Fraccionamiento y deteccin de polifenoles en vino tinto.

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Polifenoles en vino tinto.















Nombre de los estudiantes:
Calpe Ruano, Jorge



Fraccionamiento y deteccin de polifenoles en vino tinto.

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1. INTRODUCCIN
Existen varios mtodos para estimar el contenido fenlico total y separativo en el vino, en nuestro caso nos
centraremos en el anlisis por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
El estudio de compuestos fenlicos de la uva preocupa desde hace mucho tiempo a los investigadores. Los
primeros avances sobre su determinacin se deben a Ribreau Gayon (1964-1965). Desde entonces este tema ha
sido objeto de investigaciones intensivas, ya que poseen propiedades antioxidantes, tanto como captadores de
radicales libres como quelantes de metales, contribuyendo a reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares,
cncer, Alzheimer; actividad antialergnica, antiinflamatoria, bactericida, reduce la hipertensin y artritis,
fortalece capilares y tienen accin antihemorrgica.
1.1. EL VINO, DEFINICIN Y ELABORACIN

La definicin de vino, segn el reglamento de base del sector vitivincola en la
Unin Europea, es el producto resultante de la fermentacin alcohlica total o
parcial del jugo de uvas sanas y maduras, con un contenido mnimo de 8.5 % (v/v) de
etanol. En Espaa se define como el alimento natural obtenido exclusivamente por la fermentacin alcohlica,
total o parcial, de uva fresca, estrujada o no, de mosto de uva (Ley 20/2003, de la Via y el vino).
El vino es, por tanto, una mezcla hidroalcohlica. Los componentes ms abundantes son el agua, que
proviene de la uva y que se encuentra en torno al 80-85 % (segn el tipo de vino), y el etanol, que se encuentra
normalmente en una proporcin del 9 al 20% en volumen. Adems del etanol se pueden encontrar otros
alcoholes de origen fermentativo, como la glicerina.
El inicio de la vendimia lo marca el estado de la uva y su punto de maduracin (la composicin de la
misma depende de la variedad, clima, suelo y agua), suele ser desde primeros de Septiembre hasta mediados de
Octubre. Los racimos de uva son retirados de la vid y seleccionados para ser trasladados a la bodega en
condiciones higinicas adecuadas. All se pesa para controlar los kg de uva (existe una relacin uva/vino de 1.25
kg/L), se toman muestras para su anlisis y control de calidad (control de acidez, grado alcohlico potencial,
madurez fenlica, etc.) y se procede a la descarga (el sistema ms habitual es el uso de tolvas).
El siguiente proceso es la molienda o estrujado, que tiene como objetivo romper el grano de uva para
liberar el mosto, en esta etapa se aade anhdrido sulfuroso, que selecciona la fauna microbiana que interviene
en la fermentacin. Tambin ayuda a la extraccin del color y una mejor disolucin del mismo.
Esta pasta es trasladada por medio de una bomba de impulsin hasta la prensa, sin entrar en contacto con el
aire para impedir el inicio de la fermentacin, donde se produce el despalillado, con el fin de emplear
nicamente uva en el proceso evitando que el racimo confiera olores y sabores desagradables.
Ms tarde el producto se traslada a un depsito donde se inicia la fermentacin, intentando en todo
momento que la temperatura durante este proceso nunca sobrepase los 30C. Durante la fermentacin, por la
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accin de las levaduras, los azcares se desdoblan en alcohol y se desprende anhdrido carbnico, al tiempo que
las materias colorantes del hollejo se disuelven en el lquido. El anhdrido carbnico empuja los hollejos hacia
arriba, formando una barrera denominada sombrero. En un proceso denominado remontado, esta capa se remoja
con mosto en fermentacin por medio de bombas para activar la extraccin del color. El hollejo tambin debe
removerse peridicamente en una operacin conocida como bazuqueo.
Una vez finalizada la maceracin se realiza el descube, es decir, el traslado del lquido a otro depsito
donde finaliza la fermentacin. Mientras que la primera parte tiene una duracin de 6 a 10 das y se conoce
como fermentacin tumultuosa, esta segunda etapa dura prcticamente el doble, entre 10 y 20 das dependiendo
de la temperatura, y recibe el nombre de fermentacin lenta, produciendo una fermentacin malolctica, donde
se transforma el cido mlico (fuerte y vegetal) en otro ms suave y untuoso, el lctico (finura y suavidad). En
esta segunda fase se contina liberando anhdrido carbnico y el mosto-vino del sombrero es removido para que
contine fluyendo lquido, una operacin conocida como remangue porque se suele realizar manualmente.
Despus, durante el proceso de sangrado se extrae por gravedad este mosto-vino denominado mosto sangrado,
un lquido con mucho color y aspereza que, se selecciona por calidad para ser embotellado, en el caso de
jvenes, o se pasan a barricas de crianza, para que, con el tiempo y buenos cuidados, producir vinos de calidad.
Componentes del vino:
Desde el punto de vista qumico el vino es muy rico en componentes de distinta naturaleza, generados
durante su procesado. En el vino tambin se pueden encontrar coadyuvantes tecnolgicos y aditivos de uso
permitido por la Ley. Esto hace, por tanto, que la complejidad de la matriz del vino dificulte su anlisis.
Entre los compuestos endgenos o naturales de la uva y sus procesos de fermentacin se encuentran
azcares, alcoholes, cidos, compuestos fenlicos, compuestos nitrogenados, compuestos voltiles, lpidos,
vitaminas y sales minerales.
Para favorecer la vinificacin o prevenir la aparicin de microorganismos o alteraciones se incluyen
sulfitos, enzimas pectolticas y otros preparados enzimticos y compuestos presentes en cantidades de traza,
como metales.
El carcter cido del vino (pH en torno a 3,5) favorece la hidrlisis de los azcares, y por tanto, la
fermentacin, y previene de la aparicin de patgenos. La acidez es por tanto un parmetro fundamental en el
vino que favorece la elaboracin, estabilidad y el equilibrio organolptico.
Los que ms inciden en sus caractersticas sensoriales son los compuestos fenlicos, producidos en el
metabolismo secundario de la vid y acumulados fundamentalmente en los hollejos y semillas de la uva, de
donde son extrados durante la vinificacin.
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Qumicamente, son compuestos orgnicos en cuya estructura molecular contienen al menos un grupo fenol.
Se encuentran en casi todos los alimentos de origen vegetal, influyendo en la calidad, estabilidad y aceptabilidad
de los mismos, ya que actan como colorantes, antioxidantes y proporcionan sabor.
1.2. POLIFENOLES EN EL VINO
Son una clase de compuestos que tienen una importancia fundamental en enologa, ya que algunas de estas
sustancias son las responsables del color de las uvas, como los antocianos (ndice de polifenoles totales, prueba
analtica que sirve para medir de manera objetiva el color del vino). Participan en una serie de reacciones en las
que, en ocasiones, se transforman y evolucionan provocando mejoras en la calidad del vino (como la oxidacin
de los mismos que contribuye al envejecimiento y madurez del vino, evitando la oxidacin de otros
componentes, ya que por su estructura qumica son donadores de H), tambin son responsables del sabor
(especialmente sabores amargos), debido a los taninos, y olor de los vinos.
Los polifenoles en el vino varan desde compuestos sencillos producidos por la vid, hasta sustancias
complejas formadas en el envejecimiento del vino, como las extradas de la madera de los barriles. Provienen
mayoritariamente de las partes slidas de la uva, y en menor medida de la pulpa. En la vinificacin del tinto los
polifenoles son extrados y solubilizados en la maceracin, donde se deja en contacto el jugo con las partes
slidas de la uva. La concentracin de los mismos depende de las condiciones de macerado: tiempo,
temperatura, acidez, concentracin alcohlica y grado de disgregacin de los hollejos.
Las proporciones de estos compuestos en el racimo (Figura 1) estn determinados por la variedad de cepa o
cepas elegidas en su composicin, las condiciones climticas, geogrficas y de cultivo, as como las prcticas
aplicadas en el proceso de vinificacin. Se estima una media general de 50- 400 mg/L para los vinos blancos y
2500 mg/L para los vinos tintos.

Figura 1: Porcentaje de componentes en racimo de uva y contenido de polifenoles (J.Calpe, 2013.)
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Los compuestos fenlicos del vino se dividen segn su estructura en dos grandes grupos: Compuestos no
flavonoides (cidos fenlicos) y compuestos flavonoides (flavonoles, antocianos y taninos). En la tabla 1 se
muestra la localizacin de los compuestos fenlicos en la uva.
Tabla 1. Localizacin de los compuestos fenlicos en la uva.
Ac. fenlicos Flavonoles Antocianos Taninos
Hollejo SI SI SI SI
Pulpa SI NO NO NO
Semillas SI NO NO SI
Raspn SI NO NO SI

De esta manera las transformaciones adoptadas durante el procesado contribuyen a la composicin fenlica
del vino.
Estos compuestos aparecen bruscamente en la fase de envero (Figura 2), en la que se produce el cambio de
color de las uvas, teniendo lugar en verano sustituyendo a la clorofila, que haca que el grano fuera verde, para
convertirse en un fruto en proceso de maduracin y acumulacin de sustancias.


La biosntesis de polifenles (Figura 3) es consecuencia de la formacin y acumulacin de azcares en el
grano de uva (glucosa y fructosa). A partir de hexosas mediante una ruta enzimtica se forman los cidos
benzoicos y aminados, terminando en la formacin de otros polifenoles. Cada etapa metablica necesita la
presencia de un enzima especfico, por lo que se podra determinar en la uva la capacidad de sntesis
polifenlica en funcin de su patrimonio enzimtico.



Figura 2: Evolucin del contenido total de antocianos, taninos y flavonoles durante el crecimiento de la uva (Ojeda, 1999)
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Compuestos no flavonoides:
Abarca a los cidos fenlicos (Figura4), divididos en cidos benzoicos (C6-C1) derivados del cido p-
hidroxibenzoico, y cinmicos (C6-C3), pero tambin otros derivados fenlicos como los estilbenos.
cidos fenlicos
Los cidos benzoicos aportan sabor amargo, el principal componente es el cido glico en forma de ster de
flavanol, posee propiedades antioxidantes y hepatoprotectoras, ayudando a la conservacin del vino. Los cidos
cinmicos provocan pardeamiento, no interfieren tanto respecto al sabor. Se presentan como cidos
hidrocicinmicos esterificados con dicotarttico. Los mayoritarios son el cido cafeico, ferlico y p-cumrico.
Figura 4: cidos benzoicos y cinmicos ( Ribreau-Gayon, 1994)
Figura 3: Biosntesis de los polifenoles (Ribreau-Gayon, 1994))
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Se encuentran en concentraciones de 100 a 200 mg/L en vinos tintos. Pueden estar en forma libre
procedentes de hidrlisis de otros polifenoles, como los antocianos, en presencia de calor y oxgeno o
combinados parcialmente esterificados (Figura 5).


Estos cidos son especficos de la variedad vitis vinfera constituyentes del jugo de uva.
Con el tiempo y la oxidacin pueden tornarse amarillentos, o ser degradados por microorganismos
formando compuestos fenlicos voltiles.
Estilbenos
Cabe destacar la presencia de otros compuestos fenlicos como
los estilbenos, caracterizados por poseer dos ciclos bencnicos unidos
por una cadena etanol (a veces etileno). Entre estos compuestos se
encuentra el ismero trans del resveratrol (Figura 6) y su derivado glucosilado. Este compuesto previene de
ataques fngicos a la uva. Recientemente se ha demostrado que es capaz de estimular una enzima que regula el
envejecimiento de los organismos. Aparece en toda la planta, pero sobre todo en hollejo y semillas, de ah que
su contenido sea mayor en tintos, en concentraciones entre 0.001 y 10 mg/L.

Compuestos flavonoides:
Caracterizados por un esqueleto base de tipo 2-fenil-benzopirona (Figura 7), dos
anillos becnicos unidos por una cadena de 3 carbonos, que se cierra en
heterociclo oxigenado de 6 eslabones. Las subclases de este grupo se distinguen
por el grado de oxidacin de su ncleo piranosdico. En este grupo se
encuentran los polifenoles ms interesantes de la composicin de los vinos, por
concentracin y por propiedades especficas.

Antocianos
Son pigmentos solubles en agua, responsables de coloraciones rojas, azules y violetas en uva y vino (a pH
cido presentan coloraciones rojizas, mientras que a pH ms bsicos presentan tonos azulados). Se encuentran
en el hollejo de las 3-4 primeras capas celulares de la hipodermis, salvo en las variedades tintoreras donde
tambin se encuentran en la pulpa. Su estructura corresponde a un derivado del 2-fenil-benzopirilo, la aglicona
Figura 6: Molcula Resveratrol (Rebolo, 2007)
Figura 7: Molcula 2- fenil-
bezopirona (Rebolo,2007).
Figura 5: steres hidroxicinmicos de la uva (Rebolo, 2007).
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(antocianidina), en el que se modifica, segn el antociano que se trate, algn carbono de los anillos bencnicos o
del heterociclo. Se diferencian por sus niveles de hidroxilacin y metilacin (Figura 8), as como por la
naturaleza, nmero y posicin del azcar unido a la molcula (en general es glucosa, aunque participan
galactosa, ramnosa y arabinosa) formando glicsidos.


Su forma en estado natural es glucosilada, los monoglucsidos estn presentes en todas las variedades de
vitis vinfera (en otras variedades como V. riparia, V. rupestri o hbridos de V. vinifera contienen diglucsidos
en cantidad elevada, lo que permite realizar diferenciaciones analticas).
En algunos casos los azcares estn asociados a su vez con cidos orgnicos (Figura 9), como los cidos
cinmicos dando estabilidad a la molcula ante condiciones extremas de pH y temperatura.


Al considerar las variedades de antocianidinas (Figura 10), las esterificaciones con los azcares y las
acilaciones, se obtiene un alto nmero de compuestos antocianos identificables en el vino tinto. El contenido y
composicin de antocianos vara enormemente en funcin de la especie y variedad de la vid, as como las
propiedades de cultivo y tratamiento, pH, temperatura y estado oxidativo del vino, pueden transformar las
Figura 9: Estructura de antocianina 3-monoglucosilada y la acilada por acido p-cumrico (Rebolo, 2007).
Figura 8: Antocianidinas ms importantes en enologa (Ribreau-Gayon, 1994)
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antocianinas. Tienen propiedades antioxidades, quimioprotectores, controlan la secrecin de insulina y tienen
efecto vasoprotector. La conjuncin de los distintos factores dar fenmenos de copigmentacin.

Taninos
Son los responsables del sabor amargo y la sensacin de astringencia y sequedad, que con el
envejecimiento del vino se suaviza. Son flavonoides incoloros.
Provienen de las partes slidas de la vid, y son aportados al mosto durante la maceracin. Se generan
durante la primera etapa de crecimiento y contina hasta despus del envero.
Este grupo comprende compuestos fenlicos muy diferentes entre s, pero tienen en comn que pueden
combinar establemente con protenas y otros polmeros vegetales como los polisacridos, y si forman
compuestos de gran tamao, pueden precipitar. Esta propiedad afecta a la carga de protenas del vino, tambin a
la actividad enzimtica, pudiendo inhibir su actividad. Por ello los vinos tintos presentan mayor resistencia a la
oxidacin que los blancos.
Son molculas voluminosas que forman complejos con protenas de manera estable, aunque si su tamao es
muy elevado no puede enlazar con los sitios activos de protenas.
Existen dos grupos:
Figura 10: Equilibrios entre diferentes formas antocianinas (Rebolo, 2007)
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Hidrolizables: comprenden a los galotaninos y elagitaninos (Figura 11), liberan por hidrlisis cida
acido glico y elgico, que contienen glucosa. Entre estos compuestos se encuentra la vescalagina y
castalagina. Son muy solubles en medios hidroalcohlicos como el vino. Sus propiedades confieren
un sabor caracterstico al vino.

Condensados: Son polmeros de flavan-3-oles o 3-flavanoles, llamados catequinas. Se localizan
principalmente en semillas, aunque aparecen tambin en el hollejo. Los principales monmeros de
este grupo son la catequina y su ismero epicatequina (Figura 12). Puede encontrarse en forma de
ster glico, la galocatequina. Las formas polimricas reciben el nombre de proantocianas o
procianidina, por la propiedad de liberar en medio cido y con calor antocianas por ruptura de su
estructura, estas molculas de peso elevado pueden precipitar, reduciendo la astringencia.


Su contenido es variable, aunque suele oscilar para vino tinto entre 1 a 4 g/L.

Flavonoles

Solo se encuentran en el hollejo, bajo forma de glicsidos tal y como muestra la figura 13.
Son pigmentos de color amarillo que se encuentran en el vino, en una proporcin de 15-20mg/L. los
derivados del quercetol se encuentran en mayor proporcin. Pueden encontrarse libres o conjugados (unidos a
Figura 11: Estructura del cido glico y elgico (Rebolo, 2007).
Figura 12: Estructura de los taninos monmeros de la uva y las catequinas ms importantes (Rebolo, 2007)
Figura 13: Estructura y flavonoles ms importates en enologa (Rebolo, 2007)
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un azcar). Se han caracterizado ocho flavonoles monoglucsidos y tres diglucsidos, aunque stos se
encuentran en menor proporcin.
Proporcionan un aumento de color por la formacin de complejos con los antocianos, favoreciendo que
estos se disuelvan y sean retenidos por el vino.

2. CONCLUSIONES

Los polifenoles son un grupo heterogneo de compuestos, que cumplen papeles beneficiosos
en el ser humano, al ser consumidos mediante una bebida tradicional y ampliamente difundida:
vino tinto. Su deteccin, se ha ido perfeccionando a lo largo de los aos, y contina en
evolucin, y progreso. La identificacin de estos compuestos, preocupa tanto al tecnlogo como
al enlogo, ya que les permiten atribuir al producto una calidad superior.



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Legislacion vino
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