Tcnicas de siembra

ngela lvarez Coral; diego Jimnez

Universidad De Nario - Facultad De Ciencias Exactas Y Naturales
diegofer1414@hotmail.com, angevanne02@gmail.com.

Introduccin
La inoculacin o siembra es poner en
contacto los microorganismos o la
muestra bacteriolgica con los medios
de cultivo. Hay diferentes mtodos,
dependiendo del objetivo que se persiga
con la siembra por ejemplo:
Siembra para inoculacin: se puede
inocular para medio lquido o para medio
solido, se toma una pequea porcin de
la muestra y se la dispersa en el medio
de cultivo.
Siembra para aislamiento: se utiliza para
obtener cultivos puros, se siembra en
cajas de Petri que contienen medios de
cultivos slidos, siembra por estra
mltiple: es en general el mtodo mas
til de sembrar en caja, se toma una
muestra del cultivo de microorganismos y
se extiende sobre un rea pequea de la
superficie de la placa con agar nutritivo,
en forma de estras muy juntas, pero sin
hacer presin para no daar el agar.
Tcnica de los cuatro cuadrantes: Se
divide la placa en cuatro cuadrantes, se
toma el inoculo y se siembra
consecutivamente en 1-2-3-4.Incubar, en
el cuarto cuadrante, al menos,
obtendramos colonias aisladas.
Siembra por agotamiento: Se realiza una
descarga y se realiza estra por toda la
placa. Existen variadas tcnicas de
siembra que permiten llevar a cabo los
objetivos de la prctica los que se
utilizaron para esta practica fueron
anteriormente mencionados.
En la naturaleza los microorganismos se
encuentran formando poblaciones
mixtas, esto quiere decir que cada sepa
se encuentra en un lugar con otras sepas
o clases de microorganismos, esto se
convierte en un problema cuando se
requiere estudiar un microrganismo en
especfico, y en realidad, si se quiere
caracterizar completamente a un
organismo microscpico en particular se
lo debe hacer investigando sepas
aisladas, es decir, sepas que sean solo
de ese microrganismo.
Objetivos.
- realizar distintos mtodos de cultivo de
microorganismos.
- Reconocer el medio adecuado para
cada microorganismos
-Identificar y describir todas las colonias
presentes en los medios de cultivo, as
como tambin en los tubos de ensayo

MATERIALES Y MTODOS
Se limpi y esteriliz el rea de trabajo,
se prendi los mecheros, se ajust la
flama hasta que se present un cono
azul bien marcado.
a) Siembra en medio lquido: caldo
tioglicolato.
Se transfiri aspticamente con el asa de
argolla o redonda, una pequea muestra
de los microorganismos, desde la caja
que contena muestra nasofarngea
(estafilococos) hasta el tubo con medio
de cultivo estril. Se sumergi el asa en
el lquido y se agit para desprender y
diluir la muestra.
b) Siembra en medio semislido: (SIM
MIO) Cualquier medio de movilidad.
Esta tcnica se llev a cabo con un asa
recta esterilizada, con el cual se tom la
muestra de la caja que contena material
nasofarngeo; el medio qued inoculado
cuando se introdujo el asa en
profundidad hasta el fondo del tubo,
retirndola posteriormente por la misma
trayectoria utilizada anteriormente.
c) Tcnicas de estriado: Estriado simple:
EMB McConkey (cualquier medio
selectivo).
Se esteriliz el asa de siembra en argolla
y se tom la parte de la caja de Petri que
contena el medio de cultivo sembrado,
que en este caso es estreptococos, se
realizo una siembra en estra simple el
cual consiste en distribuir por todo el
medio la muestra mediante un balanceo
sucesivo y rpido de la mueca.
d) Siembra para aislamiento por estra
(cuadrantes): agar sangre.
Se esteriliz el asa, se dej enfriar y se
tom una colonia de la caja problema, se
sembr sobre un extremo de la caja a
preparar trazando una estra, y se volvi
a quemar el asa para evitar una mayor
carga bacteriana. Seguidamente se
estri el segundo plano perpendicular al
primer plano realizado y se repiti de la
misma manera con el ultimo estriado,
logrando completar todo el espacio de la
placa.
e) Siembra en agar inclinado: (TSI).
Se tom una colonia del cultivo puro con
el asa recta previamente esterilizada, se
destap el tubo con agar inclinado y se
flame la boca y se introduj el asa sin
tocar las paredes del tubo, se pico el
fondo y se sac el asa deslizndola
suavemente por la superficie en zig
zag.
f) Siembra masiva (antibiograma):
Mueller Hinton (MH).
a) disco-placa. Con este sistema se
puede probar la eficacia de varios
antimicrobianos al mismo tiempo
realizando una siembra de una
suspensin bacteriana, con un inculo
normalizado sobre la superficie de un
medio slido, colocando sobre los
mismos discos de papel impregnados de
una cantidad conocida de antibitico.

Resultados y discusin.
Se examin cada una de las cajas Petri
y se cont el nmero de colonias
desarrolladas, obtenindose los
siguientes resultados:
1-siembra de estriado simple en caja
con agar sangre, con muestra de
estreptococos: se cont un total de 3
colonias; el cual presentaron las
siguientes caractersticas:
Colonia 1: de forma circular, con color
amarillento a verdoso, un aspecto
superficial pulido, consistencia
mantecosa, elevacin plana y borde
redondeado.
Colonia 2: de forma rizoide, present un
color blanco amarillento, de aspecto
superficial spero, una consistencia
seca, elevacin plana y un borde
filamentoso.
Colonia 3: present forma redondeada,
color caf oscuro, aspecto superficial con
anillos concntricos, consistencia fibrosa,
elevacin plana y borde redondeado.
Cabe anotar que estas colonias son muy
poco visibles en las fotografas.




El agar sangre aporta muchos factores
de enriquecimiento. Se usa tambin para
ver la capacidad hemoltica de los
microorganismos patgenos (que es un
factor de virulencia). Observando los
halos hemolticos alrededor de las
colonias se determina el tipo de
hemlisis que posee: alfa, beta y gamma.
En nuestro caso corresponde a alfa:
halos verdosos (reduccin de la
hemoglobina de los glbulos rojos a
metahemoglobina en el medio)
2-Siembra para aislamiento por estra
(cuadrantes): agar EMB McConkey,
con muestra de klebsiella: se cont un
total de 1 colonia, el cual presento la
siguiente caracterstica:
-Colonias grandes planoconvexa,
mucoides, brillantes, forma irregular,
tambin se observan redondeadas,
bordes ondulados, color rosado claro
Agar MacConkey es un medio de cultivo
especfico para bacterias gram negativas
y cepas que fermenten la lactosa. Al
utilizar la lactosa en el medio, bacterias
Lac+ como Escherichia coli, Enterobacter
y Klebsiella producen acidez, lo cual baja
el PH bajo 6,8 lo que tiene como
consecuencia la aparicin de colonias de
color rosadas o rojas.


3. siembra en agar manitol salado, con
muestras de Staphylococcus aureus.
Se encontr un total de 1 colonia, la cual
presento las siguientes caractersticas:
Tipo de colonia: circular
-Aspecto de la superficie: pulida
-Consistencia: mantecosa
-Elevacin: convexa
-Borde: redondeado
El agar manitol salado es un medio de
cultivo altamente selectivo, pues tiene
una alta concentracin de cloruro de
sodio (7.5 por ciento) que impide el
crecimiento de la mayora de las
bacterias, pero tolerada por el grupo de
los estafilococos. Adems, el medio
contiene manitol como nico
carbohidrato y rojo de fenol como
indicador de PH, cuyo mbito de viraje
est entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8
(amarillo). Cuando hay produccin de
acido a causa de la fermentacin del
manitol, las colonias aparecen rodeadas
de un halo amarillo.


4. Siembra masiva (antibiograma):
Mueller Hinton (MH). Con muestra de
Klebsiella.
Para este procedimiento, se trabaj con
tres sensidiscos diferentes los cuales
corresponden a:
1. ENR 5 Enrofloxacin baytril 5mg
2. AML 10 amoxycillin 10mg
3. CL 30 Cephalexin 30 mg
Un concepto importante sobre el que es
necesario insistir es que no se pueden
realizar pruebas de sensibilidad in vitro
con cultivos mixtos, slo los cultivos
puros proporcionarn resultados vlidos
sobre la eficacia de un antibitico.
La determinacin de la Concentracin
Inhibidora Mnima (CIM) es la base de la
medida de la sensibilidad de una bacteria
a un determinado antibitico. La CIM se
define como la menor concentracin de
una gama de diluciones de antibitico
que provoca una inhibicin de cualquier
crecimiento bacteriano visible. Es el valor
fundamental de referencia que permite
establecer una escala de actividad del
antibitico frente a diferentes especies
bacterianas.
Para un determinado antibitico, una
cepa bacteriana es, segn la NCCLS
(National Committee for Clinical
Laboratory Standards):
-Sensible, si existe una buena
probabilidad de xito teraputico en el
caso de un tratamiento a la dosis
habitual.
-Resistente, si la probabilidad de xito
teraputico es nula o muy reducida. No
es de esperar ningn efecto teraputico
sea cual fuere el tipo de tratamiento.
-Intermedia, cuando el xito teraputico
es imprevisible. Se puede conseguir
efecto teraputico en ciertas condiciones
(fuertes concentraciones locales o
aumento de la posologa).
El resultado final fue que el sensidisco
que inhibi el medio y dio paso a la
formacin del halo fue el correspondiente
a ENR Enrofloxacin Baytril 5mg, lo que
indica que esta bacteria es muy sensible
a este antibitico.





El Enrofloxacin baytril es un
antimicrobianos del tipo fluoroquinolona
presentan un amplio espectro de
actividad tanto contra las bacterias Gram
negativas como las Gram positivas. La
mayora de los uropatgenos son
aerobios; las fluoroquinolonas son muy
eficaces contra ellos.
Baytril se fija muy poco sobre protenas
del plasma, lo cual permite una fcil
penetracin a travs de varias
membranas hasta alcanzar
concentraciones altas en la mayor parte
de los tejidos. La concentracin
inhibitoria mnima de baytril para el 90%
de los aislados de casi todas las
enterobacterias y cepas de
Staphylococcus intermedius se sita en
menos del 0.25 microgramo/ml.
5. Siembra en medio semislido: (SIM
MIO) Cualquier medio de movilidad.
Esta prueba se la realizo para determinar
la movilidad del microorganismo, esta
medio se sembr a partir de muestra
nasofarngea y se observ en el tubo que
el crecimiento de la bacteria se dio en
mayor cantidad cerca de la superficie del
medio.

6. Siembra en medio lquido: caldo
tioglicolato.
Este medio se sembr a partir de
muestra nasofarngea, la cual formo una
especie de precipitado en la parte
superior del medio con lo cul se infiere
que esta bacteria es de carcter aerobio.
El medio de cultivo, tiene por sus
componentes la calidad nutricional del
caldo triptena soya. Este permite el
desarrollo de una amplia variedad de
microorganismos, incluidos los
nutricionalmente exigentes. Adems, se
observa que las bacterias estrictamente
aerobias, crecen en la parte superior,
mientras que las anaerobias facultativas
o anaerobias estrictas crecen en las
profundidades del medio. Las sustancias
reductoras como tioglicolato de sodio y
cistena proporcionan una anaerobiosis
suficiente y debido a los grupos -SH- de
estos compuestos, se neutralizan los
efectos bacteriostticos de los derivados
mercuriales, arsenicales y de otros
metales pesados. La presencia de una
baja cantidad de agar, retarda la
dispersin de CO2 y O2.

Siembra en agar inclinado - Agar triple
azcar y hierro (TSI)
El agar triple azcar hierro, es un medio
nutritivo y diferencial que permite la
identificacin de enterobacterias o
bacterias Gram negativas, (en este caso
de Klebsiella) fermentadoras de
carbohidratos, es decir capacidad de
produccin de cido y gas a partir de
glucosa (0,1%), sacarosa (1%) y lactosa
(1%) y como indicador de pH el rojo de
fenol en un nico medio. Tambin
permite la deteccin de la produccin de
H2S mediante el tiosulfato de sodio y
sulfato ferroso. En nuestro caso
observamos que presento desarrollo de
colonia en la parte superior del medio.

Conclusiones.
Mediante esta practica de laboratorio se
logr identificar algunas tcnicas de
siembra que permiten identificar y
describir colonias mas especificas
El antibiograma es una tcnica muy til
para probar la eficacia de varios
antimicrobianos al mismo tiempo
realizando una siembra de una
suspensin bacteriana.
La siembra en medios diferenciales nos
permite aislar ms fcilmente un
microrganismo para su posterior
estudio.

Cuestionario.

1. Cuando tomas un inoculo de un
cultivo bacteriano. por qu es
necesario tocar una parte estril
del agar con el asa antes de tocar
el crecimiento bacteriano?
El proceso de esterilizacin del asa
se realiza mediante el calentamiento
de esta en el mechero hasta que el
instrumento alcanza el rojo vivo; para
tomar el inoculo es necesario tocar
con el asa una parte estril del agar
para enfriarla, ya que la temperatura
del instrumento puede daar la
integridad de la colonia, haciendo
que las clulas en esta sufran daos
irreparables y mueran por estrs
fsico.
2. Por qu el asa debe ser
flameada antes y despus de
todos los procedimientos de
siembra?
El flameado se usa en el asa
bacteriolgica por algunos segundos
sobre el instrumento para esterilizar;
se pone el asa sobre el mechero
hasta que se encuentre al rojo vivo.
Este modo de esterilizaciones por
medio de calor seco donde existe la
combustin incompleta de los
contaminantes dejando residuos de
carbono sumamente minsculos.

3. Por qu las placas de agar
deben mantenerse invertidas
durante la incubacin?
Se mantienen las placas de agar
invertidas para evitar que la
evaporacin causada por el calor
dentro de la estufa caiga en el medio
y este pierda su consistencia solida;
las temperaturas usualmente usadas
para incubar microorganismos y
pueden causar vapores dentro de la
caja son comnmente 35
0
a 37
0
.
4. Para realizar el antibiograma a
Streptococos que agar o medio
utilizamos y por qu?
Para realizar el antibiograma a
Streptococos se utiliza el agar
mueller Hilton que es un medio de
cultivo nutritivo no selectivo que
promueve el desarrollo microbiano.
Por su composicin, ha sido
recomendado para ser utilizado en
forma rutinaria en la realizacin del
antibiograma en medio solido, debido
a que presenta buena productividad
lote a lote en las pruebas de
sensibilidad, su contenido en
inhibidores de sulfonamidas,
trimetoprima y tetraciclina es bajo, la
mayora de los patgenos
microbianos crece satisfactoriamente
y una gran cantidad de datos
adicionales que han sido evaluados y
avalados usando este medio de
cultivo. Cuando se suplementa con
sangre de carnero al 5% permite
realizar las pruebas de sensibilidad a
los antimicrobianos en especies de
Streptococos.
BIBLIOGRAFIA.
Manual prctico de microbiologa
Carlos Gamazo Ignacio Lpez-
Goi Ramn DazElsevier
Espaa, 2005
Manual de Bioseguridad Y
Control de la Infeccion de
PracticaOdontologicaUNAM 2004
Rodriguez E. Bacteriologa
General: Principios Y Prcticas de
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ba.ar/SeminarioAntibioticos.htm
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