (Rozs 1992). TA = temprature ambiante,
HCCl
3
= chloroforme. ______________________________________________________ 115
Figure 18 : Schma descriptif de la mthode n2 ________________________________ 116
Figure 19 : Schma descriptif de la mthode n3. Vm/Vc= (2:1), puis une fois (1:1) et enfin
deux fois (1:2). TA= temprature ambiante, Vm/Vc=volume de mthanol/volume de
chloroforme. _____________________________________________________________ 117
Figure 20 : Schma descriptif de lappareillage soxhlet de la mthode n4. ____________ 118
Figure 21 : Estimation par gravimtrie du contenu total en lipides, rapport la masse sche
(MS) de cellules, aprs chaque tape dextraction (E1 E6) ________________________ 122
Figure 22 : Estimation du contenu en lipides, rapport la masse sche (MS) de cellules,
aprs chaque tape dextraction (E1 E6), mesur par Chromatographie Couche Mince.
ERG=ergostrol, AG=acides gras libres, TG=triglycrides, ES=esters de strol,
LAN=lanostrol, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PI=phosphatidyl-inositol, PS= phosphatidyl-srine, CL+PA= cardiolipides et acide
phosphatidique. ___________________________________________________________ 123
Figure 23 : Comparaison de leffet du type de lavage sur llimination des acides amins
prsents dans lextrait lipidique. A) Chromatographie couche mince avec butanol/acide
actique/H
2
O (40/20/20) comme solvant de migration et rvlation la ninhydrine. B)
Tableau rcapitulatif des pourcentages dlimination des acides amins aprs deux lavages
soit leau, soit au KCl 0,88% (w/v).__________________________________________ 125
Figure 24 : Comparaison du pourcentage de lipides extraits ramen la masse sche (% MS)
de cellules avec ou sans utilisation dantioxydant (BHT). a) lipides totaux obtenus par
gravimtrie ; b) phospholipides totaux (PL totaux) et des strols totaux obtenus par mthodes
colorimtriques ; c) chaque phospholipide (PI=phosphatidylinositol, PC=phosphatidylcholine,
PE=phosphatidylthanolamine, CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique).et d) de
chaque lipide neutre (ERG=ergostrol, AG=acides gras libres, TG=triglycrides, ES=esters de
strol) quantifis par CCM. __________________________________________________127
Figure 25 : Schma rcapitulatif de ltude de la reproductibilit de
lextraction+quantification.__________________________________________________ 128
257
Figure 26 : Quantits de lipides rcuprs aprs extraction complte en fonction du volume
de solution de standards rajout : a) pour les lipides neutres ; b) pour les phospholipides.
SQ=squalne, ES=esters de strols, TG=triglycrides, AG=acides gras libres,
LAN=lanostrol, ERG=ergostrol, PI=phosphatidyl-inositol, PS=phosphatidyl-srine,
PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine, PG=phosphatidyl-glycrol,
CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique. __________________________________ 132
Figure 27 : Evolution des concentrations en glucose ( ), biomasse ( ), thanol (p ) et
glycrol ( ) en fonction du temps de fermentation pour les quatre fermentations 1 4. Les
conditions de ces quatre fermentations sont identiques lexception de lapport de
glucose _________________________________________________________________ 139
Figure 28 : Evolution de la vitesse spcifique de production dthanol
p
() et du taux de
croissance () en fonction de la concentration en thanol dans le milieu pour les quatre
fermentations 1 4. Les conditions de ces quatre fermentations sont identiques lexception
de lapport de glucose _____________________________________________________ 140
Figure 29 : Exemple de coloration au bleu de mthylne. La photo a t prise lors dune
fermentation alcoolique, avec 116 g.l
-1
dthanol. ________________________________ 146
Figure 30 : Exemple de coloration au FUN
1. La photo a t prise lors dune fermentation

alcoolique, avec 116 g.l
-1
dthanol. ___________________________________________ 146
Figure 31 : Evolution de la proportion de cellules non colores par bleu de mthylne () et
de la proportion de cellules prsentant des CIVS aprs coloration au FUN
1 (u ) au cours
dune fermentation alcoolique. _______________________________________________ 147
Figure 32 : Evolution de la proportion de cellules non colores par le bleu de mthylne en
fonction de la concentration en thanol, pour chacune des quatre fermentations 1 4 : ___ 149
Figure 33 : Exemple de photos prises laide dun microscope fond noir (Olympus BH2,
objectif 40X, DplanApo40UVPL) quip dune camra CCD (DXM 1200, Nikon). Photo
prise pendant la fermentation 3. Lors de la prise de la photo la concentration dans le racteur
tait de 118 g.l
-1
. __________________________________________________________ 150
Figure 34 : Evolution, en fonction de la production dthanol au cours de la fermentation, du
taux de croissance (), de la vitesse spcifique de production dthanol
p
(), de la
proportion relative de cellules non colores au bleu de mthylne (u ) et de la proportion
relative de cellules sombres (). _____________________________________________ 152
Figure 35 : Evolution des pourcentages de petites ( ), moyennes ( ) et grosses ( ) cellules
pour chaque catgorie de cellules en fonction de leur brillance pour les prlvements n1 7
(1 : 25,6 g.l
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
dthanol)
(cf. figure 34). a) cellules non bourgeonnantes sombres ; b) cellules non bourgeonnantes
brillantes ; c) cellules bourgeonnantes sombres ; d) cellules bourgeonnantes brillantes ; e)
bourgeons sombres ; f) bourgeons brillants. ------ : arrt de croissance qui spare la phase de
croissance de la phase de dcouplage. _________________________________________ 154
258
dthanol
p
(), de la viabilit relative de cellules au bleu de mthylne (u ) et des
composants macromolculaires en pourcentage de la masse sche (% MS) en fonction de la
concentration en thanol : protines ( ), carbohydrates ( ), ADN/ARN ( ), lipides ( ). Le
reste pour faire une somme de 100% est assimil aux cendres ( ). __________________ 157
dthanol
p
() et de la viabilit mesure par coloration au bleu de mthylne ( - ) en
fonction de la concentration en thanol. ________________________________________ 164
Figure 38 : Schma exprimental de la stratgie adopte pour le marquage et lhybridation
des six chantillons (1 6).__________________________________________________ 165
Figure 39 : Courbes : volution du taux de croissance (), de la vitesse spcifique de
production dthanol
p
() et de la viabilit mesure ( -) au bleu de mthylne en
fonction de la concentration en thanol. Histogrammes : reprsentation du nombre de gnes
sur-exprims (n) et du nombre de gnes sous-exprims (n), en fonction de la concentration
en thanol. _______________________________________________________________ 167
Figure 40 : Dendogramme du cluster hirarchique sur les prlvements de la fermentation
(prlvements 2, 3, 4, 5 et 6 par rapport la rfrence 1, cf. figures 37 et 38) effectu avec
lensemble des ratios dexpression. ___________________________________________ 168
Figure 41 : Profil n1 et n2 des changements globaux dexpression en fonction de la
concentration en thanol par clustering de type SOM. _____________________________ 169
Figure 42 : Rpartition dans les diffrentes catgories fonctionnelles du nombre A.) de gnes
sur-exprims (P<0,05 et Ratio>1,8) et B.) de gnes sous-exprims (P<0,05 et Ratio<0,55) en
fonction du temps de fermentation (2, 3, 4, 5 ou 6 par rapport au temps de rfrence 1). Sur la
droite, est indiqu le pourcentage maximal que ces nombres reprsentent lintrieur de la
famille. _________________________________________________________________ 171
Figure 43 : Gnes cibles des facteurs de transcription (a) (Heat Shock Factor) HSF et (b)
Msn2/Msn4 induits dans nos conditions. Les cibles HSF et Msn2/Msn4p sont classes selon
leur fonction connue ou hypothtique en se basant sur la base YPD. _________________ 177
Figure 44 : a) Taux de croissance (), vitesse spcifique de production dthanol
p
(),
viabilit cellulaire mesure au bleu de mthylne () et accumulation des rserves
intracellulaires en trhalose ( ) et en glycogne (r ) exprimes en pourcentage de la masse
sche (% MS) en fonction de la concentration en thanol dans le milieu pour la fermentation
n1. Rfrence (1), 2, 3, 4, 5 et 6 correspondent aux chantillons dARN pour lanalyse des
profils dexpression des gnes. b) schma de synthse et dgradation des rserves. ______ 180
p
contenus intracellulaires rapports la masse sche (% MS) de cellules en hexose-6-
phosphate (glucose-6-phosphate+ fructose-6-phosphate) (------) et en fructose-1-6-
phosphate () pour les fermentations 3 et 4. - - - - : arrt de la croissance sparant la
phase de croissance de la phase de
dcouplage_______________________________________________________________195
259
Figure 46 : Evolution de la viabilit (u ) et du contenu intracellulaire rapports la masse
sche (MS) de cellules du pool de nuclotides (ATP+ADP+AMP) ( ) pendant les
fermentations 3 et 4, en fonction de la concentration en thanol. - - - - : arrt de la croissance
sparant la phase de croissance de la phase de dcouplage._________________________ 197
Figure 47 : Evolution, en fonction de la concentration en thanol, de la viabilit cellulaire
(), du pool de nuclotides extracellulaires (ATP+ADP+AMP) ( ) et du glucose-6-
phosphate (r ) extracellulaire pendant les fermentations 3 et 4. - - - - : arrt de la croissance
sparant la phase de croissance de la phase de dcouplage.de croissance de la phase de
dcouplage.______________________________________________________________ 199
p
contenus intracellulaires rapports la masse sche (% MS) de cellules en trhalose ( ) et
glycogne () ; et en trhalose-6-P (), glucose-6-P ( ) et UDP-glucose (p ), pour les
de dcouplage.____________________________________________________________ 201
p
(), de la viabilit ( ), du contenu
intracellulaire en strols totaux (somme des diffrents strols spars par CCM) ( ), ramen
la masse sche (% MS) de cellules, et de la rpartition en lanostrol, ergostrol et esters de
strol dans les strols totaux. ----- : arrt de croissance sparant la phase de croissance de la
phase de dcouplage._______________________________________________________ 205
Figure 50 : Evolution, en fonction de la concentration en thanol, du taux de croissance (
), de la vitesse spcifique de production dthanol
p
(), de la viabilit au bleu de mthylne
( ), du contenu intracellulaire en phospholipides totaux ( ), ramen la masse sche
(% MS) de cellules, et de la rpartition en Phosphatidyl-tanolamine (PE), Phosphatidyl-
inositol (PI), Phosphatidyl-choline (PC), Cardiolipide et Acide Phosphatidique (CL+PA) dans
les phospholipides totaux. ----- : arrt de croissance sparant la phase de croissance de la
phase de dcouplage._______________________________________________________ 207
Figure 51 : Corrlation entre le contenu intracellulaire en phospholipides, rapport la masse
sche (% MS) de cellules, et la viabilit cellulaire relative mesure au bleu de mthylne pour
les fermentations 3 ( ) et 4 ( ) (R
2
=0,9).______________________________________ 208
p
(), de la viabilit ( ) , du
contenu intracellulaire en triglycrides (p ), acides gras libres (--- ---) et esters
dacides gras (--- ---), rapports la masse sche (% MS) de cellules pour les fermentations
3 et 4. - - - - : arrt de la croissance sparant la phase de croissance de la phase de
dcouplage.______________________________________________________________ 211
p
contenus intracellulaires, rapports la masse sche (% MS) de cellules, en lipides totaux
mesurs par gravimtrie ( ) et par CCM ( ) pour les fermentations 3 et 4. - - - - :
arrt de la croissance sparant la phase de croissance de la phase de
dcouplage.______________________________________________________________ 213
260
p
(), de la viabilit ( ), des ratios
intracellulaires en acides gras insaturs/saturs ( ), et en acides gras C16/C18 (r ) pour les
de dcouplage ____________________________________________________________ 215
p
(), de la viabilit ( ) ; du
contenu intracellulaire en paroi ( ) rapport la masse sche (% MS) en cellules et de la
rpartition des sucres paritaux au sein de la paroi : mannanes ( ), glucanes ( ) et chitine
( ) pour les fermentations 3 et 4._____________________________________________ 217
261
Liste des tableaux
Tableau 1 : Principaux avantages, principaux inconvnients et ordre de grandeur de la
productivit atteinte par diffrents procds de production dthanol. .................................. 30
Tableau 2 : Concentrations inhibant 80% de la croissance cellulaire de Saccharomyces
cerevisiae pour les principaux sous-produits de la fermentation alcoolique (Maiorella et al.
1983) sur milieu synthtique glucose en mode continu pour la souche. Les sous-produits ont
t rajouts diffrentes concentrations dans lalimentation................................................. 38
Tableau 3 : Nom commun et systmatique des diffrents acides gras saturs et insaturs
prsents chez la levure. ........................................................................................................ 43
Tableau 4 : Teneur relative moyenne des diffrents phospholipides par rapport aux
phospholipides totaux. ......................................................................................................... 45
Tableau 5 : Nature et force des interactions au sein des membranes ................................... 50
Tableau 6 : Lipides standards utiliss pour lobtention de la solution standard 0,25 g. l
-1
pour la quantification par CCM, leur fournisseur et rfrence.............................................. 84
carbones :nombre dinsaturations) des standards dacides gras utiliss pour la quantification
par chromatographie gazeuse ............................................................................................... 90
carbones : nombre dinsaturations) des talons internes dacides gras utiliss pour la
quantification par chromatographie gazeuse......................................................................... 90
Tableau 9 : Procdure damplification des ORFs de levure. .............................................. 103
Tableau 10 : Longueurs donde dexcitation et dmission des diffrents fluorochromes
utiliss ............................................................................................................................... 105
Tableau 11 : Relation entre le nombre de rptitions ncessaires et le ratio seuil
statistiquement dtectable au-del duquel un gne peut-tre rationnellement dclar
diffrentiellement exprim entre deux conditions, avec une erreur exprimentale estime
30%. .................................................................................................................................. 109
Tableau 12 : Evaluation des diffrents critres dans le choix parmi les quatre mthodes
dextraction dcrites ci-dessus............................................................................................ 120
Tableau 13 : Quantit de lipides totaux ramens au pourcentage de la masse sche (% MS) de
cellules et extraits suivant deux temps dextraction : quatre tapes dune journe ou deux
tapes de 4h + une tape dune nuit + une tape de 4h. ....................................................... 124
Tableau 14 : Pourcentage de rcupration des diffrents lipides neutres aprs deux lavages au
KCl 0,88%. DG=diglycrides, ERG=ergostrol, LAN=lanostrol, TG=triglycrides,
ES=esters de strol............................................................................................................. 126
262
Tableau 15 : Pourcentage de rcupration des diffrents phospholipides aprs 2 lavages au
KCl 0,88%. PI=Phosphatidyl-inositol, PS= Phosphatidyl-srine, PC=Phosphatidyl-choline,
PG= Phosphatidyl-glycrol, PE=Phosphatidyl-thanolamine, CL=cardiolipides et PA=acide
phosphatidique. .................................................................................................................. 126
Tableau 16 : Tableau rcapitulatif des valeurs exprimentales pour chaque chantillon (E1
E6), de la moyenne et de lcart-type de ces valeurs, ainsi que le pourcentage que reprsente
cet cart-type par rapport la moyenne. Les lipides totaux sont obtenus par mthode
gravimtrique. Les strols totaux et les phospholipides totaux (PL totaux) sont obtenus par
mthodes colorimtriques. Les lipides individuels sont quantifis par CCM:
PI=phosphatidylinositol, PC=phosphatidylcholine, PE=phosphatidylthanolamine,
CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique, ERG=ergostrol, AG=acides gras libres,
TG=triglycrides, ES=esters de strol. Les valeurs sont exprimes en pourcentage de la masse
sche de cellules (%MS) .................................................................................................... 129
Tableau 17 : Rendements dextraction sur solution de standards pour les diffrents lipides
neutres. Il sagit des quantits de standards recueillies aprs extraction exprimes en
pourcentage des quantits de standards introduites au dpart. DG=diglycrides,
ERG=ergostrol, LAN=lanostrol, TG=triglycrides, ES=esters de strol .......................... 130
Tableau 18 : Rendements dextraction sur solution de standards pour les diffrents
phospholipides. Il sagit des quantits de standards recueillies aprs extraction exprimes en
pourcentage des quantits de standards introduites au dpart. PI=phosphatidyl-inositol, PS=
phosphatidyl-srine, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PG=phosphatidyl-glycrol, CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique. ....................... 130
Tableau 19 : Mlange initial de chaque chantillon contenant des cellules de levures et
diffrentes quantits de solution mre de chaque standard de lipides. ................................. 131
les valeurs thoriques introduites pour les diffrents lipides neutres. ERG=ergostrol,
LAN=lanostrol, AG=acides gras libres, TG=triglycrides, ES= esters de strols,
SQ=squalne,..................................................................................................................... 133
les valeurs thoriques introduites pour les diffrents phospholipides. PI=phosphatidyl-inositol,
PS=phosphatidyl-srine, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PG=phosphatidyl-glycrol, CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique. ....................... 133
Tableau 22 : Pour chacune des quatre fermentations dcrites ci-dessus, ce tableau indique le
taux de croissance moyen sur 45h, la vitesse spcifique de production dthanol
p
moyenne
sur 45h, la productivit sur 45h, la productivit depuis larrt de la croissance jusqu 45h et
la concentration en thanol [thanol]
crit
pour laquelle la croissance sarrte. ....................... 141
Tableau 23 : Pour chacune des quatre fermentations dcrites ci-dessus, ce tableau indique la
concentration maximale en biomasse obtenue [X]
max
, le titre en thanol au bout de 45 h de
fermentation [thanol]
45h
, le titre maximal atteint [thanol]
final
et la concentration en glycrol
au bout de 45 h de fermentation [Gly]
45h
. ........................................................................... 143
263
Tableau 24 : Pour chacune des quatre fermentations dcrites ci-dessus, ce tableau indique les
rendements Biomasse/Substrat (Y
X/S
) et Glycrol produit/Substrat (Y
gly/S
) au moment de
larrt de croissance et le rendement Ethanol produit/Substrat (Y
P/S
) 45h......................... 143
Tableau 25 : Evolution du pourcentage de cellules brillantes dans les chantillons n1 7
(cf. figure 34) pour chacune des familles : cellules non-bourgeonnantes, bourgeonnantes et les
bourgeons. ......................................................................................................................... 153
Tableau 26 : Pourcentage de cellules bourgeonnantes en fonction des prlvements n1 7
(cf. figure 34) au cours de la fermentation alcoolique en mode fed-batch. .......................... 155
Tableau 27 : Tableau rcapitulatif des populations rencontres au court de chacune des
phases de la fermentation alcoolique. ................................................................................. 156
et % du gnome correspondant aux diffrents temps compars au temps de rfrence. ....... 166
dont le ratio est soit >1,8 pour les gnes sur-exprims, soit <0,55 pour les gnes sous-
exprims. ........................................................................................................................... 167
base MIPS enrichies pour les ORFs sous-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5. ... 172
base MIPS enrichies pour les ORFs sur-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5....... 173
Tableau 32 : Analyse statistique par le logiciel FUNSPEC des fonctions molculaires de
Gene Ontology enrichies pour les ORFs sur-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5.174
Tableau 33 : Localisation cellulaire des produits des gnes soit pour lensemble du gnome,
soit pour les gnes sur-exprims aux diffrents temps de fermentation (chantillons 2, 3, 4,
et/ou 5). La rpartition dans les diffrentes localisations est indique par le nombre de gnes,
dont le produit est localis dans la classe, exprim en pourcentage du nombre de gnes dont le
produit est localisable......................................................................................................... 175
Tableau 34 : Analyse statistique par le logiciel FUNSPEC de la localisation cellulaire fournie
par la base MIPS enrichies pour les ORFs sur-exprims dans les chantillons 2, 3, 4, et/ou 5.
.......................................................................................................................................... 175
Tableau 35 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme des alcools et
diffrentiellement sur-exprims au moins un moment dans nos conditions. ..................... 183
Tableau 36 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme des sucres de rserve et
diffrentiellement sur-exprims au moins un moment dans nos conditions. ..................... 183
Tableau 37 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme parital et diffrentiellement sur-
exprims au moins un moment dans nos conditions. ............................................................... 184
264
Tableau 38 : Niveau dexpression des gnes lis au mtabolisme des lipides et diffrentiellement sur-
exprims au moins un moment dans nos conditions. ............................................................... 185
Tableau 39 : Niveau dexpression des gnes lis la chane respiratoire et la balance redox
et diffrentiellement sur-exprims au moins un moment dans nos conditions................... 186
265
Nomenclature
% MS : en pourcentage de la masse sche cellulaire
GL : Degr Gay Lussac (correspond au pourcentage volumique dthanol)
AG : Acides gras
CCM: Chromatographie sur Couche Mince
CL : Cardiolipides
DG : Diglycrides
DHAP : dihydroxyactone phosphate
EEAG : Esters dacide gras
ERG : Ergostrol
ES : Esters de strol
ESR : environnemental Stress response (Gasch et al. 2000)
[thanol]
crit
: concentration en thanol pour laquelle la croissance cellulaire sarrte (=0)
G-3-P : Glycrol-3-phosphate
GPI : Glycosylated PhosphatidylInositol
GO : Gene Ontology
HPAEC : High performance Anion-exchange Chromatography
HSE : Heat Shock Element
HSF : Heat Shock Factor
LAN : Lanostrol
MG : Monoglycrides
MIPS : Munich Information center for Protein Sequences
Mu ou : taux de croissance ou vitesse spcifique de production de biomasse
dt
X d
X
] [
] [
1
= o [X]=concentration en biomasse, t est le temps
Nu
p
ou
p
: vitesse spcifique de production dthanol
dt
thanol d
X
p
] [
] [
1
= o [thanol]=concentration en thanol, t est le temps
ORF : Open Reading Frame
PA : Acide Phosphatidique
PC : Phosphatidylcholine
PE : Phosphatidyltanolamine
PG : Phosphatidylglycrol
PI : Phosphatidylinositol
PS : Phosphatidylserine
RE : rticulum endoplasmique
REC : Response to Environmental Change (Causton et al. 2001)
RT : rtrotranscription
SOM : Self Organization Map
SQ : Squalne
TG : Triglycrides
Y
Gly/S
: rendement en glycrol produit par rapport au substrat (glucose) consomm
Y
P/S
: rendement en thanol produit par rapport au substrat (glucose) consomm
Y
X/S
: rendement en biomasse produite par rapport au substrat (glucose) consomm
YPD : Yeast Protome database

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