Maio 2014

ATDV
MMP-2 na formao de leso
aterosclertica em ratinhos deficientes em
Apolipoprotena E (apoE
-/-
)

Anibal Campos, Antnio Campos, Tiago Leite
Alvos Teraputicos na Doena Vascular
Keywords: Metaloproteinase; MMPs; MMP-2; Aterosclerose;
ABSTRACT
Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of endopeptidase wich responsible for
tissue remodeling and degradation of extracellular matrix (ECM). Recent studies have
shown that these can contribute to the development and progression of atherosclerosis.
The present study aims to assess the effect of MMP-2 in the formation of atherosclerotic
plaques in mice apoE
-/-
. Two groups of genetically modified mice were used, MMP-2
+/+
:
apoE
-/-
mice and MMP-2
-/-
: apoE
-/-
mice. After several weeks of feeding with a lipid-rich diet,
morphological and biochemical studies of the aortic arch and aortic valve (aortic sinus)
tissue were performed. It is expected a reduction of lesion area with the decrease in
macrophage-, collagen-, lipids and smooth muscle cell-positive area in MMP-2
-/-
: apoE
-/-
mice compared with that of MMP-2
+/+
: apoE
-/-
mice.

Abstract
As metaloproteinases de matriz (MMPs) so uma famlia de endopeptdases,
responsveis pela remodelao tecidular e degradao da matriz extra celular (MEC).
Estudos recentes tem evidenciado que estas podem contribuir para o desenvolvimento
e progresso da aterosclerose. Este estudo, tem como objectivo avaliar o efeito da
MMP-2 na formao de placas de aterosclerose em ratinhos apoE
-/-
.Foram utilizados
dois grupos de ratinhos geneticamente modificados: um grupo com ratinhos MMP-2
+/+
: apoE
-/-
e outro grupo com MMP-2
-/-
: apoE
-/-
. Aps varias semanas de alimentao
com dieta rica em lpidos, foram realizados estudos morfolgicos e bioqumicos do
tecido do arco artico e das vlvulas da aorta (seio da aorta). esperado que haja
uma diminuio da rea de leso nos ratinhos MMP-2
-/-
:

apoE
-/-
em comparao com
os ratinhos MMP-2
+/+
: apoE
-/-
assim como para as reas positivas para clulas do
musculo liso, macrfagos, colagnio e lpidos.

Remodelao Vascular
A renovao vascular definida com sendo a qualquer alterao no tamanho
e/ou composio de um vaso sanguneo em resposta a um estimulo hemodinmico,
permitindo a sua adaptao e reparao. Se por um lado, as alteraes a curto prazo
resultam de mudanas nas funes das clulas endoteliais e pela atividade neuro-
hormonal na musculatura lisa, as alteraes crnicas envolvem mudanas estruturais
na arquitetura dos vasos sanguneos.
17

Este fenmeno, de grande importncia tanto a nvel fisiolgico como a nvel
patolgico, sendo responsvel pelo crescimento dos vasos sanguneos e regresso
durante o desenvolvimento fetal, crescimento, exerccio fsico e gravidez. Uma
remodelao inadequada ou a sua ausncia, uma das causas principais de doenas
cardiovasculares, tais como a aterosclerose.
17
Para que ocorra remodelao vascular,
tem que ocorrer migrao de clulas do msculo liso e degradao da matriz
extracelular. Dois sistemas proteolticos, o sistema fibrinoltico
(plasminognio/plasmina) e as metaloproteinases de matriz (MMPs), so os
responsveis pela degradao da maioria dos componentes da matriz extracelular. A
plasmina responsvel por degradar alguns componentes da matriz extracelular tais
como a lamina e fibronectina, enquanto que as metaloproteinases de matriz so
responsveis pela degradao de elastina e colagnio. Contudo, o sistema
plasmina/plasminogenio desempenha um papel importante na ativao de vrias pr-
MMPs.
12

As metaloproteinases de matriz, tem sido objecto de estudo em relao a
remodelao fisiolgica (benfica) e remodelao patolgica (prejudicial).
6
Estudos
realizados in vitro e in vivo demonstraram que os principais fatores responsveis pela
remodelao vascular, tais como, o stress oxidativo, a inflamao, leses e estmulos
hemodinmicos regulam a expresso e a atividade das metaloproteinases de matriz.
17


MMPs
As metaloproteinases de matriz (MMPs) so uma grande famlia de enzimas,
endopeptdases, dependentes de zinco e clcio, que so responsveis pela
remodelao vascular atravs da degradao de componentes da matriz extracelular
(MEC), incluindo o colagnio, a elastina, a gelatina (colagnio desnaturado),
glicoprotenas da matriz, e proteoglicanos.
20

As MMPs so convencionalmente chamadas de colagenases, gelatinases,
estromelisinas, MMPs do tipo membranar (MT-MMPs) e outras MMPs baseadas na
sua especificidade para o substrato. (Tabela 1). A maior parte das MMPs so
constitudas por quatro domnios distintos, o pr-domnio no terminal N, um domnio
cataltico, uma regio de ligao (hinge) e um domnio do tipo hemopexina no terminal
C.
20
(Figura 1)


Tabela 1. Classificao das MMPs.
10

Pr-domnio
O pr-domnio contm o cisteine switch, uma sequncia conservada de Pro-
Arg-Cys-Gly-Val/Asn-Pro-Asp. O resduo de cistena na sequncia conservada
interage com o zinco presente no domnio cataltico de maneira a manter a inatividade
da enzima at o pr-domnio ser removido por protelises aquando da sua ativao.
13

Domnio cataltico
O domnio cataltico contm a ligao ao zinco HEXGHXXGXXH na qual possui
3 resduos de histidina que se ligam ao io zinco. As gelatinases tais como as MMP-2
e MMP-9, incorporam mdulos de fibronectina do tipo II localizados antes da zona de
ligao ao zinco no domnio cataltico.
13

Regio de ligao (hinge)
O domnio cataltico conectado ao domnio do tipo hemopexina por uma
regio de ligao flexvel que contm cerca de 75 aminocidos.
13

Domnio do tipo hemopexina
Todas as MMPs tm este domnio exceo da MMP-7,-23 e 26. Este domnio
tem uma similaridade estrutural protena do soro hemopexina. Este local determina a
especificidade para o substrato e o local de interao com os TIMPs.
13, 20


Figura 1 . Estrutura das MMPs.
13

A sua regulao feita por factores de crescimento, hormonas e citoquinas, e a
sua ao controlada por inibidores tecidulares das MMPs (TIMPs).
20
Quando so
sintetizadas, as metaloproteinases de matriz, encontram-se num estado inativado, pr-
MMP. Para passarem ao estado ativo, necessitam da ao de outra protase que
corta uma pequena seco da molcula. Isto vai expor o seu centro ativo, permitindo
que a MMP se ligue ao seu substrato. Os inibidores tecidulares de metaloproteinases
(TIMPs) podem inibir tanto a forma ativa como podem bloquear a ativao de pr-
MMPs (Figura2). O desequilbrio entre a ao de MMPs e TIMPs, resulta numa
sobrexpresso das MMPs, podendo provocar estados patolgicos.
8




Figura 2. Produo, ativao e inibio das MMPs.
8


Papel das MMPs na remodelao vascular
A remodelao vascular requer alteraes na dimenso e estrutura da parede
arterial. A MEC da parede dos vasos sanguneos composta por colagnio, elastina,
glicoprotenas e proteoglicanos. Os dois primeiros fornecem integridade e elasticidade
e so altamente regulados pelas MMPs. Atravs dos seus efeitos colagenolticos e
elastinolticos, as MMPs degradam a MEC ao desenrolarem o colagnio, tornando-o
mais frgil e quebram as molculas de elastina, respetivamente . As clulas
vasculares e as clulas inflamatrias tais como os macrfagos e neutrfilos produzem
colagenases (MMP-1, -8, e -13) e elastases (MMP-7 e outras protases). A restante
degradao da MEC da membrana basal e a ativao de agentes quimiotticos
(Figura 3) ocorre atravs da ativao das gelatinases (MMP-2 e MMP-9).
21



Em condies fisiolgicas normais, a atividade das MMPs so reguladas ao
nvel da transcrio, ativao dos zimgenos e pela interao com componentes
especficos da MEC. Alm disso, os inibidores teciduais endgenos das MMPs
(TIMPs) promovem um mecanismo de equilbrio de maneira a prevenir a degradao
excessiva da MEC.
17
Contudo, um desequilbrio entre as MMPs e as TIMPs pode
originar um aumento da atividade das MMPs podendo levar a alteraes patolgicas
na estrutura da parede dos vasos sanguneos provocando doenas vasculares.
17


Figura 3. As MMPs degradam o colagnio e a elastina e so
reguladas por vrios ativadores e inibidores.
21

MMPs na Aterosclerose
A desregulao do metabolismo da MEC contribui para a remodelao vascular
durante o desenvolvimento e complicao de leses aterosclerticas.
7
A aterosclerose
uma condio patolgica que pode advir de uma remodelao vascular defeituosa,
sendo atualmente reconhecida como uma doena inflamatria crnica da parede
vascular. Desde o incio do processo da formao da placa caracterstica a presena
de clulas inflamatrias que participam ativamente no processo de aterognese.
13
O
crescimento das placas aterosclerticas ocorre atravs de mudanas estruturais que
levam acumulao de clulas, MEC e lpidos dentro da camada intimal da artria.
6
A
degradao da membrana basal das clulas do endotlio durante a diapedse das
clulas inflamatrias pode contribuir para a diminuio da funo de barreira do
endotlio facilitando assim, o influxo de protenas plasmticas, incluindo as
lipoprotenas.
6
A interao das clulas infiltradas com a ECM parece aumentar a
produo de MMPs pelos macrfagos. Alm disso, os macrfagos estimulam a
produo de MMPs pelas clulas vizinhas bem como a ativao dos zimgenos. Este
aumento da atividade das MMPs nas leses aterosclerticas em desenvolvimento
pode facilitar alteraes estruturais e permitir assim o seu crescimento.
6
(Figura 4)
Em modelos animais ou humanos de aterosclerose, existe um aumento de
vrias MMPs nas leses arteriosclerticas, incluindo a MMP-1, -2, -3, -7, -9, -12,-13,
Figura 4. Produo e secreo de MMPs por clulas presentes na intima arterial.
6

MT-MMPs.
10
Estudos indicam que h uma aumento da expresso e da atividade
associadas ao desenvolvimento de leses neointimais na artria e migrao de
clulas do msculo liso aps a induo de uma leso arterial em balo em modelos
experimentais. Tambm se verificou que os inibidores das MMPs diminuem a
migrao das clulas do msculo liso quer in vitro e in vivo.
6

Acredita-se que as MMPs contribuem no s para o desenvolvimento e
progresso da aterosclerose mas tambm na ruptura da placa. Estas evidncias
sugerem um potencial papel das MMPs derivadas de macrfagos na fragilizao e em
ltimo caso na ruptura das placas.
10
Contudo existem poucos dados que sugerem uma
evidncia direta na contribuio das MMPs para o desenvolvimento de leses
aterosclerticas e na ruptura da placa. Apesar da atividade das MMPs serem
consideradas fundamentais para o desenvolvimento da aterosclerose, esta noo foi
desafiada por recentes estudos em ratinhos geneticamente modificados (Tabela 2)
onde se verificou que algumas MMPs tm um papel retardador no desenvolvimento de
leses aterosclerticas.
10

Tm sido elaborados alguns estudos acerca da atividade das MMPs e dos
TIMPS de maneira a compreender o seu papel no desenvolvimento de leses
aterosclerticas. O efeito da manipulao dos genes MMPs e TIMPs na remodelao
vascular esto sumarizados na tabela 2.
10

A sobrexpresso da MMP-1 em ratinhos ApoE
-/-
diminui inesperadamente a
extenso da aterosclerose. Estes resultados aparentam, contradizer o dogma
central na aterosclerose de que, o aumento da atividade das MMPs, leva
formao de uma neointima mais espessa, sugerindo que a atividade de
algumas MMPs pode mesmo ser antiaterognica.
10

Noutro estudo sobre a atividade da MMP-3, verificou-se que as leses
aterosclerticas so significativamente maiores em ratinhos MMP-3
-/-
: ApoE
-/-
Tabela 2. Efeitos da sobrexpresso e da deficincia das MMPs, TIMPs e inibidores sintticos
das MMPs.
10

quando comparados com ratinhos ApoE
-/-
. Contudo as placas aterosclerticas
dos ratinhos MMP-3
-/-
:ApoE
-/-
contm menos macrfagos e mais colagnio
fibrilar. Estas observaes sugerem que a MMP-3, por um lado contribui para a
destabilizao da placa e por outro lado para uma reduo do tamanho ao
degradar os componentes da MEC presentes nas placas.
10

A sobrexpresso do TIMP-1 resulta numa reduo das leses aterosclerticas
em ratinhos ApoE
-/-
.
10

A deleo do gene do TIMP-1 resulta numa reduo do tamanho da placa em
ratinhos ApoE
-/-
. o que demonstra ser contraditrio com o estudo anterior.
Contudo, os autores explica que na ausncia de TIMP-1 h um aumento do
nmero de macrfagos nas leses intimais arteriais. Estes macrfagos so
responsveis pela produo e ativao de MMPs, especialmente a MMP-2,
resultando numa degradao do colagnio, levando a uma reduo do
tamanho da placa.
10


Contudo, sero necessrios mais estudos para determinar o espectro total da
atividade das MMPs expressas nas placas aterosclerticas e assim verificar quais as
que so pr ou antiaterognicas.
Objetivo
Determinar se a metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) tem um papel pr ou
antiaterognico em ratinhos deficientes em Apolipoprotena E (apoE
-/-
).
MMP-2
A MMP-2, convencionalmente chamada de gelatinase A, uma enzima que
degrada especificamente o colagnio do tipo IV bem como o colagnio desnaturado
(gelatina). Tem sido implicada na migrao das clulas do msculo liso.
13
Foi
recentemente reportado que a rea das leses calcificadas na intima da aorta foi
significativamente maior em ratinhos MMP-2
+/+
ApoE
-/-
quando comparada com
ratinhos MMP-2
-/-
:ApoE
-/-
. A deficincia em MMP-2 origina uma reduo da protena
morfogentica do osso (BMP)-2 e de osteocalcina . Ambas do origem a condrcitos e
a protenas relacionadas com o osso. 2Foi verificada a expresso de MMP-2 em
condrcitos presentes em leses calcificadas. Esta deposio de clcio foi
significativamente suprida em cultura de clulas de msculo liso derivadas da aorta,
indicando que a MMP-2 pode contribuir para os mecanismos de calcificao
associados aterosclerose.
13

A MMP-2 especialmente importante para o desenvolvimento da remodelao
vascular ao promover a proliferao e a migrao de clulas do msculo liso
vasculares. Estudos in vivo demonstraram que a expresso e atividade de MMP-2 em
clulas do msculo liso est aumentada em regies vulnerveis das placas
aterosclerticas.
4
A expresso e atividade da MMP-2 e MMP-9 bem como a infiltrao
de macrfagos est aumentada nas leses aterosclerticas avanadas em ratinhos
LDLr
-/-
:ApoE
+/+
.
13
Tambm foi demonstrado que a deficincia em MMP-2 reduz
significativamente o desenvolvimento de leses neointimais na cartida quando
comparadas com ratinhos controlo.
11
Embora esteja descrito que a MMP-2 a maior
endopeptdase presente nas placas aterosclerticas, no h evidncia do papel da
MMP-2 na formao de leses aterosclerticas.
7


Metodologias
Modelo animal
O trabalho ser desenvolvido recorrendo a ratinhos deficientes em MMP-2 e
em apoE (MMP-2
-/-
:apoE
-/-
) tal como descrito previamente.
18
Para isto cruzou-se os
ratinhos MMP-2
-/-
com os ratinhos apoE
-/-
, sendo que primeiramente se obtiveram
ratinhos heterozigticos em relao deficincia em apoE e MMP-2
(MMP-2
+/-
:apoE
+/-
).
18
Depois esta gerao de ratinhos foi capaz de gerar os ratinhos
com o fentipo desejado (MMP-2
-/-
:apoE
-/-
). Utilizou-se ratinhos apoE
-/-
porque estudos
indicam que estes ratinhos apresentam um maior desenvolvimento de leses
aterosclerticas e uma maior hiperlipidmia do que os ratinhos LDL
-/-
.
16
Estes
seguiram uma dieta tipicamente do ocidente, rica em lpidos, a partir da quinta
semana, num total de 30 semanas.
19
No final, sero avaliadas alteraes morfolgicas
e biomecnicas no seio da aorta e no arco da aorta.
18

Anlise Imunohistoqumica
Para quantificar as leses aterosclerticas ser utilizada uma anlise
imunohistoqumica.
Ratinhos eutanizados com CO
2
5
e ser removido tecido do arco artico e das
vlvulas da aorta (seio da aorta) e cortado em pequenos segmentos;
16

Posteriormente procede-se a uma colorao destes segmentos, recorrendo a
tcnicas imunohistoqumicas. Para tal, os segmentos de tecido sero
incubadas com anticorpos contra:
o Macrfagos (Mac-2; 3.12g/ml; BD Biosciences, Oxford, U.K);
9

o Actina do msculo liso (SM actin; 1:25, Sigma Aldrich);
15

o Anticorpo policlonal de Coelho 37150 (1 g/mL, MGPLLVATFWPEK;
Abcam) para a MMP-2;
16

o Anticorpo policlonal de Coelho 16306 (1 g/mL, ab-3; Abcam) para a
MMP-9;
16

o Lpidos (red oil);
14

o Colagnio (Massons trichrome);
2

Os resultados da colorao imuno-histoqumica sero visualizados utilizando
um Kit ABC (Vector Laboratories) de acordo com as instrues do fabricante.
16

Para a quantificao da leso aterosclertica, sero captadas imagens
posteriormente reveladas por computador, comparando assim as reas que
so positivas para o anticorpo ou para o corante usado em relao rea total
de leso.
15

Real time PCR
Para quantificar a expresso de MMP-2 ser utilizado o mtodo PCR
quantitativo em tempo real (RT-PCR), sendo aplicado no tecido do arco artico e das
vlvulas da aorta (seio da aorta).
3
Este Esta tcnica tem como objetivo a confirmao
de que os ratinhos MMP-2
-/-
:apoE
-/-
no possuem esta enzima.
O PCR um mtodo de quantificao e amplificao do DNA. Neste caso
foram utilizados nesta tcnica primers especficos para a MMP-2 como est descrito.
3

Primer esquerda: 5-AGAAGATCGACGCTGTGTACGA-3
Primer direita: 5-GGCTGAATACACCCAGTATTCATTG-3

Como o objetivo desta tcnica verificar a expresso de MMP-2, nos ratinhos
MMP-2
-/-
:apoE
-/-
de esperar que no produzam qualquer fluorescncia, ou seja,
funcionem como uma espcie de controlo negativo, pois no possuem a enzima.
Quanto ao ratinho normal que expressa a MMP-2 (MMP-2
+/+
:apoE
-/-
) o resultado do
RT-PCR est dependente da quantidade existente de MMP-2 nos tecidos testados.



Zimografia
A MMP-9 semelhana da MMP-2 tambm se trata de uma gelatinase. As
MMPs 2 e 9 tm especificidades de substrato semelhantes, de modo que o efeito da
perda de MMP-2 pode ser compensada at certo ponto pela MMP-9. A zimografia
necessria para avaliar a atividade da MMP-2 e da MMP-9 nos tecidos j
mencionados.
Nesta zimografia ser utilizado como substrato a gelatina uma vez que mais
especifico para o tipo de MMPs a analisar. Esta tcnica ser elaborada como est
descrita na literatura.
1


Resultados esperados
esperado, que aps a anlise dos tecidos do arco artico e das vlvulas da
aorta (seio da aorta) se verifique uma dimunuio substancial da rea de leso nos
ratinhos MMP-2
-/-
:ApoE
-/-
em comparao com os ratinhos MMP-2
+/+
:ApoE
-/-
.
Tambm de esperar que nos ratinhos MMP-2
-/-
:ApoE
-/-
as reas positivas para
clulas do msculo liso, macrfagos e lpidos seja menor comparativamente aos
ratinhos MMP-2
+/+
:ApoE
-/-
uma vez que a deleo do gene MMP-2 reduz a formao
de leso da neointima, principalmente por causa da atenuao da migrao de clulas
musculares lisas da regio medial para a ntima devido a reduo de actividades
proteolticas resultantes da deficincia em MMP-2.
10

Outro resultado esperado, o de que os nveis de MMP-9 sejam similares tanto nos
ratinhos MMP-2
(-/-)
:ApoE
(-/-)
como nos ratinhos MMP-2
(+/+)
:ApoE
(-/-)
, enquanto que os
nveis de MMP-2 apenas sejam possveis de detetar nos ratinhos MMP-2
(+/+)
:ApoE
(-/-)
.
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