Universidade de So Paulo

Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

Evoluo cromossmica de espcies de Crotalaria (L.) da seo Hedriocarpae,
subseo Macrostachyae (Leguminosae-Papilionoideae)







Andressa Gois Morales







Dissertao apresentada para obteno do ttulo de Mestre
em Agronomia. rea de concentrao: Gentica e
Melhoramento de Plantas













Piracicaba
2008


Andressa Gois Morales
Biloga










Evoluo cromossmica de espcies de Crotalaria (L.) da seo Hedriocarpae, subseo
Macrostachyae (Leguminosae-Papilionoideae)







Orientador:
Prof. Dr. MATEUS MODI






Dissertao apresentada para obteno do ttulo de Mestre
em Agronomia. rea de concentrao: Gentica e
Melhoramento de Plantas








Piracicaba
2008

































Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP


Morales, Andressa Gois
Evoluo cromossmica de espcies de Crotalaria (L.) da seo Hedriocarpae,
subseo Macrostachyae (Leguminosae-Papilionoideae) / Andressa Gois Morales. - -
Piracicaba, 2008.

70 p. : il.
Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. Caritipos vegetais 2. Cromossomos vegetais 3. Crotalria 4. Marcador molecular
Ttulo

CDD 633.652




Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor





3










































Dedico: Dedico: Dedico: Dedico:
minha me Dirce minha me Dirce minha me Dirce minha me Dirce e e e e memria memria memria memria
de meu pai Osvaldo, por serem os de meu pai Osvaldo, por serem os de meu pai Osvaldo, por serem os de meu pai Osvaldo, por serem os
pilares de minha pilares de minha pilares de minha pilares de minha formao. formao. formao. formao.




4


AGRADECIMETOS


A Deus, pela infinita sabedoria....
Ao Prof. Dr. Mateus Mondin, meu orientador, pela pacincia, amizade e ajuda, que sem os quais
no seria possvel a realizao deste trabalho.
Ao CNPq e CAPES pela concesso das bolsas de estudo.
ESALQ e ao Departamento de Gentica que permitiram a realizao deste trabalho.
Aos professores pelos ensinamentos e disposio em ajudar.
Profa. Dra. Margarida Lopes Rodrigues de Aguiar-Perecin, pelo apoio e sugestes
apresentadas.
Profa. Dra Ana Lcia Dias, pela amizade e incentivo.
tcnica Silva Cristina Menuzzo Molina, pela grande amizade e ajuda.
Aos amigos do Laboratrio de Citogentica Molecular de Plantas: Maiara, Ceclia, Daniel,
Renato e Renata, pelos momentos de descontrao e incentivo.
Aos amigos Antnio (mais conhecido como Berdan), Fernandinho e Valdir, pelos momentos
descontrados e pela disponibilidade em sempre ajudar.
Aos funcionrios do Campo, por me ajudarem sempre que precisei.
minha companheira de casa Michelle e a todos meus amigos de Piracicaba pelo incentivo,
ajuda, compreenso e momentos inesquecveis.
Aos amigos Thiago e Jsica, pela amizade e companheirismo.
s minhas grandes amigas Mariana e Carol que mesmo longe sempre me apoiaram.




5


Ao Celso, por estar ao meu lado em todos os momentos, me ensinando a ver a vida de uma
maneira especial, me incentivando e me apoiando em momentos difceis, tornando-os mais fceis
de lidar.
Ao meu pai e meu anjo Osvaldo (in memorian), que enquanto comigo me ensinou o verdadeiro
valor da vida e que mesmo distante sempre estar ao meu lado.
minha me Dirce e minhas irms Anglica e Aracelis pelo eterno amor, carinho, incentivo em
mim depositado e que sem eles eu no conseguiria chegar at aqui.
A todos que de alguma maneira contriburam para a realizao deste trabalho.

























6


SUMRIO
RESUMO.................................................................................................................................. 08
ABSTRACT ............................................................................................................................. 09
1 INTRODUO ..................................................................................................................... 10
2 REVISO DE LITERATURA ............................................................................................... 13
2.1 O GNERO CROTALARIA ...................................................................................................... 13
2.2 A CITOGENTICA DO GNERO CROTALARIA ............................................................................ 15
2.3 OS GENES RIBOSSOMAIS E AS REGIES ORGANIZADORAS DO NUCLOLO (RON) COMO
MARCADORES PARA ESTUDO DA EVOLUAO CARIOTPICA ........................................................... 24
3 MATERIAL E MTODOS..................................................................................................... 29
3.1 MATERIAIS........................................................................................................................... 29
3.2 MTODOS............................................................................................................................. 30
3.2.1 GERMINAO.................................................................................................................... 30
3.2.2 PR-TRATAMENTO DE RAZES COM INIBIDORES DO FUSO MITTICO...................................... 30
3.2.3 Mtodos DE PREPARAES DE LMINAS............................................................................. 30
3.2.4 COLORAO PELO MTODO DE FEULGEN............................................................................ 31
3.2.5 COLORAO COM FLUOROCROMOS.................................................................................... 31
3.2.5.1 COLORAO COM DAPI (4-6- DIAMIDINO-2-FENILINDOL) ............................................. 31
3.2.5.2 COLORAO COM DAPI/AMD (4-6- DIAMIDINO-2FENILINDOL/ACTINOMICINA D) ........ 32
3.2.5.3 COLORAO COM CMA (CROMOMICINA A
3
) .................................................................. 32
3.2.5.4 COLORAO COM CMA/DA (CROMOMICINA A
3
/DISTAMICINA) ...................................... 33
3.2.6 HIBRIDAO MOLECULAR IN SITU FLUORESCENTE (FISH) .................................................. 33
3.2.6.1. SONDAS......................................................................................................................... 33
3.2.6.2 EXTRAO DO DNA GENMICO TOTAL DE ESPCIES DE CROTALARIA ............................... 33
3.2.6.3 AMPLIFICAO DO GENE DE RNA RIBOSSMICO 5S......................................................... 34
3.2.6.4 MARCAO DAS SONDAS E HIBRIDAO MOLECULAR I SITU FLUORESCENTE DAS SONDAS
DE DNAS RIBOSSOMAIS 45S E 5S............................................................................................... 34
3.2.7 MICROSCOPIA E ANLISE DE IMAGENS................................................................................ 35
3.2.8 MEDIDAS DOS CROMOSSOMOS............................................................................................ 35
4 RESULTADOS...................................................................................................................... 37
5 DISCUSSO ......................................................................................................................... 52
5.1 ESTRUTURA DOS CARITIPOS................................................................................................ 52




7


5.2 EVOLUO CARIOTPICA DO GNERO CROTALARIA ATRAVS DO USO DE MARCADORES
CITOGENTICOS.......................................................................................................................... 56
6. CONCLUSES..................................................................................................................... 60
REFERNCIAS........................................................................................................................ 61
APNDICE............................................................................................................................... 69












































8


RESUMO

Evoluo cromossmica de espcies de Crotalaria (L.) da seo Hedriocarpae, subseo
Macrostachyae (Leguminosae-Papilionoideae)

O gnero Crotalaria possui aproximadamente 600 espcies descritas, localizadas
principalmente nas regies tropicais e subtropicais. Estas espcies esto classificadas em oito
sees e nove subsees botnicas definidas principalmente com base em caracteres florais. Estas
sees botnicas podem ser subdivididas em dois grupos principais: um de espcies com flores
especializadas e outro de espcies sem especializao das flores. Estudos citogenticos anteriores
mostraram que as caractersticas cromossmicas so conservadas dentro de uma mesma seo ou
subseo botnica e foi proposto que as espcies com especializao das flores teriam uma
organizao cromossmica diferente das espcies sem especializao das flores. Dentro deste
contexto, foram descritos os caritipos e a organizao do genoma de trs espcies e duas
sinonmias, da seo Hedriocarpae, subseo Macrostachyae, com a utilizao de colorao
convencional dos cromossomos pelo mtodo de Feulgen, de colorao com fluorocromos
especficos s regies cromossmicas ricas em GC ou AT e mapeamento fsico por hibridao
molecular in situ fluorescente (FISH) dos locos de DNA ribossmicos 45S e 5S. A obteno de
marcadores cromossmicos caractersticos para esta subseo e a construo de mapas
citogenticos possibilitaram a identificao de uma inverso pericntrica, de eventos de
transposio e da diferenciao na natureza das seqncias de DNA da heterocromatina
pericentromrica, previamente descrita em espcies com flores especializadas como ricas em GC.
Estes resultados revelaram alguns dos eventos citogenticos ocorridos durante a diversificao do
gnero, sendo que a subseo Macrostachyae caracterizada por uma inverso no cromossomo 1
que pode ter uma origem antiga no gnero e que espcies sem especializao das flores, de fato
possuem uma organizao cromossmica distinta das espcies com flores especializadas,
principalmente quanto natureza das seqncias de DNA da heterocromatina pericentromrica.

Palavras-chave: Crotalaria; rDNA 45S; rDNA 5S; Bandamento cromossmico; Evoluo
cariotpica







9


ABSTRACT

Karyotype evolution of Crotalaria (L.) species of the Hedriocarpae section, Macrostachyae
subsection (Leguminosae-Papilionoideae)

Approximately 600 species of the Genus Crotalaria have been described, the majority is
located in tropical and subtropical regions. These species are classified into eight botanical
sections and nine subsections according to floral characteristics. The botanical sections can be
divided into two major groups: one with species presenting flower specialization and the other
without flower specialization. Previous cytogenetic studies showed that chromosomal features are
conserved within the same botanical section or subsection, and it has been suggested that species
with flower specialization have a different chromosomal organization from those species without
flower specialization. In this context, the karyotypes and genome organization of five species
(being three synonymy from the Hedriocarpae section, Macrostachyae subsection) were
described by conventional chromosome staining using Feulgen, specific fluorochrome staining to
GC or AT chromosomal rich regions and physical mapping by fluorescent in situ molecular
hybridization of 45S and 5S ribosomal genes. The mapping of specific chromosome markers and
construction of cytogenetic maps of this section have allowed us to identify a pericentric
inversion, transposition events and a differentiation in the nature of DNA sequences of the
pericentromeric heterochromatin, previously described as GC-rich in species with flower
specialization. The results reveal diverse cytogenetic events that occurred during the genus
diversification: the Macrostachyae subsection showed a pericentric inversion in the chromosome
pair 1 (presumably of ancient origin) while species without flower specialization are
characterized by a distinct chromosomal organization, mainly concerning the nature of DNA
sequences of pericentromeric heterochromatin.

Key-words: Crotalaria, rDNA 45S, rDNA 5S, Chromosomal banding, Karyotype evolution










10


1 ITRODUO

O gnero Crotalaria (Leguminosae-Papilionoideae) possui uma grande diversidade de
espcies, localizadas principalmente nas regies tropicais e subtropicais. O continente Africano
o centro primrio de diversidade onde 550 espcies foram descritas; o Americano o centro
secundrio de diversidade onde foram descritas 70 espcies, sendo que destas, 31 foram
classificadas como endmicas. ndia e Austrlia tambm so consideradas centros de diversidade,
entretanto, no h descries precisas sobre o nmero de espcies encontradas nestes dois pases.
A sistemtica do gnero baseada em caractersticas morfolgicas e na presena de apndices e
peas florais que permitem um maior ou menor grau de especializao a polinizao cruzada
realizada por insetos. Com base nestas caractersticas florais as espcies foram agrupadas em
sees e subsees botnicas e o gnero pde ser dividido em dois grupos principais, o primeiro
com as sees sem especializao floral e o segundo com as sees que apresentam
especializao floral (reviso em BISBY; POLHILL, 1973; POLHILL, 1982; FLORES;
MIOTTO, 2005; FLORES, 2004).
As espcies do gnero Crotalaria so de grande importncia para a agricultura dos
pases tropicais e so utilizadas principalmente como adubo verde para cobertura do solo e
combate eroso, como fertilizante devido a sua capacidade de fixao de nitrognio atmosfrico
e como agente biolgico no controle das reas infectadas com nematides. Alm disso, so
utilizadas na produo de fibras e celulose de alta qualidade (MEDINA, 1959; POLHILL, 1982).
H um interesse crescente da indstria farmacutica em substncias do metabolismo secundrio
de espcies de Crotalaria, como alguns alcalides que apresentam atividade como anti-
inflamatrios e anti-hepatotxicos (AHMED; AL-HOWIRINY; MOSSA, 2006) e outras
substncias que auxiliam na funo imune, na preveno e tratamento de cncer (UNIV HOSEO
ACADEMIC COOP FOUND, 2007).
A maior parte dos estudos citogenticos no gnero Crotalaria est restrita principalmente
a contagem do nmero de cromossomos (ATCHINSON, 1950; BOULTER et al., 1970, FLORES
et al., 2006) e a descrio dos caritipos de algumas espcies (GUPTA; GUPTA 1978a, 1978b;
RAINA; VERMA, 1979; VERMA; KESAVACHARYULU; RAINA, 1984; PALOMINO;
VZQUEZ, 1991; OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999; TAPIA-PASTRANA, et al., 2005;
ALMADA; DAVIA; SEIJO, 2006).




11


A anlise de cerca de 150 espcies mostra que o nmero de cromossomos praticamente
constante, isto 2n=16; que apenas um grupo restrito de espcies e subespcies africanas possui
2n=14 e que no continente Americano predominam espcies poliplides com 2n=32 (reviso em
MONDIN, 2003 e referncias neste). Em decorrncia destes estudos, estabeleceu-se que o
nmero bsico de cromossomos para o gnero x=8 (2n=2x=16; 2n=4x=32), porm x=7 tambm
mencionado, baseado em espcies, como C. incana, com 2n=14. Este ltimo pode ser derivado
de x=8, por aneuploidia ou por rearranjos estruturais acarretando na perda de um par de
centrmeros (GUPTA; GUPTA, 1978a., PALOMINO; VRQUEZ, 1991).
A descrio dos caritipos mostra que as espcies possuem um gradiente de reduo do
tamanho dos cromossomos e um aumento do ndice de assimetria dos caritipos, que coincide
com o aumento do grau de especializao das flores (BOULTER, et al., 1970; OLIVEIRA;
AGUIAR-PERECIN, 1999).
A anlise citogentica atravs de tcnicas de bandamento cromossmico (bandamento C e
fluorocromos) e hibridao molecular in situ fluorescente (FISH) dos genes ribossomais 18S-
5.8S-26S (abreviado rDNA45S) e 5S, de cinco espcies, sendo quatro com flores especializadas e
uma com flores sem especializao, permitiu as seguintes observaes: 1) As espcies com flores
especializadas possuem regies heterocromticas pericentromricas ricas em GC (CMA
+
-
CMA/DA
-
), stios de rDNA 45S e 5S riqussimos em GC (CMA
+
-CMA/DA
+
) e colinearidade
destes locos nas espcies diplides, e perda de sequncias ribossomais durante a evoluo de
espcies poliplides; 2) As espcies sem especializao floral no possuem regies
heterocromticas pericentromricas ricas em GC, mas possuem regies ricas em AT em posies
terminais e intersticiais dos braos cromossmicos, stios menores de rDNA 45S na regio
telomrica de alguns cromossomos e h uma perda de sintenia dos locos de rDNA 45S e 5S em
relao as espcies diplides de flores especializadas, provavelmente como resultado de uma
translocao (MONDIN, 2003, MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007,
MONDIN, et al., 2007a; MONDIN, et al., 2007b).
Os resultados encontrados por Mondin (2003) indicam que h uma diferena na
organizao dos genomas entre espcies de flores especializadas e flores no especializadas,
porm estes resultados basearam-se apenas em uma espcie com flores no especializadas.
Sendo assim, neste trabalho foram caracterizadas trs espcies e duas sinonmias,
pertencentes seo Hedriocarpae, com flores no especializadas, atravs do bandeamento com




12


fluorocromos especficos a regies ricas em AT e GC, alm do mapeamento dos rDNAs 45S e 5S
via hibridao molecular in situ fluorescente (FISH).
Os resultados obtidos atravs destas tcnicas permitiram a caracterizao dos
cromossomos das espcies de Crotalaria da seo Hedriocarpae, bem como forneceram
marcadores cromossmicos que permitiram o entendimento da reorganizao cromossmica
durante o processo de diversificao do gnero.






























13


2 REVISO DE LITERATURA

2.1 O gnero Crotalaria

A famlia Leguminosae, tambm denominada Fabaceae, possui 727 gneros com mais de
19000 espcies aproximadamente e est subdividida em trs subfamlias: Papilionoideae,
Mimosoideae e Caesalpinioideae (LEWIS, et al., 2005).
A subfamlia Papilionoideae a maior dentro da famlia Leguminosae, com 12000
espcies distribudas em 483 gneros (LEWIS, et al., 2005), alm de ser amplamente distribuda e
a mais diversificada, inclui a maior parte das espcies domesticadas para consumo humano e
forrageiro (GEPTS et al., 2005).
Esta subfamlia esta dividida em quatro grupos principais: o grupo basal, a aliana
genistide, o conjunto das tribos tropicais e a aliana galegide (POLHILL, 1981). A aliana
genistide constituda das tribos Euchresteae, Thermopsideae, Podalyrieae, Liparieae,
Genisteae, Crotalarieae, e alguns gneros de Sophoreae. Dentro da tribo Crotalarieae est
includo o gnero Crotalaria. (POLHILL, 1981, DOYLE, et al., 2000).
Este gnero possui aproximadamente 600 espcies descritas, distribudas nos trpicos e
subtrpicos (POLHILL, 1982). No Brasil foi relatada a ocorrncia de 42 espcies do gnero
Crotalaria, sendo 31 espcies nativas e 11 exticas (FILLIETAZ, 2002, FLORES, 2004).
O centro primrio de diversidade o continente Africano, principalmente no centro sul e
leste da frica, com cerca de 550 espcies descritas, seguido do continente Americano com 70
espcies descritas, destas 31 consideradas endmicas (POLHILL, 1982; FLORES, 2004).
O habitat de Crotalaria limitado por alguns fatores ambientais. As espcies pertencentes
a esse gnero necessitam de alta incidncia de luz, sendo sensveis a geadas e a aridez extrema,
alm de possurem uma desvantagem competitiva em relao s gramneas (POLHILL, 1982).
No Brasil o gnero encontrado em ambientes abertos como cerrados e campos, podendo estar
associado a bordas de mata ciliar (FILLIETAZ, 2002; FLORES, 2004; FLORES; MIOTTO,
2005).
A classificao infragenrica proposta por Polhill (1968) inicialmente dividiu o gnero em
onze sees botnicas, baseada apenas nas morfologias florais. A partir de estudos utilizando a
taximetria como ferramenta para a taxonomia, o gnero foi agrupado em oito sees e nove
subsees, sendo esta a classificao atual (BISBY, 1970; BISBY, 1973; BYSBY; POLHILL,




14


1973). Bisby e Polhill (1973) apontam que o gnero pode ser dividido em duas partes, conforme
a complexidade floral, sendo um grupo com espcies com especializao floral e o outro
contendo espcies sem especializao das flores.
O grau de especializao floral inferido a partir de caracteres morfolgicos, como a
forma do receptculo, o grau de toro do bico da quilha, posio dos apndices no estandarte,
clice bilabiado ou no e a forma e presena de plos no estilete (POLHILL, 1968; BISBY;
POLHILL, 1973; POLHILL, 1982). Esta especializao pode estar relacionada com a eficincia
na transferncia do gro de plen para o polinizador (POLHILL, 1982).
Bisby e Polhill (1973) sugeriram a diviso do gnero em dois subgneros. O primeiro
contendo as sees Grandiflorae, Chrysocalycicae, Hedriocarpae e Geniculatae e o segundo com
as sees Calycinae, Crotalaria e Dispermae. Porm, esse tipo de classificao no possvel,
devido a presena de espcies intermedirias fora da frica, particularmente nas sees
Calycinae e Crotalaria. Muitos destes grupos intermedirios so resultados de uma evoluo
convergente, com um nmero de caracteres evoluindo vrias vezes. (BISBY; POLHILL, 1973).
Cerca de metade do gnero Crotalaria possui flores no especializadas (POLHILL, 1968)
tendo este grupo uma distribuio principalmente ao sul da frica e anfiatlntica, com maior
ocorrncia na Amrica do Sul (BISBY; POLHILL, 1973).
As principais aplicaes agrcolas de espcies do gnero Crotalaria so como fontes de
nitrognio pela fixao biolgica atravs da adubao verde, agente biolgico no controle de
nematides, cobertura do solo para controle da eroso, produo de celulose, fibras txteis,
ornamentao e alimentao animal (MEDINA, 1959; POLHILL, 1982).
Alm disso, h um grande interesse na composio qumica de espcies do gnero
Crotalaria, que so particularmente ricas em alcalides pirrolizidnicos (APs) (FLORES, 2004).
Estes alcalides podem atuar como antimicrobianos e em alguns insetos estimulam a ovoposio
(CAMPO; SMEDLEY; EISNER, 2005). Outras substncias de interesse da indstria
farmacutica so a crotaorixina, que inibe o crescimento do parasita causador da malria,
Plasmodium falciparum (NARANDER et al., 2005), os cidos crotlico e emarginlico, que
apresentam atividade antiinflamatria e antihepatotxica, respectivamente (AHMED; AL-
HOWIRINY; MOSSA, 2006), e a lecitina extrada de sementes de C. paulina, que inibe o
crescimento de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (PANDO et al., 2004). Alm do mais,
um extrato obtido de Crotalaria sessiflora melhora a atividade antioxidante, a funo imune,
alm de reduzir os efeitos colaterais no tratamento de cncer de intestino, auxiliando no apenas




15


no tratamento, como tambm na preveno desse tipo de cncer (UNIV HOSEO ACADEMIC
COOP FOUND, 2007).

2.2 A Citogentica do gnero Crotalaria

A maioria dos gneros pertencentes tribo Crotalariae possui um nmero bsico de
cromossomos x=9, no entanto, outros nmeros bsicos tambm tm sidos propostos, como x=7,
para os gneros Pearsonia e Rothia, x=12 para Anathrophyllum e x=8 como o nmero bsico de
Rafnia e Crotalaria (GOLDBLATT, 1981).
Ao realizar uma reviso em relao citogentica do gnero Crotalaria, observa-se que a
maioria dos estudos citogenticos realizados neste gnero esto restritos contagem do nmero
de cromossomos e descrio do caritipo de algumas espcies, utilizando-se colorao
convencional de razes tratadas ou no com inibidores do fuso mittico (GUPTA; GUPTA,
1978a, 1978b; RAINA; VERMA, 1979; VERMA; KESAVACHARYULU; RAINA, 1984;
PALOMINO; VZQUEZ, 1991; OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999; TAPIA-PASTRANA,
et al., 2005; ALMADA et al., 2006; FLORES et al., 2006).
Um dos trabalhos pioneiros em relao ao nmero bsico de cromossomos do gnero foi
realizado por Senn (1939 apud ATCHINSON, 1950), onde originalmente foi descrito que a
maioria das espcies de Crotalaria possui x=8, e que somente algumas espcies possuem x=7. A
contribuio principal deste trabalho foi a sugesto de um mecanismo para a reduo do nmero
bsico de cromossomos de x=8 para x=7. Senn (1939 apud ATCHINSON, 1950) sugere que esta
diminuio teria se originado por aneuploidia, ou por translocaes envolvendo a perda de um
centrmero, sem que houvesse perda de material gentico.
Embora no se possa comprovar qual dos mecanismos seja o responsvel pela origem do
nmero bsico de cromossomos x=7 em Crotalaria, certamente o mecanismo de translocao o
mais parcimonioso, por no envolver a perda de grande contedo gnico (STEBBINS, 1971).
Alm disso, este mecanismo de reduo do nmero cromossmico por translocao e perda de
um centrmero foi recentemente comprovado. Para demonstrar a origem do nmero bsico de
cromossomos de Arabidopsis thaliana (x=5) e outras espcies relacionadas (x=6 e x=7), Lysak,
et al. (2006) desenvolveram um conjunto de sondas a partir de BACs (cromossomos artificiais de
bactrias) que permitiu a pintura individual dos cromossomos de A. thaliana. A hibridao
cruzada destas sondas com as demais espcies permitiu a identificao das translocaes e dos




16


centrmeros perdidos durante o processo e este mecanismo foi descrito como o mais importante
na evoluo do nmero bsico de cromossomos em Brassicaceae (LYSAK, et al., 2006),
comprovando as suposies anteriormente feitas por Stebbins (1971).
Este mecanismo tambm havia sido proposto por Atchinson (1950) para explicar o
nmero cromossmico de C. incana (2n=2x=14). Porm, o autor fez outras observaes
relevantes. Uma delas foi a constatao da presena de uma correlao entre o tamanho dos
cromossomos (anlise visual) e a posio botnica destas espcies de acordo com seu grau de
especializao floral.
Outra observao feita por Atchinson (1950) mostrava que os cromossomos de C. incana
(2n=14) eram maiores que os das espcies diplides com 2n=16 e que espcies poliplides, como
C. pumila, onde o nmero cromossmico dobra (2n=4x=32), o tamanho dos cromossomos fica
mais reduzido.
Alm disso, o autor infere, atravs dos padres morfolgicos e citolgicos, que o gnero
ancestralmente tropical com um nmero diplide de 2n=16 (ATCHISON, 1950). Esta observao
serviu de suporte para a teoria botnica que prope a origem do gnero em uma regio limitada
no sul do continente africano (POLHILL, 1982).
O estabelecimento de grupos botnicos organizados de acordo com o grau de
especializao floral concretizado por Polhill (1968), permitiu a Boulter et al. (1970) realizar um
dos trabalhos mais importantes para a compreenso da citogentica do gnero.
Apesar de ser um trabalho relativamente simples, Boulter et al. (1970) relacionou os
resultados citogenticos obtidos para cada uma das espcies estudadas com as respectivas sees
botnicas. Isso foi possvel devido ao grande nmero de espcies analisadas, 57 espcies ao todo
e devidamente classificadas por Polhill (1968). Um dos resultados foi a comprovao da
predominncia de espcies com 2n=16 cromossomos, no entanto, no h qualquer meno deste
ser o nmero cromossmico bsico do gnero (BOULTER, et al. 1970).
A principal concluso deste trabalho foi a comprovao de uma diminuio no tamanho
dos cromossomos e que esta reduo de tamanho est relacionada com o aumento da
especializao floral, sendo que cromossomos maiores predominam nas sees Grandiflorae e
Chrysocalycinae (particularmente subseo Incanae), considerados como grupos derivados e com
menor especializao floral, enquanto cromossomos menores esto na seo Crotalaria (subseo
Longirostres) e seo Dispermae, considerados grupos mais especializados (BOULTER, et al.
1970).




17


Gupta (1976) publica o nico trabalho sobre o contedo de DNA em espcies de
Crotalaria. Neste, o autor estima o contedo de DNA nuclear, a rea nuclear e a massa seca
nuclear de 13 espcies do gnero Crotalaria.
O contedo de DNA em C. pallida (seo Hedriocarpae) foi de 2.50 pg, enquanto em C.
retusa (seo Crotalaria) foi de 1.95 pg, indicando perda de material gentico com o ganho de
especializao floral. Outra observao foi que espcies pertencentes a diferentes sees podem
ter contedos similares de DNA e que as espcies pertencentes mesma seo podem ter
diferentes contedos de DNA (GUPTA, 1976). Alm disso, estas variaes na quantidade do
contedo de DNA teriam um importante papel na evoluo do gnero, porm ainda mais
importante seria a variao qualitativa do DNA (GUPTA, 1976).
Posteriormente, Gupta e Gupta (1978a) estudando 27 espcies do gnero atravs de
medidas de cromossomos mitticos observaram uma variao de 15,2m a 33,6m no
comprimento total do lote haplide (CTLH), indicando uma considervel variao no contedo
total da cromatina.
Comparando estes cromossomos mitticos com cromossomos meiticos na fase de
paquteno (GUPTA; GUPTA, 1978a; 1978b) verificou-se que a maior parte das espcies tem
cromossomos metacntricos e submetacntricos, consequentemente caritipos simtricos.
Alm disso, os autores indicam que a seo Incanae seria derivada da seo Grandiflorae
pelo aumento no tamanho dos cromossomos menores em relao aos maiores acompanhado da
reduo do nmero cromossmico de 2n=16 para 2n=14. A partir desta observao, os autores
sugerem que caritipos assimtricos deram origem aos simtricos, resultado de uma derivao
secundria (GUPTA; GUPTA, 1978a; 1978b).
De maneira geral os autores concluem que se houveram algumas mudanas estruturais
importantes na evoluo dentro do gnero Crotalaria, estas no modificaram o caritipo de
maneira significativa. Assim, a derivao e a especiao do gnero so, provavelmente,
resultadas de mudanas em genes individuais ou complexos gnicos atravs de mutaes ou
recombinaes genticas (GUPTA; GUPTA, 1978a; 1978b). Estas concluses corroboram com a
idia de Gupta (1976), de que as variaes qualitativas teriam uma importncia maior quando
comparadas com as variaes quantitativas no contedo de DNA para explicar a evoluo o
gnero.
Raina e Verma (1979) estudando vinte espcies de Crotalaria observaram que o par de
cromossomos maior 1,5 vezes maior quando comparado ao menor par do complemento, e que a




18


constrio secundria aparece apenas neste primeiro par de cromossomos. A posio da
constrio secundria alterava entre as espcies e poderia ser organizada em trs tipos: com a
constrio secundria prxima ao centrmero, um pouco mais afastada do centrmero e por
ltimo, prxima a metade do brao cromossmico. Raina e Verma (1979) sugerem que estas
mudanas poderiam ser resultados de delees, translocaes desiguais ou inverses.
Alm disso, os autores sugerem para as espcies que possuem a constrio primria
separada por um pequeno segmento de cromatina da constrio secundria, que durante a
evoluo ocorreram perdas desta cromatina, posicionando as duas constries praticamente no
mesmo loco (RAINA; VERMA, 1979).
Ainda, os autores descrevem o gnero como tendo uma grande estabilidade dos
cromossomos, em relao morfologia, ao tamanho e simetria. Esta caracterstica seria um
indcio de que a especiao no estaria relacionada com a diferenciao cromossmica (RAINA;
VERMA, 1979).
Verma e Raina (1980) estudando a meiose das espcies do trabalho anterior verificaram a
formao natural de oito bivalentes. No entanto, algumas anormalidades foram descritas como a
formao de univalentes para a espcie C. lanceolata, ou ainda a formao de multivalente para
as espcies C. lanceolata e C. intermedia. Estas anormalidades poderiam ser conseqncias de
vrias alteraes cromossmicas estruturais.
Os autores tambm observaram a formao de pontes com ou sem fragmentos nas
espcies C. lanceolata e C. retusa, indicando para estas espcies, heterozigose para inverses
paracntricas (VERMA; RAINA, 1980). Mesmo assim, os autores concluem que a derivao e a
especiao do gnero na natureza, provavelmente ocorreram atravs de mutaes gnicas no
nvel diplide (VERMA; RAINA, 1980).
Verma, Kesavacharyulu e Raina (1984) deram continuidade ao estudo mittico realizado
por Raina e Verma (1979) e analisaram outras 19 espcies de Crotalaria. Os resultados foram
semelhantes ao anterior, como as trs posies da constrio secundria e a diferena de 1,5
vezes entre o maior e menor cromossomo (RAINA; VERMA, 1979; VERMA,;
KESAVACHARYULU; RAINA, 1984).
Os autores discutem sobre a origem do nmero x=7 para a seo Incanae, como derivada
da seo Macrostachyae, hiptese primeiramente apresentada por Atchinson (1950) ou derivado
da seo Grandiflorae, conforme proposto por Gupta e Gupta (1978a; 1978b) (VERMA;
KESAVACHARYULU; RAINA, 1984). Apesar de discutir as duas hipteses, os autores




19


concluem que a seo Grandiflorae apresenta uma maior similaridade com a seo Incanae,
apoiando a teoria proposta por Gupta e Gupta (1978a; 1978b) (VERMA,;
KESAVACHARYULU; RAINA, 1984).
Para algumas espcies, como C. ochroleuca, foi observado apenas um cromossomo
nucleolar, sendo considerado resultado de anfiplastia, ou seja, devido origem hbrida, o
organizador nucleolar mais fraco suprimido (VERMA; KESAVACHARYULU; RAINA,
1984). Porm, como j observado por Gupta (1976), cruzamentos interespecficos no gnero
Crotalaria so pouco provveis de ocorrer.
Em relao aos poliplides, observou-se uma tendncia na reduo do tamanho dos
cromossomos, principalmente quando se compara as espcies tetraplides com as espcies
diplides (VERMA; KESAVACHARYULU; RAINA, 1984). Esta diminuio seria atribuda
adaptao dos poliplides e a manuteno de um balano ncleo-citoplasma, prximo ao nvel
diplide. No entanto, estes dados no foram comparados com os trabalhos anteriores, por causa
das diferentes tcnicas de preparao das lminas e de pr-tratamentos com inibidores do fuso
mittico utilizados por cada autor, alm das influncias ambientais. Alm disso, os autores
sugerem que a poliploidia no apresenta um papel significante na especiao do gnero, devido
rara ocorrncia de poliplides em Crotalaria (VERMA; KESAVACHARYULU; RAINA, 1984),
o que no verdade, pois Windler (1974) demonstrou que a maioria das espcies endmicas do
continente Americano so tetraplides e predominantemente pertencem a seo Calycinae.
Corroborando com as anlises realizadas por Windler (1974), Palomino e Vzquez (1991)
em estudo sobre populaes mexicanas de espcies de Crotalaria observaram que a poliploidia
seria um mecanismo importante para a especiao das espcies americanas, uma vez que espcies
com 2n=32 foram descritas em pelo menos 20 espcies do novo mundo. No entanto, em espcies
asiticas e africanas, este evento no teria importncia, j que apenas uma espcie foi relatada
como poliplide (PALOMINO; VZQUEZ, 1991).
Os autores encontraram dois cittipos para C. incana e sugerem que estas variaes
cariotpicas possam ser resultadas de rearranjos estruturais, principalmente translocaes.
Variaes cariotpicas podem estar relacionadas ao processo de especiao, pois distintos
cittipos podem acarretar em alteraes morfolgicas de valor evolucionrio (PALOMINO;
VZQUEZ,1991).
Oliveira e Aguiar-Perecin (1999) estudando 11 espcies de Crotalaria, em preparaes
com um padro homogneo de condensao dos cromossomos, compararam e analisaram




20


morfometricamente os caritipos e mostraram a predominncia de cromossomos com centrmero
na posio mediana, regies organizadoras do nuclolo no primeiro par de cromossomos e um
decrscimo contnuo do tamanho dos mesmos, confirmando observaes anteriores.
Observaram tambm, que a seo Calycinae apresenta os maiores ndices de simetria
entre os caritipos, e na seo Crotalaria foi possvel a diferenciao das duas subsees,
Crotalaria e Longirostres, com base no tamanho dos cromossomos e no ndice de assimetria.
Estes dados sugerem um aumento do ndice de assimetria e diminuio do tamanho dos
cromossomos nas sees mais especializadas. Alm disso, Oliveira e Aguiar-Perecin (1999)
observaram a ocorrncia de uma maior similaridade entre caritipos de espcies relacionadas
dentro das respectivas sees e subsees botnicas.
Em C. incana foi observado que o comprimento do lote haplide semelhante ao das
espcies com 2n=16, apesar de ter um par de cromossomos a menos. Alm disso, uma outra
hiptese sobre a origem desta espcie foi lanada, a de que C. incana teria se originado a partir de
espcies da prpria seo Chrysocalycinae (OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN; 1999). Esta
hiptese contradiz as demais anteriormente citadas, porm mais coerente a ocorrncia de
acontecimentos dentro de uma mesma seo, ao invs de eventos que ocorram em um grupo,
resultando em uma espcie com semelhanas a um terceiro grupo.
As autoras comentam que aproximadamente 7% das espcies analisadas so poliplides,
principalmente entre as espcies americanas pertencentes seo Calycinae, sugerindo para este
evento uma origem recente, alm de um importante papel na diversificao do gnero nos centros
secundrios, concordado com a idia de Palomino e Vzquez (1991) (OLIVEIRA; AGUIAR-
PERECIN; 1999).
Assim como em estudos anteriores, Oliveira e Aguiar-Perecin (1999) observaram uma
reduo no tamanho dos cromossomos das espcies poliplides, em relao as diplides. Esta
reduo parece ser a condio necessria para sobrevivncia e estabelecimento dos poliplides na
natureza, atuando de maneira correta para a eliminao do excesso de material gentico,
corroborando com a idia de Verma, Kesavacharyulu e Raina (1984), primeiramente proposta.
A partir do estudo de Oliveira e Aguiar-Perecin (1999), Mondin (2003) utilizou tcnicas
de bandamento cromossmico e mapeamento fsico de rDNA 45S e 5S por hibridao molecular
in situ fluorescente (FISH), para estudar as mesmas espcies. O autor pode constatar que espcies
com maior grau de especializao floral possuem blocos heterocromticos pericentromricos
ricos em GC (CMA
+
-CMA/DA
-
), sintenia entre as posies dos genes ribossomais e uma




21


particular diferenciao entre as heterocromatinas pericentromricas daquelas adjacentes
constrio secundria quando corada com a combinao cromomicina A
3
/ distamicina. Enquanto,
C. incana, pertencente a uma seo com menor grau de especializao floral, no possui regies
heterocromticas pericentromricas ricas em GC; h uma perda de sintenia entre os genes
ribossomais, exceto para o rDNA 45S do cromossomo 1, o qual deve ter uma origem muito
antiga no gnero; e possui pequenas regies ricas em AT em posies intersticiais e terminais dos
cromossomos.
Mondin (2003) descreve que a alterao do tamanho dos cromossomos devida em parte
diminuio do tamanho dos blocos heterocromticos, observado entre as espcies de flores
especializadas e a eliminao de seqncias de DNA durante o processo evolutivo. Esta ltima
observao pode ser feita comparando-se espcies poliplides da seo Calycinae, que nunca
apresentavam o dobro de stios de rDNA 45S e 5S mapeado via FISH, com a provvel espcie
diplide ancestral. Desta forma o autor pde concluir que alguns locos de genes ribossomais
foram eliminados durante o processo e outros estavam diminuindo de tamanho com tendncia a
eliminaes dos mesmos, em um processo de diploidizao (reviso em WENDEL, 2000;
LEITCH; BENNETT, 2004).
Estes resultados, no entanto, apenas indicam que, provavelmente, as espcies de flores
no especializadas, teriam genomas parecidos com o de C. incana, uma vez que as espcies de
sees com flores especializadas apresentaram algumas regies cromossmicas bem conservadas
(MONDIN, 2003) e por espcies de uma mesma seo botnica compartilharem semelhanas de
caractersticas morfomtricas (OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999).
Outro estudo realizado com populaes mexicanas de C. incana mostrou, atravs de
prometfases, alguns cromossomos com as partes terminais no condensadas, semelhantes s
constries secundrias (TAPIA-PASTRANA, et al. 2005). Apesar das evidncias apontarem
para um novo cittipo, os autores preferiram no interpretar como tal, pois embora estas regies
se assemelhem as constries secundrias, elas no apresentavam RONs ativas, nem variaes do
nmero de nuclolos, podendo ser o resultado do menor grau de contrao da cromatina na fase
mittica analisada (TAPIA-PASTRANA, et al. 2005), embora Mondin (2003) tenha mapeado o
rDNA 45S em posies terminais de alguns cromossomos desta espcie.
Almada, Davia e Seijo (2006) analisando espcies de Crotalaria da Amrica do Sul
chegaram a importantes resultados. O primeiro foi a descrio pela primeira vez de uma espcie
octaplide, a C. tweediana, com 2n=8x=64 cromossomos, sendo o maior nvel de ploidia




22


detectado para o gnero. Outra observao em relao reduo do nmero cromossmico de
x=8 para x=7, onde os autores apiam a hiptese de uma reduo no nmero cromossmico, sem
perda significante de material gentico. Esta afirmao foi sustentada observando que a mdia do
comprimento cromossmico de C. incana era similar ou mesmo superior aos das espcies com
x=8 (ALMADA; DAVIA; SEIJO, 2006).
Os autores tambm relatam que 11% das espcies so poliplides, 3% a mais que a
reviso realizada por Oliveira e Aguiar-Perecin (1999). Devido a isso, os autores inferem que a
poliploidia deve ser considerada, como um importante evento na evoluo do gnero,
principalmente das espcies americanas da seo Calycinae. A descrio de uma espcie
octaplide, confirmou a importncia dos poliplides na evoluo do gnero (ALMADA;
DAVIA; SEIJO, 2006).
Ao contrrio do que a maioria dos autores sugere os resultados apresentados por Almada,
Davia e Seijo (2006) mostraram a no uniformidade dos caritipos, podendo esta variabilidade
ser observada atravs do nmero bsico cromossmico, pelo nvel de ploidia e posio da
constrio secundria. Alm disso, os resultados deste trabalho mostram sees ancestrais
possuindo caritipos mais assimtricos que as sees derivadas, contrariando estudos anteriores,
que consideravam as sees mais especializadas como aquelas de caritipo mais assimtrico
(OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999), entretanto, o rigor dos pr-tratamentos e da seleo
das metfases deve ser levado em considerao nestes casos.
Simultaneamente, foi realizada uma anlise do tamanho do plen, do comprimento das
clulas guardas estomacais e do peso de sementes, relacionando com o nvel de ploidia das
espcies. O tamanho do plen foi maior em tetraplides do que em diplides; o tamanho das
clulas guardas aumentou dos diplides para tetraplides e diminuiu na espcie octaplide e
nenhuma relao foi encontrada entre o peso da semente e o nvel de ploidia. Estes resultados
indicam que a massa de DNA afeta o tamanho celular (ALMADA; DAVIA; SEIJO, 2006).
No mesmo ano, foi publicado um trabalho descrevendo o nmero de cromossomos de
espcies brasileiras de Crotalaria, demonstrando a tendncia para a ocorrncia de espcies
poliplides na Amrica, confirmando trabalhos anteriores (FLORES, et al., 2006). As autoras
enfatizam a importncia da poliploidia em espcies do Novo Mundo e acrescentam que o Novo
Mundo foi ltima rea a ser colonizada pelas espcies da seo Calycinae, acompanhadas de
um aumento na ploidia (FLORES, et al., 2006).




23


O principal relato deste estudo foi de um novo nmero cromossmico para C. tweediana
com 2n=54. As autoras sugerem duas interpretaes: a primeira que este nmero possa ser
conseqncia de aneuploidia com 7x-2, onde x=8, porm espcies com nveis de ploidia mpar
apresentam problemas de fertilidade ou se reproduzem sexuadamente. A segunda, e a mais
plausvel para as autoras, que este nmero seria um hexaplide de x=9, relatando um novo
nmero bsico para o gnero (FLORES, et al., 2006). Entretanto, esta mesma espcie foi descrita
com 2n=8x=64 cromossomos, por Almada, Davia e Seijo (2006), em uma populao da
Argentina, o que indica que o novo nmero encontrado seja um derivado restrito a uma
determinada populao. Para se entender melhor este fenmeno, outras populaes de C.
tweediana coletadas no Brasil esto sendo estudadas no departamento de Gentica da
ESALQ/USP.
Exceto pelo estudo realizado por Mondin (2003), a maioria dos trabalhos realizados no
gnero esto limitados contagem do nmero cromossmico, sem o emprego de tcnicas mais
avanadas. No entanto Mondin, Santos-Serejo e Aguiar-Perecin (2007) realizaram uma
caracterizao mais minuciosa de C. juncea atravs de tcnicas mais avanadas. Utilizando
tcnicas de bandamentos fluorescentes, colorao com prata e hibridao molecular in situ das
sondas de rDNA 45S e 5S demonstraram que a contrio secundria est presente apenas no par
1, confirmando estudos anteriores, porm observaram um stio de rDNA 45S adicional localizado
no brao longo do cromossomo 4. Este stio menor aparece em algumas metfases impregnado
com prata, indicando uma possvel atividade nucleolar em algumas clulas, ou em estgios
iniciais do ciclo celular (MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007).
Apenas um loci foi observado para rDNA 5S, posicionado na regio proximal do brao
longo do cromossomo 1. A colorao com fluorocromos revelou que os rDNAs so CMA
+
e
CMA/DA
+
, enquanto as heterocromatinas pericentromricas so CMA
+
e CMA/DA
-
o que sugere
diferenciao no contedo de GC ou nos resduos de AT. Estes padres no so observados em
C. incana (seo Chrysocalycinae; subseo Incanae) com flores no especializadas (MONDIN;
SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007).
Estes resultados indicam que, apesar das espcies do gnero Crotalaria possurem
caritipos morfologicamente semelhantes entre si, as diferenas encontradas entre os marcadores
cromossmicos das sees botnicas com espcies especializadas e das sees botnicas com
espcies sem especializao floral indicam uma provvel diferenciao na organizao
cromossmica entre tais grupos.




24



2.3 Os genes ribossomais e as regies organizadoras do nuclolo (RO) como marcadores
para estudo da evoluo cariotpica

Os genes ribossomais 18S-5.8S-26S e 5S formam uma famlia gnica moderadamente
repetitiva que apresenta posies relativamente conservadas nos cromossomos, o que torna estas
regies importantes marcadores para o estudo da evoluo dos cromossomos e dos processos
envolvidos nas suas alteraes. Alm disso, o arranjo dos genes 18S-5.8S-26S, abreviado rDNA
45S, o responsvel pela organizao do nuclolo (reviso em PIKAARD, 1999, 2000).
Entretanto, estes genes que formam longos arranjos em tandem em uma determinada regio
cromossmica, podem ocupar diferentes locos no genoma, e no necessariamente serem todos
expressos. Uma expresso citolgica clara de que um destes arranjos foi ativo durante a interfase
organizando o nuclolo, a presena de constries secundrias nos cromossomos (ver
NAVASHIN, 1927; MCCLINTOCK, 1934), embora recentemente tenha sido demonstrado a
ocorrncia de expresso de genes ribossomais, sem que houvesse necessariamente a formao de
uma constrio secundria (MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007).
O conhecimento da relao entre a expresso destes genes com estruturas nucleares e
cromossmicas, permitiu em primeira instncia o estudo das dominncias nucleolares
(NAVASHIN, 1927), que at hoje continua sendo um modelo para o estudo do controle da
expresso gnica e dos mecanismos epigenticos envolvidos neste controle (PIKAARD, 1999 e
2000; LAWRENCE et al., 2004).
Os estudos de Navashin (1927) no incio do sculo passado, utilizando hbridos
interespecficos e alopoliplides, foi o passo inicial para a utilizao das regies organizadoras do
nuclolo (constries secundrias) como marcadores no estudo da evoluo dos caritipos. O uso
das regies organizadoras do nuclolo (RON) como marcadores cromossmicos, implica
necessariamente na expresso destas regies na interfase anterior e a formao de constrio
secundria na metfase. Portanto, podemos dizer que os estudos citolgicos atravs de colorao
convencional utilizando-se RON como marcadores cromossmicos, um estudo de regies ativas
do genoma (reviso em SWANSON, 1981; STEBBINS, 1971; SYBENGA, 1992; SINGH,
2002). Exemplos destes estudos, para o entendimento da evoluo cariotpica de plantas, podem
ser dados para o gnero Capsicum (BERTO, 1993), Stylosanthes (VIEIRA; AGUIAR-
PERECIN; MARTINS, 1993), Crotalaria (OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999), Tulbaghia




25


(VOSA, 2000) e Eriospermum (VOSA; PERRY, 1999), Mikania (RUAS; AGUIAR-PERECIN,
1997). Ressalta-se, no entanto, que estes exemplos so apenas de casos mais prximos, uma vez
que a lista de gneros estudados por este mtodo extensa.
Durante os anos de 1970 e 1980 com o desenvolvimento e o aperfeioamento da
hibridao molecular in situ, a utilizao do rDNA 45S tornou-se dissiminada por duas razes
principais: os arranjos completos de milho e trigo (reviso em FLAVELL, 1989, MASCIA et al.,
1981) j haviam sido isolados e clonados e a verificao de que estes genes eram altamente
conservados entre as espcies de plantas, de modo que novos isolamentos no eram necessrios e
os experimentos de hibridao in situ cruzada eram reproduzveis, conservados e refletiam
exatamente os locos com arranjos de genes ribossomais (HESLOP-HARRISON, 2000). Do
mesmo modo o isolamento e o sequenciamento do rDNA 5S de trigo (GERLACH; DYER,
1980), tabaco (VENKATESWARLU; LEE; NAZAR, 1991) e soja (GOTTLOB-MCHUGH et al.,
1990) permitiram o uso deste gene ribossomal como marcador, desde que a sequncia
espaadoras (entre 350-550pb) fosse eliminada por ser altamente polimrfica e utiliza-se apenas
o arranjo do gene (~140pb) que altamente conservado e permite a hibridao in situ cruzada,
ainda que em experimentos com alta estringncia.
Alternativamente neste perodo, quando no era possvel a utilizao da hibridao
molecular in situ, a utilizao da metodologia de precipitao de nitrato de prata, desenvolvido
por Howell e Black (1980), era a forma mais eficiente e barata de se localizar stios de rDNA 45S
ativos, mesmo que estes no formassem constries secundrias.
Utilizando esta metodologia de precipitao de prata, Schubert (1984) props que
possivelmente o rDNA 45S tinha algum tipo de mobilidade, tal como os elementos de
transposio. Entretanto, seus resultados com nitrato de prata no eram conclusivos, pois de
forma alguma era provado a presena de rDNA 45S nestas novas posies aps o evento de
transposio, j que o nitrato de prata apresenta especificidade a outras protenas e no somente
s nucleolares. Posteriormente, Schubert e Wobus (1985) atravs da hibridao molecular in situ
com o rDNA 45S, comprovaram a presena desta seqncia nas posies previamente
identificadas como ativas pelo nitrato de prata e comprovaram que este arranjo tinha alguma
capacidade de mudar de posio no genoma.
Recentemente, Raskina, Belyayev e Nevo (2004a, 2004b) demostraram que tanto o rDNA
45S, quanto o rDNA 5S podem estar associados com elementos de transposio do tipo En/Spm.
Os autores demonstraram atravs de hibridao molecular in situ fluorescente (FISH) que os




26


elementos de transposio quando ativos carregam fragmentos dos rDNAs, que no novo stio de
insero se amplificam e do origem a um novo loco. Um outro grande feito destes trabalhos foi
demonstrar pela primeira vez que este mecanismo poderia gerar uma nova espcie. O estudo de
duas espcies de Aegilops em duas populaes a menos de 30 metros de distncia, que no se
misturavam e que ocupavam tipos de solos bem distintos, demonstrou que a espcie Aegilops
speltoides era altamente instvel com relao posio dos rDNA 45S e 5S, e que esta
instabilidade por inmeras vezes reproduzia fielmente as posies dos rDNA 45S e 5S de
Aegilops sharonensis. Os autores ainda detectaram que estas alteraes dos rDNAs produziam
variantes morfolgicas de A. speltoides que eram idnticas as de A . sharonensis. Foi proposto
ento, que durante o perodo quaternrio, quando aquela regio sofreu as maiores alteraes
geolgicas, o tipo de solo surgido favoreceu a fixao dos locos rDNA 45S e 5S do tipo de Ae.
sharonensis e deram origem a uma nova espcie.
Desde os trabalhos de Navashin com dominncia nucleolar, acreditava-se que tambm
nos poliplides o rDNA apresentava uma dinmica de reorganizao, que posteriormente foi
demonstrada como sendo o resultado de transposio, deleo e eliminao de loci e tambm do
controle epigentico (reviso em Wendel, 2000).
Em hbridos somticos de Passiflora, Cuco et al. (2005) descreveram que um dos hbridos
apresentava nmero de lcos de rDNA 45S maior que o esperado. Aps uma anlise detalhada
das posies do rDNA 45S das espcies parentais, os autores puderam concluir que um loco
menor na extremidade de um dos cromossomos, tratava-se de um novo loco resultado de um
evento de transposio. Por outro lado, Mondin (2003) estudando poliplides do gnero
Crotalaria, atravs de FISH dos rDNA 45S e 5S, observou que um dos poliplides possua
nmero idntico de lcos de rDNA ao da espcie diplide (provvel ancestral) e que uma outra
espcie apresentava um nmero intermedirio entre o que seria esperado e o da espcie diplide.
Neste caso o autor pode inferir que durante a evoluo das espcies poliplides, estas sequncias
de rDNA foram eliminadas, ao ponto de uma delas restaurar o estado diplide com relao ao
nmero de locos de genes ribossomais. Fenmeno semelhante havia sido descrito previamente no
gnero Scilla durante a evoluo dos poliplides (VAUGHAN, et al., 1993).
No estudo da evoluo cariotpica de espcies diplides, a deteco da ocorrncia de uma
alterao cromossmica de uma espcie em relao outra, somente era possvel atravs de um
cruzamento interespecfico e a observao do pareamento cromossmico durante a meiose
(STEBBINS, 1971). Este tipo de procedimento limitava muito as inferncias sobre os




27


mecanismos envolvidos na evoluo cromossmica, principalmente de espcies distantes. A
hibridao molecular in situ fluorescente dos rDNA 45S e 5S mostrou ser uma das mais
promissoras ferramentas no entendimento da evoluo cariotpica e elucidou estas questes em
um grande nmero de gneros (reviso em HESLOP-HARRISON, 2000).
Um caso tpico o do gnero Hypochaeris (Asteraceae), que tem origem europia
(caritipos simtricos modais) e um centro de diversidade na Amrica do Sul (caritipos
assimtricos bimodais) (STEBBINS, 1971). Embora houvesse suspeitas sobre o envolvimento de
alteraes cromossmicas no processo de especiao, estas nunca haviam sido demonstradas.
Ruas et al. (2005) atravs de uma anlise filogentica com marcadores de RAPD, pode agrupar
espcies de caritipos semelhantes dentro do mesmo clado. A hibridao in situ (FISH) com os
genes ribossomais demonstrou que a maior diferena entre os clados era devido a inverses
cromossmicas nos cromossomos que continham os locos ribossomais. Ressalta-se que neste
caso os genes ribossomais no esto envolvidos diretamente nas alteraes, mas serviram apenas
como marcadores para localizar os pontos de quebra.
Outro caso elucidativo quanto aos mecanismos de evoluo cromossmica ocorreu no
gnero Phaseolus. Moscone et al. (1999) estudando trs espcies de Phaseolus e duas cultivares
europias, atravs de FISH de rDNA 45S e 5S, props que o gnero evoluiu atravs de
duplicaes dos locos ribossomais e de inverses nas posies destes locos. Entretanto, Pedrosa-
Harand et al. (2006) estudando feijes Andinos e Mesoamericanos, com a mesma tcnica, sugeriu
que as variaes no nmero de locos e o maior evento de amplificao dos genes ribossomais
ocorreram na linhagem Andina aps sua separao da linhagem Mesoamericana.
Em gneros com filogenia e botnica sistemtica bem estabelecidas, tal como o gnero
Crotalaria, j descrito anteriormente, os padres de distribuio dos locos de rDNA 45S e 5S so
bem conservados e a sintenia destes locos permitem inferir sobre os eventos que ocorreram
durante a evoluo. o caso dos gneros Vicia (RAINA et al., 2001; NAVRTILOV;
NEUMANN; MACAS, 2003) e Lathyrus (ALI; MEISTER; SCHUBERT, 2000) onde as espcies
esto agrupadas em sees e subsees botnicas de acordo com os estudos morfolgicos e de
filogenia molecular; e a posio dos locos de rDNA e suas alteraes acompanham estes
agrupamentos.
Portanto, o mapeamento fsico, atravs de FISH de DNAs ribossmicos 45S e 5S como
marcadores cromossmicos, uma ferramenta importante para a compreenso da evoluo dos




28


genomas e poder contribuir significantemente para o entendimento das relaes entre as
espcies e a evoluo no gnero Crotalaria.


































29


3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Materiais

As espcies estudadas no presente trabalho esto descritas na tabela1. Todas as espcies
pertencem seo Hedriocarpae, subseo Macrostachyae, sendo utilizados os acessos
pertencentes ao banco de sementes do Departamento de Gentica - ESALQ/USP. Estas espcies
estavam classificadas de acordo com a tabela 1, conforme as amostras de sementes recebidas dos
locais de origem, as exicatas foram confeccionadas e reclassificadas pela Dra. Andria Silva
Flores por comparao com o material depositado no herbrio do Departamento de Botnica do
Instituto de Biologia da UNICAMP e a classificao foi correspondente quela feita por Lewis
(1987) com exicatas depositadas no Herbrio Alexandre Leal Costa Bahia (ALCB) do
Departamento de Botnica do Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia.
Crotalaria pallida, C. mucronata e C. striata foram primeiramente identificadas como
espcies diferentes, porm a partir de estudos mais detalhados, constatou-se que C. striata e C.
mucronata so espcies sinonmias de C. pallida. Portanto, neste trabalho, onde se l C. striata e
C. mucronata denota diferentes populaes de C. pallida.
Todas as espcies so encontradas em beiras de estradas e terrenos baldios (FLORES,
2004), sendo de origem Africana. No Brasil, so conhecidas pelos nomes populares de chocalho,
xique-xique, guizo-de-cascavel, e so encontradas em todas as suas regies, exceto C. ochroleuca
que ocorre apenas nos estados de So Paulo e Paran (FLORES, 2004).

Tabela 1 Espcies de Crotalaria da seo Hedriocarpae, subseo Macrosthachyae utilizadas nas anlises
citolgicas
Espcies Local de Coleta Local de Origem Cdigo ESALQ
C. lanceolata Santa Rita So Paulo BR 116
(Km 114)
Instituto de Zootecnia de Nova
Odessa SP
CL-3
C. ochroleuca Indeterminado Piracicaba, ESALQ SP COC-1
C. pallida Rio Bonito RJ Instituto de Zootecnia de Nova
Odessa SP
CPA-1
C. mucronata* Indeterminado Piracicaba, ESALQ SP CM-1
C. striata* Indeterminado Piracicaba, ESALQ SP CSR-1
* espcies sinonmias de C. pallida.




30


3.2 Mtodos
3.2.1 Germinao

As sementes foram escarificadas quimicamente com cido sulfrico puro, para
germinarem, seguindo as etapas abaixo:
As sementes foram colocadas em cido sulfrico puro durante 15 minutos. Terminado
este tempo, o cido foi lavado cuidadosamente em gua corrente, at que toda substncia fosse
eliminada. As sementes lavadas foram secas em papel de filtro por 12 horas, e aps este perodo
de secagem, as sementes foram embebidas em placa de Petri contendo papel de filtro umedecido,
at o inchao das sementes. Aps esta embebio as sementes foram semeadas em Sphagnum
umedecido sob temperatura controlada de 28 a 30C.
Depois de aproximadamente 18 horas, as razes alcanaram o tamanho entre 1 e 3 cm,
adequado para coleta e realizao do pr-tratamento.

3.2.2 Pr-tratamento de razes com inibidores do fuso mittico

Os materiais coletados foram pr-tratados com uma soluo hidroxiquinolina a 300 ppm
+ cicloheximida a 6,25 ppm por 1 hora e 30 minutos, conforme metodologia realizada por Cuco
et al. (2003). Este pr-tratamento permite a obteno de cromossomos em prometfase e metfase
com nitidez de sua morfologia.
As razes pr-tratadas foram fixadas por 24 horas em soluo de Carnoy (3 partes de
lcool etlico e 1 parte de cido actico). As razes destinadas colorao convencional pelo
mtodo de Feulgen, foram transferidas para uma soluo de lcool a 70%, aps a fixao; as
destinadas a colorao com fluorocromos e hibridao molecular in situ (FISH) foram
conservadas no fixador. Ambos os materiais foram conservados em congelador a -4C
(MONDIN; DOCHA NETO, 2006).

3.2.3 Mtodos de preparaes de lminas

As razes fixadas foram retiradas do congelador e ao atingirem a temperatura ambiente
foram lavadas rapidamente em tampo citrato (citrato trissdico mais cido ctrico, 0,01M, pH
4,6) e a seguir colocadas em microtubos contendo soluo enzimtica de celulase a 2%




31


(concentrao final: 9.2 units mL
-1
) mais pectinase a 0,3% (concentrao final: 14,7 units mL
-1
),
pr-aquecidas a 37 C e mantidas a esta temperatura, por 40 minutos. Em seguida, as pontas de
razes foram transferidas para uma placa de Petri contendo tampo citrato frio, mantida sobre um
bloco de gelo. Cada raiz utilizada para uma preparao foi colocada em uma soluo de cido
actico a 60% por um tempo varivel de 3 a 5 minutos. Aps este perodo a raiz foi retirada com
pipeta Pasteur e colocada sobre a lmina, sendo sua ponta esmagada cuidadosamente com uma
pina fina. O material foi coberto com lamnula, esmagado entre papel filtro para remover o
excesso de cido actico e permitir o espalhamento dos cromossomos. Aps este procedimento,
observou a lmina em microscpio de contraste de fase e as melhores lminas foram selecionadas
e tiveram suas lamnulas removidas em nitrognio liquido e secas ao ar.
As lminas secas foram conservadas em cubas altas com slica gel para evitar hidratao
e mantidas a -20C.

3.2.4 Colorao pelo mtodo de Feulgen

As razes conservadas em lcool a 70% foram retiradas do congelador para atingirem
temperatura ambiente. Posteriormente, foram lavadas por duas vezes em gua destilada por 5
minutos, e ento hidrolisadas em uma soluo pr-aquecida de cido clordrico 1N por 8 minutos
a 60 C. As razes hidrolisadas foram novamente lavadas por duas vezes em gua destilada por 5
minutos. Posteriormente, em uma cmara escura, foi realizada a reao com reativo de Schiff, por
45 minutos e a seguir as razes foram lavadas em gua corrente em placas de Petri.
As melhores lminas foram montadas permanentes com blsamo do Canad.

3.2.5 Colorao com fluorocromos

A colorao com fluorocromos adotou a metodologia descrita por Friebe et al. (1996) com
algumas modificaes.

3.2.5.1 Colorao com DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol)

Aps secagem das lminas mantidas em freezer, sobre a lmina foram aplicados 25 l
de uma soluo de DAPI diluda em tampo de McIlvaine (pH 7,0) na concentrao de 0,2




32


g/ml, coberta com lamnula de parafilme e mantida no escuro para colorao durante 30
minutos.
Posteriormente, a lamnula foi removida e a lmina rapidamente lavada em gua
deionizada, e colocada para secagem ao ar. A seguir, a lmina foi montada com 5 l de
vectashield H-1000. As lminas foram guardadas no escuro na geladeira de 10
o
C a 20
o
C, para
estabilizao dos corantes, antes de serem observadas.

3.2.5.2 Colorao com DAPI/AMD (4-6-diamidino-2-fenilindol/Actinomicina D)

As lminas foram retiradas do freezer a -20
o
C e deixadas para atingirem a temperatura
ambiente. A seguir foram aplicados 25 l de uma soluo de DAPI diluda em tampo de
McIlvaine (pH 7,0) na concentrao de 0,2 g/ml, sendo coberta com lamnula de parafilme e
mantida no escuro para colorao durante 30 minutos. Aps tal perodo, a lamnula foi retirada e
a lmina lavada rapidamente em gua deionizada, e seca ao ar. Na lmina seca foram aplicados
25 l de uma soluo de actinomicina D (AMD) diluda em tampo fosfato (pH 7,0) contendo 1
mM de EDTA, na concentrao de 0,2 mg/ml, sendo coberta com lamnula de parafilme e
mantida no escuro durante 20 minutos. Novamente, foi retirada a lamnula e a lmina foi lavada
em gua deionizada e colocada para secar ao ar no escuro. A lmina seca foi montada com 5 l
de vectashield H-1000. Antes de serem observadas, as lminas foram guardadas no escuro em
temperatura ambiente para estabilizao dos corantes.

3.2.5.3 Colorao com CMA (Cromomicina A
3
)

Aps secagem das lminas foram aplicados 25 l de uma soluo de CMA diluda em
tampo de McIlvaine (pH 7,0) contendo MgCl
2
5 mM, na concentrao de 0,5 g/ml, sendo
coberta com lamnula de parafilme e mantida no escuro durante 2 horas. A seguir a lamnula foi
removida e a lmina lavada rapidamente em gua deionizada, e colocada para secar ao ar no
escuro. A lmina seca foi montada com 5 l de vectashield H-1000. Antes de serem observadas
as lminas foram deixadas no escuro em temperatura ambiente para estabilizao dos corantes.







33


3.2.5.4 Colorao com CMA/DA (Cromomicina A
3
/Distamicina)

Posterior a secagem das lminas foram aplicados 25 l de uma soluo de CMA diluda
em tampo de McIlvaine (pH 7,0) contendo MgCl
2
5 mM, na concentrao de 0,5 g/ml, que foi
coberta com lamnula de parafilme e mantida no escuro durante 2 horas. A seguir a lamnula foi
retirada e a lmina lavada rapidamente em gua deionizada, e colocada para secar ao ar no
escuro. Depois de seca na lmina foram aplicados 25 l de uma soluo de DA diluda em
tampo de McIlvaine (pH 7,0) na concentrao de 0,2 mg/ml, coberta ento com lamnula de
parafilme e mantida no escuro por 10 minutos. Novamente, a lamnula foi retirada e a lmina foi
lavada em gua deionizada e posta para secar ao ar. A lmina seca foi montada com 5 l de
vectashield H-1000. Antes de serem observadas as lminas foram deixadas no escuro em
temperatura ambiente para estabilizao dos corantes.

3.2.6 Hibridao molecular in situ fluorescente (FISH)
3.2.6.1 Sondas

Foram utilizadas como sondas a seqncia de rDNA 18S-5.8S-25S (unidade de 9,1 kb,
que ser mencionada como rDNA 45S) de milho, clonada no plasmdeo pUC8 no stio Eco RI,
cordialmente cedida pelo Dr. R. L. Phillips (University of Minesota, EUA) e o produto da reao
de PCR que amplificou fragmentos do gene e espaadores do rDNA de 5S de Crotalaria
(MONDIN, 2003).

3.2.6.2 Extrao do DA genmico total de espcies de Crotalaria

A extrao de DNA genmico total foi realizada utilizando-se a espcie C. striata
pertencente seo Hedriocarpae. A extrao seguiu o protocolo descrito pelo fabricante, para
isolamento de DNA de plantas do KIT DNEASY (Qiagen).
As amostras de DNA resultantes da extrao foram utilizadas para amplificao do
rDNA de 5S a partir de uma reao de PCR, sendo o produto utilizado como sondas para o
mapeamento fsico deste lco nos cromossomos atravs de FISH.






34


3.2.6.3 Amplificao do gene de RA ribossmico 5S

Os primers indicados abaixo (sintetizados pela life Technologies) foram utilizados para
amplificar a seqncia de rDNA de 5S, atravs de uma reao de PCR, empregando como molde
o DNA genmico de C. striata:
RDNA1 (forward) 5 GTG CGA TCA CAG C(AG)(CT) TAA TGC ACC GG 3
RDNA2 (reverse) 5 GAG GAG CAA CAC GAG GAC TTC CAA GGA GG 3
Na reao de PCR foram utilizados 10ng de DNA genmico de C. striata, 200mM de
dNTPs, 300 nM de cada primer, 1,5 mM de MgCl
2
e 2,5 U de Taq polimerase. A reao de PCR
seguiu os seguintes passos: incubao a 93 C por 5 min seguida por 30 ciclos de 94 C por 50
seg, 57 C por 50 seg e 72 C por 1 min. Aps completado os 30 ciclos, a reao foi deixada por
mais 10 min a 72 C. O produto obtido foi purificado utilizando-se o kit QIAquick PCR
Purification (QIAGEN), seguindo o protocolo descrito pelo fabricante.
Os produtos de amplificao foram submetidos eletroforese em gel de agarose a 0,8%,
para a confirmao e quantificao dos fragmentos amplificados.

3.2.6.4 Marcao das sondas e hibridao molecular in situ fluorescente das sondas de DA
ribossomais 45S e 5S

Foram realizados dois experimentos de hibridao in situ utilizando como sondas o
rDNA 45S e 5S (duplo-FISH). Um dos experimentos utilizou a sonda 45S marcada com biotina,
e a sonda 5S marcada com digoxigenina; o outro experimento utilizou a sonda 45S marcada com
digoxigenina e a 5S marcada com biotina. Este tipo de experimento invertido foi realizado para
verificar se h uma diferena na hibridao das sondas em relao aos diferentes tipos de
marcadores.
As seqncias de DNA utilizadas como sondas foram marcadas com biotina via nick
translation e digoxigenina via random primer, respectivamente, seguindo protocolos fornecidos
pelos fabricantes. As preparaes cromossmicas foram preparadas para hibridao com as
sondas marcadas, atravs de lavagem com RNase (5g/l) e pepsina (5g/l), para remoo do
RNA e do excesso de protenas, respectivamente. As preparaes cromossmicas foram ento
fixadas em paraformaldedo a 4% e desidratadas em uma srie alcolica (70%, 96% e 100%). A
mistura de hibridao foi constituda de 50% formamida, 2xSSC, 10% dextran sulfato, 0,1%




35


SDS, 1 mg/ml de herring sperm DNA e de 8 e 10 ng/ml de DNA das sondas de rDNA de 45S e
5S, respectivamente para duplo-FISH. As sondas foram desnaturadas a 95-98
o
C, por 10 min e
mediatamente incubadas em gelo. Adicionou-se 20 l da mistura de hibridao s preparaes
cromossmicas. A mistura de hibridao desnaturada e o DNA cromossmico foram aquecidos
conjuntamente a 83
o
C por 9 min; aps tal perodo a temperatura foi gradualmente decrescida at
37
o
C utilizando-se um termociclador (PTC-100, MJ). A hibridao foi realizada a 37
o
C por 16 hs,
seguida por lavagens em 2xSSC a 42
o
C por 5 minutos; duas lavagens com formamida a
20%/0.5x SSC a 42
o
C (74% de estringncia) por 5 minutos; 0,5xSSC 42
o
C por 5 minutos. No
primeiro experimento, a sonda de rDNA de 45S marcada com biotina foi detectada com o
anticorpo mouse anti-biotin seguido dos anticorpos rabbit anti-mouseTRITC e a sonda de
rDNA 5S marcada com digoxigenina foi detectada com sheep anti-dig-FITC. J no
experimento posterior, a sonda de rDNA de 45S marcada com digoxigenina foi detectada com o
anticorpo sheep anti-dig-rhodamine e a sonda de rDNA 5S marcada com biotina foi detectada
com mouse anti-biotin seguido dos anticorpos rabbit anti mouse-FITC. As preparaes foram
contra-coradas com DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) a 4 g/ml e montadas em 5 l de
vectashield H-1000.

3.2.7 Microscopia e anlise de imagens

As metfases coradas pelo mtodo de Feulgen, foram capturadas no fotomicroscpio
Zeiss ao qual est acoplado uma cmara CCD, que permitiu a digitalizao das imagens, atravs
do programa IKAROS (Metasystem). As preparaes fluorescentes foram observadas em
fotomicrocpio de epifluorecncia Zeiss, igualmente acoplado a uma cmara CCD, permitindo
atravs do programa ISIS (Metasystem), a digitalizao das imagens.
Tanto as imagens digitalizadas de Feulgen, quanto as imagens digitalizadas das
preparaes fluorescentes foram processadas no programa Adobe PhotoShop verso 6.0, para a
confeco das pranchas.

3.2.8 Medidas dos cromossomos

As medidas cromossmicas foram realizadas nas cpias impressas de oito metfases com
semelhante grau de condensao utilizando-se um compasso de ponta seca e papel milimetrado.




36


Cada figura das metfases continha uma barra cuja escala correspondia a 10m. Esta barra foi
necessria para a converso da escala de centmetro (cm) para micrmetro (m). Foram medidos
o brao curto e o brao longo de cada cromossomo, obtendo-se pela soma de ambos, o
comprimento absoluto dos cromossomos.
As mdias dos valores obtidos para o brao curto, brao longo e comprimento absoluto
dos cromossomos para cada espcie foram utilizados para calcular os seguintes itens:
- Intervalo (m): corresponde aos valores do maior e menor cromossomo;
- Comprimento total do lote haplide CTLH (m): somatria do comprimento dos
cromossomos do lote haplide (somatrio dos comprimentos dos cromossomos/2);
- Comprimento relativo (CR%): comprimento absoluto do cromossomo/comprimento do
total do lote haplide multiplicado por 100;
- Relao de braos: comprimento do brao longo/comprimento do brao curto;
- Tamanho dos braos: mdia dos braos de cada par cromossmico.
Alm disso, foi calculado o desvio padro para cada item mencionado.






















37


4 RESULTADOS

Todas as espcies estudadas apresentaram 2n=16 cromossomos. No houve grandes
diferenas entre as medidas cromossmicas das espcies, sendo que Crotalaria mucronata
apresentou o menor valor do lote haplide, 20,00m (1,37m) e Crotalaria lanceolata o maior
valor, 22,91m (2,29m).
Os tamanhos dos cromossomos tambm no diferiram significantemente entre as espcies,
sendo o menor cromossomo encontrado em C. mucronata, 1,86m (0,20m) e o maior
encontrado em C. pallida, 3,97m (0,35m). Estes valores podem ser visualizados na Tabela 2.

Tabela 2 Caractersticas gerais do caritipo: nmero cromossmico, intervalo entre maior e menor cromossomo do
complemento dos cromossomos metafsicos das espcies de Crotalaria e comprimento total do lote
haplide (CTLH)

Espcies 2n Intervalo (m) CTLH (m)
C. lanceolata 16 3,62 0,46 2,06 0,20 22,91 2,29
C. ochroleuca 16 3,47 0,45 2,07 0,33 22,31 3,10
C. pallida 16 3,97 0,35 1,98 0,23 22,48 2,43
C. mucronata 16 3,33 0,27 1,86 0,20 20,00 1,37
C. striata 16 3,43 0,24 1,87 0,16 20.89 0,89

Os dados sobre comprimento relativo e relao de braos dos pares cromossmicos esto
apresentados na Tabela 3. Atravs de observaes visuais nota-se que as espcies apresentaram
caritipos simtricos com cromossomos metacntricos e submetacntricos (Figuras 1 e 8). A
maioria dos valores da relao de braos so inferiores a 1,7, indicando que a maioria dos
cromossomos so metacntricos. Apenas C. pallida apresentou dois cromossomos com valores de
1,71 e 1,95, caracterizando cromossomos submetacntricos.
Os comprimentos relativos dos pares cromossmicos foram parecidos entre as espcies
estudadas, diferindo apenas para o cromossomo 1, onde ocorreu uma variao considervel entre
o maior valor, 17,34%, para C. pallida e o menor valor de 14,32%, para C. lanceolata (Tabela 3).
O apndice A apresenta os resultados do comprimento relativo (%) e tamanhos (m) dos
braos curto e longo dos pares cromossmicos nas espcies de Crotalaria.
Igualmente aos estudos anteriores, realizados por Oliveira e Aguiar-Perecin (1999) e
Mondin (2003) as espcies apresentaram apenas uma constrio secundria, localizada no brao
curto do cromossomo 1 (Figura 1 e 8).




38



Tabela 3 Anlise morfomtrica dos caritipos: comprimento relativo (%) e relao de braos dos pares
cromossmicos nas espcies de Crotalaria

Cromossomos Espcies
1 2 3 4 5 6 7 8
Comprimento relativo
C. lanceolata 14,32
1,82
14,60
0,88
13,75
0,75
12,83
0,49
11,99
0,49
11,42
0,50
10,75
0,32
9,12
0,87
C. ochroleuca 15,42
0,28
14,26
0,14
13,93
0,27
13,43
0,36
12,66
0,46
10,83
0,34
9,99
0,36
9,25
0,50
C. pallida 17,34
0,69
14,62
0,26
13,81
0,78
12,56
0,46
11,81
0,60
11,32
0,33
10,36
0,58
8,93
0,26
C. mucronata 16,66
0,67
14,53
0,52
13,59
0,49
12,39
0,24
11,73
0,31
11,19
0,40
10,67
0,26
9,31
0,80
C. striata 16,43
0,84
14,52
0,59
13,43
0,35
12,84
1,04
11,89
0,29
11,22
0,41
11,01
0,35
8,94
0,49

Relao de braos
C. lanceolata 1,15
0,15
1,06
0,03
1,23
0,02
1,45
0,12
1,62
0,16
1,28
0,09
1,56
0,14
1,18
0,20
C. ochroleuca 1,07
0,08
1,36
0,17
1,15
0,03
1,5
0,13
1,18
0,09
1,39
0,12
1,10
0,05
1,39
0,14
C. pallida 1,18
0,09
1,20
0,10
1,71
0,16
1,53
0,25
1,95
0,08
1,30
0,12
1,28
0,12
1,16
0,08
C. mucronata 1,43
0,15
1,13
0,04
1,49
0,14
1,45
0,25
1,61
0,23
1,17
0,07
1,41
0,16
1,25
0,11
C. striata 1,27
0,08
1,20
0,11
1,35
0,20
1,66
0,16
1,39
0,15
1,58
0,25
1,23
0,06
1,22
0,11

A colorao com o fluorocromo cromomicina A
3
revelou fluorescncia apenas nas regies
adjacentes regio organizadora do nuclolo (RON) para todas as espcies analisadas (Figura 2),
indicando que estas regies so ricas em GC (SCHWEIZER, 1976).
Apesar do fluorocromo cromomicina A
3
ser especfico s regies ricas em GC, estas
regies podem conter inmeros resduos com os nucleotdeos AT. A utilizao de distamicina,
um contra-corante no fluorescente, em combinao com o fluorocromo cromomicina A
3
permite
diferenciar as regies ricas em GC sem resduos de AT daquelas com resduos, pois a distamicina
A compete com os stios de ligao AT circunvizinhos s regies GC, impedindo a ligao da
cromomicina e consequentemente que estas regies apaream fluorescentes (SCHWEIZER,
1981; MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007).
Em todas as espcies estudadas, a combinao do fluorocromo cromomicina A
3
e
distamicina A apresentou o mesmo padro de marcas fluorescentes que o encontrado nas
preparaes coradas apenas com cromomicina A
3
, sendo a nica diferena a intensidade da




39


marcao. Portanto, esta combinao mostrou apenas fluorescncia mais intensa nas regies
adjacentes regio organizadora do nuclolo (Figura 3).
Em relao s coloraes especficas para as regies ricas em nucleotdeos AT, tanto a
utilizao do fluorocromo DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol), quanto a combinao do
fluorocromo DAPI e do contra-corante AMD (Actinomicina D) no resultaram em regies
cromossmicas fluorescentes (Figura 4 e 5). Apenas mostraram fluorescncia reduzida nas
regies adjacentes regio organizadora do nuclolo como esperado, uma vez que estas regies
so ricas em GC, sendo este resultado uma contraprova do anterior.
Embora as tcnicas at agora descritas apresentem o mesmo padro de marcas
cromossmicas para todas as espcies estudadas, a dupla hibridao in situ com as sondas de
rDNA 45S (seqncia de rDNA 18S-5.8S-25S) e rDNA 5S resultou em diferentes padres de
marcaes entre as espcies.


Na espcie C. lanceolata a sonda de rDNA 45S hibridizou na constrio secundria do
cromossomo 1 e nas regies adjacentes a esta. A sonda de rDNA 5S foi mapeada prximo a
posio da sonda de rDNA 45S, no brao curto do cromossomo 1 (Figura 6A).
Crotalaria ochroleuca apresentou trs tipos de marcaes em relao sonda rDNA de
45S: 42,85% das clulas analisadas apresentaram apenas a constrio secundria marcada
(Figura 6 B1); 42,85% apresentaram alm da constrio, um stio adicional em apenas um dos
homlogos do cromossomo 4 (Figura 6 B2) e 14,3% foram marcados a constrio secundria do
cromossomo 1 e o par de homlogo do cromossomo 4 (Figura 6 B3). Semelhantemente em C.
lanceolata, a sonda de rDNA 5S hibridizou adjacente a sonda de rDNA 45S, no brao curto do
cromossomo 1 (Figura 6B).
Alguns autores utilizam os sinnimos C. mucronata, C. striata e C. pallida, como
espcies distintas apresentando descries cariotpicas para cada espcie (RAINA; VERMA,
1979). Neste trabalho, este tipo de classificao tambm foi adotado para a comparao entre os
marcadores cromossmicos dos caritipos, apenas de modo ilustrativo j que se trata de
populaes diferentes da mesma espcie.
Todas estas populaes apresentaram o mesmo padro de stios de hibridao in situ. A
sonda de rDNA 45S marcou a constrio secundria e as regies adjacentes a esta do
cromossomo 1. Prximo ao stio de localizao da sonda de rDNA 45S foi mapeado a sonda de
rDNA 5S no brao curto deste par. Diferentemente das outras espcies, nestas populaes foram




40


observados dois pares de stios adicionais de rDNA 5S, um maior encontrado no brao curto do
cromossomo 5 e um menor no brao curto do cromossomo 6 (Figuras 7 e 9).
Observou-se uma diferena no tamanho das marcaes da sonda rDNA 5S no
cromossomo 1 das diferentes populaes de C. pallida quando comparada com as espcies C.
lanceolata e C. ochorleuca. Nestas ltimas, a marcao parece ser maior quando comparadas
com as de C. pallida (Figuras 6, 7 e 8). Esta diminuio provavelmente esta relacionada aos stios
adicionais encontrados nesta espcie, que em decorrncia do aumento do nmero de stios, o
rDNA encontrado no cromossomo 1, pde sofrer perdas de seqncias durante a evoluo sem
acarretar grandes danos para a espcie.
Para todas as espcies verificou-se que os stios de rDNA 45S na constrio secundria do
cromossomo 1 e nas regies adjacentes a esta constrio correspondem s regies fluorescentes
positivas para as coloraes CMA e CMA/DA, indicando que as regies organizadoras do
nuclolo so ricas em GC (Figura 9).
Nas espcies analisadas foram encontradas em todos os cromossomos heterocromatinas
fluorescentes pericentromricas de natureza neutra. Estas regies heterocromticas
pericentromricas no foram detectadas com os fluorocromos CMA e DAPI. Elas aparecem
como conseqncia da desnaturao e renaturao do DNA, durante o processo de hibridao
(Figuras 7 e 8) e provavelmente so resultadas de um processo de diferenciao dos arranjos de
DNA da heterocromtina durante a evoluo. Um outro processo de diferenciao das
heterocromatinas pericentromricas j foi observado para as espcies com flores especializadas,
que apresentaram CMA
+
, porm so CMA/DA
-
, indicando diferenas no contedo de GC ou nos
resduos de AT (MONDIN, 2003).
Apesar das diferenas encontradas pela hibridao in situ dos rDNAs, verifica-se que h
um padro semelhante em relao aos marcadores cromossmicos para a seo Hedriocarpae,
subseo Macrostachyae (Figura 9), principalmente quando comparados s outras espcies de
outras sees previamente estudadas por Mondin (2003) (Figura 10).
Ao se comparar as espcies com flores especializadas com as espcies sem especializao
floral nota-se que as primeiras possuem na maioria das espcies heterocromatinas
pericentromricas ricas em GC, enquanto as espcies com flores sem especializao floral
possuem apenas os stios de rDNA 45S ricos em GC, ou ainda dois stios adicionais no
relacionados ao rDNA 45S, como em C. incana. Alm disso, diferem tambm em relao ao
rDNA 5S, onde nas espcies com flores especializadas esse stio esta localizado no brao longo




41


do cromossomo 1, enquanto que em C. incana aparece no brao longo do cromossomo 3, e nas
espcies da seo Hedriocarpae, subseo Macrostachyae, o stio aparece no brao curto,
provavelmente conseqncia de uma inverso pericntrica, como ser discutido mais adiante
(Figura 10).
Sendo assim, os resultados obtidos com a utilizao de tcnicas de colorao com
fluorocromos e hibridao molecular in situ de sondas de rDNA 45S e 5S tanto para as espcies
estudadas, quanto para as espcies analisadas previamente por Mondin (2003), permitem inferir
sobre os eventos cromossmicos ocorridos durante a evoluo do gnero.




























42










Figura 1 Caritipos das espcies C. lanceolata (A), C. ochroleuca (B), C. pallida (C), C. mucronata (D) e C.
striata (E)







43






Figura 2 - Metfases coradas com o fluorocromo cromomicina A
3
nas espcies C. lanceolata (A), C. ochroleuca (B),
C. pallida (C), C. mucronata (D) e C. striata (E). As setas indicam as regies ricas em GC, localizadas no
par 1. Barra= 10m






44







Figura 3 - Metfases das espcies C. lanceolata (A), C. ochroleuca (B), C. pallida (C), C. mucronata (D) e C. striata
(E), coradas com a combinao cromomicina A
3
/distamicina A. As setas indicam as regies ricas em GC,
localizadas no par 1. Barra= 10m






45






Figura 4 - Metfases das espcies C. lanceolata (A), C. ochroleuca (B), C. pallida (C), C. mucronata (D) e C. striata
(E), coradas com o fluorocromo DAPI. As setas indicam as regies com fluorescncia negativa
localizadas na constrio secundria do par 1. Barra= 10m






46






Figura 5 - Metfases das espcies C. lanceolata (A), C. ochroleuca (B), C. pallida (C), C. mucronata (D) e C. striata
(E), coradas com a combinao DAPI/AMD. As setas indicam as regies fluorescentes negativas,
localizadas na contrio secundria no par 1. Barra= 10m






47











Figura 6 - Metfases mitticas das espcies C. lanceolata (A) e C. ochroleuca (B), aps FISH com sondas de rDNA
45S (vermelho) e 5S (verde). As setas brancas indicam a constrio secundria do par 1 marcada com a
sonda de rDNA 45S e adjacente a ela o rDNA 5S, posicionado no brao curto. C. ochroleuca apresentou
trs tipos de marcao em relao sonda 45S: a primeira marcando a constrio secundria (B1); outra
marcando a contrio e apenas um dos cromossomos 4 (B2), ou marcando o par do cromossomo 4 (B3).
As setas amarelas destacam a heterocromatina fluorescente de natureza neutra, localizadas nas regies
pericentromricas, conseqncia da desnaturao e renaturao do DNA, durante o processo de
hibridao. Estas regies pericentromricas no apresentam fluorescncia quando coradas com CMA ou
DAPI. Barra= 10m






48













Figura 7 - Metfases mitticas das espcies C. pallida (A); C. mucronata (B) e C. striata (C) aps FISH com sondas
de rDNA 45S (vermelho) e 5S (verde). As setas brancas indicam a constrio secundria no par 1,
marcada com a sonda de rDNA 45S e adjacente a ela o rDNA 5S posicionado no brao curto. As setas
rosa apontam para dois stios adicionais de 5S no brao curto dos cromossomos 5 e 6 destas espcies. As
setas amarelas destacam a heterocromatina fluorescente de natureza neutra, conseqncia da desnaturao
e renaturao do DNA, durante a hibridao. Barra= 10m






49































Figura 8 Idiogramas dos caritipos das espcies de Crotalaria. C. lanceolata (A), C. ochroleuca (B), C. pallida
(C), C. mucronata (D) e C. striata (E)






50





Figura 9 Mapas citogentics dos cromossomos de espcies de Crotalaria. C. lanceolata (A), C. ochroleuca (B), C.
pallida (C), C. mucronata (D) e C. striata (E). O asterisco (*) representa uma marcao do rDNA 45S
instvel





51









Figura 10 Modelo integrado entre as relaes filogenticas de sees botnicas do gnero Crotalaria (adaptado de
Polhill, 1982) e a estrutura dos caritipos das espcies anteriormente estudadas por Mondin (2003) e as
do presente trabalho






52


5 DISCUSSO

5.1 Estrutura dos caritipos

A maioria das espcies do gnero Crotalaria apresenta caritipos simtricos com
cromossomos metacntricos e submetacntricos (OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999),
nmero cromossmico diplide 2n=16 cromossomos, com apenas uma constrio secundria no
brao curto do cromossomo 1 (RAINA; VERMA, 1979, OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999,
MONDIN 2003), com exceo de C. spectabilis, que apresenta a constrio secundria no brao
longo do cromossomo 1 (OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999; MONDIN, 2003).
Em Crotalaria, tanto o tamanho quanto a morfologia dos cromossomos so relativamente
semelhantes, dificultando a identificao individual dos pares. Por isso, alm de medidas
cromossmicas realizadas em metfases mitticas com boa morfologia, o uso de marcadores
cromossmicos, obtidos a partir da utilizao de fluorocromos especficos s regies ricas em GC
ou AT, alm de sondas de rDNA, so ferramentas indispensveis a identificao precisa dos
cromossomos.
Muitos trabalhos j demonstraram que as regies associadas s regies organizadoras do
nuclolo so ricas em nucleotdeos GC (SCHWARZACHER; SCHWEIZER, 1982; FUCHS, et
al. 1998; RUAS, et al. 2005; CUCO, et al. 2005; MARCON; BARROS; GUERRA, 2005;
MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN; 2007). As espcies estudadas da seo
Hedriocarpae, subseo Macrosthachyae apresentaram regies fluorescentes para cromomicina
A
3
nas regies associadas s RONs.
A combinao do fluorocromo cromomicina A
3
com o contra-corante, no fluorescente,
distamicina A no resultou para as espcies de Crotalaria da seo Hedriocarpae, em qualquer
tipo de diferenciao em relao quelas encontradas na colorao apenas com CMA, porm foi
detectado um pequeno aumento da intensidade da fluorescncia. Este processo j foi descrito para
Vicia faba e Scilla siberica onde o fluorocromo associado ao contra-corante metil-green,
provocou uma alterao no contraste das bandas (SCHWEIZER, 1976).
No entanto, nas espcies da seo Calycinae e Crotalaria foram encontrados uma alterao
qualitativa no padro de bandas com o emprego das coloraes com CMA e com CMA/DA,
diferenciando as bandas pericentromricas, marcadas apenas com CMA, das regies associadas
RON, marcadas com CMA e CMA/DA (MONDIN, 2003).




53


O uso do flurocromo DAPI ou da combinao DAPI/AMD no revelou nenhuma banda
com fluorescncia positiva, apenas nas regies associadas regio organizadora do nuclolo foi
observada fluorescncia negativa, corroborando com a evidncia destas regies serem ricas em
GC. Este padro de fluorescncia para as regies organizadoras do nuclolo tambm foi
encontrado para as espcies C. juncea, C. stipularia, C. paulina e C. spectabilis, com
fluorescncia reduzida nas regies associadas s RONs (MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-
SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007).
Apesar das espcies de Crotalaria no apresentarem bandas DAPI e DAPI/AMD
positivas, a espcie C. incana apresentou sinais fluorescentes, indicando regies ricas em AT
(MONDIN, 2003). Sendo assim, um estudo em um maior nmero de espcies com flores no
especializadas deveria ser realizado, para verificar se este padro peculiar a esta espcie ou se
aplica as outras espcies.
As espcies pertencentes seo Hedriocarpae, subseo Macrostachyae apresentaram os
mesmos padres de bandas tanto entre as coloraes CMA e CMA/DA, assim como entre as
coloraes DAPI e DAPI/AMD. Esta correspondncia entre os marcadores cromossmicos
obtidos tanto para CMA e CMA/DA, como para DAPI e DAPI/AMD tambm foi observada por
Mondin (2003) em C. incana e sugerido que estas regies teriam sofrido diversificao das
seqncias repetitivas, sendo consideradas regies DNA espcie-especfico (MONDIN, 2003).
Porm, todas estas espcies citadas possuem flores sem especializao floral, podendo esta
diversificao ser especfica para o grupo de espcies sem especializao floral.
Como j mencionado, as regies organizadoras do nuclolo de todas as espcies
analisadas foram ricas em nucleotdeos GC, uma vez que apresentaram padres fluorescentes
tanto para a colorao utilizando apenas CMA quanto para CMA/DA. No entanto, a marcao
inconstante de rDNA 45S encontrada no brao curto do cromossomo 4 de C. ochroleuca no
resultou em fluorescncia CMA positiva. Esta no visualizao de fluorescncia CMA pode ser
conseqncia do pequeno tamanho desta regio e as coloraes com CMA e CMA/DA no so
suficientemente sensveis a este stio. Esta observao pode ser apoiada pelo fato da marcao
rDNA 45S ser instvel para esta regio, reforando a idia de que este seja um stio muito
pequeno. Alm disso, C. incana apresentou dois stios adicionais de rDNA 45S nos cromossomos
4 e 5 que no apresentaram fluorescncia com a colorao com CMA e CMA/DA, devido ao
tamanho reduzido dos stios (MONDIN, 2003).




54


Provavelmente este stio adicional de rDNA 45S em C. ochroleuca no ativo, pois para
as espcies de gramneas, RONs ativas quando no formam constrio secundria, apresentam
pelo menos uma banda maior que 0,2 m, que marquem pela tcnica de nitrato de prata e sejam
cromomicina positiva e DAPI negativo (WITERFELD; RSER, 2007). Os resultados
encontrados para rDNA 45S no cromossomo 4 de C. ochroleuca se enquadram nesta descrio,
no entanto, para uma confirmao da ativao ou no deste stio, a tcnica de impregnao com
nitrato de prata deve ser realizada.
Os sinais das sondas de rDNA 5S das espcies estudadas no foram CMA nem CMA/DA
positivo, como era de se esperar, j que esta correspondncia na literatura rara. Todavia, dentro
do gnero Crotalaria, para as espcies C. juncea, C. retusa, C. incana e C. spectabilis, j foi
relatado a correspondncia entre stios de rDNA 5S e sinais CMA positivos (MONDIN, 2003)
assim como para as espcies Hypochaeris brasiliensis e Hypochaeris megapotamica (RUAS, et
al. 2005).
Variabilidade no nmero de stios adicionais rDNA tem sido relatado para muitas espcies
de plantas e tem sido sugerido muitas explicaes para tal fato.
Em Phaseolus vulgaris a variao no nmero de loci rDNA 45S foi explicado atravs de
vrios mecanismos de amplificaes que ocorreram independentemente, amplificao esta
ocorrida antes da domesticao da espcie (PEDROSA-HARAND, et al., 2006).
Porm no gnero Allium, Schubert (1984) e Schubert e Wobus (1985) observaram o
surgimento de novos stios ativos de DNA ribossmicos corados com nitrato de prata e mapeados
por hibridao in situ, e concluram que rDNA tem uma natureza mvel. Esta explicao
tambm foi utilizada nos gneros Oryza, Passiflora e Pinus pra explicar a variabilidade nos stios
de rDNA encontradas em espcies destes gneros (SHISHIDO; SANO; FUKUI, 2000; MELO;
GUERRA, 2003, CAI, et al. 2006).
Datson e Murray (2006) sugerem trs possveis mecanismos para explicar as mudanas
das posies dos genes ribossomais nas espcies de emesia: inverses, translocaes e
transposio. Atravs de estudos do comportamento meitico das espcies, os autores supem
que a transposio dos rDNAs o melhor mecanismo para explicar tais mudanas.
A melhor demonstrao de que o rDNA pode sofrer transposio foi realizado em
Aegilops speltoides, onde os autores observaram a associao dos transposons En/Spm com os
rDNAs 45S e 5S e puderam concluir que esta transferncia pode ser de dois tipos: especfica ao
genoma, movendo o rDNA 45S do cromossomo 1 ou 6 para o cromossomo 5; ou ainda especfica




55


clula, incluindo a mudana de posio do rDNA 5S dentro do cromossomo 5. Esta mobilidade
esta ligada em parte a atividade meitica dos transposons En/Spm (RASHINA; BELYAYEV;
NEVO, 2004a). Esses mesmos autores trabalhando com duas populaes pequenas de Ae.
speltoides e Ae. sharonensis encontraram um padro de caritipo em relao ao rDNA para a Ae.
sharonensis e quatro padres de organizao dos rDNAs para a Ae. speltoides, padres estes que
se assemelhavam a caritipos intermedirios entre ambas espcies. Partindo do pressuposto que
Ae. sharonensis era derivada de Ae. speltoides, os autores sugeriram dois eventos de especiao
utilizando o remodelamento dos rDNAs 5S e 45S: o aparecimento de um novo bloco de rDNA 5S
no cromossomo 1 e a transposio do rDNA 45S do cromossomo 1 para o cromossomo 5
(RASHINA; BELYAYEV; NEVO, 2004b). Este resultado indica que o rDNA pode sofrer
transposio e este processo pode ser um importante fenmeno durante a diversificao das
espcies.
Apesar dos indcios sugerirem a interveno da transposio do rDNA 45S por
transposons do tipo En/Spm, h evidncias de que a atividade desses transposons sejam
responsveis pelo menos em parte pela mobilidade principalmente dos stios rDNAs 5S, devido a
co-localizao de rDNAs 5S com transposons En/Spm encontrados em espcies de Triticeae e
Poaceae (RASHINA; BELYAYEV; NEVO, 2004a; ALTINKUT, et al., 2006a; ALTINKUT, et
al., 2006b).
No entanto, algumas espcies de leguminosas, como em Pisum sativum, que no possuem
seqncias de elementos de transposio na constrio secundria (NEUMANN; NOUZOV;
MACAS, 2001), sugere que a mobilidade do rDNA 45S pode ser explicada tambm pela
recombinao e rearranjos cromossmicos (ABIRACHED-DARMENCY, et al. 2005).
Os stios adicionais encontrados nas espcies estudadas provavelmente so resultados de
eventos de transposio, pois tanto em C. pallida, C. mucronata e C. striata que possuem dois
stios adicionais do rDNA 5S, como em C. ochroleuca que possui um rDNA 45S adicional, o
sinal do rDNA 5S e do rDNA 45S encontrado no cromossomo 1, das respectivas espcies,
demonstraram uma reduo em sua intensidade, provavelmente fruto de translocao de partes
destas regies para os novos stios, onde so normalmente ausentes. Esta situao j foi reportada
em Aegilops speltoides (RASHINA; BELYAYEV; NEVO, 2004a).
Embora os caritipos das espcies, da seo Hedriocarpae, subseo Macrostachyae, no
diferiam muito entre si, o uso de coloraes com fluorocromos e hibridao molecular in situ so
importantes ferramentas, que geram marcadores cromossmicos que auxiliam na identificao de




56


cromossomos individuais. Estes marcadores ajudam no apenas a compreender a organizao
cromossmica dentro de cada seo e subseo botnica, mas tambm possibilitam a
compreenso da evoluo cromossmica de todo o gnero, como ser visto a seguir.

5.2 Evoluo cariotpica do gnero Crotalaria atravs do uso de marcadores citogenticos

O gnero Crotalaria possui cerca de 600 espcies divididas em oito sees e nove
subsees (POLHILL, 1968; BYSBY; POLLHIL, 1973), e conforme a complexidade floral, as
espcies podem ser diferenciadas em dois grupos: um com espcies possuindo especializao das
flores, e um segundo, com espcies sem especializao floral (BYSBY; POLLHIL, 1973).
A citogentica uma ferramenta adicional que aliada a dados botnicos, fornece
embasamento para a classificao taxonmica, alm de auxiliar na compreenso da evoluo
cariotpica e ajuda a elucidar o processo de diversificao sofrido durante a evoluo do gnero.
Essa conexo entre a botnica e a citogentica em Crotalaria foi primeiramente realizada
por Boulter, et al. (1970). Os autores estudando algumas espcies devidamente agrupadas em
sees e subsees puderam constatar uma correlao entre tamanho cromossmico e
especializao floral. As espcies com especializao floral possuam cromossomos menores,
enquanto as espcies com flores no especializadas possuam cromossomos maiores (BOULTER,
et al.,1970).
Esta correlao tambm foi observada por Oliveira e Aguiar-Perecin (1999), mostrando
que cada seo botnica possui caractersticas em relao simetria e ao tamanho cromossmico,
indicando que nas sees mais especializadas, a evoluo cariotpica aponta para uma reduo no
tamanho cromossmico e um aumento no grau de assimetria.
No entanto, a maioria dos trabalhos citogenticos realizados em Crotalaria no
classificam as espcies em sees e subsees, no conseguindo, portanto, realizar grandes
observaes sobre a evoluo do gnero.
A utilizao de marcadores cromossmicos, gerados por coloraes com fluorocromos e
hibridao molecular in situ, combinados a dados botnicos previamente estabelecidos uma
estratgia importante, principalmente para gneros como Crotalaria, que possuem uma
similaridade na morfologia e no nmero constante dos cromossomos das espcies diplide,
adicionando importantes dados para o entendimento da evoluo de caritipo.




57


As espcies analisadas pertencem seo Hedriocarpae, subseo Macrostachyae e
possuem flores sem estruturas especializadas e apresentaram padres citogenticos pertinentes
com sua classificao e caractersticos para a subseo.
Todas as espcies possuem stios de rDNA 45S, cromomicina positivo, na constrio
secundria localizada no brao curto do cromossomo 1. O padro deste marcador est de acordo
com as outras espcies analisadas por Mondin (2003) pertencentes a diferentes sees botnicas,
com exceo de C. spectabilis que devido a uma inverso pericntrica apresenta a constrio
secundria no brao longo do cromossomo 1 (OLIVEIRA E AGUIAR-PERECIN, 1999;
MONDIN, 2003).
Stios adicionais de rDNA 45S, como o encontrado em C. ochroleuca, j foram descritos
para as espcies C. juncea, C. paulina, C. stipularia e C. incana (Mondin, 2003). A espcie C.
juncea possui o stio adicional na poro proximal do brao longo do cromossomo 4. A espcie
C. paulina uma espcie poliplide, da mesma seo de C. juncea e apresenta um stio adicional
rDNA no brao curto do cromossomo 2, e outro no brao longo do cromossomo 8. Estes
cromossomos so provavelmente homelogos aos cromossomos 1 e 4, respectivamente de C.
juncea. C. stipularia, tambm poliplide pertencente seo Calycinae, apresenta um stio na
parte proximal no brao curto do cromossomo 8, provavelmente resultado de uma inverso
pericntrica (MONDIN, 2003).
O stio adicional rDNA 45S de C. ochroleuca poderia ser interpretado de imediato como o
resultado de uma inverso pericntrica, pois nesta espcie, este stio est localizado no brao
curto do cromossomo 4, enquanto que em C. juncea, o rDNA adicional se encontra localizado no
brao longo do cromossomo 4. No entanto, esta hiptese no pode estar correta, pois sees
intermedirias entre estas espcies no apresentam esse tipo de stios adicionais, apontando que
estes stios so decorrentes de eventos independentes que ocorreram no curso da evoluo.
Apesar destes stios serem resultados de eventos independentes, eles provavelmente so
conseqncia de transposio, como sugerido para a espcie de Aegilops speltoides (RASHINA;
BELYAYEV; NEVO, 2004a).
Outros stios adicionais de rDNA 45S foram encontrados nas pores subterminal e
terminal do brao curto dos cromossomos 4 e 5, respectivamente em C. incana (MONDIN,
2003), sendo provavelmente originados tambm a partir de eventos de transposies.
Tanto as espcies da subseo Macrostachyae como as da seo Chrysocalycinae,
diferentemente das sees com espcies com flores especializadas, no apresentam




58


heterocromatinas pericentromricas ricas em GC, sugerindo um ganho de heterocromatinas ricas
em GC nas espcies com especializao floral (MONDIN, 2003). Entretanto, durante a
hibridao molecular in situ foram detectadas heterocromatinas pericentromricas, o que sugere
que durante o curso da evoluo houve mudanas nestas seqncias (evoluo concertada)
alterando sua constituio quanto ao contedo de GC e por conseqncia sua deteco com
fluorocromos. Estes dados corroboram com a classificao botnica do gnero, demonstrando
uma similaridade citogentica entre sees relacionadas, alm de padres diferentes entre as
espcies com ou sem especializao floral (BYSBY; POLLHIL, 1973).
Outro importante resultado foi observado para o DNA ribossmico 5S. Todas as espcies
analisadas apresentaram stio rDNA 5S adjacente a marcao 45S na parte distal do cromossomo
1, alm de adicionais marcas no brao curto do cromossomo 5 e 6 de C. pallida, C. mucronata e
C. striata. Ao contrrio, das outras espcies anteriormente estudadas por Mondin (2003) que
apresentaram estas marcas no brao longo do cromossomo 1, como no caso de C. spectabilis, C.
retusa e C. juncea, no cromossomo 3 de C. incana, no cromossomo 4 de C. grantiana e no
cromossomo 8 de C. paulina e C. stipularia.
Estes dados obtidos atravs do uso do marcador cromossmico de rDNA 5S indicam uma
inverso pericentromrica envolvendo o stio ribossmico 5S do cromossomo 1, sendo que esta
inverso est fixada nas espcies da subseo Macrosthachyae. Porm, para obteno de
informaes mais precisas sobre esta inverso, e esclarecimento se este evento caracterstico a
esta subseo ou se anterior derivao desta, devem ser analisadas espcies pertencentes a
sees consideradas mais primitivas, como a seo Chrysocalycinae, subseo Glaucae.
O stio rDNA 5S localizado no cromossomo 3 em C. incana, provavelmente seja o
resultado de uma translocao (MONDIN, 2003). Alguns autores sugerem que esta espcie com
2n=14 cromossomos, tenha surgido atravs de translocaes, a partir de uma espcie pertencente
a sua prpria seo, com 2n=16 cromossomos (ATCHINSON, 1950; OLIVEIRA; AGUIAR-
PERECIN, 1999; MONDIN, 2003). Este mecanismo de reduo do nmero cromossmico
atravs de translocaes, foi proposta por Stebbins (1971) e recentemente foi demonstrado para
Arabidopsis thaliana e espcies afins na famlia Brassicaceae (LYSAK, et al. 2006).
As espcies de Crotalaria se caracterizam por no possurem bandas ricas AT, no sendo
encontrado nenhuma banda DAPI positiva, tanto nas espcies analisadas neste trabalho, quanto
nas espcies estudadas por Mondin (2003), com exceo para C. incana, que apresentou regies
ricas em AT dispersas nos cromossomos. Esta espcie considerada primitiva e em conseqncia




59


deste fato, possui um caritipo peculiar a ela, permitindo a adaptao em diferentes ambientes
(MONDIN, 2003).
As espcies de Crotalaria no possuem grandes diferenas em relao ao nmero, ao
formato e ao tamanho cromossmico encontrados entre as espcies, sendo portando, os
marcadores cromossmicos eficientes ferramentas para a anlise e compreenso da evoluo
cariotpica de Crotalaria. Certamente, outras espcies pertencentes a outras sees botnicas
devem ser estudadas, para o entendimento da evoluo no gnero como todo, utilizando estes e
outros marcadores cromossmicos. No entanto, os resultados obtidos neste estudo apiam a
teoria primeiramente proposta por Mondin (2003), onde sugere-se diferenas na organizao dos
genomas entre as espcies com flores especializadas das espcies sem especializao floral. Alm
disso, os dados indicam que a evoluo do gnero foi impulsionada principalmente por rearranjos
cromossmicos e modificaes nas seqncias de DNA altamente repetitivo atravs da evoluo
concertada que alteraram principalmente o contedo de GC nas regies pericentromricas.























60


6 COCLUSES

As tcnicas de colorao com fluorocromos e hibridao molecular in situ forneceram
marcadores cromossmicos, possibilitando uma anlise detalhada dos caritipos das espcies
pertencentes seo Hedriocarpae e subseo Macrostachyae. Foi verificado a presena de rDNA
45S na constrio secundria do brao curto do cromossomo 1 e adjacente a esta na poro distal,
um stio de DNA ribossmico de 5S. A associao destes sinais decorrente de uma inverso
pericntrica e fornece um marcador cromossmico especfico para este grupo. Alm disso, sinais
adicionais de rDNA so comuns para espcies desta subseo botnica. Estes sinais
provavelmente so decorrentes de transposio.
Os resultados esto de acordo com a hiptese elaborada por Mondin (2003) de que as
espcies com flores especializadas possuem diferenas na organizao cromossmica quando
comparadas s espcies sem especializao floral, contribuindo com a diviso do gnero em dois
grandes grupos: espcies com especializao floral e espcies sem especializao das flores. No
entanto, um maior nmero de espcies deve ser estudado utilizando estes e outros marcadores, a
fim de esclarecer pontos ainda em abertos, assim como ampliar os marcadores para as sees
botnicas ainda no analisadas e demonstrar todos os eventos cromossmicos envolvidos durante
a evoluo de Crotalaria.


















61


REFERCIAS


ABIRACHED-DARMENCY, M.; PRADO-VIVANT, E.; CHELYSHEVA, L.; POUTHIER, T.
Variation in rDNA locus number and position among legume species and detection of 2 linked
rDNA loci in the model Medicago truncatula by FISH. Genome, Ottawa, v. 48, p. 556-561,
2005.
AHMED, B.; AL-HOWIRINY, T. A.; MOSSA, J. S. Crotalic and emarginellic acids: Two
triterpenes from Crotalaria emarginella and anti-inflammatory and anti-hepatotoxic activity of
crotalic acid. Phytochemistry, Londres, v. 67, p. 956-964, 2006.
ALI, H.B.; MEISTER, A.; SCHUBERT, I. DNA content, rDNA loci, and DAPI bands reflect the
phylogenetic distance between Lathyrus species. Genome, Ottawa, v. 43, p. 1027-1032, 2000.
ALMADA, R. D.; DAVIA, J. R.; SEIJO, J. G. Karyotype analysis and chromosome evolution
in southernmost South American species of Crotalaria (Leguminosae). Botanical Journal of the
Linnean Society, Londres, v. 150, p. 329-341, 2006.
ALTINKUT, A.; KOTSERUBA, V.; KIRZHNER, V. M.; NEVO, E.; RASKINA, O.;
BELYAYEV, A. Ac-like transposons in populations of wild diploid Triticeae species:
comparative analysis of chromosomal distribution Chromosome Research, Dordrecht, v. 14,
p. 307-317, 2006a.
ALTINKUT, A.;. RASKINA, O.; NEVO, E.; BELYAYEV, A. En/spm-like transposons in
Poaceae species: transposase sequence variability and chromosomal distribution. Cellular &
Molecular Biology Letters, Wroclaw, v. 11, p. 214-229,2006b.
ATCHINSON, E. 1950 Studies in the Leguminosae. V. Cytological observations on Crotalaria.
Journal of the Elisha Mitchell Science Society , Carolina do Norte, v. 66, p. 70-75, 1950.
BERTO, M.R. Evoluo cariotpica no gnero Capsicum (Solanaceae). 1993. 148p.
Dissertao (Mestrado em Gentica e melhoramento de Plantas) Escola Superior de Agricultura
Luiz de Queiroz, Universidade de So Paulo, Piracicaba, 1993.
BISBY, F. A. The evaluation and selection of the characters in Angiosperm taxonomy: an
example from Crotalaria L. ew Phytologist, Londres, v. 69, p. 1149-1160, 1970.
BISBY, F. A. The role of taximetrics in angiosperm taxonomy. I. Empirical comparisons of
methods using Crotalaria L. ew Phytologist, Londres, v. 72, p. 699-726, 1973.
BISBY, F. A.; POLHILL, R. M. The role of taximetrics in angiosperm taxonomy. II. Parallel
taximetrics and orthodox studies in Crotalaria L.. ew Phytologist, Londres, v. 72, p. 727-742,
1973.




62


BOULTER, D.; DERBYSHIRE, E.; FRAHM-LELIVELD, J.A.; POLHILL, R.M. Observations
on the cytology and seed-proteins of various African species of Crotalaria L. (Leguminosae).
ew Phytologist, Londres, v. 69, p. 117-131, 1970.
CAI, Q.; ZHANG, D.; LIU, Z.; WANG, X. Chromosomal localization of 5S and 18S rDNA in
five species of subgenus Strobus and their implications for genome evolution of Pinus. Annals of
Botany, Londres, v. 97, p. 715-722, 2006.
CAMPO, M. L. del; SMEDLEY, S. R.; EISNER, T. Reproductive benefits derives from
defensive plant alkaloide possession in na arctiid moth (Utetheisa ornatrix). Proceedings of the
ational Academy Sciences of the United States of Amrica, Nova Iorque, v. 102, p. 13508-
13512, 2005.
CUCO, S. M.; MONDIN, M.; VIEIRA, M. L. C.; AGUIAR-PERECIN, M. L. R. Tcnicas para
obteno de preparaes citolgicas com alta frequncia de metfases mitticas em plantas:
Passiflora (Passifloraceae) e Crotalaria (Leguminosae). Acta Botanica Braslica, So Paulo,
v. 17, p. 363-370, 2003.
CUCO, S. M., VIEIRA, M. L. C., MONDIN, M., AGUIAR-PERECIN, M. L. R. Comparative
karyotype analysis of three Passiflora L. species and cytogenetic characterization of somatic
hybrids. Caryologia, Florncia, v. 58, n. 3, p. 220-228, 2005.
DATSON, P. M.; MURRAY, B. G. Ribosomal DNA locus evolution in emesia: transposition
rather than structural rearrangement as the key mechanism? Chromosome Research, Dordrecht,
v. 14, p. 845-857, 2006.
DOYLE, J. J.; CHAPPILL, J. A.; BAILEY, D. C.; KAJITA, T. Towards a comprehensive
phylogeny of legumes: evidence from rbcL sequences and non-molecular data. In:
HERENDEEN, P. S.; BRUNEAU, A. (Ed.). Advances in Legume Systematics. Londres:, Royal
Botanic Gardens, Kew, 2000. chap. 1, p. 120.
FILLIETAZ, A., M. Estudos taxonmicos de espcies de Crotalaria sect. Calycinae Wight &
Arn. (Leguminosae Papilonoideae Crotalarieae) no Brasil. 2002. 145p. Dissertao
(Mestrado em Biologia Vegetal) - Universidade de Campinas, Campinas, 2002.
FLAVELL, R.B. Variation in structure and expression of ribosomal DNA loci in wheat.
Genome, Ottawa, v. 31, p. 963-968, 1989.
FRIEBE, B; ENDO, T. R.; GILL, B. S. Chromosome-banding methods. In: FUKUI, K.;
SHIGEKI, N. (Ed.) Plant chromosomes: laboratory methods. Boca Raton: CRC Press, 1996.
chap.7, p. 123-154.
FLORES, A. S. Taxonomia, nmeros cromossmicos e qumica de espcies de Crotalaria L.
(Leguminosae-Papilolionoideae) no Brasil. 2004. 196p. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal)
- Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2004.




63


FLORES, A. S.; CORRA, A. M.; FORNI-MARTINS, E. R.; TOZZI, A. M. G. A. Chromosome
numbers in Brazilian species of Crotalaria L. (Leguminosae-Papilioideae) and their taxonomic
significance. Botanical Journal of the Linnean Society, Londres, v. 151, p. 271-277, 2006.
FLORES, A. S.; MIOTTO, S. T. S. Aspectos fitogeogrficos das espcies de Crotalaria L.
(Leguminosae, Faboideae) na Regio Sul do Brasil. Acta Botanica Brasilican, So Paulo, v. 19,
n. 2, p. 245-249, 2005.
FUCHS, J.; STREHL, S.; BRANDES, A.; SCHWEIZER, D.; SCHUBERT, I. Molecular-
cytogenetic characterization of the Vicia faba genome heterocromtin differentiation, replication
patterns and sequence localization. Chromosome Research, Dordrecht, v. 6, p. 219-230, 1998.
GEPTS, P., W.D. BEAVIS, E.C. BRUMMER, R.C. SHOEMAKER, H.T. STALKER, N.F.
WEEDEN, AND N.D. YOUNG. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed
report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiology, Rockville,
v. 137, p. 1228-1235, 2005.
GERLACH, W. L.; DYER, T. A. Sequence organization of the repeating units in the nucleus of
wheat which contain 5S rRNA genes. ucleic Acids Research, Oxford, v. 8, n. 21, p. 4851-
4865, 1980.
GOLDBLATT, P. Cytology and phylogeny of Leguminosae. In: POLHILL, R. M.; RAVEN, P.
H. (Ed.) Advances in legume Systematics. Londres: Royal Botanic Gardens, Kew, 1981. pt. 2,
chap. 55, p. 191-208.
GOTTLOB-MCHUGH, S. G.; LEVESQUE, M.; MACKENZIE, K.; OLSON, M.; YAROSH, O.;
JOHNSON, D. A. Organization of the 5S rRNA genes in the soybean Glycine max (L.) Merrill
and conservation of the 5S rDNA repeat structure in higher plants. Genome, Ottawa, v. 33, n. 4,
p. 486-494, 1990.
GUPTA, P. K. Nuclear DNA, nuclear area and nuclear dry mass in thirteen species of Crotalaria
(Angiospermae, Leguminosae). Chromosoma, Nova Iorque, v. 54, p. 155-164, 1976.
GUPTA, R.; GUPTA, P.K. Karyotype studies in the genus Crotalaria Linn. Cytologia, Tquio,
v. 43, p. 357-369, 1978a.
GUPTA, R.; GUPTA, P.K. Pachytene karyotype in the genus Crotalaria L (Leguminosae).
Cytologia, Tquio, v. 43, p. 655-663, 1978b.
HESLOP-HARRISON, J. S. Comparative genome organization in plants: From sequence and
markers to chromatin and chromosomes. The Plant Cell, Rockville, v. 12, p. 617-635, 2000.
HOWELL, W. M.; BLACK, D. A. Controlled silver staining of nucleolos organizer regions with
a protective colloidal developer: a one-step method. Experientia, Basel, v. 36, p. 1014-1015,
1980.




64


LAWRENCE, R. J; EARLEY, K. PONTES, O.; SILVA, M.; CHEN, Z. J. ;NEVES, N.;
VIEGAS, W.; PIKAARD, C. S. A. Concerted DNA Methylation/Histone Methylation Switch
Regulates rRNA Gene Dosage Control and Nucleolar Dominance. Molecular Cell, Cambridge,
v. 3, p. 599-609, 2004.
LEITCH, I. J.; BENNETT, M. D. Genome downsizing in polyploid plants. Biological Journal of
the Linnean Society, Oxford, v. 82, p. 651663, 2004.
LEWIS, G. Legumes of Bahia. Rotterdam: Royal Botanic Gardens, Kew, 1987. 369p.
LEWIS, G.; SCHRIRE, B.; MACKINDER, B.; LOCK, M. (Ed.) Legumes of the world.
Londres: Royal Botanic Gardens, Kew, 2005. 592p.
LYSAK, M. A.; BERR, A.; PECINKA, A.; SCHMIDT, R.; MCBREEN, K.; SCHUBERT, I.
Mechanisms of chromosome number reduction in Arabidopsis thaliana and related Brassicaceae
species Proceedings ational Academy Science of the United States of Amrica, Nova
Iorque, v. 103, p. 52245229, 2006.
MARCON, A. B.; BARROS, I. C. L.; GUERRA, M. Variation in chromosome numbers, CMA
bands and 45S rDNA sites in species of Selaginella (Pteridophyta). Annals of Botany, Londres,
v. 95, p. 271-276, 2005.
MASCIA, P. N.; RUBENSTEIN, I.; PHILLIPS, R. L.; WANG A. S.; XIANG L. Z. Localization
of the 5S rRNA genes and evidence for diversity in the 5S rDNA region of maize. Gene,
Amsterdam, v. 15, p. 7-20, 1981.
MCCLINTOCK, B. The relationship of a particular chromosomal element to the development of
the nucleoli in Zea mays.Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat., Viena, v. 21, p. 294328, 1934.
MEDINA, J.C. Plantas Fibrosas da Flora Mundial. So Paulo: Indstria Grfica Siqueira,
1959. 913p.
MELO, N. F. de; GUERRA, M. Variability of the 5S and 45S rDNA sites in Passiflora L. species
with distinct base chromosome numbers. Annals of Botany, Londres, v. 92, p. 309-316, 2003.
MONDIN, M. Estudo da evoluo cariotpica do gnero Crotalaria L. (Leguminosae-
Papilionoideae) com o emprego de tcnicas de bandamento cromossmico e hibridao in
situ fluorescente (FISH). 2003. 115p (Doutorado em Gentica e Melhoramento de Plantas)
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de So Paulo, Piracicaba, 2003.
MONDIN, M.; AGUIAR-PERECIN, M. L. R.; MORALES, A. G.; ANDRADE, L.M.;
MOLINA, S. C. M. Citogentica do gnero Crotalaria (Leguminosae-Papilionoideae): da
clssica a molecular. In: SIMPOSIO LATINOAMERICANO DE CITOGENTICA Y
EVOLUCIN, 2, 2007a, Palmira. Memrias. Palmira: Universidad Nacional de Colmbia,
2007a. p. 189-195.




65


MONDIN, M.; AGUIAR-PERECIN, M. L. R.; FUCHS, M. C. P.; ANDRADE, L.M..
Chromosomal evolution of the genus Crotalaria (Leguminosae-Papilionoideae) and its taxonomy
relationships. In: INTERNATIONAL CHROMOSOME CONFERENCE, 2007b, Amsterdam.
Chromosome Research. Hingham: Springer, 2007b. v. 15. p. 37-37.
MONDIN, M.; DOCHA NETO, A. Citogentica vegetal enfatizando a famlia orchidaceae.
Orchidstudium: International Journal of Orchid Study, Poos de Caldas, v. 1, p. 26-54, 2006.
MONDIN, M.; SANTOS-SEREJO, J. A.; AGUIAR-PERECIN, M. L. R. Karyotype
characterization of Crotalaria juncea l. (Leguminosae-Papilionoideae) by chromosome banding
and in situ hybridization of rDNA 45s and 5s. Genetics and Molecular Biology, Ribeiro Preto,
v. 30, p. 65-72. 2007.
MOSCONE, E. A.; KLEIN, F.; LAMBROU, M.; FUCHS, J.; SCHWEIZER, D. Quantitative
karyotyping and dual-color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated
Phaseolus species (Leguminosae). Genome, Ottawa, v. 42, p. 1224-1233, 1999.
NARANDER, T.; SHWETA; TANVIR, K.;.SRINIVASA RAO, M.; SRIVASTAVA, K.; PURI,
S. K. Prenylated chalcones isolated from Crotalaria genus inhibits in vitro growth of the human
malaria parasite Plasmodium falciparum Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Oxford,
v. 15, p. 24532455, 2005.
NAVASHIN, M. Changes in number and form of chromosomes as a result of hybridization. Z.
Zellforsch. Mikrosk. Anat., Viena, v. 6, p. 195223, 1927.
NAVRTILOV, A.; NEUMANN, P.; MACAS, J. Karyotype analysis of four Vicia species
using in situ hybridization with repetitive sequences. Annals of Botany, Londres, v. 91, p. 921-
926, 2003.
NEUMMAN, P.; NOUZOV, M.; MACAS, J. Molecular and cytogenetic analysis of repetitive
DNA in pea (Pisum sativum L.). Genome, Ottawa, v. 44, p. 716-728, 2001.
OLIVEIRA, A.L.P.C.; AGUIAR-PERECIN, M.L.R. Karyotype evolution in the genus
Crotalaria L. Cytologia, Tquio, v. 64, p. 164-174, 1999.
PALOMINO, G.; VZQUEZ, R. Cytogenetic Studies in Mexican Populations of Species of
Crotalaria L. (Leguminosae-Papilionideae). Cytologia, Tquio, v. 56, p. 343-351, 1991.
PANDO, L. A.; CARVALHO, D. D. de; TOYAMA, M. H.; CIERO, L. di; NOVELLO, J. C.;
PASCHOLATTI, S. F.; MARANGONI, R. Purification and Characterization of a Lectin from
Crotalaria paulina Seeds. The Protein Journal, Nova Iorque, v. 23, p. 437-444, 2004.
PEDROSA-HARAND, A.; ALMEIDA, C. C. S. de; MOSIOLEK M.; BLAIR M. W.;
SCHWEIZER, D; GUERRA, M. Extensive ribosomal DNA amplification during common bean
(Phaseolus vulgaris L.) evolution. Theoretical and Applied Genetics, Nova Iorque, v. 112,
p. 924-933, 2006.




66


PIKAARD, C. S. Nucleolar dominance and silencing of transcription Trends in Plant Science,
Londres, v. 4, p. 478-483, 1999.
PIKAARD, C. S. The epigenetics of nucleolar dominance Trends in Genetics, Londres, v. 16,
p. 495-500, 2000.
POLHILL, R. M. Miscellaneous notes on African species of Crotalaria: II. Kew Bulletin,
Londres, v. 22, p. 169-348, 1968.
POLHILL, R. M. Papilionoideae. In: POLHILL, R. M.; RAVEN, P. H. (Ed.) Advances in
legume Systematics. Londres: Royal Botanic Gardens, Kew, 1981. pt. 1, chap.1, p. 191-208.
POLHILL, R.M. Crotalaria in Africa and Madagascar. Rotterdam: Royal Botanic Gardens,
Kew, 1982. 389p.
RAINA, S.N.; MUKAI, Y.; KAWAGUCHI, K.; GOEL, S.; JAIN, A. Physical mapping of 18S-
5.8S-26S and 5S ribosomal RNA gene families in three important vetches (Vicia species) and
their allied taxa constituting three species complexes. Theoretical and Applied Genetics, Nova
Iorque, v. 103, p. 839-845, 2001.
RAINA, S.N.; VERMA, R.C. Cytogenetics of Crotalaria. I. Mitotic complements in twenty
species of Crotalaria L. Cytologia, Tquio, v. 44, p. 365-375, 1979.
RASKINA, O.; BELYAYEV, A.; NEVO E. Activity of the En/Spm-like transposons in meiosis
as a base for chromosome repatterning in a small, isolated, peripheral population of Aegilops
speltoides Tausch. Chromosome Research, Dordrecht, v. 12, p. 153-161, 2004a.
RASKINA, O.; BELYAYEV, A.; NEVO E. Quantum speciation in Aegilops: Molecular
cytogenetic evidence from rDNA clustes variability in natural populations. Proceedings
ational Academy Sciences of the United States of Amrica, Nova Iorque, v. 101, n. 41,
p. 14818-14823, 2004b.
RUAS, C. F.; AGUIAR-PERECIN, M. L. R. Chromosome evolution in the genus Mikania
(Compositae). American Journal of Botany, Ohio, v. 84, p. 1156-1163, 1997.
RUAS, C. F.; VANZELA, A. L. L.; SANTOS, M. O.; FREGONEZI, J. N.; RUAS, P. M.;
MATZENBACHER, N. I.; AGUIAR-PERECIN, M. L. R. Chromosomal organization and
phylogenetic relationships in Hipochaeris species (Asteraceae) from Brazil. Genetics and
Molecular Biology, Ribeiro Preto, v. 28, p. 129-139, 2005.
SCHUBERT, I. Mobile nucleolus organizing regions (NORs) in Allium (Liliaceae s. lat.)?
Inferences from specificity of silver staining. Plant Systematic and Evolution, Wien, v. 144,
p. 291-305. 1984.
SCHUBERT, I.; WOBUS, U. In situ hybridization confirms jumping nucleolus organizing
regions in Allium. Chromosoma, Nova Iorque, v. 92, p. 143-148, 1985.




67


SCHWARZACHER, T.; SCHWEIZER, D. Karyotype analysis and heterochromatin
Differentiation with Giemsa (]-Banding and Fluorescent Counterstaining in Cephalanthera
(Orchidaceae). Plant systematic and Evolution, Wien, v. 141, p. 91-113, 1982.
SCHWEIZER, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomyn and DAPI.
Chromosoma, Nova Iorque, v. 58, p. 307-324, 1976
SCHWEIZER, D. Counterstain-enhanced chromosome banding. Human Genetics, Nova Iorque,
v. 57, p. 1-14, 1981.
SHISHIDO, R.; SANO, Y.; FUKUI, K. Ribosomal DNAs: na exception to the conservation of
gene order in rice genomes. Molecular and General Genetics, Nova Iorque, v. 263, p. 586-591,
2000.
SINGH, R. J. Plant cytogenetics. 2nd ed., Londres: Boca Raton CRC Press, 2002. 463p.
STEBBINS, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. Londres: Edward Arnold, 1971.
216p.
SWANSON, C. P. Cytogenetics: the chromosome in division, inheritance, and evolution. 2nd
ed., Nova Jersey: Prentice-Hall, 1981. 577p.
SYBENGA, J. Cytogenetics in plant breeding. New York: Springer-Verlag, 1992. 469p.
TAPIA-PASTRANA, F.; GALLEGOS-PACHECO, E.; TEODORO-PARDO, C.; MERCADO-
RUARO, P. New cytogenetic information of two mexican populations of Crotalaria incana
L.(Leguminosae-Papilioideae). Cytologia, Tquio, v. 70, n. 2, p. 207-212, 2005.
UNIV HOSEO ACADEMIC COOP FOUND (Uyho). Seong, H. J.; Koh, S. B.; Kim, T. S.; Park,
H. W.; Park, C. G.; Kim, J. S.; Kang, M. H. Composition for preventing and treating large
intestine cncer without side effects comprising extract of Crotalaria sessiflora L. with
antioxidizing, anticancer and imune function-promoting activities KR 2007036099-A. 26
fev. 2007. 02 abr. 2007.
VAUGHAN, H. E; JAMILENA, M.; REJON R. C.; PARKER J. S.; GARRIDO-RAMOS M. A.
Loss of nucleolus-organizer regions during polyploid evolution in Scilla autumnalis. Heredity,
Londres, v. 71, p. 574580, 1993.
VENKATESWARLU, K.; LEE, S. W.; NAZAR, R. N. Conserved upstream sequence elements
in plant 5S ribosomal RNA encoding genes. Gene, Amsterdam, v. 105, n. 2, p. 249-253, 1991.
VERMA, R. C.; KESAVACHARYULU, K.; RAINA, S. N. Cytogenetics of Crotalaria. IX.
Mitotic complements in 19 species. Cytologia, Tquio, v. 49, p. 157-169, 1984.
VERMA, R. C.; RAINA, S. N. Cytogenetics of Crotalaria. II. Male meiosis in 8 species of
Crotalaria. Cytologia, Tquio, v. 45, p. 297-306, 1980.




68


VIEIRA, M. L. C.; AGUIAR-PERECIN, M. L. R.; MARTINS, P. S. M. A cytotaxonomic study
in twelve Brazilian taxa of Stylosanthes Sw., Leguminosae. Cytologia, Tquio, v. 58, p. 305-311,
1993.
VOSA, C. G. A revised cytotaxonomy of the genus Tulbaghia (Alliacaae). Caryologia,
Florncia, v. 53, p. 83-112. 2000.
VOSA, C. G.; PERRY, P. L.. On the cytotaxonomy of the genus Eriospermum Jacq. ex. Willd.
(Eriospermaceae). Caryologia, Florncia, v. 52, p. 117-125, 1999.
WENDEL, J. F. Genome evolution in polyploids. Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 42,
p. 225249, 2000.
WINDLER, D. Chromosome number for native North American unifoliate species of Crotalaria
(Leguminosae). Brittonia, Nova Iorque, v. 26, p. 172-176, 1974.
WINTERFELD, G.; RSER, M. Disposition of ribosomal DNAs in the chromosomes of
perennial oats (Poaceae: Aveneae). Botanical Journal of the Linnean Society, Londres, v. 155,
p. 193-210, 2007.




































69





























APNDICE


























7
0






















APNDICE A - Comprimento relativo (%) e tamanho (m) dos braos curto e longo dos pares cromossmicos nas espcies de Crotalaria