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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIA, TECNOLOGIA E INGENIERIA DE ALIMENTOS









PROYECTO DE TESIS

Caracterizaci n reologica del licor de cacao de la variedad
CCN51 de la zona de Pucaca (Theobroma cacao)


RESPONSABLE : BECERRA RAMIREZ, Edil


ASESOR : Ing. RIVERA ROJAS, Humberto


COASESOR :





TINGO MARA - PER
2014

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I. EL PROBLEMA

1.1 Planteamiento del problema
El cacao (Theobroma cacao) es un cultivo de notable importancia
econmica para Per; declarado recientemente como producto bandera de
Per, por la Comisin Nacional de Productos de Bandera (Coproba). Y debido
al alto valor nutricional y amplio consumo en la alimentacin por el mundo en
general; la produccin de cacao, chocolates y subproductos pasan a constituir
una prioridad en el pas. Gran parte del cacao Peruano es exportado y continua
siendo considerado entre los ms finos de aroma del mundo, sin embargo, su
participacin en el mercado internacional es prcticamente imperceptible en las
estadsticas. Durante los ltimos anos las compaas procesadoras de cacao, y
en particular aquellas encargadas de la produccin de chocolate, han
comprendido que la calidad sensorial constituye el xito de un producto y, para
ello, es necesario conocer los factores que determinan la calidad sensorial de
dicho producto. En la elaboracin del chocolate se pueden citar innumerables
factores vinculados a esta, cuyo manejo apropiado puede generar un carcter
aromtico distintivo y deseable. Los estudios que se han realizado en torno a
las diferentes etapas que conforman la elaboracin del chocolate son diversos.
Sin embargo, la bioqumica y los procesos qumicos que conducen a la
2

formacin y al desarrollo del aroma y del sabor del chocolate, su relacin con el
carcter final y la percepcin de la calidad no se entienden por completo.
Esta situacin hace necesario en realizar la caracterizacin reolgica del licor de
cacao para compilar la informacin necesaria, referente a los diferentes factores
que determinan la calidad sensorial del chocolate.
La semilla del fruto del rbol de cacao es la principal materia prima para la
elaboracin del chocolate, la cual es sometida a una serie de etapas de
transformacin primaria en donde se efecta la cosecha, la apertura de la
vaina, la fermentacin y el secado. Posteriormente se procede con el proceso
de manufactura del chocolate en el cual los granos son limpiados y tostados,
seguidos por la produccin del licor de cacao, mezcla y refinado, conchado,
temperado y moldeado, enfriamiento y finalmente el embalaje, almacenamiento
y distribucin. El sabor, el aroma, la apariencia y la textura son fundamentales
para la aceptacin del chocolate, los cuales estn influenciados de una u otra
forma por diversos factores, tales como la variedad de cacao, el clima, el suelo,
el tratamiento post-cosecha, as como por el proceso de manufactura del
chocolate.






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1.2 Justificacin
El presente trabajo de investigacin se justifica por los siguientes
motivos:
La falta de datos cientficos y de trabajos de investigacin en
aguaje,fruto extico de nuestra amazonia.
La informacin del presente estudio permitirconocer los tipos de
ismeros de vitaminas y el contenido de los mismos presentes en la
pulpa de este fruto.
Los datos que se obtengan servirn para la formulacin de nuevos
productos e incentivacin para su produccin y comercializacin.













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II. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Cuantificacin deismeros de vitaminas A, D yE en dos variedades de
pulpa deaguaje Mauritia flexuosa por HPLC en fase reversa.
2.2 Objetivos especficos
Realizar las medidas biomtricas y el balance de materia en la
obtencin de pulpa de aguaje: cascara, pulpa, piel y semilla.
Evaluacin al estado fresco y seco, almacenados a -20C de las dos
variedades de aguaje.

















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III. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
3.1 Antecedentes
Segn GARCA y RETEGUI (2002),realizaron la conservacin de
pulpa de Mauritiaflexuosal. aguaje con aplicacin de mtodos de factores
combinados.El objetivo de este trabajo fue estudiar la estabilidad fsico-
qumica, sensorial y microbiolgica durante el almacenamiento a temperatura
ambiente de pulpa de aguaje. Se han realizado los estudios de aplicacin de la
tecnologa de factores combinados en la conservacin de pulpa de aguaje.
Segn GARCA et al (2008), determinaronpor CLAR la Vitamina E
en el Pool de Aceite de Hgado de Tiburn.En este trabajo se desarroll y
valid un mtodo analtico, por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin
(CLAR), para determinar vitamina E, aplicable al control de la calidad del pool
de aceite de hgado de tiburn.El mtodo se bas en la separacin de la
vitamina a travs de una columna cromatogrfica Lichrosorb RP - 18 (5 m, 25
cm x 4 mm), empleando una fase mvil compuesta por metanol: agua (98:2).
La cuantificacin de las vitamina E se realiz frente a muestras de referencia
empleando el mtodo del estndar externo, a una longitud de onda de 284 nm.
El mtodo analtico desarrollado result lineal, preciso, especfico y exacto en
el rango de concentraciones estudiadas.
Segn SIERRA et al (2007),realizaron la validacin de una
metodologa por cromatografa lquida de alta eficiencia para la determinacin
6

simultnea de vitaminas A, D
3
y E en inyectables de uso veterinario. Obtuvieron
resultados del desarrollo y de la validacin de una metodologa analtica para la
cuantificacin simultnea de vitamina A palmitato, vitamina D
3
y vitamina E
acetato en inyectables de uso pecuario. El procedimiento consiste en una
separacin por cromatografa lquida de alta eficiencia (CLAE) en fase inversa
empleando como fase mvil una mezcla de acetonitrilo, metanol, agua
(45:50:2.5), una columna C18 a 45 C y deteccin a una longitud de onda de
280 nm. Se encontr que el mtodo es selectivo, lineal y preciso. Estas
caractersticas junto con su sencillez hacen que el mtodo sea adecuado y
conveniente para el objetivo propuesto. La robustez de la metodologa fue
tambin investigada. El mtodo validado se aplic para la determinacin de las
vitaminas en tres productos inyectables del mercado colombiano con registro
sanitario del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA).











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3.2 Conceptos bsicos generales
3.2.1 Caractersticas botnicas del aguaje
3.2.1.1 Clasificacin taxonmica
NAVARRO (2006), menciona que la taxonoma del aguaje
es la siguiente:
Reino : Vegetal
Divisin : Fanergamas
Clase : Monocotiledne
Subclase : Liliopsida
Orden : Arecales
Familia : Arecaceae
Sub Familia : Calamaoid
Tribu : Lepidocaryeae
Gnero : Mauritia
Especie : flexuosa
3.2.1.2 Descripcin morfolgica
El aguaje es una palmera arborescente de un solo tallo, sin
espinas, que alcanza 25 a 30 m de altura en su estado de adulto. Crece en
suelos inundados o con mal drenaje. El tallo es cilndrico con hasta 50 cm de
dimetro y est constituido por un material fibroso duro. La corona de hojas se
presenta en nmero de 10 a 20 por planta, con peciolo cilndrico y largo (hasta 6
m). La planta es dioica con rboles de flores masculinas y rboles de flores
femeninas, sin caractersticas que permitan diferenciar a los individuos machos
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de las hembras, hasta la floracin. La proporcin de plantas masculinas y
femeninas es similar, pero, es alterada por la prctica que existe de cortar las
plantas femeninas para cosechar los frutos.
El fruto es una drupa, de forma elptica, con longitud entre 5 y 7 cm
y dimetro entre 4 y 5 cm. El epicarpio (cscara) es escamoso, de color rojo vino
o rojo oscuro. El mesocarpio, la nica parte comestible, de 4 a 6 mm de espesor,
es suave, sabor agridulce y de color naranja a naranja-rojizo y representa
solamente 12 a 13% del peso seco del fruto. El endocarpio (cobertura de la
semilla) es suave, rico en celulosa y pobremente diferenciado. Hay una, muy
raramente, de dos semillas por fruto, casi esfricas, cubiertas con una testa
marrn. La floracin y fructificacin se distribuyen irregularmente durante el ao,
pero, siempre ocurren anualmente. Los frutos maduros se encuentran todo el
ao, con abundancia en la primera mitad del ao (Per y Amazona norte de
Brasil), o en la segunda mitad del ao (Colombia, Venezuela y Amazona central
de Brasil). El peso promedio de los frutos en una inflorescencia es de 40 kg
(VILLACHICA, 1996).
Se puedendiferenciar tres variedades de fruta por sucolor: el
Amarillo o Posheco, cuando todo elmesocarpio es de color amarillo; el Colorado,
cuando la parte externa del mesocarpioes de color rojo y el resto es amarillo;
elShambo, cuando todo el mesocarpio es decolor rojo (NAVARRO, 2006).



3.2.1.3 Composicin qumica
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La pulpa del aguaje es el alimento ms nutritivo de los
frutos del trpico. En la tabla 01, se presenta el anlisis qumico y el valor
nutritivo de la pulpa:
Cuadro 1. Composicin qumica en 100 g de pulpa
Componentes 100 g de pulpa
Energa 283,0 kcal
Agua 53,6 g
Protenas 3,0 g
Lpidos 21,1 g
Carbohidratos 18,1 g
Fibra 10,4 g
Ceniza 0,9 g
Calcio 74,0 mg
Fsforo 27,0 mg
Hierro 0,7 mg
Fuente: NAVARRO, 2006
3.2.2 Vitaminas
3.2.2.1 Vitamina A
Definicin
La vitamina A, tambin denominada trans-retinol (retinol),
es un alcohol isoprenoide que desempea un papel clave en la visin. Se trata
de un compuesto poliisoprenoide que contiene un anillo ciclohexano (MELO-
CUAMATZI, 2004).
10

Se conoce bien la importancia de la vitamina A como factor para el
crecimiento y la salud normal. El estudio del ojo y sus enfermedades, y las
investigaciones sobre el valor nutricional de las grasas a comienzos de siglo
fueron rutas diferentes que condujeron al descubrimiento de esta
vitamina,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
En 1909, Stepp descubri que en la yema del huevo exista una
sustancia soluble esencial para el mantenimiento de la vida. McCollum en
1992 introdujo el trmino de sustancia liposoluble A para este factor y en 1920
Drummond llamo a esta sustancia vitamina A. Adems, fue la primera vez que
se observo que los extractos amarillos de planta ricos en carotenos tenan
actividad de vitamina A. La explicacin llego aos ms tarde (1992) al
descubrirse en ratas que el beta caroteno se converta en vitamina A. La
estrecha relacin entre esta vitamina y los grupos carotenoides se rebel
cuando se determino la forma estructural de ambos, aunque los carotenos ya
haban sido extrados y cristalizados de zanahorias en el ao 1831 por
Wakenroder. La vitamina A
2
fue aislada por Morton en 1937 y la actividad
biolgica del acido retinoico fue descubierta en el ao 1946.
Wald en los 1934 - 1935 aisl retinaldehido de la retina y demostr
que estaba implicado en el proceso de la visin,(SASTRE y HERNNDEZ,
1999).
Estructura.
El termino vitamina A se ha utilizado para los derivados
beta ionona que poseen una estructura yactividad biolgica comparable a la
molcula base que es el transretinol. En la naturaleza la vitamina A puede
11

encontrarse en tres estados de oxidacin diferentes como resultado de la unin
de 4 unidades de isopreno: alcohol (retinol), aldehdo (retinaldehido) y acido
(acido retinoico). En los mamferos, la conversin del retinol a retinal es un
proceso reversible; sin embargo, la transformacin del aldehdo en acido
retinoico es irreversible,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
Suele denominarse retinoide a todas las formas de vitamina A,
incluso a sus anlogos sintticos, por su enorme importancia en la fisiologa de
la retina, aunque algunos autores consideran que son retinoides solo derivados
sintticos y anlogos de la vitamina A. El trmino incluye alrededor de unas
1500 formas.
Los retinoides pueden presentar cambios en su estructura tanto a
nivel de la cadena lateral como el anillo,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
Los retinoides nativos en solucin y tambin los carotenos por
accin de la luz, calor y iodo pueden sufrir transformaciones (transiciones).
Estas transiciones involucran las isomerizaciones cis-trans de los enlaces
dobles. La cadena lateral de la vitamina A tiene 4 dobles enlaces que
tericamente son 16 ismeros. El 13-cis-retinol y all-trans-retinol estn en
equilibrio en solucin con un 33 por 100 de forma cis,(SASTRE y
HERNNDEZ, 1999).
Con respecto a la estabilidad, la vitamina A es muy sensible al
O
2
del aire, especialmente en presencia de luz y calor. Los esteres son ms
estables al O
2
de las formas alcohlicas. Las formas comerciales de la vitamina
A (retinil acetato y retinil palmitato) se presentan en forma oleosa, emulsin
acuosa o polvo estabilizado. Estos productos deben ser protegidos de la luz y
12

oxigeno durante su almacenamiento. La actividad de la vitamina A que
enriquece la harina disminuye solo con la luz cuando se almacena a 40 45 C
al cabo de varios meses,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
Respecto a sus propiedades fsicas la mayora de las formas de
vitamina A son compuestos cristalinos con un punto de fusin relativamente
bajo. Por su estructura todos los retinoides tienen un espectro de absorcin
caracterstico que se utiliza para su identificacin. Cuando se irradian con luz
UV el retinol emite una fluorescencia amarillo-verdosa, mientras que el 3-
dehidroretinol lo hace en el marrn-naranja, (SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
La actividad de los carotenoides es similar a la vitamina A. Son
sensibles a la luz, cidos y O
2
la oxidacin de los carotenoides con O
2
, produce
compuestos no coloreados. Son ms bien solubles en cloroformo y benceno,
poco solubles en ter y acetona e insolubles en agua.
La unidad de medida de la actividad de vitamina A se expresa
como equivalente de retinol (RE). La concentracin de vitamina A y -caroteno
en plasma se expresan como mol/L, mol/dL o mol/Ml, (SASTRE y
HERNNDEZ, 1999).

3.2.2.2 Vitamina D
Definicin
La vitamina D se ha considerado durantedcadas como
factor antirraqutico esencial para la regulacin del metabolismo mineral.
Actualmente se reconoce que su principal metabolito, la 1,2 (OH)2D o calcitrol,
13

es una hormona esteroidea con amplias funciones en el organismo,(SASTRE y
HERNNDEZ, 1999).
La 1,2 (OH)2D tiene accin en los principales rganos relacionados
con la homeostasis mineral como intestino, hueso y rin. Adems, est
implicada en el proceso de la osteognesis, en la modulacin de la respuesta
inmune, en la funcin de las clulas musculares, as como la diferenciacin y
crecimiento del tejido hematopoytico y epidrmico,(SASTRE y HERNNDEZ,
1999).
La vitamina D efecta muchas de estas acciones como el resto de
las hormonas esteroideas, es decir por acoplamiento con un receptor
nuclear/citosolico, que en una subsecuente asociacin con regiones selectivas
de los genes produce un aumento o disminucin de su expresin.
En los aos treinta se asla la vitamina D como principio activo,
pero permanecen desconocidos su metabolismo as como su mecanismo de
accin. En la dcada de los setenta se describen su fisiologa y metabolismo.
Actualmente se puede considerar que es una vitamina y una
hormona. Puede considerarse como vitamina ya que cuando su sntesis
cutnea endgena es insuficiente, debido a irradiacin solar baja o a
disminucin en la capacidad de fotoconversion de la piel, su deficiencia puede
ser curada por suplementos de esta sustancia con la dieta. Pero ya sea
sintetizada por la piel o ingerida por va oral, el esteroide bsico es
transformado a metabolismo activo, actuando como una prehormona. En virtud
de su produccin endgena, la regulacin de su sntesis, su distribucin por va
sangunea a los tejidos diana lejos del lugar de produccin as como por su
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mecanismo de accin, la vitamina D (en cuanto a su metabolito activo, la
1,25(OH)2D) puede considerarse como una hormona esteroidea, (SASTRE y
HERNNDEZ, 1999).
Estructura
La vitamina D tiene una estructura qumica muy semejante
a la del colesterol. El trmino calciferol engloba a dos esteroles: colecalciferol
(vitamina D3), que es la forma de la vitamina D que se encuentra en los
animales y en las plantas ergocalciferol (vitamina D2). Los calciferoles no estn
ampliamente distribuidos en la naturaleza y la mayora de los alimentos
animales o vegetales contienen solo precursores inactivos que necesitan de la
radiacin ultravioleta para su conversin en calciferoles.
Las vitaminas D2 y D3 se producen en la piel de los animales y en
las plantas por la conversin no enzimtica de sus precursores. El precursor de
la vitamina D3 en la piel es el 7-dehidrocolesterol. Por la accin de los rayos
ultravioleta se rompe la unin en el carbono 9-10; posteriormente se produce
una isomerizacin, y el ergosterol o el 7-dehidrocolesterol se transforma en
ergocalciferol (D2) o colecalciferol (D3), respectivamente,(SASTRE y
HERNNDEZ, 1999).

3.2.2.3 Vitamina E
Definicin
Con el termino vitamina E se denominan a todos los
derivados del tocoferol y tocotrienol. Los cuales tienen una actividad biolgica
cualitativa de alfa tocoferol. Este trmino tambin se aplica a deficiencia de
15

vitamina E, actividad de vitamina E, antagonistas de la vitamina E, etc. La
actividad de la vitamina E est condicionada por diferentes tocoferoles y
tocotrienoles presentes en la dieta. No se supo por muchos aos con que
patologa se poda relacionar esta vitamina. Se observ que la lechuga y el
germen de trigo eran ricos en este factor.
En 1992, Evans y Bishop publicaron la existencia de un nuevo
factor nutricional, primero llamado factor X, el cual prevena la muerte fetal y
atrofia testicular. Tres aos ms tarde, Evans publico lo siguiente: Nosotros
hemos adoptado la letra E como la designacin de este nuevo factor dentro de
la serie alfabticams prxima a la designacin de la vitamina antirraqutica D.
En los 20 aos siguientes fue dirigida a encontrar la aplicacin de esta nueva
vitamina en la prevencin o cura en los desordenes de la reproduccin, tanto
en veterinaria como en medicina humana, sin ningn xito. Hasta que cuarenta
aos mas tarde de su descubrimiento que el edema y la hemolisis del recin
nacido pretermino estaban relacionados con la deficiencia de vitamina E.
Las investigaciones iniciales fueron difciles por la falta de mtodos
adecuados y por que la vitamina E no tiene una accin de coenzima selectiva
como las otras vitaminas y se encuentra e interviene en la fase lipdica. Esta
situacin cambia cuando Evans y sus colaboradores aislaron en alcohol
vitamina E altamente activa de germen de trigo. Se determino su formula
(C29H30O2) y se le dio el nombre de tocoferol (tocos = nacimiento); dos
aos ms tarde se aislaron el y tocoferol con menor actividad que el
tocoferol. Al mismo tiempo Olcott y Emerson (1973) descubrieron que estos
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tocoferoles eran efectivos antioxidantes, aunque su poder antioxidante y su
actividad biolgica no eran paralelos.
Por mucho tiempo no se considero la funcin esencial de esta
vitamina en nuestra alimentacin debido a que en los pases bien nutridos esta
deficiencia es desconocida.
Adems las reservas en rganos y tejidos son grandes, por la cual
es difcil producir una avitaminosis. Ha sido en los ltimos 15 aos cuando se
ha definido su papel esencial para un desarrollo normal y mantenimiento del
sistema nervioso central, nervios perifricos y msculos de nios y adultos.
Actualmente se reconoce que la deficiencia de vitamina E se produce
comnmente en lactantes, nios y adultos con mala absorcin crnica a las
grasas; como posible complicacin de la nutricin parenteral total, es un
problema nutricional en pases desarrollados, y como una caracterstica del
error innato del metabolismo en el cual est involucrada la protena
transportadora del tocoferol heptico. Fue en 1968 cuando la Food and
Nutrition Board la considero como un componente esencial, (SASTRE y
HERNNDEZ, 1999).
Estructura
El termino de vitamina E se le da a una familia compuesta
de 8 sustancias similares que existen en la naturaleza derivadas del 6-
cromanol, cuatro tocoferoles (,, y tocoferol: la posicin q ocupa el grupo
metilo en el anillo cromanol determina la letra griega utilizada como prefijo), con
la cadena lateral saturada y cuatro tocotrienoles ((,, y tocotrienol) con la
cadena lateral insaturada. Los grupos metilos le confieren diferente
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bioactividad(alfa > gamma > beta > delta). La esterificacin del grupo fenlico
del anillo de cromanol con acetato, succinato, nicotina, etc., protege al tocoferol
de la oxidacin. Sin embargo, puesto que estos grupos ocupan los sitios donde
est la actividad antioxidante de este compuesto, se requiere que estos esteres
sean hidrolizados para que tengan actividad biolgica.
La nomenclatura puede ser confusa pero hay un acuerdo
internacional que especifica que el d--tocoferol se llama RRR--tocoferol; es
la forma ms extendida en la naturaleza. Al diesteroisomero con
configuracin2S,4R,8R se llama 2-epi--tocoferol. A la mezcla RRR--
tocoferol y 2-epi--tocoferol obtenida por sntesis del fitol e hidroquinona se
denomina 2-ambo--tocoferol 1 UI se define como 1 mg de 2-ambo--tocoferil
acetato. La vitamina E sintetica es una mezcla de los 8 diesteroisomeros
conocida como all-rac--tocoferol.
El alfa tocoferil acetato es la forma cuantitativamente ms
importante utilizada como suplemento diettico en medicina. La vitamina E no
esterificada se utiliza como antioxidante en tecnologa alimentaria (evitan que
las grasas y aceites se enrancien).
En ausencia de O2, los tocoferoles tienen una estabilidad elevada
al calor, la luz y alcalinidad. En presencia de O2 pierden sus propiedades
antioxidantes,(SASTRE y HERNNDEZ, 1999).
Fuentes
La vitamina E se encuentra principalmente en el aceite de
los vegetales (soja, maz, algodn y girasol), granos, plantas y en el tejido
adiposo de los animales. Se localiza principalmente en las hojas y partes
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verdes de las plantas, las cuales contienen ms-tocoferol que las partes
amarillas. Tambin se encuentran en algas marrones, verdes y rojas, en
algunas levaduras y hongos, pero no en las bacterias. La distribucin de los
tocoferoles es diferente a los tocotrienoles. Los tocotrienoles son abundantes
en el aceite de la semilla de palma. El aceite de girasol es tal vez la fuente ms
importante de vitamina E (42,1 a 113 mg/100g de aceite). El aceite de germen
de trigo es comparable al de girasol. La destilacin de un aceite produce
prdidas considerables en su contenido de vitamina E, que causa
desestabilizacin del mismo, por lo que son los vapores destilados en la
refinera de los aceites utilizados en la alimentacin las fuentes naturales ms
importante de vitamina E.
Normalmente en un cocinado cuidadoso se pierde un 10 por 100
de esta vitamina. Las mayores prdidas ocurren al frer, asar o cocer a fuego
lento, y son totales cuando se fre en aceites que son recalentados
repetidamente. El tocoferol se degrada lentamente si hay una gran cantidad de
cidos grasos insaturados en los alimentos congelados. En los granos
almacenados se pierden un 10 por 100 cada mes. El germen y salvado del
grano contienen la vitamina E por lo que las harinas blancas prcticamente se
eliminan en la elaboracin. En los vegetales desecados las perdidas fluctan
entre el 50 70 por 100.
Para los nios las principales fuentes dietticas son los aceites
vegetales, margarinas, germen de trigo, nueces y hojas verdes. Las formulas
infantiles contienen 0,4 mg de vitamina E/mg de Polyunsaturated fatty acids
(PUFA).
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3.2.3 CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
Es una tcnica de separacin de compuestos, que permite aislar,
identificar y cuantificar los compuestos desconocidos tales como vitaminas,
protenas y compuestos activos como flavonoides, alcaloides y esteroles en
una muestra o solucin conocida. Para la cuantificacin de estos compuestos
se utiliza estndares especficos (Horie et al., 2000).
La tcnica HPLC describe el proceso en el cual la fase mvil
(lquido) es mecnicamente bombeado a travs de una columna que contiene
la fase estacionaria (slido) y la cuantificacin de los analitos se realiza
mediante un detector (Nielsen, 1998).
Segn Nielsen, 1998 el sistema HPLC consta de las siguientes
partes:
1. Bomba: Son dispositivos de alta tecnologa que tiene por funcin de
entregar la fase mvil a travs del sistema, a diferentes flujos segn lo
especifique el mtodo, en cantidades exactas y de manera precisa.
2. Inyector: El fin del proceso de inyeccin es introducir la muestra en
un reservorio sujeto a accin de la bomba para luego ser llevado a la columna.
3. Columna: La columna es considerada como una herramienta para la
separacin de las molculas presentes en la muestra que est siendo
analizado.
4. Detector: El detector por lo general es ultravioleta (UV) o visibles
(VIS), es el instrumento que detecta la presencia de las molculas motivo de
anlisis. Una vez que la muestra sale de la columna es presentada al detector
20

que identifica en funcin a la absorbancia la cantidad presente de un
determinado analito; luego el detector convierte esta interaccin en seal
electrnica que es enviada al sistema de datos. La magnitud de esta seal es
graficada contra el tiempo.
En la Figura 1 se esquematiza un sistema HPLC en gradiente de
baja presin, que es la configuracin con la que se trabajar.
21




Figura 1. Sistema HPLC en gradiente de baja presin
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IV. HIPOTESIS
Es posible evaluar el contenido de ismeros de vitaminas A, D y E
de dos variedades de pulpa de aguaje (Mauritia flexuosa) por HPLC en fase
reversa.
















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V. MATERIALES Y METODOS
5.1 Lugar de ejecucin
El presente trabajo de investigacin se realizar en el Centro de
Investigacin de Productos Naturales de la Amazona (CIPNA), de la
Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS).
5.2 Materiales
5.2.1 Materia prima
Las dosvariedades de aguaje (Amarillo y Shambo)se obtendrn del
mbito de la regin amaznica peruana.
5.2.2 Materiales de laboratorio
5.2.2.1 Materiales
- Tubos de ensayo (10ml)
- Vasos de precipitacin(1000ml,500ml,100ml,50ml,10ml)
- Fiolas (1000ml, 500ml, 100ml, 50ml, 10ml)
- Probetas
- Termmetros
- Microtubos (1,5 ml, 2 ml)
- Puntas para micropipeta(1000ul, 200ul, 100ul)
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- Micropipetas
- Matraces Erlenmeyer
- Geringas
5.2.2.2 Equipos
- Estufa
- Congeladora
- Centrfuga
- Homogenizador
- Destilador
- Desionizador
- Equipo de Cromatografa Lquida de Alta Performancia
(HPLC)
- Refrigeradora
5.2.2.3 Reactivos y solventes
- Acetonitrilo (grado HPLC)
- Ismeros de vitamina A, D y E
- Etanol al 99.9%
5.3 Mtodos de anlisis
5.3.1 Evaluacindel contenido de vitaminas A, D e ismeros de
vitamina E por HPLC
Se realizar de acuerdo al mtodo descrito por SUPELCO Sigma
Aldrich (1999), para la determinacin de vitaminas liposolubles.

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VI. METODOLOGA EXPERIMENTAL
El siguiente trabajo de investigacin estar dividido en dos etapas:
6.1 Obtencin de los extractos
En esta etapa se proceder a la obtencin de los extractos (Ver
figura 2).
6.1.1 Obtencin de la muestra
Las dos variedades de aguaje se obtendrn del mbito de la regin
amaznica peruana, tomando criterios de poscosecha (frutos de color rojo
oscuro).
6.1.2 Determinacin de medidas biomtricas
Se medirn el dimetro y la longitud de los frutos de las dos
variedades de aguaje empleando un vernier.
6.1.3 Maduracin del aguaje
Los frutos se sumergirn en agua a 55 C, por 2 horas y media
para su maduracin, (GARCIA y REATEGUI, 2002).
6.1.4 Obtencin de la pulpa y balance de materia
Se desprender la cascarilla del endocarpio del fruto con la ayuda
de una cuchara y luego se separar la pulpa. Se realizar el balance de
materia pesando la cascara, pulpa, piel y semilla.
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6.1.5 Conservacin y Almacenado de la pulpa
Se realizaran los tratamientos descritos a continuacin:
T1= Empacadoy almacenado a -20C.
T2 = Secadoa 45 C, empacado y almacenado a -20C.
T3= Inmersin en solucin de cido ctricoal 0.3 % por 5 seg, oreado por
5 min, secado a 45 C,empacado y almacenado a -20C.
6.1.6 Extraccin
La pulpa se someter a una solucin de etanolal 70 % con el fin de
extraer los ismeros para su caracterizacin.
6.1.7 Filtracin
Se realizar con papel filtro y con la ayuda de una bomba de vacio
para agilizar este proceso.











27















Figura 2. Obtencin de los extractos para las dos variedades de aguaje.
6.2 Evaluacin del contenido de vitaminas A, D eismeros de vit. E por
HPLC
La caracterizacin de las vitaminas se realizara en dos grupos:
6.2.1 Vitaminas A y E empleando columna cromatogrfica C8, CLC
Para la caracterizacin de ismeros de las vitaminas A y E se
trabajar utilizando las siguientes caractersticas que debe tener el equipo:
- Columna: Shim Pack CLC - C8, 15cm x 4.6mm ID, 5m partculas
- Fase mvil:Acetonitrilo:agua (90:10)
FILTRACIN
EXTRACTOS
EXTRACCION

MADURADO
CONSERVACIN Y ALMACENADO

OBTENCIN DE LA PULPA
AGUAJE
28

- Flujo de alimentacin: 2mL/min
- Temperatura:30C
- Deteccin: UV, 290nm
- Inyeccin:10L
6.2.2 Vitaminas D2y D3 empleando columna cromatogrfica C18,
Supelco
Para la caracterizacin de ismeros de la vitaminaD se trabajara
utilizando las siguientes caractersticas para el equipo:
- Columna: Supelco C18, 15 cm x 4.6mm ID, 5m partculas
- Fase mvil: Acetonitrilo 100%
- Flujo de alimentacin: 1.5 mL/min
- Temperatura:30C
- Deteccin: UV, 290nm
- Inj.:10L
29




VII. DISEO EXPERIMENTAL







Figura 3.Diseo experimental para la caracterizacin de los ismeros de las vitaminas propuestas.
Donde:
A, y B: Son las variedades de aguaje.
T1, T2, y T3: son los tratamientos para evaluar el contenido de vitaminasA, D eismeros de vit. E.
R1, R2 y R3 son las repeticiones para cada tratamiento.
CARACTERIZACION DE LOS ISOMEROS DE
LAS VITAMINA A, D y E
Mauritia flexuosa
T2 T3 T1
Variedades
B A
R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R1 R3
30




VIII. ANLISIS ESTADSTICO
Para evaluar los resultados de acuerdo al diseo experimental se
utilizar el modelo estadstico diseo completo al azar con arreglo factorial de2
x 3con tres repeticiones, por cada vitamina, para lo cual se emplear el
siguiente modelo matemtico:
y
ij
= + a
i
+ b
j
+ (ab)
ij
+ e
ij

Donde:
Y
ijk
: Contenido de Ismeros de vitaminasA, D y E.
U : Efecto de la media general de las evaluaciones.
a
i
: Efecto de las variedades de aguaje.
b
j
: Efecto de los tratamientos de conservacin en la pulpa de
aguaje.
(ab)
ij
: Efecto de la interaccin de la variedades y los tratamientos
de conservacin en la pulpa de aguaje.
e
ij
: Efecto del error experimental.
De existir significancia entre los tratamientos, se evaluar con la
prueba de Duncan, con un nivel de significacin del 5%. El anlisis estadstico
se realizar mediante el software STATGRAPHICS PLUS 5.1


31




IX. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
En el siguiente cuadro, se muestra el cronograma de actividades,
los meses divididos en semanas.

Cuadro 2. Cronograma de actividades de la presente investigacin.
Meses
Actividades

1

2

3

4

5

6
Elaboracin del proyecto X X
Presentacin y aprobacin
del Proyecto
X X X X
Desarrollo de pruebas
experimentales
X X X X XX X X X X X X X X
Redaccin del informe X X X X X X X X X X X X X X X

Donde:
X = Semanas.





32



X. PRESUPUESTO
En el Cuadro 3, se presenta el presupuesto para la ejecucin de
este trabajo de investigacin.
Cuadro 3.Presupuesto para la ejecucin del trabajo de investigacin.
N

Rubro Costo
unt.
S/.
Costo
total
S/.
Costo
rubro
S/.
Costo
total
partida
(S/.)
01.00
01.10



01.20




01.30
01.40



02.00
02.10
02.20
02.30
02.40

02.50
02.60
Bienes
Materiales de escritorio
- 2mill. Papel bond A4
- 4u. Plumones indelebles
- 1u. Cuaderno de registro
Materiales de procesamiento de
datos
- 1 Memoria USB
- 2 CDs
- 4 Cartuchos impresin
Impresin, fotocopias, internet
Materia prima, insumos y
reactivos
- 20 kg aguaje
- otros
Servicios
Pasajes y viticos
Anlisis
Material de apoyo
Tipeos, impresiones y
encuadernados
Servicios de gua y luz
Alquiler de equipos


33.00
7.00
2.00


50.00
1.50
60.00



2.50
20.00







66.00
28.00
2.00


50.00
3.00
240.00



50.00
20.00






96.00



293.00




250.00
70.00




250.00
2000.00
50.00
300.00

200.00
500.00
709.00














3300.00
Sub. total
Improvistos (10%)
4009.00
400.90
TOTAL 4409.90
33




XI. BIBLIOGRAFIA
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34

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