Carrera: Licenciatura en Ciencia y Tecnologa de

los Alimentos

Materia: Microbiologa General

Docentes: Lic. Guillermo Guirin
Lic. Martn Landriel

Ao: Segundo


Cuatrimestre: 1


BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

La bioseguridad en el laboratorio se refiere al conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la
salud de las personas que all trabajan. El propsito bsico es obtener un ambiente de trabajo seguro y
ordenado.

Un accidente ocurre por mltiples causas, pero casi siempre se debe a errores humanos, con excepcin de las
grandes catstrofes debidas a fenmenos atmosfricos. Una vez ocurrido dicho accidente, su consecuencia
puede ser banal, terminal o grave. Por lo tanto, resulta de vital importancia que dicho accidente no ocurra y
para ello es necesario conocer los hbitos de trabajo en el laboratorio de microbiologa as como tambin los
peligros potenciales que encierra el manejo de material biolgico y reactivos qumicos de diferente naturaleza,
y aquellos altamente txicos y/o cancergenos.
Resulta de fundamental importancia considerar en todo momento que, cuando se manejan agentes infecciosos,
existe siempre una posibilidad de infeccin, tanto para el operador como para otras personas, en caso de
negligencia o descuido.
A continuacin se enumeran una serie de precauciones que deben ser consideradas para reducir el riesgo de
adquirir infecciones y permitir el adecuado trabajo en el laboratorio:
1. Los ojos, la boca, la nariz, las pequeas abrasiones presentes en nuestras manos constituyen sitios efectivos
de entrada para los microorganismos. En consecuencia, se recomienda no comer, beber, fumar ni tocarse la
cara durante la realizacin del trabajo prctico, as como tambin el lavado de manos previo y posterior una
vez finalizado el mismo.
2. Se deben lavar las manos con jabn o detergente lquido y secarlas con toallas de
papel al inicio del prctico, despus de haber manipulado material infeccioso y al
abandonar el laboratorio.

3. El uso de guardapolvo ser imprescindible para la proteccin del operador. El mismo deber ser
higienizado peridicamente y adems deber evitar el contacto con ropa de calle.
4. Mientras se maneja material estril, es conveniente no hablar ni circular por el laboratorio, de manera tal de
evitar las corrientes de aire y por ende disminuir el riesgo de contaminacin. No pipetear jams con la boca
ningn medio de cultivo (inoculado o no) o reactivo qumico. Para esta tarea se deber hacer uso de
propipetas.
5. Con el fin de reducir la contaminacin de material estril, las mesadas debern ser limpiadas con un trapo o
papel embebidos en una solucin desinfectante (por ejemplo, hipoclorito de sodio 1000 ppm o etanol 70%)
antes y despus de trabajar.
6. El material contaminado ser descartado en recipientes provistos para tal efecto. Nunca se volcarn cultivos
de microorganismos en las piletas.
7. Los cultivos debern ser rotulados con nombre o nmero identificatorio, nombre del material y fecha. La
incubacin de los mismos es responsabilidad del operador.
8. Los microscopios pticos se limpiarn y guardarn adecuadamente. Los reactivos se ubicarn en una zona
del laboratorio destinada para tal fin. Se deber revisar si los mecheros quedaron correctamente apagados una
vez finalizado el trabajo.
9. El laboratorio no es un lugar apto para el consumo de alimentos o bebidas, ya que
existe la posibilidad de ingerir sustancias contaminadas por accidente.

Cuando por razones ajenas a la voluntad de los operadores ocurre un accidente, es obligatorio saber las
conductas a seguir dado que el devenir de la salud de las personas involucradas depende del tiempo en que se
pone en prctica el auxilio correcto. En particular, si un cultivo es volcado o roto su envase, o si alguien
resultara herido en tal episodio, se deber informar de inmediato a la persona responsable a cargo del trabajo
en el laboratorio.
Deseamos transmitir que todas las medidas de bioseguridad no son per se prohibitivas o represivas, se trata de
preservar la salud e integridad de los operadores interesados en aprender correctamente el manejo de
microorganismos.

MATERIAL DE USO HABITUAL EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y CONCEPTOS
DE ESTERILIZACIN, DESINFECCION Y ANTISEPSIA

EQUIPOS DE SEGURIDAD (Contencin primaria). Los elementos de contencin primaria deben permitir
al operador la preparacin y transferencia del material potencialmente infeccioso sin romper la barrera. Estos,
incluyen elementos simples como guantes, delantal, cofias, barbijos, tubos de centrfuga con tapn,
homogenizadores con sistemas cerrados, propipetas, etc, y otros elementos de mayor tecnologa y de mayor
importancia como los gabinetes de bioseguridad.
DISEO DEL LABORATORIO (contencin secundaria). El diseo debe estar pensado para proteger al
personal de laboratorio, como tambin a las personas que trabajan en otras reas de la institucin y a la
comunidad. Debe estar localizado fuera del rea de atencin del personal ajeno al laboratorio, visitas, y con
acceso limitado. El diseo y los materiales de laboratorio deben permitir una fcil limpieza. Cada seccin
requiere adems un lavamanos.
Segn el nivel de bioseguridad que el laboratorio requiera deben cumplirse otras especificaciones.
PRACTICAS DE TRABAJO. Corresponde a la utilizacin estricta de los procedimientos y tcnicas
especialmente diseadas para disminuir el riesgo. Para ello el personal debe estar consciente de los riesgos de
la manipulacin de agentes infecciosos. Su importancia relativa es mayor al 95% en cuanto a la prevencin de
infeccin en el laboratorio. Es importante la aceptacin y compromiso de cada uno de los miembros del
laboratorio acerca de las medidas de seguridad que sean implementadas.

Material de Vidrio

Material Utilizacin
Tubos de ensayo Contener medios de cultivo
Tubos de hemlisis Contener medios de cultivo
Placas de Petri Siembra en medio slido en superficie
Pipetas graduadas Traspaso de lquidos en volmenes exactos
Pipetas Pasteur Traspaso de lquidos en volmenes pequeos
Asa de Drigalsky Extensin de siembra en placa
Matraces Erlenmeyer Contener medios de cultivo
Matraces Kitasato Filtracin al vaco de medios de cultivo y otros lquidos
Probetas Medicin de volmenes exactos
Portaobjetos Observaciones microscpicas
Cubreobjetos Observaciones microscpicas
Campana Durham Deteccin de gases
Vasos de precipitado Contener y preparar soluciones

Otros Materiales

Mango de Ansa y Ansa Siembra de microorganismos en superficie
Ansa Recta Siembra de microorganismos en picadura
Filtros 0.22 micrones Esterilizacin de medios lquidos termolbiles por filtracin
Discos de antibiticos Valoracin de antibiticos
Mechero Bunsen Esterilizacin al rojo y flameado
Porta pipetas Contener pipetas estriles
Papel pH Determinacin del pH de medios de cultivo y soluciones
Cestillo metlico Contener material a esterilizar en autoclave

Equipos

Microscopio ptico Observacin de preparaciones
Autoclave Esterilizacin por calor hmedo
Horno Pasteur Esterilizacin por calor seco
Refrigerador Mantencin de cultivos
Flujo Laminar Siembra en condiciones aspticas
Incubadora o Estufa Crecimiento de cultivos en condiciones controladas de temperatura
Cmara de anaerobiosis Contener cultivos anaerobios
Cuenta colonias Recuento de colonias de microorganismos
Ph metro Ajustar el pH de medios de cultivo o soluciones
Destilador Obtencin de agua destilada para preparacin de medios de cultivo
Freeser Almacenamiento prolongado de medios de cultivo

En los prcticos de microbiologa es necesario tener todo el material a usar libres de microorganismos viables
y limpios. De esta manera se impide el crecimiento de mltiples contaminantes que pueden interferir con un
microorganismo inoculado aspticamente que constituye el objeto de estudio.

Esterilizacin: Concepto y mtodos.
La esterilizacin es un proceso a travs del cual un objeto o sustancia queda libre de todo organismo viviente,
en trminos de viabilidad, la capacidad que ese organismo posee para dividirse. Existen varios mtodos
prcticos para esterilizar: la eleccin depende, fundamentalmente, de la naturaleza de los materiales a
esterilizar y de la conveniencia.
Asimismo, se pueden emplear distintos mtodos de desinfeccin mediante agentes que slo disminuyen el
riesgo de contaminacin sin garantizar la eliminacin de todo organismo viviente, fundamentalmente por la
eliminacin de los micoorganismos patgenos. Es decir, la desinfeccin elimina el potencial infectivo de un
material.
A su vez, un antisptico se opone a la sepsis o a la putrefaccin, ya sea por accin letal de los
microorganismos o impidiendo su desarrollo. Este trmino se emplea con frecuencia para aquellos agentes que
se aplican en forma tpica sobre los tejidos vivos.
La eleccin de un procedimiento o agente apropiado est determinada por la situacin especfica y por el
hecho de que sea necesario destruir a todos los microorganismos (m.o.) o slo a ciertas especies. La
destruccin completa de todos los m.o. presentes sobre cualquier material o dentro de l, es indispensable en
los procedimientos quirrgicos, en la preparacin de medios de cultivo y material de vidrio utilizado en el
laboratorio de Microbiologa, y en el envasado de alimentos, por ejemplo. En el cuidado de personas con
enfermedades transmisibles, la destruccin del patgeno es necesaria para prevenir la diseminacin de la
infeccin a personas susceptibles. Con este propsito, una desinfeccin resulta adecuada y, en general, se la
emplea en el procedimiento de limpieza.
La esterilizacin o desinfeccin pueden llevarse a cabo segn dos mtodos:

Mtodos Fsicos

Agentes Aplicacin
Calor Hmedo Esterilizacin y descontaminacin
Calor seco Esterilizacin
Radiacin Ultravioleta Esterilizacin y Desinfeccin
Radiaciones ionizantes (, x) Esterilizacin
Filtracin Esterilizacin

Mtodos Qumicos

Agentes Aplicacin
Alquilantes Oxido de etileno Esterilizacin
Formaldehdo Desinfeccin o Esterilizacin
Alcoholes (alifticos y aromticos) Desinfeccin
Oxidantes: halgenos, KMnO4, H2O2 Desinfeccin o antisepsia
Tensioactivos catinicos y aninicos Desinfeccin
Metales pesados Desinfeccin o antisepsia
Soluciones de cidos o lcalis Desinfeccin
Nota: Se deber leer el Anexo de Bioseguridad para estudiar los Mtodos Qumicos de Esterilizacin y
Desinfeccin. Control de crecimiento microbiano se desarrollar en la segunda mitad del programa de la
materia.

Esterilizacin por Calor Hmedo.

Es proporcionado por autoclaves, aparatos especiales capaces de generar vapor bajo presin. El principio
esterilizante del autoclave se basa en la acumulacin de vapor y no en la presin desarrollada en su interior. El
vapor se condensa en los objetos ms fros y los calienta instantneamente cedindoles su calor latente. La
esterilizacin en autoclave se lleva a cabo desde 15 a 30 min a 121 C, condiciones que corresponden a una
presin aproximada de 1,1 Kg/cm2 . El tiempo es necesario para que el vapor penetre y caliente los materiales
hasta la temperatura esterilizante que causa coagulacin y desnaturalizacin de las estructuras proteicas y
enzimticas. An cuando dicha temperatura es alcanzada, las esporas y clulas vegetativas no mueren todas
instantneamente; en general se requiere alrededor de 12 min a 121C para matar endosporas.
Precauciones:
1- el vapor debe estar libre de impurezas e idealmente proporcionado a partir de agua destilada.
2- La carga debe estar acomodada de manera tal que el vapor pueda circular libremente.
3- Aquellos artculos que se encuentren cerrados hermticamente no estarn estriles al finalizar la operacin
(hay que permitir un intercambio gaseoso eficiente para garantizar una esterilizacin adecuada).
4- Los frascos con medios lquidos no deben llenarse ms de las 2/3 partes de su contenido, ya que el lquido
se volcar durante el proceso.
5- Transcurrido el tiempo, la presin debe disminuir lentamente para evitar la ebullicin violenta de las
soluciones.
En autoclave se esterilizan soluciones salinas, ropa, guantes, materiales de ciruga, tapones, gomas.
Normas de bioseguridad: cualquier material (sea de vidrio o descartable) que contenga un cultivo de
microorganismo debe ser descontaminado. La descontaminacin es un proceso ms violento y agresivo q la
esterilizacin por el cual se utiliza el autoclave a 130-150C durante 30 minutos. Los materiales descartables,
luego de la descontaminacin sern arrojados a los cestos de residuos correspondientes. El material de vidrio q
haya entrado en contacto con cultivos sern descontaminados convenientemente: por ejemplo las pipetas se
llevaran a un descarte con solucin de hipoclorito de sodio al 10000 ppm y los erlenmeyer q contengan
cultivos se llevarn al autoclave. El material de vidrio descontaminado y aquel q no requiera
descontaminacin por no haber estado en contacto con cultivos se descartara en la bacha para su posterior
lavado y limpieza.

TRABAJO PRCTICO N1
MICROBIOLOGA DE AIRE Y SUPERFICIE
Durante la elaboracin de alimentos, la contaminacin microbiana (tanto los microorganismo alterantes y
saprfitos como los patgenos), se encuentran en las superficies de los equipos y reas de trabajo (pisos,
paredes, mesadas, y utensilios de trabajo), en las superficies expuestas de los operarios (manos, rostro, pelo) y
en las secreciones de la nariz y la boca.
Existe una relacin directa entre la actividad que se realiza en el mbito de trabajo y el nmero y tipo de
microorganismos q colonizan un ambiente y superficie. La contaminacin microbiana de las superficies de
los equipos y reas proviene del suelo, agua, materias primas y del operario.
En el aire, las partculas de polvo o los aerosoles son los que transportan la contaminacin que proviene de la
dispersin del agua y del suelo. Las empresas elaboradoras de alimentos tienen la responsabilidad de asegurar
la inocuidad y calidad de los productos que expenden. Un componente esencial de los planes de
Aseguramiento de la Calidad, son los procedimientos de limpieza y desinfeccin conocidos como POES
(Procedimientos Operativos estandarizados de Saneamiento).
La limpieza y desinfeccin previenen la contaminacin de los alimentos producida por las superficies en
contacto directo con los mismos. En algunos casos la higiene es una condicin extremadamente necesaria, y
como tal debe tener asociado un sistema de monitoreo y registro. Adems cuanta ms alta sea la concentracin
de microorganismos en un alimento, ms corta es la vida til del mismo por lo que el control de los mismos
ayuda a evitar grandes prdidas econmicas en las lneas de produccin. Las tcnicas analticas que se deben
utilizar para monitorear deben ser rpidas y seguras de manera tal de detectar errores en forma inmediata y
aplicar las acciones correctivas correspondientes antes de que se contamine el alimento. De esta forma se
mantiene el proceso bajo control, se evita la aparicin de productos rechazados al final del proceso o el
conflicto con consumidores que sufran los efectos de la contaminacin. Con un contador de partculas se
puede controlar el nmero de partculas totales (viables y no viables) pero no diferencia a los
microorganismos de las partculas inertes. A continuacin se describirn los mtodos ms habituales para
controlar y evaluar la contaminacin del Aire y las Superficies.
Mtodo de Sedimentacin:
Existen diferentes mtodos que permiten evaluar la calidad microbiolgica del aire. Uno de los ms utilizados
es el mtodo de sedimentacin en placas de agar, que consiste en exponer placas con un medio nutritivo slido
al ambiente durante un periodo determinado, incubar las placas y hacer el recuento de las colonias obtenidas.
El tiempo de exposicin depende del ambiente a evaluar: mientras mayor sea la contaminacin menor ser el
tiempo de exposicin de las mismas. Con este mtodo se detectan los microorganismos que caen sobre la
superficie de la placa, lo cual simula lo que ocurre normalmente cuando estamos trabajando. Como las
condiciones ambientales influyen en la sedimentacin de los microorganismos es necesario que, cuando se
realiza este mtodo, las placas se expongan siempre en el mismo lugar y bajo las mismas condiciones para
poder comparar los resultados obtenidos. Este mtodo requiere de la calibracin segn el rea a evaluar y sus
condiciones ambientales: si dichas condiciones cambian se debe volver a calibrar el mtodo. Este mtodo es
muy utilizado para evaluar tanto reas de laboratorio como zonas de produccin de alimentos as como validar
el funcionamiento de flujos laminares y cabinas de bioseguridad.
Mtodo de Filtracin

El aire, aspirado por una bomba de vaco que forma parte del muestreador, pasa a travs de un orificio y es
dirigido a la superficie del medio de cultivo contenido en una placa adecuada.
Muchos muestreadores emplean este mtodo, algunos recogen las partculas sobre una superficie nica,
mientras otros las recogen por diferentes fracciones de tamao (dimetro aerodinmico equivalente), en
superficies sucesivas (impactacin en cascada). Ejemplos de estos muestreadores por impactacin incluyen los
de rendija, impactadores de etapa simple, impactadores 2 y 6 etapas o placas (este ltimo considerado como
mtodo de referencia), impactador en cascada que recoge fracciones sobre portaobjetos.
La identificacin especfica del agente biolgico supone habitualmente que se proceda a su resiembra, en
medio idneo, y la posterior aplicacin de reacciones de identificacin o estudios por morfologa directa o
tinciones especficas. La ventaja de este mtodo por sobre el de sedimentacin es que la cuantificacin se
realiza por volumen de aire filtrado.








Mtodo de Hisopado

El hisopado de superficies es el mtodo ms empleado para evaluar la higiene de las superficies en las reas
de trabajo de los establecimientos donde se elaboran y procesan alimentos y de los laboratorios, especialmente
si las superficies son irregulares y de difcil acceso para anlisis. Adems presenta la versatilidad de poder
emplear el mtodo de manera cuantitativa (expresando los resultados como u.f.c./cm2) y/o cualitativa (en caso
de investigaciones donde interesa la presencia o ausencia del microorganismo en estudio).
Para realizar el estudio se requiere de un hisopo estril el cual es embebido en solucin salina. El hisopo se
frota sobre la superficie a evaluar, midiendo la superficie si es que el ensayo es cuantitativo y teniendo la
precaucin de ir rotando el hisopo para mejorar la transferencia de los microorganismo al hisopo. A
continuacin se sumerge en un tubo con solucin salina estril para su posterior determinacin.
En el caso de realizar el ensayo cuantitativo se debe desprender los microorganismos del hisopo (por medio de
vortex o similar) y realizar un recuento microbiano sobre la solucin salina. Para ello se pueden emplear dos
mtodos: o bien se filtra el contenido de la solucin salina sobre un filtro de 0.45 micrones y luego se llevara
el filtro a un placa con medio de cultivo slido adecuado o se puede realizar una siembra directa de una
alcuota conocida de la solucin salina sobre la superficie del medio slido agarizado en la placa de petri.
Luego se llevaran las placas a incubar a una temperatura y tiempo adecuados.

Mtodo de Soporte o Placas de contacto
Los soportes o las Placas de Contacto son ideales para el control microbiolgico de superficies lisas, duras y
no porosas. El medio de cultivo posee la superficie convexa, permite aplicar la presin adecuada para capturar
el mayor nmero de microorganismos posibles. Un mtodo rpido y eficaz, que permite realizar el control de
superficies sin la necesidad de equipamientos de laboratorio sofisticados ni formacin especfica en
microbiologa. Disponibilidad de una amplia gama de medios de cultivo permite cubrir las necesidades del
control microbiolgico de superficies.
Se coloca la placa sobre la superficie a muestrear de una forma directa, mantenindola inmvil y presionando
durante unos segundos. Se incuban en una estufa de cultivo a la temperatura y tiempo requerido en cada caso.
Finalmente contar las colonias que han crecido y expresar el resultado en UFC/placa o UFC/cm2.



Mtodo por Bioluminiscencia
Los residuos de materia orgnica en las superficies se convierten en una fuente de nutrientes para los
microorganismos presentes y adems los protegen frente a la accin de los desinfectantes.
Una tcnica rpida para el monitoreo de la higiene es la deteccin de ATP por Bioluminiscencia.
El ATP es una molcula que est presente en todos los organismos vivos y se encuentra tambin en grandes
cantidades en los alimentos en la forma de ATP-no microbiano (somtico) y puede estar presente tambin
como ATP Libre. Es as como la presencia de ATP permite la deteccin de estos dos tipos de contaminacin
en forma conjunta.
La tcnica de determinacin de higiene por ATP Bioluminiscencia puede ser utilizada en cualquier tipo de
industria de Alimentos y especficamente para monitoreo de higiene de superficies de contacto directo.
Adems de ser utilizada para el monitoreo de higiene, la tcnica ha sido implementada en una amplia gama de
ensayos incluyendo el monitoreo de calidad microbiolgica de muestras que contienen cultivos iniciadores,
barros activados y fermentaciones.
La ATP-Bioluminiscencia est basada en una reaccin que ocurre en forma natural en las lucirnagas
(Photinus pyralis). La reaccin bioluminiscente catalizada por la luciferasa utiliza la energa qumica
contenida en la molcula de ATP para producir la descarboxilizacin oxidativa de la luciferina a
oxiluciferina, dando como resultado la produccin de LUZ.
La cantidad de luz emitida es proporcional a los niveles de microorganismos y/o materia orgnica presente.
Existen distintas tcnicas para la determinacin de ATP por Bioluminiscencia. Las variaciones
estn dadas por la integracin o no de los reactivos y reactantes en un mismo dispositivo utilizado, a su
vez, para la toma de muestra. En este sentido se pueden encontrar hisopos, cubetas o lapiceras.



Ventajas:
- Rapidez en la obtencin de los resultados: lectura de resultados en segundos.
- Instrumental de fcil manejo: equipos porttiles.
- Tcnica sencilla: hisopado de superficies.
- Resultados estimulantes: la implementacin como monitoreo de las condiciones higinicas motiva al
personal encargado de las tareas de limpieza y desinfeccin que tienen la posibilidad de ver los resultados del
anlisis efectuado.
- Prevencin de fallas mayores: permite llevar a cabo acciones correctivas ante fallas en las condiciones
higinicas de las superficies de contacto directo sin que los alimentos lleguen a contaminarse.
- Elevada Sensibilidad: Deteccin de muy bajos niveles de ATP.

Desventajas:
- Calibracin y validacin constante mediante inoculaciones de superficie y/o hisopados de superficie.
- Los consumibles de este tipo de equipos tienen un costo elevado.
- Los resultados se presentan en una escala arbitraria que es difcil de aceptar por los microbilogos
acostumbrados a obtener resultados exactos como unidades formadoras de colonias (UFC).
- Actualmente la bioluminiscencia no puede indicar la presencia o ausencia de patgenos, slo informa el
nivel total de contaminacin como ATP que existe sobre una superficie.
- Los compuestos qumicos tales como detergentes y desinfectantes pueden interferir en la reaccin de ATP
Bioluminiscencia por los siguientes caminos: - Reaccin de quimioluminiscencia que da falsos
positivos
- Reduccin de la respuesta bioluminiscente por
interferencia con la enzima luciferasa que es muy sensible a la accin de los compuestos qumicos.
No obstante ante esta desventaja, existen modificaciones de la tcnica que incluyen reactivos para
reducir esta interferencia por inactivacin de los compuestos qumicos y/o dilucin.

Definitivamente, el xito en el uso de estos equipos est en que consideremos las caractersticas del lugar en el
que los usaremos: tamao, escala, ambiente, cantidad de controles, nmero y capacidad del personal, tipo de
producto elaborado, procedimiento de limpieza y desinfeccin realizados, recursos econmicos.





PARTE EXPERIMENTAL:
OBJETIVO:
- Evidenciar la contaminacin del aire y las superficies por medio de ensayos cualitativos.
- Que el alumno tome contacto con las normas de bioseguridad del laboratorio de Microbiologa
- Que el alumno reconozca los materiales y equipos a utilizar en el laboratorio de Microbiologa
- Adquirir destreza en la observacin macroscpica de microorganismos en medios de cultivos slidos
(agar)
TRABAJO PRCTICO N 2
MTODOS DE SIEMBRA

En la naturaleza los microorganismos existen como poblaciones mixtas de varios tipos diferentes. Al igual que
otras formas de vida, los microorganismos necesitan nutrientes adecuados y ambientes favorables. Todos los
estudios de laboratorio requieren de cultivos puros, constituidos, en nuestro caso, por una nica especie de
bacterias, razn por la cual es necesario esterilizar los medios de cultivo y mantenerlos en condiciones
estriles, de manera tal de poder utilizarlos para sembrar un inculo de cultivo puro evitando la contaminacin
ambiental.
Cualquier transferencia de microorganismos de un medio a otro lo llamaremos siembra. Para iniciar un
cultivo bacteriano, un nmero de clulas (inculo) es transferido (inoculado) a un medio estril. Luego, dicho
medio es incubado a la temperatura adecuada para su crecimiento, lo que significa, el desarrollo de una
poblacin de clulas a partir de una o pocas clulas. La masa de clulas hijas se hace visible como turbidez en
medio lquido o como una poblacin aislada y pura (colonia) en medio slido.
Cuando se inocula un medio de cultivo slido, las clulas hijas no se dispersan a medida que se dividen como
ocurre en un medio lquido, sino que establecen una colonia fija. Si las bacterias inoculadas estn lo
suficientemente separadas en la superficie del medio slido, cada una desarrollar una colonia separada. Este
hecho es de suma importancia ya que constituye el paso inicial para poder identificar un microorganismo
determinado.

Tcnicas de Siembras

En medios slidos: Por medio de ansa o de un hisopo se puede sembrar en superficie de medios slidos
contenidos en placas o tubos de ensayo.






La siembra puede darse por estra diseminando el inoculo contenido en el hisopo o en el rulo del ansa
haciendo zigzag suavemente sobre la superficie del medio



Cuando desea obtener un cultivo puro a partir de una flora heterognea la estra sigue un procedimiento para
lograr el crecimiento aislado de colonias q nos permitan identificar al clon puro. Este procedimiento se
denomina Aislamiento por agotamiento en superficie en placa de petri. Lo q supone este procedimiento es
que el ansa cargada con el cultivo mixto se estriara aprovechando toda la superficie del agar. Se seccionara la
placa en tercios o cuartos, para descargar el ansa, donde cada nueva estra comenzara donde termina la
anterior a excepcin de la ltima estria q no deber tocar ni las anteriores ni la ltima para lograr el clon puro.
Cada seccin nueva que se estra genera que el ansa se descargue llegando a la ltima seccin con una
cantidad de microorganismos baja que generarn las colonias aisladas.


Cuando se utilizan picos inclinados en tubos de ensayo el objetivo es obtener el crecimiento masivo de los
cultivos que se suponen puro del aislamiento para poseer un gran nmero de clulas viables para su posterior
estudio (reaislamiento) o bien para evaluar su metabolismo o su actividad enzimtica cuando se usan medios
de cultivo especficos. De esta manera se obtiene una superficie expuesta para estriar con ahorro de espacio,
materiales y medios.

La puncin o siembra por pinchazo se utiliza con medios slidos o semislidos para evaluar el tipo
respiratorio del microorganismo o su movilidad. Requiere de una columna del medio en tubo y de un ansa con
la punta recta sin el rulo. El pinchazo debe estar centrado en el medio del tubo y sin generar roturas en exceso
del medio. Para evaluar movilidad se deber pinchar hasta la mitad de la columna y para evaluar el
metabolismo se pinchar hasta el fondo del tubo.





En un laboratorio de microbiologa todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de tal modo que se
impida la contaminacin en el rea de trabajo. Los procedimientos utilizados para conseguirlo se conocen con
el nombre de "Tcnica asptica".
La "Tcnica asptica" se realiza cuando se trabaja con mechero sobre mesadas limpias y tiene un doble
objetivo: a) evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes de las muestras o cultivos y
b) evitar la contaminacin de las muestras y cultivos con microorganismos procedentes del ambiente o del
propio operador.
Se debe trabajar siempre al lado de una llama de un mechero. Esta llama crea a su alrededor una atmsfera
estril y adems la utilizaremos para esterilizar o flamear parte del material que utilizamos durante la siembra.
Las ansas deben esterilizarse antes de utilizarlas y una vez esterilizadas deben enfriarse antes de tomar la
muestra de microorganismos con objeto de no destruirlos con el calor. El ansa se enfra sobre el agar o sobre
el material de vidrio (en zonas estriles del material de vidrio). Despus de utilizarlas las asas se vuelven a
esterilizar.
Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapados y despus de la
inoculacin. Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano sujetndolos por la parte que no
entra en contacto con tubos y matraces. Siempre que es necesario abrir un tubo debe mantenerse en posicin
inclinada para que el riesgo de contaminacin sea mnimo. Las tapas de las placas de Petri no deben colocarse
nunca sobre la mesa de trabajo.
Siembras para recuento en placa:
Esta tcnica permite la determinacin de los microorganismos presentes en una muestra, basndose en su
crecimiento y desarrollo en forma de colonias, en un medio de cultivo especfico en placa. Se determinan por
este mtodo slo las clulas microbianas viables en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera
temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto a partir de una clula como de un grupo de clulas,
se utiliza el trmino unidades formadoras de colonias (ufc).





Observacin macroscpica de colonias:
Bordes: entero, ondulado, lobulado, aserrado, arborescente, etc.
Superficie: lisa, rugosa, granulada, transparente, opaca, con surcos, etc.
Consistencia (ayudados con el ansa): mantecosa, seca, filante
Elevacin: plana convexa, mamilar, elevada con depresin, etc.
Pigmento: soluble, insoluble, fluorescente
Olor: frutal, fecal, sulfhdrico, ptrido, etc.



ACTIVIDAD EXPERIMENTAL
OBJETIVO:
- Que el alumno adquiera la destreza sobre las diferentes metodologas de siembra a partir de
suspensiones testigo inoculadas e incubadas en el laboratorio: se utilizarn agar en placa de petri,
tubos en pico de flauta, tubos con medios semislidos y caldos
- Observar las caractersticas macroscpicas de las colonias aisladas y la turbidez de los caldos.












TRABAJO PRCTICO N 4

FACTORES DE CRECIMIENTO: FACTORES INTRNSECOS, EXTRNSECOS

Los alimentos contienen una gran variedad de microorganismos que provienen de las materias primas y de los
mbitos donde se producen, manipulan y almacenan. Pero solo una parte de la poblacin original puede llegar
a multiplicarse para generar alteracin de los productos. Los factores o parmetros que son la causa de la
multiplicacin de algunos de los microorganismos presentes originalmente son:

Factores Intrnsecos:

1. Actividad acuosa: ms all de la definicin fsico qumica de aw, en microbiologa se define como
la cantidad de agua disponible para el desarrollo de los microorganismos. El agua disponible
son aquellas molculas que no se encuentran ligadas por fuerzas intermoleculares a las molculas
de los alimentos (azcares, protenas y sales principalmente). La mayora de las bacterias crecen a
aw cercanas a 1. Otros como levaduras tienen un aw mnimo de 0.6 y los hongos de 0.4.
2. Potencial redox: est ntimamente relacionado con el metabolismo aerbico, facultativo o
anaerobio de un microorganismo. Los primeros requieren potenciales (Eh) positivos (oxidado) y
los ltimos, negativos (reducido).
3. pH: Si bien la mayora de los microorganismo crecen alrededor del neutro tienen un rango de
crecimiento, con un pH mnimo de crecimiento que se ver influido por la naturaleza orgnica o
inorgnica de la acidez
4. Nutrientes: segn el tipo de alimento se le proveer a los microorganismos de fuente de carbono,
nitrgeno, vitaminas, minerales y factores de crecimiento
5. Antimicrobianos naturales: Algunos alimentos poseen antimicrobianos naturales como ser
lizosima en el huevo, lactoperoxidasa en la leche, nitratos y nitritos en aguas y leches, entre otros.
6. Estructuras biolgicas: La cubierta natural de los alimentos son una barrera excelente para
proteger el interior de los alimentos (cscara de vegetales y del huevo, la piel de los animales,
entre otros)

Factores Extrnsecos:

1. Gases del ambiente: segn el metabolismo de los microorganismos se desarrollarn o inhibirn
con las tensiones de oxgeno, CO2 y nitrgeno molecular. Adems puede haber en al ambiente
gases antimicrobianos como el acetileno o el ozono.
2. Temperatura: Los microorganismos crecen en amplios rangos temperaturas, los cuales en algunos
casos es muy importante conocerlos. Si bien se clasifican segn temperaturas ptimas de
crecimiento los rangos pueden variar segn el tipo de microorganismo.
3. Humedad: la humedad relativa del ambiente es importante desde el punto de vista de la aw del
producto (por la migracin de agua al interior) como por el crecimiento de los microorganismos
en la superficie del producto.
4.
Adems, otros factores tambin influyen en el crecimiento de los microorganismos.

Factores Tecnolgicos: pasteurizacin, esterilizacin, refrigeracin o congelacin, irradiacin,
Factores Implcitos: sinergismo, cambios de pH, cambios en el Potencial Redox
Poder demostrar como un parmetro dentro de un ensayo influye en el crecimiento de los microorganismos
requiere del control y estatizacin del resto de los parmetros del ensayo ya que en general el desarrollo
microbiano se ve afectado por dos factores o ms, en combinacin. A este comportamiento se le denomina
factores combinados y supone que pocos parmetros influyen sustancialmente en el desarrollo o inhibicin
de los microorganismos pero todos los factores contribuyen.
El manejo de los factores combinados nos permite predecir el comportamiento de los microorganismos en los
alimentos y su consecuente vida til. Adems nos permite establecer las condiciones de almacenamiento.

Manejo de los factores de crecimiento en el laboratorio de microbiologa:

Factores Intrnsecos:
1. Actividad acuosa: salvo excepciones no se ejerce inhibicin del crecimiento por manejo de la aw.
Por lo contrario se utilizan medios lquidos y los slidos y semislidos tienen gelificantes que no
producen agua ligada sino agua retenida dentro de la matriz gelificada que se encuentra
disponible para el desarrollo de los microorganismos.
2. Potencial redox: no se ejerce inhibicin por manejo del potencial redox salvo excepciones q lo
requieran como en el caso de bacterias anaerobias estrictas donde los medios poseen en su
formulacin amortiguadoras del potencial redox.
3. pH: los valores de pH se encuentran alrededor del neutro en la mayora de los casos salvo en casos
de bacterias acidificantes, hongos y levaduras donde para mejorar la competencia frente a otros
microorganismos se baja el pH del medio. Muchos medios poseen buffer de pH para amortiguar
los cambios derivados del metabolismo de los microorganismos
4. Nutrientes: Es donde ms se influye para fomentar la inhibicin o crecimiento de los
microorganismo. Los requerimientos nutricionales particulares de los microorganismos o de los
grupos de microorganismo y sus metabolismos son tenidos en consideracin para el diseo de los
medios de cultivo.
5. Antimicrobianos: Se agregan agentes de seleccin (control qumico como pueden ser antibiticos,
colorantes, entre otros).
6. Estructuras o estados de agregacin: Segn la necesidad se usan medios lquidos (los
microorganismo fluyen sin necesidad de competir por alimento), semislidos (para evidenciar
movilidad) o slidos (soporte para contener el crecimiento y evidenciar las unidades formadoras
de colonias.

Factores Extrnsecos:

1. Gases del ambiente: Segn los requerimientos se los incuba en las atmsferas necesarias. Para
aerobios se utilizan tensiones normales. En el caso de microaerfilos o anaerobios se pueden
utilizar jarras que por algn reactivo qumico genera anaerobiosis o microaerofilia al cerrar la
jarra o bien generar vacio por medio de una bomba de vaco o generar la atmsfera adecuada por
medio de gases o mezclas de gases comerciales que se intercambian en la jarra luego de generar
vacio. Tambin se pueden utilizar estufas calefaccionadas con CO2 para anaerobiosis. Se puede
generar anaerobiosis en tubos de ensayo, ya sea para agares o caldo, por medio de la evacuacin
de los gases por calentamiento y enfriamiento rpido. Se debe sembrar rpidamente y sin
agitacin excesiva. Inmediatamente se debe agregar un tapn de vaspar (vaselina-parafina 1:1)
para aislar el medio del ambiente.



2. Temperatura: Cada microorganismo debe ser incubado a su temperatura ptima de crecimiento o
a una temperatura que le permita al ensayo ser selectivo para el microorganismo en estudio. Para
ello se debe de proveer de estufas para estatizar las temperaturas, en algunos casos baos de agua
termos atizados y en caso de requerir refrigeracin se podrn utilizar heladeras que permitan la
regulacin y control de las temperaturas.

3. Humedad: la humedad relativa del ambiente no se controla debido a que los medios se encuentran
en la mayora de los casos en recipientes hermticos para proteger los medios y los cultivos de la
contaminacin ambiental. En casos de requerirse los materiales de trabajo permiten el intercambio
de gases. Adems al poseer aw elevados en los medios no requiere intercambio de la presin de
vapor del ambiente.

PARTE EXPERIMENTAL

OBJETIVOS:

- Evidenciar la influencia de los diferentes factores de crecimiento sobre un cultivo puro (se modificarn el
pH, las temperaturas de incubacin, la presencia/ausencia de oxgeno) en caldo nutritivo
- Poder caracterizar al microorganismo en estudio