UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.

FACULTAD
DE QUMICA. BIOQUMICA EXPERIMENTAL. RENGEL GARCA
CHRISTIAN RODOLFO. EQUIPO 4. GPO. 2 PRCTICA 2.
Purificacin de una protena a travs de un sistema simulado
INTRODUCCIN.
La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la
purificacin de las sustancias de estudio, ya sea parcial o total.
Para ello se necesita de un gran trabajo, ya que una clula
contiene miles de sustancias diferentes, la molcula que
buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a
concentraciones muy bajas. Sin embargo, el conocimiento del
proteoma (conjunto de protenas de un organismo), ha pasado
a ser el reto de la comunidad cientfica y de las empresas
biotecnolgicas, una vez que ya se ha completado la
secuenciacin del genoma de varios organismos incluyendo el
genoma humano.
El mtodo de purificacin debe disearse desde un principio
teniendo en cuenta la cantidad de protena que se requiere.
Hay etapas de purificacin que se pueden aumentar de escala
fcilmente y otras en que no es posible hacerlo. El grado de
pureza necesario depender del uso que se va a dar a la
protena, desde investigacin y terapia, hasta uso industrial. Si
el inters est en la protena y no importa el organismo de
origen, conviene buscar una fuente fcil de obtener, barata,
que contenga esa protena en abundancia, es preferible partir
de organismos enteros o de clulas en cultivo, aunque lo
ptimo es producir la protena por mtodos de DNA
recombinante.
Dependiendo de la finalidad, la protena debe ser obtenida en
estado nativo o puede estar desnaturalizada. Para determinar
su actividad biolgica (enzimas) debe estar nativa y para
determinar estructura primaria, puede estar desnaturalizada.
Se debe seleccionar un mtodo de determinacin especfico de
la protena en cuestin, por ejemplo su actividad, si se trata de
una enzima, su unin de ligando a un receptor o a un
anticuerpo especfico. Y un mtodo para determinar la
protena total. Debe tenerse en cuenta que, salvo la
determinacin de protena por anlisis de aminocidos o por
peso seco, todos los dems mtodos son semicuantitativos, a
menos que se los estndar dice con la propia protena en
estudio. Entre estos mtodos se pueden mencionar:
espectrofotometra en el UV (280 nm, Trp; 210-215 nM, unin
peptdica); Biuret (Cu2+ alcalino); Lowry (Cu
2+
alcalino +
reactivo de Folin-Ciocalteau); Bradford (Coomassie Blue); unin
de Ag.
La actividad especfica (AE) es igual a la relacin entre la
cantidad de protena que se purifica sobre la cantidad de
protena total. El grado de purificacin es el cociente de la AE
en la etapa 2 sobre la AE en la etapa 1 (la purificacin global,
AE final sobre AE inicial) Se debe utilizar un mtodo adecuado
para juzgar la pureza de la protena obtenida; actualmente se
utiliza SDS-PAGE, monodimensional o, preferentemente,
bidimensional. En otras pocas, se utiliz la ultracentrifugacin
analtica.
Se debe evitar la protelisis de la protena en estudio durante
su purificacin, utilizando mezclas de inhibidores de proteasas,
y trabajando tan rpido como sea posible y en fro, para
minimizar su accin.
En general el aislamiento de la protena tiene este esquema
general:
1) Separacin de las clulas.
2) Si la protena es intracelular, ruptura celular y separacin de
restos.
3) Concentracin.
4) Aislamiento primario.
5) Purificacin de alta resolucin.
6) Producto final.
As entonces podemos plantear que entre ms eficiente sea el
proceso de purificacin, mayor ser la cantidad de protena o
enzima obtenida al final, y menor la de los dems
contaminantes y otras protenas presentes en la muestra
(idealmente la cantidad de estas debe ser igual o lo ms
cercano a cero).
En esta ocasin se realizo una simulacin en un sistema
computacional, donde se puede evaluar de una forma muy
rpida los distintos mtodos de separacin, as mimo
brindando un panorama inicial de lo complejo e importante
que es este proceso. El programa utilizado es el ProteinLab
(Protein Purification, A. G. Booth, Faculty of Biogical Sciencies
University of Leeds United Kingdom), con el que se evalu las
protenas nombradas como nmero 1 y nmero 11. Las cuales
por sus caractersticas y condiciones de manejo fueron
purificadas a travs de mtodos como la precipitacin por
salado (con sulfato de amonio), por tratamiento con calor y a
por punto isoelctrico, por lo que la cuestin a responder en
este experimento es el saber cul es el mtodo ms adecuado
de purificacin para estas protenas en particular, as como
determinar su peso molecular.
RESULTADOS.
La protena 1, es estable por varias horas hasta los 40 C, y en
un intervalo de pH entre 2.5 y 9.5. Primeramente fue sometida
a una precipitacin con sulfato de amonio al 65 % y despus se
realizo una electroforesis, confirmando que an presentaba
gran cantidad de contaminantes. Tambin se realizo una
prueba inmunolgica, la cual nos permiti detectar y localizar
la protena, y un valor aproximado de su punto isoelctrico, el
cual utilizamos para proceder a precipitarla.

Fig. 1.1. Electroforesis de dos dimensiones de la muestra de
protena despus de la precipitacin por salado.

Fig. 1.2. Electroforesis de dos dimensiones despus de la
precipitacin por punto isoelctrico.

Fig. 1.3. Determinacin de la fraccin de la muestra que
presenta la actividad enzimtica.


Tabla 1. Reporte de progreso de la purificacin de la protena 1.
Ahora bien, la protena 11, es estable hasta 50 C entre un
intervalo de pH de 3.0 a 11.0. Por ende esta muestra fue
tratada inicialmente con calor (50 C durante 60 minutos) y
despus dos horas ms a la misma temperatura. Como el valor
de contaminantes no bajo considerablemente, se realizo la
precipitacin por punto isoelctrico, el cual fue identificado a
travs de una electroforesis de dos dimensiones.

Fig. 2.1 Determinacin de la fraccin con actividad enzimtica.
Fig. 1.4. Electroforesis de una
dimensin de la muestra despus
de la precipitacin por punto
isoelctrico.

Fig. 2.2. Electroforesis de dos dimensiones de la protena 11,
despus de la separacin por punto isoelctrico.

Tabla 2. Reporte del progreso de purificacin de la protena 11.
Posteriormente se determino un valor aproximado de los pesos
moleculares, obteniendo los factores de retencin para cada
marcador de peso molecular, graficando log(PM) VS Rf. Se
obtiene la ecuacin de la recta, y como de cada muestra
problema se tiene su Rf, solo se interpola y se obtiene el valor
del peso molecular aproximado de la protena.
Protena Peso molecular (KD)
1
11
Tabla 3. Pesos moleculares obtenidos de las protenas.
ANALISIS DE RESULTADOS.
En el caso de la protena 1, se observa que la concentracin de
sulfato de amonio (65 %) se pudo eliminar una buena parte de
los contaminantes sin llevarnos de por medio parte de la
enzima, sin embargo la cantidad de contaminantes an era
grande y eso lo refleja la electroforesis (fig 1.2). Anteriormente
se haba hecho otros ensayos probando distintas
concentraciones de sulfato de amonio, pero a menores
concentraciones la cantidad de contaminantes eliminados fue
menor, lo que tiene sentido, teniendo en cuenta que en este
mtodo se busca llegar a una alta concentracin de la sal para
que se solubilice la protena, claro que tampoco puede ser
demasiado alta, como se evalu previamente tambin, ya que
a concentraciones mayores a 65 % la cantidad de
contaminantes eliminados es casi total, sin embargo la
precipitacin de la enzima tambin se ve favorecida, lo que nos
produce una gran prdida y un muy bajo rendimiento, nada
ideal para el proceso. Por eso solamente se uso esta
concentracin, posteriormente se uso el punto isoelctrico, el
cual estaba alrededor de 8, por lo que se estableci un
gradiente de 7 a 9, obteniendo buenos resultados puesto que
se elimino totalmente las contaminaciones, sin embargo
tambin se perdi un poco de la protena en el proceso, si esto
se quisiera modificar, solo se tendra que abrir el un poco ms
el gradiente de pH, lo que evitara perder un poco de la enzima,
claro que con el riesgo de no poder eliminar todos los
contaminantes, pero eso ya depender de lo parecidos o no
que son la protena estudiada y las dems. Hablando de costos
el proceso es muy accesible, y con un alto grado de
enriquecimiento.
En el caso de la protena 11, sabamos que resista
temperaturas de 50 C, por ello la sometimos a calor, puesto
que la mayora de la protenas se desnaturalizan a 40C, y
sometiendo la muestra a la temperatura limite de nuestra
protena podemos asegurar que gran parte de las
contaminantes sern eliminadas, y as fue, despus del
tratamiento se logro eliminar ms de la mitad. Se volvi a
someter al calor, y ms tiempo, pero ya no se pudo eliminar
ms, seguramente porque los contaminantes tambin
presentes son igual o ms resistentes a 50 C. As mismo
tambin se prosigui a terminar la purificacin mediante la
separacin por punto isoelctrico, donde al igual que la
protena 1, se logro purificar totalmente a la protena, con un
cierto grado de prdida, debido al gradiente de pH manejado,
en este caso de 4 a 6, puesto que su PI estaba alrededor de 5;
de igual forma el aumentar un poco ms el gradiente reducira
la perdida.
En ambos casos se trato de purificar por cromatografa de
intercambio inico, sin embargo no fue factible debido a que
Fig. 2.3 Electroforesis de una
dimensin, posterior a la
separacin por punto
isoelctrico.
ambas protenas tiene un amplio intervalo de pH a la cual son
estables.
CONCLUSIONES.
Se sometieron a purificacin dos muestras de protenas, a
travs de una simulacin en computadora, obtenindose
rendimientos de 95.7% para ambas muestras.
La protena 1 se pudo purificar a travs de una precipitacin
inicial con sulfato de amonio al 65%, con una posterior
separacin por punto isoelctrico.
La protena 11, se purifico a travs de tratamiento con calor y
separacin por punto isoelctrico.
Los costos simulados de los procesos son bajos y accesibles.
BIBLIOGRAFA.
Voet. Bioqumica. 3 Edicin. Editorial Medica Panamericana.
2006. Pp. 135-158.