APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, June 1978, p. 1041-1045 Vol. 35, No.

6
0099-2240/78/0035-1041$02.00/0
Copyright 1978 American Society for Microbiology Printed in U.S.A.

DESCOMPOSICIN DE LIGNOCELULOSA POR CEPAS
SELECCIONADAS DE Streptomyces.
DON L. CRAWFORD
Department of Bacteriology and Biochemistry, Idaho Agricultural Experiment Station, University of
Idaho,Moscow, Idaho 83843

Received for publication 20 December 1977
De 30 cultivos aislados de actinomicetos por tcnica de enriquecimiento en medios
de agar que se contiene en papel peridico, como fuente de carbono y de energa
primaria, tres cepas de Streptomycetos se seleccionaron para la caracterizacin de
sus habilidades de descomposicin de la lignocelulosa. Los tres Streptomycetos
eran capaces de oxidar especficamente muestras etiquetadas de lignocelulosas
14
C
para CO
2
. Estos Streptomycetos mostraron atacar principalmente componentes
celulsicos (glucano), de los cuales entre 25 y 40% evolucionaron como CO
2
durante 1.025 h de incubacin, dependiendo del cultivo referencial utilizado.
Muestras rotuladas de lignina- lignocelulosas tambin fueron atacados, pero en un
grado menor, con hasta aproximadamente 3,5% de oxidacin a CO
2
dependiendo
del cultivo utilizado. Adems, se demostr que la lignina purificada de la madera
molida marcada con C
14
fue atacada, con recuperaciones de hasta el 17,7% de la
etiquetada como CO
2
. Esta es la primera evidencia concluyente que muestra que
los Streptomicetos pueden descomponer lignina.

Durante aos se ha sabido que ciertos
hongos son capaces de descomponer la
lignocelulosa.
Los hongos de pudricin blanca han sido de
particular inters debido a su capacidad de
oxidar completamente tanto los
componentes celulsicos y lignina de la
madera en CO
2
y agua. Los roles en que se
desempean los grupos microbianos no
micticos en la descomposicin de
lignocelulosa, sin embargo, an no se han
definido. Se sabe que ciertas especies de
actinomicetos termfilos atacan la
lignocelulosa, componentes del ozono
principalmente hidratos de carbono, mientras
que otras especies tambin pueden agotar la
lignina. Otros investigadores han demostrado
que algunas eubacterias gramnegativas son
capaces de descomponer ligninas
purificadas. Recientemente, se public la
primera evidencia concluyente para
demostrar que unas especies de Nocardia
pueden degradar la lignina. Los
euactinomycetes no han sido estudiados en
detalle con respecto a la descomposicin de
la lignina. En el trabajo que aqu se presenta,
tres cepas de Streptomyces son examinados
por sus capacidades para atacar a la
lignocelulosa.
Sus capacidades para oxidar tanto la
celulosa y componentes de lignina se
examinaron mediante el uso de la
metodologa
14
C.
MATERIALES Y MTODOS
Preparacin de lignocelulosas
etiquetadas. De la lignocelulosa natural de
Abeto de Douglas ( Pseudotsuga menziesii )
que contiene
14
C especficamente en sus
componentes de lignina o celulsico (
glucano), se prepararon componentes por
ramas de alimentacin L-[ U-
14
C ]
fenilalanina o D- [U -
14
C ] glucosa,
respectivamente, a travs de su corte se
deriva, por mtodos previamente descritos
(4,5), o en su lignina los componentes de la
alimentacin de las ramitas de arce rojo (
Acer rubrum ) [ 2' - 14C ( cadena lateral ) ] de
cido ferlico (4 - hidroxi - 3 -cido
metoxicinmico ), que es conocido para ser
incorporado preferentemente en
componentes de lignina de las plantas (8,9).
Despus de la molienda y un extenso
procedimiento de extraccin (vanse las
referencias 4, 5, y 8 para la metodologa), los
preparados lignocelulsicos residuales eran
[
14
C] etiquetado de lignina, [
14
C] etiquetado
de glucano y [2-
14
C (cadena lateral)] lignina
marcado, respectivamente. En el caso del
material de la cadena lateral marcada con
14
C estaba presente en el C2 de las unidades
de la cadena lateral dentro de fenilpropano el
polmero de lignina. Adicionalmente, ramas
de Abeto Douglas se les permiti tomar L-[ U-
14C ] histidina con el fin de evaluar la
incorporacin de la etiqueta en la protena
vegetal. Esta Lignocelulosa marcada para
protena
14
C se utiliz para ayudar a evaluar
la especificidad de nuestras tcnicas de
etiquetado y para determinar las tasas de
rotacin de la protena de madera por
cultivos.
Los anlisis qumicos mostraron que las
lignocelulosas consistan de
aproximadamente 25% de lignina y 65% de
hidratos de carbono, que fue la celulosa
sobre todo junto con pequeas cantidades
de glucanos y hemicelulosa. Tambin, otras
hemicelulosas, principalmente xilanos y
mananos, estuvieron presentes. El contenido
de protena cruda de las lignocelulosas era
un promedio de 5,0% en base al anlisis de
nitrgeno de Kjeldahl. Trabajos anteriores
han demostrado que estos extractos libres
de
14
C-lignocelulosas son buenos sustratos
para estudios de degradacin microbiana y
para ser esencialmente libre de materiales
contaminantes fcilmente descomponibles (4,
5, 8, 9,14).
Para un experimento de descomposicin, la
lignina
14
C de la madera molida (
14
C-MWL)
se prepar a partir de la lignocelulosa
marcada como lignina
14
C. El
14
C-MWL fue
preparado por el tarro de molienda de
14
C-
arce(madera) en el aire a 2 C durante 2
semanas. La madera molida se extrajo
durante 24 h con 90% de dioxano en agua.
La lignina soluble en la solucin Dioxano-
agua se purific por precipitacin a partir de
dicloroetano-etanol (01:01) en ter, luego en
hexano. Como una purificacin final, la
lignina se precipit a partir del cido actico
al 90% en agua. Los compuestos insolubles
se recogieron por centrifugacin, se disolvi
en 90% dioxano-agua, y se liofiliz en un
polvo de color blanco. Esta es una lignina
Bjorkman (2) y es uno de los mejores tipos
de ligninas de extraccin para los estudios de
degradacin microbiana.
Recuento de radiactividad. El
14
C se
cuantific por tcnicas de centelleo lquido
descrito anteriormente (4, 5).
Fuente de sustratos lignocelulsicos. Las
fuentes de madera para el trabajo que aqu
se presentan fueron ramitas de Abeto
Douglas (P. menziesii) o el arce rojo (A.
rubrum). Ambos sustratos etiquetados y no
etiquetados se prepararon a partir de albura
o el nuevo crecimiento exterior de la madera
que yace por encima del duramen.
Aislamiento y seleccin de actinomicetos
que descomponen lignocelulosa. Los
aislamientos se hicieron a temperatura
ambiente a partir de muestras naturales,
incluidos los suelos de bosques, los suelos
de jardines y materiales vegetales en
descomposicin.
Los cultivos se aislaron mediante tcnica de
enriquecimiento. Muestras naturales diluidas
en serie se colocaron en placas sobre un
medio de agar de sales minerales que
contienen papel de peridico suelo de malla
40 (0,5%) como una fuente de carbono y
energa y casaminocidos-vitamina libre
(0,025%) como una fuente de nitrgeno
suplementario. De las placas de aislamiento
originales se incubaron a temperatura
ambiente, 30 cepas de actinomicetos
mesfilas se purificaron por restreaking en el
mismo medio. Todos estos aislamientos
aclarados de agar de papel peridico en
diversos grados dentro de 7 a 14 das. Cada
aislado se proyect por su capacidad para
descomponer la lignocelulosa en un
experimento de crecimiento de 14 das,
donde se inocul el aislado en 10 ml de
medio de lignocelulosa en un tubo de
ensayo. El medio consisti en una solucin
de sales minerales que contiene 0,10 %
KH
2
PO
4
, 0,4 % Na
2
HPO
4
7H
2
0 , 0,02 % de
NaCl , 0,02 % MgSO
4
7H
2
0 , y 0.005 % CaCl
2

2H
2
0 ms 0,025 % vitaminas libres
Casamino, los cidos ( Difco ) y un nivel de
0,5 % de tierra , se extrajo de la lignocelulosa
de Abeto. Sales de lignocelulosa y minerales,
adems de soluciones de casaminocidos se
trataron en autoclave por separado, luego se
mezcl antes de la inoculacin. Los cultivos
inoculados se incubaron durante 14 das a
temperatura ambiente, bajo aireacin
constante. El aire estril, humidificado entr
en cada tubo de ensayo a travs de un tubo
burbujeador de vidrio, que penetr casi hasta
el fondo del tubo de cultivo. De las 30 cepas,
se seleccionaron 3 organismos para el
estudio adicional en base a su capacidad
para causar la prdida de peso sustancial de
lignocelulosa. Los tres, cultivos 28, 87A y
177, fueron identificados como cepas de
Streptomyces determinadas a partir de los
exmenes microscpicos directos de
esporulacin de colonias en agar. El cultivo
28 produce cadenas de esporas largas en
espiral abierta en un micelio areo gris. Un
pigmento no melanoide se produce en los
medios orgnicos ricos. El cultivo 87A es
similar, pero produce un pigmento
ligeramente amarillo en tales medios. El
cultivo 177 produce largas cadenas de
esporas rectas en un micelio areo gris y un
melanoide con pigmento marrn a negro en
medios orgnicos ricos.
Caracterizacin de la lignina y la celulosa
habilidades degradantes. Las cepas de
Streptomyces 28, 87A, y 177 fueron
examinados, utilizando la metodologa de
14
C, por sus habilidades para oxidar la lignina
y la celulosa dentro del complejo
lignocelulosa. Cultivos de quince mililitros se
realizaron por duplicado, cada uno que
contiene 13,5 ml de solucin de sales
minerales, 1,5 ml de una solucin de
aminocido (que contiene cantidades iguales
de los 20 aminocidos comunes a una
concentracin final de 0,25 % en sales
minerales), una cantidad conocida de
14
C-
lignocelulosa y con suficiente cantidad de
lignocelulosa sin etiqueta para la
concentracin final de 0,5%. Fuentes y
actividades especficas de todos los
14
C-
lignocelulosas se informa en la seccin
Resultados.
Los tubos se inocularon y se incubaron con
constante aireacin a temperatura ambiente.
La degradacin del sustrato de
14
C
etiquetado se control siguiendo la evolucin
del
14
CO
2
en el crecimiento activo de los
cultivos a travs del tiempo. El
14
CO
2
estaba
atrapado por el paso de todos los gases de
salida a travs de 10 ml de NaOH acuoso al
8 %. Las trampas fueron cambiadas
peridicamente, y el
14
CO
2
se cuantific.
RESULTADOS
Todos los 30 aislamientos examinados por la
prueba de prdida de peso causaron
prdidas de peso de lignocelulosa en exceso
en comparacin con los controles no
inoculados. Despus de 14 das de
crecimiento, los cultivos se recogieron y
todos los insolubles residuales se recogieron
por centrifugacin, con dos lavados con agua
destilada. El promedio de las prdidas de
sustancias insolubles oscilaron entre 7,2 y
24,8 % en comparacin con el 5,0 % de los
controles. Los tres mejores cultivos en este
sentido eran las cepas de Streptomyces 28,
87A y 177, lo que caus prdidas de peso de
20.2, 13.3 y 24.8 %, respectivamente
(promedio de dos determinaciones). Estos
valores de prdida de peso no explicaron
bioconversiones de lignocelulosa en masa de
clulas; por lo tanto, se considera que los
valores mnimos son de descomposicin.
Los anlisis de nitrgeno Kjeldahl de
residuos, sin embargo, mostraron que las
cepas que causaron considerable prdida de
peso de sustrato tambin producen
cantidades significativas de masa celular. En
el caso de las tres cepas de Streptomicetos,
los residuos, despus de 14 das, hubo un
promedio de protena cruda de 10 a 12 %.

Cuando los Streptomycetes fueron cultivados
en
14
C-lignocelulosas, las incubaciones se
ampliaron a 1,025 horas (unos 43 das).
Como resultado, la descomposicin general
del sustrato fue mayor que la observada
despus de slo 14 das de crecimiento. Los
cultivos 28, 87A y 177 causaron prdidas de
peso de 35.8, 28.8 y 36.0 %,
respectivamente. Este nivel de
descomposicin era tan grande como la
obtenida por hongos tales como Trichoderma
viride cultivados en sustratos que contienen
menos lignina que la lignocelulosa de Abeto
(10). Los tres cultivos evolucionaron a
14
CO
2

de todos los sustratos
14
C-lignocelulosa, con
los componentes celulsicos siendo atacados
con mayor facilidad. Como se muestra en la
figura.1, una parte sustancial del total de
14
C
localizado en lignocelulosa marcada con
glucano [
14
C] se oxid a
14
CO
2
. La cepa 177
de Streptomyces dio las ms altas
conversiones de sustrato a
14
CO
2
. Los tres
tambin evolucionaron a
14
CO
2
a partir de
lignocelulosa marcada con lignina [
14
C],
aunque en un grado ms limitado en
comparacin con los componentes
celulsicos etiquetados. Las curvas de
oxidacin tpicas de la lignina [
14
C] se
muestran en la figura.2 (para lignocelulosa
marcado con lignina [
14
C] etiquetado por el
mtodo de incorporacin de fenilalanina) y en
la figura.3 (para lignocelulosa marcada con
lignina [
14
C] etiquetado por el mtodo de
incorporacin de cido ferlico).






La evolucin de
14
CO
2
con el tiempo sigui
un patrn de respiracin predecible para
ambos sustratos marcados glucano y
sustratos de lignina. Despus de 48 a 72
horas de retraso, los cultivos alcanzaron
rpidamente una tasa mxima de actividad
metablica que despus de
aproximadamente 200 horas comenzaron
lentamente a disminuir a travs del resto del
perodo de incubacin. A menudo, cerca de
las 1,000 horas, se produjo un aumento
temporal o pulso en la evolucin de
14
CO
2
,
probablemente por el comienzo de la divisin
celular y porque algunas biomasas se
oxidaron mediante crecimiento crptico y el
metabolismo endgeno.


Se ha informado de que pequeas
cantidades de fenilalanina [
14
C] incorporada
(3 a 5%) pueden terminar en la protena de la
planta como resultado de la absorcin por las
ramas (7). Debido a que la lignocelulosa de
Abeto, utilizado aqu, contena protena de
aproximadamente 5,0%, es posible que la
oxidacin microbiana de la protena
fenilalanina [
14
C] contaminada puede haber
sido la causa de los bajos niveles de
degradacin de la lignina observadas para el
sustrato marcado de fenilalanina (aunque no
para el marcado con cido ferlico). Para
examinar esta posibilidad, se analiz la
lignocelulosa de Abeto marcada con lignina
para la protena marcada con fenilalanina por
cromatografa en capa fina. Adems,
especficamente la lignocelulosa de Abeto
marcada con protena (marcado con histidina
[
14
C]) fue usada como sustrato para ayudar a
evaluar la contribucin de la protena
14
C a la
14
CO
2
liberado durante el crecimiento de los
cultivos en lignina [
14
C] de la lignocelulosa.
Tambin, se hizo crecer los cultivos 28 y 177
en medios que contienen
14
C-MWL, y se
determin la capacidad de ambos para oxidar
la lignina de esta preparacin purificada.

Para la separacin por cromatografa en
capa fina, muestras de 50 mg de
lignocelulosa de Abeto marcado con lignina
(3,64 x 10
5
dpm) en 2,5 ml de HCl 6N se
hidrolizaron en ampollas selladas a 121 C
durante 18 a 24 horas para liberar la protena
de la madera como aminocidos libres.
Tpicamente, se solubiliz 37,5% del total de
14
C. Esto, sin embargo, incluyendo
componentes de lignina [
14
C] solubles en
cido, as como cualquier fenilalanina [
14
C]
liberada de la protena. Para distinguir entre
estos componentes, los cidos hidrolizados
se sometieron a cromatografa mediante
cromatografa en capa fina. Una muestra de
cien microlitros (5,5 x 10
3
dpm) fueron
avistados en las placas que contienen
Adsorbosil-5 (Cientfica Aplicada, Universidad
Estatal, PA) como absorbente y se
desarrollaron en un sistema disolvente de
butanol-etanol-agua (7:2:3). Patrones de
fenilalanina y tirosina se ejecutaron
simultneamente. Despus del desarrollo, las
placas secadas al aire se pulverizaron con
ninhidrina o soluciones de cloruro de potasio-
ferrocianuro frrico para detectar
aminocidos o compuestos aromticos
fenlicos, respectivamente.
El sistema disolvente utilizado no separ
fenilalanina a partir de tirosina; por lo tanto,
cualquier conversin en plantas de
fenilalanina [
14
C] a tirosina [
14
C] no fueron
considerados. Este disolvente hizo separar la
mayora de los puntos fenlico - tincin de
fenilalanina, que viaj en el R
f
ms lento. Se
recuper ms del 95% del
14
C aplicado entre
el origen y el frente del disolvente .Se
detectaron numerosas manchas del reactivo
ninhidrina, incluyendo una correspondiente a
la fenilalanina. Sin embargo, slo el 7,9 % del
total de
14
C aplicado se desplaz con la
fenilalanina. Este promedio 2.96 % del total
de
14
C presente en la lignocelulosa (7,9 de
37,5 %). La mayora de
14
C viaj ms rpido
que la fenilalanina en R
f
s correspondientes a
compuestos fenlicos aromticos
(fragmentos de lignina - cido solubilizado).
Puede, por lo tanto, llegarse a la conclusin
de que menos del 3% del [
14
C] de esta
lignocelulosa era localizada en fenilalanina
dentro de la protena vegetal, desde la
separacin de fenilalanina de los
contaminantes fenlicos no era completa.
Debido a la variabilidad inherente entre
diferentes plantas, se recomienda que este
anlisis se ejecute de forma rutinaria en
todos los nuevos ensayos de [
14
C]
lignocelulosas- lignina etiquetados por el
mtodo de fenilalanina. Como se muestra en
el presente caso, la protena contaminada
con [
14
C] no parece ser un problema.
Para evaluar la contribucin potencial de
14
CO
2
de microbios contaminantes de
protena oxidada en el [
14
C] lignocelulosa
lignina, se desarroll un experimento donde
las culturas se cultivaron en la presencia de
[
14
C] histidina etiquetados para lignocelulosa.
La hidrlisis cida de esta preparacin,
seguida por cromatografa, mostr que el
70% del [
14
C] era hidrolizable en medio cido
y esencialmente todo era localizado con
puntos de [
14
C] histidina en la capa fina de
las placas de cromatografa. En 1,025 h de
incubacin, ninguno de los estreptomicetos
evoluciono ms de 1,9% de la protena
etiquetada [
14
C] histidina como
14
CO
2
. La
posible interferencia con el ensayo de
oxidacin de la lignina seria mximo, un
insignificante 0,06% del
14
CO
2
desprendido
(1,9% del 2,96%).
Finalmente, las culturas 28 y 177 fueron
cultivadas en 10 ml de la solucin de sales
minerales aminocidos suplementado con
45 mg de lignocelulosa fra de Abeto y 5,0
mg de
14
C-MWL (fig. 4). Ambas cepas
oxidaron una porcin significativa de
14
CO
2.
Las recuperaciones porcentuales despus de
1,025 h fueron, de hecho, considerablemente
mayor para
14
C-MWL que para ligninas
naturales. MWL fue, por lo tanto, menos
resistente al ataque por estas culturas a
diferencia de las ligninas naturales que
formaron complejos con hidratos de carbono.
Con recuperaciones de
14
CO
2
de 17.7 y
15.0%, respectivamente, para las culturas 28
y 177, estos datos confirman la habilidad
para degradar la lignina de estos organismos
y apoyar la datos obtenidos cuando los
cultivos se cultivaron en [
14
C] lignocelulosas
marcadas como ligninas. Recientemente,
otros investigadores han informado sobre
descomposiciones similares de MWL no
marcado, por las eubacterias, tales como las
especies Pseudomonas , Flavobacterium , y
Aeromonas ( 12 ) .

Como resultado del crecimiento sobre estas
14
C lignocelulosas, el
14
C no solo se oxida a
14
CO
2
, adicionalmente tambin se solubiliza.
Mediante el examen por radiactividad de
cultivos flotantes en el momento de la
cosecha, fue posible determinar la cantidad
de lignina insoluble o sustrato celulsico que
se haba convertido en soluble en agua como
resultado del crecimiento de cada cultivo. El
14
C soluble fue cuantificado mediante la toma
de cinco muestras de 1,0 ml replicadas de
cada cultivo flotante, se las coloc en
ampolletas de centelleo, se evaporaron las
muestras hasta sequedad, y se adiciono
lquido de centelleo (10 ml), a continuacin,
se cont cada vial con todos los datos que se
compararon con controles no inoculados.
Tpicamente, los cultivos que crecieron a
expensas de
14
C lignocelulosas con glucano
solubilizaron tanto como 7 - 14% del
14
C total,
superior a lo que los cultivos oxidan el C0
2
.
Asimismo, la solubilizacin adicional de
14
C
tpicamente la producen los componentes de
la lignina, que va entre 4 y 8 % del total de
14
C. Desde que la solubilizacin es una forma
de degradacin parcial, estas cepas de
Streptomycetos descomponen ms del
sustrato que del
14
CO
2
. Cuando se utilizan
todos los datos de
14
C para calcular la
prdida de peso terica de sustrato para los
experimentos especficos, los valores
calculados coinciden muy bien con las
prdidas reales de peso cuando se
consideran las estimaciones de la actual
masa de clulas.
DISCUSIN
Para las cepas de Streptomycetos
examinadas, se demostr que todos eran
buenos degradadores de lignocelulosa, con
habilidades aparentemente similares a los
pocos hongos de pudricin blanda-que han
sido estudiados (6); es decir, que llevan a
cabo un ataque limitado sobre la lignina, pero
agotan principalmente hidratos de carbono.
La validez de considerar como significativa la
escasa degradacin de
14
C lignina se
fundamenta en el crecimiento de las cepas
en varias preparaciones de lignina. Los datos
combinados de todos los sustratos
etiquetados para lignina, en su conjunto,
muestran concluyentemente que estas
culturas atacan el polmero de lignina. De
particular inters fue la observacin de que
los streptomycetes descomponen MWL ms
fcilmente de ligninas naturales. Otros
investigadores han aislado eubacterias que
descomponen estas ligninas purificadas (12,
13). Es posible que sus organismos no
pudieran atacar las ligninas naturales tan
fcilmente como los que han sido
examinados en ese sentido.
Hemos determinado recientemente que los
tres estreptomicetos son capaces de utilizar
compuestos de un solo anillo aromtico tales
como parahidroxibenzoato como fuentes de
carbono y energa (no publicado los datos).
Esto tambin apoyara la conclusin de que
las culturas atacan a la lignina. Trojanowski
et al. (14) ha encontrado que su organismo
degradador de lignina, Nocardia, era capaz
de atacar a varios compuestos aromticos de
un solo anillo. Esta es la primera evidencia
concluyente para mostrar que la degradacin
de la lignina se lleva a cabo por cepas de
Streptomyces. Aunque con las cepas
examinadas aqu, la degradacin total de la
lignina no era grande, parece probable que
las culturas ms activas an no se han
aislado.