Integrantes:

Garca Hourquet, Mariano

Chipana Cuarez, Martin
Vea Murgua, Daniela

TRABAJO PRACTICO N1
Introduccin
Las bacterias son organismos procariotas, cuyas clulas no tienen un ncleo celular diferenciado.
Son microorganismos unicelulares que tienen un nico cromosoma circular y pueden tener
tambin plsmidos, los cuales son pequeas molculas de ADN extra-cromosmico.
Las bacterias Gram positivas son aquellas bacterias que se tien de azul oscuro o violeta por la
tincin de Gram. Esta caracterstica qumica refleja un tipo de organizacin bacteriana: la
envoltura celular de las Gram positivas comprende la membrana citoplasmtica y una pared
celular compuesta de peptidoglucano, que es ms gruesa que la pared de las Gram negativas y es
la responsable de retener el tinte durante la tincin. Mientras que las Gram negativas, no se tien
de azul oscuro o violeta y lo hacen de un color rosado tenue y presentan dos membranas lipdicas
entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglucano. La bacteria Escherichia coli es
una bacteria Gram negativa.
Los plsmidos son molculas circulares extra-cromosmicas de DNA doble cadena presentes en
bacterias y en algunas eucariotas. En bacterias se encuentran en forma sper enrollada y su
tamao puede variar desde pocos miles de pares de bases (pb) hasta 100 kpb. Los plsmido no son
esenciales para la supervivencia de la bacteria pero pueden contener genes, que les otorguen
caractersticas adicionales, permitindoles sobrevivir o crecer en condiciones desfavorables o
competir con otros microorganismos que se encuentran en el mismo nicho ecolgico.
El nmero de copias por clula de un plsmido es regulado, la cual puede ser explicada segn el
mtodo del represor, que controla la iniciacin de la replicacin y se encuentra codificado en una
regin del DNA plasmdico. De este modo, los plsmidos se clasifican en: plsmidos con bajo
nmero de copias (1 a 5 plsmidos por clula), plsmidos con mediano nmero de copia (5 a 20) y
plsmidos con alto nmero de copias (20 a 200)
Dos plsmidos pueden ser incompatibles cuando, en ausencia de una presin selectiva, no pueden
coexistir en una misma clula ya que comparten parte de la maquinaria replicativa y por ende,
parte del mecanismo de represin. En consecuencia, al cabo de sucesivas generaciones, uno logra
permanecer dentro de la poblacin y excluir al otro.
En el laboratorio se utiliza el mtodo de extraccin de DNA plasmdico para extraer el plsmido e
introducirlos en otras bacterias para que estas expresen los genes del plsmido extrado.
Objetivos
Aprender mtodos bsicos de extraccin de DNA de laboratorio.
Extraer DNA cromosmico de Escherichia coli.
Preparar DNA plasmdico de Escherichia coli.
Desarrollo
Parte 1: extraccin de DNA cromosmico
Recibimos un tubo de ensayo con bacterias ya cosechadas por centrifugacin, crecidas en un
medio rico.
1) El tubo contena a las bacterias resuspendidas en 2 ml de buffer Tris-HCL 50 mM (pH= 8),
sacarosa 25% (p/v). Colocamos el tubo en hielo.
2) Aadimos 0,8ml de EDTA 0,25 M pH=8 y mezclamos con una varilla durante 10 minutos.
Agregamos 0,4 ml de lisozima (10mg/ml), revolvimos y dejamos quieto 10 minutos. A partir de
aqu trabajamos a temperatura ambiente.
3) Aadimos 0,4 ml de Tritn X-100 9% (v/v), mezclamos con la varilla y dejamos reposar
30minutos a temperatura ambiente.
4) Agregamos 0,4 ml de acetato de sodio 3M (pH=5.2), mezclamos con la varilla y transferimos a
un vaso de precipitados.
Mientras uno de nosotros mezclbamos con una varilla, otro agreg 10ml de etanol fro.
- De esta manera, el DNA se precipit formando hebras que se enrollan a la varilla ya que el
etanol disminuy la polaridad del medio lo que provoc a que el DNA precipitara.
5) Por ltimo, sumergimos la varilla de DNA en etanol 70% (v/v).

Observaciones

La funcin del Tris-HCL es actuar como sistema de buffer, el cual mantiene el pH constante
en 8. La sacarosa es levemente hipertonica, es decir que provoca que el agua, que rodea a
la bacteria, ingrese a ella ocasionando una presin que genere cierta inestabilidad en la
pared de la misma. La combinacin de ambas ayuda a que la lisis de la bacteria no sea
abrupta.
El EDTA es un quelante de cationes divalentes y un inhibidor de nucleasas, ya que capta
sus cofactores y as evita la degradacin del DNA. Adems el tubo se mantiene sumergido
en hielo de modo que baja la actividad enzimtica. El EDTA adems ayuda a desestabilizar
la membrana externa de la clula, favoreciendo la lisis celular.
La enzima lisozima corta los enlaces de la pared celular bacteriana.
El Tritn X-100 es un detergente inico (menos fuerte que el SDS) que solubiliza los
fosfolpidos de la membrana, ayudando tambin a obtener una lisis suave.
El acetato de sodio, como se encuentra a pH 5.2, neutraliza el pH bsico de la
solucin de lisis. Adems los iones K+ evitan la repulsin de los fosfatos de las
hebras de DNA, favoreciendo as su renaturalizacin.
El lavado con etanol 70% sirvi para purificar al DNA de las sales y otros
compuestos polares de pasos anteriores. El etanol 70% permite disolver muchas de
las sales pero no disuelve el DNA debido a su polaridad intermedia.
El DNA se enrolla en la varilla ya que es una molcula de mucha longitud y gracias
al movimiento manual de girar la varilla sobre el DNA.
2da Parte: extraccin de DNA plasmdico
Trabajamos con un cultivo bacteriano de Escherichia coli con DNA plasmdico (pBluescript II SK/KS)
de alto nmero de copias
1) Recibimos un tubo eppendorf con una cepa E. coli conteniendo un plsmido de alto nmero
de copias, resuspendido en 0.3 ml de la solucin 1.
2) Luego agregamos 0.3 ml de solucin 2 y mezclamos por inversin, se incub a temperatura
ambiente por no ms de 5 min.
3) Despus agregamos 0.3 ml de solucin 3 (en hielo) y mezclamos por inversin.
4) Se centrifug el tubo durante 15 minutos a mxima velocidad.
5) Luego el sobrenadante se transfiri a otro eppendorf.
6) Se agreg isopropanol 0.6 ml (a temperatura ambiente) y mezclamos por inversin.
7) Se volvi a centrifugar por 30 min a mxima velocidad.
8) Despus se descart el sobrenadante en la pileta, para luego agregar 500 l de etanol 70% y
luego mezclar por inversin.
9) Se volvi a centrifugar por 5 minutos a mxima velocidad, para luego descartar el
sobrenadante con una pipeta.
10) Se dej secar el pellet durante 10 minutos con la tapa abierta.
11) Por ultimo agregamos en 20 l de agua MilliQ para luego se guarde a -20C.
Observaciones
La solucin 1 est compuesta por Tris-HCL 50mM y EDTA 10 mM pH=8. Cmo actan estos
compuestos ya se ha descripto en el experimento anterior.
La solucin 2 est compuesta por NAOH 200mM y SDS 1%. Esta solucin lisa las bacterias y acta
rompiendo la pared celular de pptidoglicano, solubilizando las membranas externa e interna,
degradando parcialmente los RNA y desnaturalizando los DNA genmico y plasmdico.
EL SDS es un detergente inico fuerte que solubiliza los fosfolpidos de las membranas
permitiendo el acceso al DNA. Contribuye a desnaturalizar protenas al romper uniones no
covalentes.
EL NAOH aumenta el pH de la solucin desnaturalizando protenas, DNA genmico y plasmdico.
Desestabiliza molculas de RNA que son parcialmente degradadas
La solucin 3 est compuesta por K+AcO- 3 M pH 4.8, el cual ya se ha descripto en el 1er
experimento. Adems los iones K+ evitan la repulsin de los fosfatos de las hebras de DNA,
favoreciendo as su renaturalizacin. Por ltimo el catin monovalente Potasio reemplaza al catin
sodio en la molcula de SDS y esto disminuye la solubilidad del detergente. En consecuencia, se
forma una malla que facilita la precipitacin de complejos de DNA genmico y protenas mal
renaturalizadas.
Isopropanol: acta de la misma forma que el etanol del TP 1, pero se prefiere este primero ya que
al ser menos polar que el etanol, se requiere un menor volumen de isopropanol para lograr la
precipitacin del DNA plasmdico.
Etanol 70%, ya fue descripto su para qu se utiliza en el 1er TP.
Discusion
El DNA genmico, debido a su gran tamao, se fragmenta durante la lisis. Por lo tanto, al
desnaturalizarse las hebras, stas se separan.
El DNA plasmdico se desnaturaliza, pero al ser ms pequeo, no se fragmenta. Por lo tanto, al
permanecer superenrrollado, las hebras desnaturalizadas siguen vinculadas fsicamente.
Al agregar K
+
acO
-
el DNA plasmdico, al haber mantenido a sus hebras asociadas, se renaturaliza
correctamente y permanece en solucin. Mientras que el DNA genmico no se renaturaliza bien
ya que las largas hebras complementarias no se aparean correctamente y se aparean por
atracciones dbiles con protenas y restos de membranas.
El DNA precipitado forma un pellet que es necesario para el paso de centrifugacin. Se descarta el
sobrenadante y ms tarde se coloca el alcohol 70% para que se lave el pellet. Se vuelve a
centrifugar y a descartar el sobrenadante. El pellet se deja secar de modo que nos quede el DNA
plasmdico lo ms purificado posible.
Mientras que en el TP1 la lisis fue suave (solucion de sacarosa, detergentes no tan fuertes), la lisis
del TP 2 fue abrupta, ya que en el TP 2 poco import que el ADN cromosmico se renaturalizara de
forma correcta. Gracias a las sucesivas centrifugaciones, en el TP2 pudimos separar al entramado
de DNA cromosmico, protenas desnaturalizadas, del DNA plasmdico renaturalizado
correctamente. Fue de gran utilidad las centrifugacin en el TP2.

Cuestionario
Las preguntas 1, 2,3 fueron contestadas en la introduccin.
4)
El ORI o rep(Pmb1): origen de replicacin de alto nmero de copias
El gen bla de resistencia a antibitico (amplicilina)
Polylinker o sitio mltiple de clonado: presenta secuencias de reconocimiento para varias
enzimas de restriccin
Promotores PT3 Y PT7: en presencia de la RNA pol se puede dirigir la transcripcin del
inserto en uno u otro sentido.
Lac Z: codifica para la enzima B-galactosidasa, la cual degrada la lactosa.
F1: origen de replicacin viral para obtener DNA de simple cadena.
5) El procedimiento que llevamos a cabo en el experimento 2 es una forma habitual de extraer el
DNA plasmidico.
6) Para separar las el DNA del RNA y las protenas :
Se deben separar las protenas con la finalidad de obtener solamente los cidos nucleicos. La
desproteinizacin se logra agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol es un
desnaturalizador activo de protenas que suprime la solubilidad de las protenas en solucin y las
precipita. Puesto que el fenol y la solucin salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere
centrifugar la suspensin para separar las fases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solucin
dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado concentrado como
pellet. La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitacin con fenol y
centrifugacin hasta agotar toda la protena de la solucin. Esto se lleva a cabo tratando la
muestra con fenol o con proteasas. (Las proteasas son enzimas que degradan los enlaces
peptdicos de las protenas)
Es necesario separar el ARN del ADN, esto se lleva a cabo mediante un tratamiento con
ribonucleasas. (Es una enzima que cataliza la hidrlisis de ARN en componentes ms pequeos).
Como consecuencia, si se corriera la muestra de DNA despus de su tratamiento con ribonucleasas
sobre un gel de agarosa, no se vera una chorreada debido a la presencia de RNA.
7) La ventaja es que vamos a obtener un producto con mayor cantidad de DNA plasmdico que nos
ser til para el prximo experimento.
8) Fue respondida en la parte de observaciones.
9) a) Se le podra agregar isopropanol para lograr que el DNA plasmdico precipite mientras que las
protenas no. (Este paso se ha llevado a cabo en el TP2) B) Se podra agregar etanol 70% para lavar
las sales coprecipitadas con DNA. (este tambin realizado en los dos experimentos)