DETERMINACIN DE CAFENA EN CAF MEDIANTE ESPECTROMETRA

INFRARROJA


1. ANTECEDENTES
En la actualidad, el caf es uno de los productos alimenticios de mayor importancia a nivel
mundial, siendo Venezuela un pas productor, exportador; y con un marcado hbito de
consumo. El caf contiene diversos alcaloides entre los que destaca la cafena (1, 3,7-
trimetilxantina), considerada una sustancia psicoactiva que estimula la transmisin de los
impulsos entre las clulas nerviosas.
La determinacin de cafena ha adquirido mucha importancia, debido a su uso en la
industria farmacutica y en la industria de alimentos; ya sea como ingrediente en la
elaboracin de refrescos y bebidas energticas, o por su presencia en productos como el t,
el mate, el cacao y el caf. En todos estos casos, el control de calidad del parmetro cafena
es necesario en los productos. Por esta razn, se han desarrollado nuevos mtodos
instrumentales para su determinacin en diversas matrices, especialmente alimentos. Los
ms confiables y robustos se basan en el uso de tcnicas instrumentales de separacin
(cromatografa de gases, cromatografa lquida de alta resolucin y electroforesis capilar)
acoplados con diversas tcnicas de deteccin como la espectroscopia de absorcin
molecular UV/Vis y la espectrometra de masas. Sin embargo, muchos de ellos requieren
instrumental y accesorios costosos, no siempre accesibles o disponibles a los laboratorios.
En contraste, el mtodo oficial para el anlisis de cafena en caf utiliza un sistema de
cromatografa lquida de baja presin con deteccin espectrofotomtrica a 276 nm, que es
tedioso, ya que incluye varias etapas manuales, consume tiempo y grandes cantidades de
solventes orgnicos. En este panorama, luce atractivo disear nuevos mtodos
espectroscpicos directos para realizar esta determinacin, y en esa va estn trabajando
muchos investigadores.
La espectrometra IRTF es una tcnica analtica espectroscpica rpida y accesible, que
proporciona abundante informacin cualitativa y cuantitativa acerca de la composicin de
las muestras; y en la ltima dcada ha demostrado ser una herramienta poderosa para
abordar el anlisis cuantitativo y directo de muestras reales complejas, sin la necesidad de
etapas previas de separacin. Adems, es un detector casi ideal para ser acoplado a sistemas
de flujo.
En el caso de la cafena, la espectrometra IRTF ofrece una opcin interesante, sensible y
selectiva, debido a las bandas de absorcin que presenta en el infrarrojo medio (IRM).
Sobre esta base se han propuesto diversos mtodos para su determinacin en productos
farmacuticos, refrescos, t y caf; algunos de los cuales se han desarrollado utilizando
sistemas de flujo. Estos mtodos utilizan diversos procedimientos analticos que incluyen:
tcnicas de extraccin o lixiviado manuales y fuera de lnea con disolventes orgnicos,
extraccin en fase slida (solid phase extraction, SPE) en sistemas de flujo, sistemas varios
de preconcentracin, etc. Sin embargo, en todos ellos, la ltima etapa del procedimiento
contempla el anlisis directo de la solucin orgnica por IRTF. La cuantificacin se lleva a
cabo en la banda de 1659 cm
1
, utilizando diversos criterios de correccin, o mediante
anlisis quimiomtrico de la data espectral por PLS (partial least squares)- IRTF.
El principal objetivo de este trabajo es desarrollar un nuevo mtodo de anlisis sencillo,
directo, automtico y accesible para evaluar el contenido de cafena en caf, basado en la
espectrometra IRTF. El mtodo fue aplicado al anlisis de cafena en muestras comerciales
de caf tostado.


2. PRODUCCION INDUSTRIAL DEL CAF:
2.1. TRILLADO: El trillado o curado consiste en el descascarado o pelado de la cubierta
del grano, eliminando por pulimento las cscaras plateadas y finalmente su clasificacin.





2.2. MAQUINA DESPULPADORA COMPUESTA: Se encarga de descascarar el cerezo
recogido de las plantas de caf.








2.3. CONTROL DE CALIDAD: El caf se muestrea y se cata antes de que sea enviado al
comercio. El mejor color para los granos crudos es el de verde - azuloso a verde - grisceo.
El anlisis que se hace al producto es la cuantificacin de la cafena siendo este un factor
importante en cuanto al sabor tpico agrio del caf. Por otra parte es un factor que indica el
contenido alto o bajo de alcaloide (cafena) presente en el caf.

2.4. ENVASADO: el envasado se realiza en diferentes tipos de envoltorios como:








Laminados
Enlatados








2.5. TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO: El principal vehculo de transporte es el
triler que normalmente se utiliza para una ruta larga, pueden ser con carrocera abierta
como tambin en furgn serrado, estn en segundo lugar para transporte local las
camionetas, camin pequeo, etc.
El producto terminado, como caf instantneo o caf para pasar luego de ser empacados su
transporte es de igual manera que en el de materia prima son llevados hasta los centros de
distribucin y al mismo tiempo son almacenados en ambientes frescos y secos para evitar
futuros daos al producto entre estos tenemos a las bodegas de almacenamiento, depsitos,
guardeolas o silos, etc.









En sacos o yutes
Bodegas de almacenamiento
Camiones de reparto
3. PARTE EXPERIEMNTAL
3.1. Equipos y montaje instrumental
La Figura 1A muestra el montaje utilizado, que se basa en el acoplamiento de un sistema de
anlisis en flujo que incorpora una celda de extraccin lquido-lquido (CE), con un
espectrmetro infrarrojo de transformada de Fourier (AF-IRTF). La celda (CE) es una
unidad de tipo sndwich de fabricacin casera que incorpora una membrana de PTFE
para la separacin de las fases (acuosa y orgnica); y representa una modificacin del
separador propuesto por Kubn (Figura 1B).

Los espectros de absorcin fueron adquiridos con un espectrmetro IRTF Perkin Elmer
(PE), modelo Spectrum 2000 equipado con una fuente de radiacin para el infrarrojo
medio, un detector de Mercurio-Cadmio-Telurio (MCT), un divisor ptico intercambiable
(beamspleatter) de KBr-Ge y una celda de transmisin convencional (CFIR) de geometra
rectangular, que se utiliza como celda de flujo (Tabla 1). El instrumento, en su totalidad, se
controla a travs del software Spectrum 2000, de PE.

Tabla 1. Condiciones experimentales de operacin del sistema AF-IRTF propuesto
Espectrmetro infrarrojo de transformada de Fourier (IRTF)
Parmetro Valor o condicin seleccionado
Intervalo espectral:
4500-600 cm
1
(1800-1500 cm
1
)
Resolucin:
4 cm
1

Nmero de espectros
acumulados:
5
Caractersticas de la celda
Celda de transmisin rectangular
(Wilmad)
Ventanas rectangulares (38 19 2)
mm
ZnSe
Sistema de Anlisis en Flujo (AF)
Flujo de la solucin
portadora (C
P
):
0,25 mL/min
Composicin de la solucin
portadora (C
P
):
Agua destilada
Flujo del canal de la muestra
o estndar (C
M
):
0,25 mL/min
Composicin de la muestra
(C
M
):
2,5g de caf extrados con 50 mL de
agua
Composicin de los
estndares (C
M
):
Estndares acuosos de cafena
Flujo del agente extractante
(C
Ext
):
0,32 mL/min
Composicin del agente
extractante (C
Ext
):
CHCl
3
puro (99,8%) y seco
Composicin de la tubera
(C
P
, C
M
, C
Ext
):
C
P
y C
M
: Tygon; C
Ext
: Vitn
R

Serpentn de reaccin (R)
PTFE (Tefln): 100 cm de longitud y
0,8 mm de dimetro interno
3.2. REACTIVOS Y MUESTRAS
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analtico y las soluciones fueron preparadas
con agua de alta pureza de 18 MW cm
1
de resistividad, suministrada por un sistema Mili-
Q-TOC de Milipore. Se prepararon patrones de cafena (Merck) al 1% (p/v) disolviendo la
cantidad adecuada en agua y cloroformo, respectivamente. Los estndares de trabajo se
prepararon diariamente por dilucin adecuada de la disolucin patrn en agua. Se utiliz
cloroformo grado HPLC (Mallinckrodt).
Las muestras de caf tostado, molido y en grano, fueron adquiridas en expendios de
alimentos de la ciudad de Mrida, Repblica Bolivariana de Venezuela. Para la preparacin
de las muestras, se pesan 2,5 g de caf a los que se adicionan 30 mL de agua caliente
(80C). La mezcla se calienta por 5 min y se filtra al vaci a travs de un papel de filtro
Whatman 54. Se adicionan 20 mL de agua destilada y se lleva a aforo (50 mL) con agua.
Este procedimiento corresponde a un protocolo aceptado y validado por la AOAC.
3.3. PROCEDIMIENTO GENERAL DE TRABAJO
Inicialmente se colocan todos los reactivos en sus respectivas lneas a temperatura ambiente
(Figura 1). La bomba B permanece encendida durante todo el anlisis para propulsar de
forma continua al portador (C
P
), o la muestra/estndar (C
M
); y al agente extractante (C
Ext
).
La vlvula selectora de canales (VS), que se conmuta de forma manual, permite introducir
al sistema de forma selectiva al portador o a la muestra (estndar). Los estndares y
muestras, en medio acuoso, y el cloroformo fueron transportados a travs de tubera
de Tygon yVitn
R
, respectivamente, ya que este ltimo material es resistente a muchos
solventes orgnicos.
La mezcla de la disolucin acuosa (portador, muestra o estndar) con el cloroformo, as
como la extraccin de la cafena desde la fase acuosa a la fase orgnica se realizan, en
lnea, en el serpentn de reaccin R, mientras que la separacin de las fases se lleva a cabo
en la celda de extraccin. La fase acuosa fluye directamente al drenaje, mientras la orgnica
se dirige a la celda de medida, donde se adquiere el correspondiente espectro IRTF en una
modalidad continua, acumulando cinco barridos (scans). Esta etapa se realiza de forma
anloga, por triplicado, en los estndares y muestras. La seal analtica correspondiente a
las muestras se interpola en la curva de calibrado obtenida a partir de estndares acuosos de
cafena. Mayores detalles del funcionamiento de este sistema, as como de la CE estn
disponibles en publicaciones y trabajos previos.

4. RESULTADOS Y DISCUSIN
Estudio de viabilidad de la propuesta metodolgica
El mtodo que se desarrolla en este trabajo, como se indic con anterioridad, parte de la
preparacin de estndares de cafena y muestras de caf en medio acuoso, la retro-
extraccin del analito en cloroformo y el anlisis del extracto orgnico por IRTF. Por ello,
la viabilidad de la propuesta depende del cabal cumplimiento de una serie de condiciones
relacionadas a la solubilidad del analito, la transparencia del disolvente en el IR medio y el
comportamiento espectral de la cafena en ese medio.
El espectro IRTF de la cafena slida en pastillas de KBr, que se ilustra en la Figura 2A,
muestra dos bandas relativamente intensas situadas en 1705 y 1659 cm
1
que tienen su
origen en las vibraciones de tensin de los grupos carbonilos y otras dos, menos intensas,
centradas en 1600 y 1550 cm
1
. Por otra parte, la cafena tiene una solubilidad elevada en
agua caliente (21,7g L
1
) y es muy soluble en cloroformo, un solvente orgnico con amplias
ventanas de transparencia en el infrarrojo medio (Figura 2B y 2D). Las bandas de la cafena
estn localizadas en una regin espectral donde el agua presenta intensa absorcin de
radiacin infrarroja (Figura 2C), mientras el cloroformo muestra transparencia. Esto se
aprecia en la Figura 2B, que presenta el espectro correspondiente a un estndar de cafena
en cloroformo, as como del blanco del disolvente, donde se observan con claridad las
cuatro bandas del analito descritas con anterioridad.



























En relacin con la matriz de inters, caf, la Figura 2D presenta, de forma comparativa, los
espectros obtenidos en el sistema propuesto correspondientes a: (a) una solucin acuosa de
cafena, (b) una muestra de caf (M1) en medio acuoso y (c) la misma muestra enriquecida
con el analito.
Se observa un crecimiento importante y centrado de las bandas de la cafena, sin ningn
tipo de deformacin, lo que demuestra la viabilidad del sistema propuesto para el anlisis
de cafena en caf por espectrometra IRTF, utilizando estndares y muestras acuosas.
Seleccin de las condiciones de trabajo
Parmetros espectroscpicos-instrumentales
El intervalo espectral de trabajo se fij entre 4500 y 600 cm
1
; aunque la data espectral que
se estudia se restringe a la regin comprendida entre 1800 y 1500 cm
1
. Se evalu el efecto
de algunos parmetros instrumentales-espectroscpicos como: acumulacin de barridos y
resolucin, sobre la seal de un estndar acuoso de cafena 0,05% (p/v). Los resultados
obtenidos son consistentes con los obtenidos en investigaciones previas realizadas en
nuestro laboratorio; y se resumen en la Tabla 1.
El criterio de medida seleccionado fue el valor absoluto de la medida pico-valle (1668-1649
cm
1
) de la derivada de primer orden (D
1
, ventana de 25 puntos) del espectro de absorcin
(banda de 1659 cm
1
). Esta seleccin proporciona una solucin sencilla y directa al
problema asociado con la definicin de la lnea de base necesaria para la correccin de la
absorbancia en el mximo de la representacin D
o
, en un sistema espectral en el cual las
bandas (1659 y 1704 cm
1
) no se encuentra totalmente resueltas, como se observa en
la Figura 3.





















Caractersticas analticas del sistema FA-FTIR
Bajo las condiciones de trabajo seleccionadas (Tabla 1), la seal analtica mostr linealidad
con la concentracin, hasta un valor de 0,175% (p/v). La Tabla 2 resume las caractersticas
de la curva de calibrado, as como los lmites de deteccin y cuantificacin encontrados,
definidos como la concentracin de analito cuya seal corresponde a 3 y 10 veces la
desviacin estndar del blanco (3s y 10s), respectivamente. Por ltimo, la frecuencia de
anlisis del mtodo es del orden de 12 muestras h1.
Tabla 2. Caractersticas de la curva de calibrado simple y ecuaciones de las curvas de
adicin de estndar

(a) La preparacin de las soluciones utilizadas en las tres experiencias de adicin de
estndar se describe en detalle en el texto. (b) | dA/dn |1668-1649 cm1 es el valor
absoluto de la medida pico-valle (1668-1649 cm1) de la representacin D1 (25 puntos) del
espectro de absorcin correspondiente a la banda analtica de 1659 cm1; [Cafena]
representa la concentracin de cafena expresada en% (p/v). (c) Concentracin de cafena
obtenida a travs de las distintas formas de calibracin.
La precisin del mtodo se evalu a travs de la desviacin estndar relativa (DER).
Inicialmente se midieron cinco rplicas de una solucin estndar (0,075% p/v) y de la
muestra M1 ([Cafena] M1 0,05% p/v). Los resultados obtenidos fueron 0,11% y 0,15%,
respectivamente. Esta es una medida directa de la repetibilidad inherente al sistema AF-
IRTF. En segunda instancia, se evalu la precisin del procedimiento completo de anlisis
(incluyendo la preparacin de las muestras), analizando 5 soluciones de la muestra M1
preparadas en forma independiente, encontrando un valor de 1.2%. Por ltimo, se estim la
precisin entre-das del mtodo repitiendo la experiencia anterior en tres sesiones de trabajo
sucesivas e independientes. Los resultados obtenidos (DER = 1.7%; Sesin-1: [Cafena]M1
= 0,0502 0,0009% (p/v), n = 3 (1,00 0,02% p/p); Sesin-2: [Cafena]M1 = 0,0510
0,0008% (p/v), n = 3 (1,02 0,02% p/p) y Sesin-3: [Cafena]M1 = 0,0493 0,0005% p/v
(0,99 0,01% (p/p), n = 3) muestran una excelente reproducibilidad, que es indicativa de la
robustez del sistema de anlisis.
Estudios de interferencia y recuperacin
Para verificar la ausencia de efectos de matriz, se realizaron estudios de adicin de estndar
(CAE) en la modalidad clsica (volumen de muestra constante, volumen de estndar
variable y volumen final constante). Se disearon dos experiencias (curvas CAE-I y CAE-
II) fijando el volumen de muestra en 4 mL y 8 mL, respectivamente, a partir de una muestra
preparada con 5g de caf (M1) extrados con 100 mL de agua. En ambas curvas se
adicionaron cantidades variables y conocidas de cafena en el rango de 0 a 0,125% (p/v),
diluyendo en todos los casos a un volumen final de 10 mL. Se realiz una experiencia
adicional (III), aadiendo cafena slida directamente al caf molido en cantidades
exactamente establecidas para proporcionar a las soluciones de trabajo una concentracin
final de cafena adicionada equivalente al de las series anteriores. Los resultados de estas
experiencias se resumen en la Tabla 2. La comparacin de las pendientes de estas curvas,
basado en la prueba de Fisher y el estadstico t de student [26], indic con una certeza del
95% que las pendientes de las curvas CAE no muestran diferencias significativas con
relacin a la curva de calibrado simple (CCS). Este comportamiento permite concluir que
no existen interferencias fsicas ni qumicas por parte de la matriz en el anlisis.
Para evaluar la exactitud del mtodo, en una primera fase, se realizaron estudios de
recuperacin, utilizando para este fin la serie de muestras enriquecidas preparadas para las
curcas CAE. Los resultados obtenidos en todos los casos (Serie I: 97,73-102,0%, Serie II:
94,76-99,65% y Serie III: 93,40-101,8%) indican una recuperacin cuantitativa. A
continuacin, se compararon los resultados obtenidos para la concentracin de cafena de la
muestra de caf M1(s), a partir de la CCS y las tres curvas CAE (Tabla 2). El anlisis
estadstico de estos resultados nuevamente evidencia que no existen diferencias
significativas entre ellos, ratificando la exactitud del mtodo, la correcta aplicacin del
mismo y la ausencia de errores sistemticos a lo largo de todo el procedimiento
desarrollado. La equivalencia estadstica entre las pendientes de las curvas CCS y CAE, as
como entre la concentracin de cafena obtenida por ambas formas de calibracin, avala el
uso de la CCS a partir de estndares acuosos de cafena para realizar el anlisis.
Anlisis de muestras reales
Se analizaron 20 muestras de caf tostado de doce marcas diferentes que se comercializan
en el pas, 16 de ellas en presentacin de caf molido y 4 en granos. Los resultados se
muestran en la Tabla 3. El contenido de cafena en las muestras M1-M4 se evalu, en
paralelo, a travs del mtodo oficial [10]. Las dos poblaciones de resultados muestran una
buena coincidencia, lo cual ratifica la exactitud del mtodo propuesto.
Anlisis de muestras reales
Se analizaron 20 muestras de caf tostado de doce marcas diferentes que se comercializan
en el pas, 16 de ellas en presentacin de caf molido y 4 en granos. Los resultados se
muestran en la Tabla 3. El contenido de cafena en las muestras M1-M4 se evalu, en
paralelo, a travs del mtodo oficial. Las dos poblaciones de resultados muestran una buena
coincidencia, lo cual ratifica la exactitud del mtodo propuesto.
Tabla 3. Anlisis de muestras reales
Muestra* (Presentacin) [Cafena] %
(p/p)
(d)

Muestra* (Presentacin) [Cafena] %
(p/p)
(d)

M1
(a)
1,000 0,005 M11
(a)
1,03 0,02
M2
(a)
1,005 0,007 M12-1
(b)
1,02 0,01
M3
(a)
1,00 0,01 M12-2

(b)
1,06 0,01
M4
(a)
1,03 0,02 M12-3
(b)
1,07 0,02
M5
(a)
1,00 0,02 M12-4
(b)
1,03 0,01
M6
(a)
0,800 0,008 M12-5
(b)
1,07 0,01
M7
(a)
0,94 0,01 M6-(g)
(c)
1,16 0,02
M8
(a)
0,940 0,006 M7-(g)
(c)
1,05 0,01
M9
(a)
0,600 0,008 M13-(g)
(c)
1,07 0,02
M10
(a)
0,620 0,007 M14-(g)
(c)
1,10 0,02
M1
(e)
1,02 0,03 M3
(e)
1,02 0,04
M2
(e)
0,99 0,04 M4
(e)
1,00 0,04
Muestra
*
: Marca y presentacin comercial del caf. El subndice i (1-14) corresponde al
cdigo de la marca del caf. (a)Caf molido tostado. (b)Corresponde a 5 muestras distintas
de la misma marca (lotes distintos). Mi-(g). (c)Caf en grano tostado. (d)[Cafena] obtenida
por el mtodo propuesto (Media aritmtica desviacin estndar de 3 medidas
independientes). (e)[Cafena] obtenida por el mtodo oficial [10] (Media aritmtica
desviacin estndar de tres medidas independientes).
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