Coloración DE Wright

Universidad Nacional San Antonio Abab del Cusco Sub Sede Canchis
Carrera de Medicina Veterinaria

COLORACIN DE WRIGHT

A. Introduccin

Con el fin de estudiar satisfactoriamente los frotis sanguneos, es necesario colorearlos.

En la mayora de los laboratorios los colorantes ms empleados para la tincin
hematolgica se basan en el de Romanowsky constituido fundamentalmente con la mezcla
de eosina (cido) y azul de metileno (bsico). Adems se han incorporado el empleo de
derivados por oxidacin del azul de metileno que se conoce con el nombre de azures (A, B,
C). Son los azures los responsables de la coloracin prpura o roja de ciertas estructuras.

Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las
diferentes estructuras celulares, de forma que las que tienen carcter bsico fijan la eosina
mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno.

Esto explica que las estructuras basfilas se tian de color azul mientras que los competente
acidfilas adquieren un color rosado. La diferente afinidad de ciertas granulaciones
citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar a los leucocitos polimorfonucleares
en 3 grupos:

Granulocitos eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias de
carcter bsicos que fijan los colorantes cidos y se tien de color rojo-naranja.
Granulocitos basfilos, en los que la granulacin especfica posee sustancias de
carcter cido que fijan los colorantes bsicos y se tien de color azul oscuro.
Granulocitos neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos de
carcter neutro por lo que fijan ambos colorantes simultneamente, de ah que se
tien de color pardo.

Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los ms utilizados son el de Wright,
Giemsa y May- Grnwald-Giemsa, entre otras.

Material necesario para realizar la prctica:
Lo primero es obtener un frotis de sangre, para ello seguir los siguientes pasos:

1. Recoger una pequea gota de sangre y depositarla a 1cm del extremo de un porta
objetos totalmente limpio.

2. Extender mediante otro portaobjetos de la manera siguiente: poner el
portaobjetos en contacto con la gota, que en principio se alargar
en una lnea en la zona de contacto de los dos portas
Hacer deslizar el portaobjetos esmerilado
sobre el porta soporte en direccin opuesta a
la de la gota de sangre; sta, por
tensin superficial, se extiende formando una
lmina muy delgada.
De esta manera, la gota es atrada
por el portaobjetos esmerilado y no empujada. (verfigura).

3. Dejar secar al aire.


1. Tincin de Wright

Esta coloracin es conocida como policromtica debido a que produce varios colores. Es
una solucin de alcohol metlico de un colorante cido (eosina) y otro bsico (azul de
metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguneo al portaobjetos. El
amortiguador, que consiste en una solucin tamponada, mantiene el pH del colorante y
favorece la mejor absorcin por los diferentes componentes celulares.


1. Tincin de Wright

Esta coloracin es conocida como policromtica debido a que produce varios colores. Es
una solucin de alcohol metlico de un colorante cido (eosina) y otro bsico (azul de
metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguneo al portaobjetos. El
amortiguador, que consiste en una solucin tamponada, mantiene el pH del colorante y
favorece la mejor absorcin por los diferentes componentes celulares.

Materiales:

Colorante de Wright: para 100 mL se requiere de colorante de Wright (0.3g),
metanol (97.0 mL) y glicerol (3.0 mL). Disolver en un mortero el colorante con el
glicerol. Una vez disuelto se adiciona el metanol trasvasndolo a un frasco oscuro.
Agitar. Filtrar antes de usar.
Solucin amortiguadora tamponada: en un litro de agua destilada se agregan 3.76 g
de hidrofosfato disdico (Na2HPO4* 2H20) y 2.10g de fosfato de potasio
dihidrogenado (KH2PO4). Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de vidrio
en lugar fresco. Ajustar el pH a 7.2.
Rejilla horizontal o soporte de tincin.

Figura 4. Tincin de Wright manual en portaobjetos y cubreobjetos.
Fuente: Rodak B. Hematologa: fundamentos y aplicaciones clnicas. 2 ed. Rondinone S, trad. Buenos Aires: Mdica
Panamericana, 2004. 884p.

Tcnica:


Colocar
el frotis
secado
al aire
sobre u
na rejilla
o cube
ta de ti
ncin c
on la sa
ngre
hacia ar
riba (ver
figura
4).
Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de Wright
gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos,
para fijar los glbulos sanguneos. El colorante deber cubrir completamente el
portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deber agregarse una
cantidad adicional si ste se comienza a evaporar.
Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright,
para evitar la coloracin dbil. Esperar la formacin de brillo metlico. Puede usarse
de igual manera agua desionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos.
Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensin presente un
aspecto rosado al examinarlo a simple vista.
Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol
para eliminar cualquier resto de colorante.
Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.

Resultados:

Los eritrocitos se observarn de color naranja o rosado.


El citoplasma de los monocitos presentarn una tonalidad azul griscea con grnulo
rojizos bastante finos y sus vacuolas caractersticas. El citoplasma de los linfocitos
presentar varias tonalidades azules.
Los ncleos de los linfocitos y neutrfilos aparecern de color prpura oscuro. Los
ncleos de los monocitos de color prpura algo ms claros (lila).
Los grnulos de los eosinfilos son de color rojo-anaranjado intenso. Los grnulos
de los basfilos prpura azulado muy oscuro. Los grnulos de los neutrfilos se
aprecian de color lila, bastante finos.
Las plaquetas toman coloracin violeta o prpura.

Observaciones:

Los tiempos varan de acuerdo a cada lote o tiempo de maduracin del colorante.
De ah que si los frotis recin teidos resultan demasiado plidos se corrige
aumentando el tiempo de tincin o disminuyendo el tiempo de lavado.
Si en la preparacin se observa precipitados de colorante puede ser debido a varias
causas: lavado insuficiente al final del proceso, utilizacin de porta o cubreobjetos
sucios, mala filtracin del colorante, mala distribucin del colorante a lo largo de la
extensin por no mantenerse en posicin horizontal.
Durante la tincin el tampn fosfato controla el pH del colorante. Si el colorante es
demasiado cido la extensin resultar demasiado rojiza y si por el contrario es
demasiado alcalina la precipitacin presentar un aspecto azulado.

2. Tincin de Giemsa

Es la segunda coloracin en uso, luego de la tincin de Wright, y en importancia de las
mezclas de Romanowsky. Es quizs la mejor modificacin de este tipo de coloraciones para
descubrir parsitos en la sangre, como en el caso de malaria (Plasmodium spp.) y
tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de Giemsa tambin da excelentes
resultados para la tincin rutinaria de frotes sanguneos. Cuando se va a teir con este
colorante, debe fijarse primero la muestra con metanol absoluto por un tiempo mnimo de
tres minutos (cuando la preparacin no incluye metanol). El colorante en solucin nunca se
utiliza de manera directa, por lo que se debe diluir con la solucin amortiguadora en una
proporcin de 1:10 1:20 y el tiempo de coloracin podr ser de 10 20 minutos,
respectivamente.

Material:

Colorante de Giemsa (constituido por una mezcla de azul de metileno, eosina y varios
azures en dilucin acuosa): 1.0g del colorante en polvo, 66mL de metanol absoluto y 66mL
de glicerol. Se debe disolver el colorante con el glicerol, adicionar el metanol, mezclar bien y
dejar a temperatura ambiente de 7-14 das (maduracin). Filtrar antes de su empleo.
Guardar en frasco color mbar. Importante: Las indicaciones de preparacin pueden variar
dependiendo de la casa comercial.

Tcnica:


Fijar el frotis con alcohol metlico de 3-4 minutos. En caso de que la preparacin del
colorante ya posea metanol, este paso queda obviado.
Sumergirlo verticalmente en una solucin de Giemsa preparada extemporalmente a
partir de 1 volumen de la solucin colorante ms 9 volmenes de solucin tampn
(pBs, pH 6.8) o bien en agua desionizada.
Esperar durante 10-20 minutos.
Lavar el frotis con abundante agua, directamente del chorro.
Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol
para eliminar cualquier resto de colorante.
Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.

Resultados y observaciones:

Los ncleos celulares se tornan violeta intenso.
Es frecuente encontrar en el mtodo de Giemsa que la granulacin eosinfila no
presenta la tonalidad rojo-anaranjada caracterstica sino que presenta una tonalidad
pardo rojizo. Esta dificultad puede prevenirse aadiendo una gota de fucsina
fenicada por cada 10ml de alcohol metlico utilizado.
Las granulaciones neutrfilas (lila) y los hemates (rojo plido) se tien mal; sin
embargo, esta coloracin permite diferenciar algunas formas de metamielocitos que
pueden ser confundidos con los monocitos, pues el protoplasma de los monocitos
queda de color azulado y el de los metamielocitos de color rosa.
El citoplasma de los linfocitos presenta una tonalidad azul definida y sus ncleos
violeta de intensidad variable.
Los grnulos basfilos y las plaquetas se tien de color azul, no obstante stas
ltimas presentan corpsculos violeta internos.

3. Tincin de May-Grnwald o de Jenner

Modificacin de la coloracin de Wright, muy inferior a sta, porque no produce efecto
cromtico entre ncleos, citoplasma e inclusiones. No obstante, el eosinato de azul de
metileno de Jenner disuelto en alcohol metlico, destaca bien los grnulos de leucocitos y es
por tanto especialmente til en su recuento diferencial. No es til para descubrir parsitos
en sangre.

Materiales:

Colorante May-Grnwald en polvo (disponible comercialmente) 0.3g. Alcohol metlico
absoluto 100mL. Se debe calentar la mezcla a 56C hasta la disolucin completa del
colorante. Dejar enfriar en nevera a 4C durante 24 horas, agitando en periodos al azar.
Filtrar antes de su empleo.

Tcnica:

Cubrir el frotis con el colorante, dejar actuar de 3-5 minutos.
Cubrir la preparacin con igual volumen de agua destilada neutra. Mover el porta
para que abarque toda la extensin. Dejar por 5-10 minutos.


Lavar con agua destilada hasta que la preparacin tome una coloracin rojo-rosado.
Secar al aire en posicin vertical y observar con objetivo de inmersin.

Resultados:

Los ncleos celulares se tornan violeta azulado.
Los eritrocitos se tien mal, adquiriendo coloracin rojo plido.
El citoplasma de los linfocitos aparece azul mientras que el monocito azul grisceo.
Los grnulos basfilos son violeta intenso, los eosinfilos rojo intenso mientras que
los neutrfilos azul oscuro.
Las plaquetas se tien de color azul con corpsculos violeta internos.

4. Tincin de Pappenheim o tincin panptica de May-Grnwald-Giemsa

Es el resultado de combinar la tincin de Giemsa con la de May-Grnwald, con el fin ltimo
de combinar las ventajas de dichos colorantes, de ah que, esta tincin resalta de manera
especial las granulaciones leucocitarias y mejora la coloracin de los hemates.

Materiales:

Frotis sanguneo seco
Colorante de Giemsa (ver especificaciones en la coloracin respectiva)
Colorante de May-Grnwald (ver especificaciones en la coloracin respectiva)

Tcnica:

Fijar el frotis en el porta sumergindolo en solucin metanlica de May-Grnwald
durante 2 3 minutos.

Transferir a una dilucin de May-Grnwald diluida en agua destilada o con PBS (1:1)
preparada extemporneamente y dejar en reposo durante 2 3 minutos.

Sin lavar, sumergir el frotis en la solucin de Giemsa preparada extemporneamente
durante 20 minutos.

Lavar el frotis con abundante agua destilada y sumergirlo en tampn PBS de pH 6.8
de unos 2-5 minutos.

Secar el frotis al aire y una vez seco est listo para su observacin al microscopio.

Resultados:

ii. Esta preparacin proporciona una amplia gama de colores. Los hemates se tien
de una tonalidad color rosa plido con una zona central ms clara. La policroma se
advierte con una tendencia de color azulado.


iii. La cromatina nuclear se tie de rojizo a violeta oscuro dejando dibujadas las
estructuras cromticas que sirven para evaluar y determinar el grado de madurez
celular.

iv. Los linfocitos se tien de azul claro bastante definido adems de presentar
pequeos granos azurfilos de color rojo intenso. El citoplasma de los monocitos
aparece de un color ligeramente azulado.

v. Las granulaciones de los eosinfilos son rojo-anaranjado casi amarillentas. Las
granulaciones de los basfilos son violeta oscuro a negro, mientras que los grnulos
neutrfilos rojo-prpura bastante claros.

vi. Las plaquetas presentan una porcin perifrica azulada y grnulos centrales rojos.

5. Causas de error en la tincin del frotis sanguneo
Una extensin de sangre bien teida debe caracterizarse por una buena diferenciacin de
las estructuras sub-celulares de los leucocitos, definicin completa de los hemates y de la
ausencia de precipitados que den lugar a artefactos no deseados.
Todos los colorantes anteriormente descritos pueden producir resultados poco satisfactorios
en la coloracin del frotis, siendo algunas de las causas de estos malos resultados las
siguientes:

Una coloracin excesivamente azul que puede ser debida a:

Frotis excesivamente gruesos
Tiempo prolongado, dando lugar a sobretincin
Lavado insuficiente
Empleo de solucin diluyente o el colorante demasiado alcalino.

Importante: En este caso los eritrocitos aparecen azules o verdes, la cromatina nuclear es
azul oscuro o negra y los grnulos de los eosinfilos son azulados o grises. Este defecto se
puede corregir coloreando por menos tiempo con el colorante y por ms tiempo con el
amortiguador. Si esto no mejora el frote, debe evaluarse la calidad de los reactivos
utilizados y tomar decisiones con respecto al cambio de lote.

Una coloracin excesivamente rosada que puede deberse a:

Tincin insuficiente
Lavado prolongado
Secado inadecuado
Empleo de solucin colorante o amortiguante muy cidos.

Importante: En estos frotes los eritrocitos aparecen de un color rojo brillante o anaranjados,
la cromatina nuclear es rosa plida y los grnulos de los eosinfilos son rojo brillante
intensos.

La presencia de precipitados en el frote puede deberse a:


Lminas mal lavadas
Secamiento insuficiente
Accin excesiva de la solucin fijadora
Lavados inadecuados al concluir la tincin
Filtracin inadecuada del colorante que se est utilizando.

Otras causas de error pueden ser debidas a:

Apreciacin de artefactos morfolgicos debidos al anticoagulante empleado.
Apreciacin de artefactos debido a suciedad, deterioro o a la presencia de grasa en
la lmina.
Hidratacin de los eritrocitos.

CUESTIONARIO

1. Indique cules son los componentes del colorante de Wright y como se prepara. Indique
cules son los componentes del colorante de Wright y como se prepara.
2. Qu soluciones pueden utilizarse como amortiguador para la tincin de Wright y cul es el
pH que debe tener?
3. Qu sucede cuando se evapora el colorante?
4. Describa el principio de los dispositivos de tincin automatizados, sus ventajas y
desventajas.
5. En qu consiste la tincin de Wright-modificado?

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