UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I

MEDICIN VETERINAR
BUCURETI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE
LUCRARE DE LICEN
Coordonator tn!"#$
%" &'#r(r dr) POPA Ga*r%&a
St'd%nt$
PUN A&%+andra Andr%%a
B'#'r%t
,-./
1
UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I
MEDICIN VETERINAR
BUCURETI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE
EMBRIOCULTURA IN VITRO LA CIRE
Coordonator tn!"#$
%" &'#r(r dr) POPA Ga*r%&a
St'd%nt$
PUN A&%+andra Andr%%a
B'#'r%t
,-./
2
R%0'1at'& &'#r(r
CUPRINS
I) STUDIU DOCUMENTAR
CAP) .) INTRODUCERE...............................................
CAP) ,) EMBROGENEZA SOMATICA2 ASPECTE GENERALE........................................
2.1.
2.2..................................
2.3......................................................
2.3.1.....................................................................................................
2.3.2.........................................................................................................
2.4.........
CAP) 3) CULTURA DE EMBRIONI LA POMII FRUCTIFERI2
REALIZRI CURENTE............................................................................................
3.1........................................................................
II) PARTE E4PERIMENTAL
CAP) /) MATERIAL SI METODE
4.1. Materialul biologic utilizat
4.2. Metode de lucru
CAP)5) REZULTATE I DISCUII
5.1. Materiale i metode..................................................................................................................
5.2. Rezultate i discuii..................................................................................................................
CAP)6) CONCLUZII....................................................................................................................
CAP)7)BIBLIOGRAFIE..............................................................................................................
3
CAPITOLUL .
INTRODUCERE
CAPITOLUL ,
EMBROGENEZA SOMATICA2 ASPECTE GENERALE
,).) INTRODUCERE
I) STUDIU DOCUMENTAR
4
Embriogeneza somatic (ES este !rocesul de a"ansare #n te$nologia de !ro!agare
"egetati" !entru !lante% care are un im!act ma&or asu!ra re!roducerilor !omilor i culturilor
$orticole de mare "aloare. 'n cadrul acestui !roces se descrie multi!licarea #n mas a unor
"arieti noi% de elit% #ntr(un tim! scurt i cu resurse limitate% )iind necesar !roducerea de
!lante ade"rate% cu trsturi noi% de dorit% rezistente la stresurile biotice i abiotice !e care le
!resu!un trierea in vitro i s!oririle genetice com!arati" cu cele transgenice.
*iteza de multi!licare !rin metodele de re!roducere tradiionale este sczut i de!inde
de natur% #n "reme ce embriogeneza somatic ar !utea a&uta la multi!licarea #n mas ra!id a
!lantelor de cultur #nce!ute recent i #mbuntite.
+lobalizarea agriculturii im!une din ce #n ce mai mult e)icien s!orit i concuren #n
cazul sistemelor de !roducie e,istente. 'mbuntirea !omilor )ructi)eri !rin te$nici de
re!roducere clasice a de"enit limitat din cauza unor !robleme inerente% cum ar )i durata
lung de "ia cu !erioad &u"enil e,tins% mor)ologia )loral% bariera e,istent #n calea
$ibridizrilor% sterilitatea% a!omi,iile i diminuarea "italitii organismelor% care a!are ca
rezultat al #ncrucirii intras!eci)ice.
'nc e,ist metode de rs!-ndire tradiionale% de genul altoiri% marcotri% butiri etc.
!entru #mbuntirea multor !omi )ructi)eri% #ns !relungirea !erioadei lor &u"enile a )cut ca
aceste te$nici s dureze !rea mult i s de"in greoaie. 'ncercarea lui .aberlandt de a institui
sisteme de culti"are de esuturi de !lante a a&utat la o mai bun #nelegere a toti!otenei
celulelor "egetale.
/ultura de esuturi de !lante o)er o soluie e)icient la !roblemele de ti!ul rs!-ndirii
recoltelor de )ructe. 0meliorarea acestora !rin mai multe demersuri biote$nologice i !rintr(o
regenerare deosebit de e)icient este o condiie !realabil (1itz i +ra2% 1335.
Embriogeneza somatic #n cazul recoltelor de )ructe de"ine o ane, atrgtoare i uneori
indis!ensabil la re!roducerea de !lante clasic. Este un sistem ideal de in"estigare a
#ntregului !roces de di)ereniere a !lantelor% !recum i un mecanism de e,!rimare a
toti!otenei celulelor "egetale. Ea are mai multe a"anta&e distincte com!arati" cu rs!-ndirea
con"enional (1itz i +ra2% 1332.
'n cazul metodelor embriogenetice% ameliorarea ra!id !oate duce la a!licaii !ractice i
comerciale am!le% #ndeosebi !entru micro!ro!agarea clonal in vitro. 0!licarea
embriogenezei somatice la #mbuntirea recoltelor )ructi)ere a )ost restr-ns din cauza
germinrii srace a embrionilor somatici i a )rec"enei sczute de recu!erare a rsadurilor
somatice.
/u toate acestea% #n calitate de sistem !entru !roduciile la scar larg #n bioreactoare !rin
inducere re!etiti"% embriogeneza somatic a atras atenia re!roductorilor de )ructe i a
5
!omologitilor !entru ameliorarea !omilor )ructi)eri. 4rintre trsturile de dorit ale
#mbuntirii !omilor )ructi)eri se numr coacerea #nt-rziat% rezistena la duntori% la boli%
la secet i )rig% calitatea )ructelor% ca!acitatea rdcinilor de a a"ea esuturi mature%
&u"enilitatea redus% obiceiul de a )ace )ruct regulat% !recum i modi)icarea )ormei i
ar$itecturii !omilor 5 s!re e,. ca!acitatea de a de"eni !itici i semi(!itici.
Strategiile care s(au creat !entru #mbuntirea !omilor )ructi)eri de cultur s(au bazat !e
i!oteza c e !osibil s se aib #n "edere celule cu abiliti embriogenice i s se modi)ice
subtil genoti!ul% !entru a se a&unge la una sau mai multe trsturi $orticole s!eci)ice (1itz i
alii% 1332.
Regenerarea !omilor )ructi)eri !rin embriogenez somatic% mai ales la banane% gua"a%
mango% !a!a2a etc. !rezint o im!ortan comercial deosebit !entru industrie.
,),) TIPURI DE CULTURI IN VITRO
DEFINI IE
'n sens general% !rin cultura in "itro se #nelege creterea !e medii arti)iciale% #ncondiii de
ase!sie de!lin i de )actori ambientali bine controlai% a unor organe% !ri deorgane% esuturi
sau celule "egetale. Reuita culturii de!inde de o multitudine de )actori i este"izibil #n
momentul #n care e,!lantul crete.
E,!lantul% numit i inocul% este !oriunea de !lant (organ% esut% celul care sedes!rinde
de !e !lanta donor (!lanta mam% i se inoculeaz #n condiii sterile !e un mediuarti)icial de
cultur. E"oluia e,!lantului este diri&at de o!erator #n )uncie de sco!ul urmrit.0cesta
!oate e"olua )orm-nd o nou !lant (sau mai multe !lante ( neo!lantule% !rinstimularea
dez"oltrii organelor aeriene (tul!ina i )runzele i a rdcinii% sau !oate )ormacalus% !rin
stimularea #nmulirii nedi)ereniate a celulelor.
E,!lantul constituie unitatea "ie ce conine #n celule #ntreaga in)ormaie genetic a
!lantei mam i !e baza toti!otenei este ca!abil de a regenera una sau mai multe
!lanteidentice cu !lanta donor.
6oti!otena% este #nsuirea celulelor "egetale de a se di"ide% de a se re!roduce i de
a)orma o !lant identic cu !lanta mam. 6eoretic )iecare celul "ie este toti!otent% #ns #n
!ractic s(a obser"at c nu toate celulele au ca!acitatea de a(i e,!rima acest caracter%
datorit !e de o !arte di)erenierii celulare i #mbtr-nirii% iar !e de alt !arte gradului mare
des!ecializare al acelor celule.
7
0st)el% s(a demonstrat !ractic c% #ntr(o !lant matur% celulele s!ecializate careconstituie
esuturile% de e,em!lu8 tra$eidele% )ibrele libero(lemnoase% sclereidele% etc% la careli!sete
cito!lasma i nucleul% nu sunt toti!otente. 0cest as!ect este e,!licat c$iar !rin )a!tulc
#ntreaga in)ormaie genetic a celulei toti!otente se a)l #n cromozomii din nucleu.
1a !lantele cormo)ite% odat cu #naintarea #n "-rst% o !arte din celule #i !ierdca!acitatea
de toti!oten sau aceasta se reduce )oarte mult. Rm-n% #ns% anumite zone #n careacti"itatea
celulelor este intens% a"-nd loc di"iziunea i )ormarea a!roa!e continu de noicelule. 0ceste
celule sunt mici #n dimensiuni% !oligonale% bogate #n cito!lasm% au "acuolmic i nucleu
mare dis!us central i !rezint o membran celulozic% )orm-nd esutul cudenumirea de
meristem.
Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii #n lungime i grosimea
!lantelor% )iind dis!use terminal at-t #n tul!in c-t i #n rdcini.
CARACTERISTICILE CULTURILOT IN VITRO
S!re deosebire de multi!licarea tradiional% unde se o!ereaz cu semine sau
!oriunimari de !lant (marcote% butai% altoi% la multi!licarea in "itro se )olosesc e,!lante
mici% deordinul milimetrilor sau c$iar microsco!ice (celule% !roto!lati% e,!lante care #n
condiiinormale de cultur nu ar reui s creasc o!un-nd rezisten agenilor !atogeni
isintetiz-ndu(i singure substanele nutriti"e necesare.
9in acest moti"% !entru reuita culturii de celule i esuturi se cer res!ectate urmtoarele
condiii8
(!re!ararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie $eterotro) a e,!lantului%
!rin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil e,!lantelor:
(asigurarea i controlarea )actorilor de mediu (tem!eratur% lumin% umiditate #n
limiteleo!time !entru )iecare s!ecie% soi i )az de cretere% #n )uncie de cerinele acestora i
sco!ulurmrit:
(stimulare creterii i di)erenierii sau dedi)erenierii organelor !rin utilizareacores!unztoare
a substanelor stimulatoare de cretere:
(asigurarea unei ase!sii de!line !e tot )lu,ul de !roducere a !lantelor in "itro% !rin
dezin)eciamaterialului "egetal% sterilizarea mediului i a "aselor de cultur% !recum i
e)ectuarea tuturor o!eraiilor #n $ota cu )lu, de aer laminar steril% )olosind instrumentar
sterilizat !rin )lambare.
;
DOMENII DE APLICARE A CULTURILO IN VITRO
9atorit s!ectrului larg de !robleme la care culturile in vitro au rs!uns a)irmati"%
suntutilizate #n !rezent #n agricultur% sil"icultur% )armacie% industria alimentar% industria
uoar%etc. 'n agricultur% #n general i #n $orticultur #n s!ecial% culturile de esuturi i celule
sunt)olosite !entru multi!licarea unor s!ecii% soiuri sau clone "aloroase% !entru
ameliorareas!eciilor culti"ate% !entru conser"area germo!lasmei $orticole% !entru obinerea
de metaboliisecundari.
0"anta&ele culturii in vitro sunt multi!le% dintre care amintim8
(asigur multi!licarea clonal ra!id a unor soiuri% $ibrizi sau clone "aloroase !ornindde la
cantiti mici de material "egetal. 6eoretic% se asigur o multi!licare e,!onenial% !rincare #n
circa 7 luni se !ot obine 1 milion de !lante:
(se !oate !roduce material sditor liber de "iroze i mico!lasme% material mai "iguros%
!recoce i !roducti":
(necesit s!aii mici de cultur i se "alori)ic bine s!aiul din laborator !rin cultura
!e"ertical !e 3(5 ni"ele su!ra!use:
(obinerea de !lante $a!loide% !rin cultura de !olen% antere sau alte e,!lante de
esuturigenerati"e (cu n cromozomi:
(d !osibilitatea obinerii $ibrizilor inters!eci)ici !rin )ecundarea in "itro% $ibrizi care#n
condiii normale sunt im!osibil de obinut:
(selecia de !lante rezistente la stres% boli i duntori:(se e"it e)ectul sezonier de !e!inier:(
se !ot obine semine arti)iciale:
(se !ot obine !lante !e rdcini !ro!rii e"it-nd ast)el c$eltuielile de altoire:
(asigur multi!licarea clonal a !ortaltoilor care nu #nrdcineaz #n condiii normalede
cultur:
(asigur !strarea materialului #n )aza de !lantul !-n la !rimirea unor comenzi)erme de
multi!licare.
/u toate aceste a"anta&e% e,ist s!ecii care nu rs!und bine la cultura in vitro i
care%deocamdat rm-n s )ie #nmulite tradiional.
E,ist #ns i c-te"a im!edimente #n utilizarea acestei metode !entru #nmulirea #n mas a
!lantelor% cum ar )i8
(necesitatea unui laborator cu dotrile minime8 instalaii i a!arate indis!ensabile acti"itilor
de micro!ro!agare% care sunt costisitoare:
(necesitatea unui !ersonal s!ecializat #n multi!licarea clonal i mani!ularea in "itro
:(utilizarea )ito$ormonilor% care sunt scum!i i !uin accesibili tuturor unitilor de !roducie:
<
(nu se !oate controla caracterul recalcitrant al unor s!ecii sau soiuri% care nu rs!undla
metodele cunoscute de multi!licare:
(e,ist riscul a!ariiei i multi!licrii mutaiilor recesi"e% cu a)ectarea autenticitii soiurilor:
,),).)ETAPE ALE EMBRIOGENEZEI SOMATICE
1a culturile cu esuturi "egetale% din !ers!ecti"a toti!otenei unei celule de !lant
"ie se tie bine c nucleul )iecrei celule somatice "ii conine in)ormaiile genetice
necesare !entru g$idarea dez"oltrii !lantei com!lete.
9e c-nd Ste=ard i alii (135< i Reinert (135< au atras !rima dat atenia asu!ra
)ormrii embrionului somatic #n sus!ensiile celulare de 9aucus carota% !otenialul !entru
embriogeneza somatic a )ost demonstrat #ntr(o gam larg de s!ecii de !lante.
Embriogeneza somatic (ES este un !roces #n care dintr(o celul nezigotic )r
legturi "asculare cu esutul originar se dez"olt structuri bi!olare care seamn cu un
embrion zigotic. Embrionii somatici se )olosesc la studierea reglrii dez"oltrii
embrionare% #ns embriogeneza este un !roces de regenerare #n mai multe eta!e% care
#nce!e cu )ormarea de mase !roembriogenice% urmat de )ormarea embrionului somatic%
de maturizare% des$idratare i regenerarea !lantei (0rnold i alii% 2>>2. Este un sistem
im!ortant% #n cadrul cruia multi!licrile se !ot )ace #n !ro!orie enorm. Embriogeneza
somatic im!lic !roducerea de structuri care seamn cu embrionii% din celule somatice
)r )uzionarea gameilor.
9e(a lungul dez"oltrii lor% embrionii somatici trec !rin stadii asemntoare celor
obser"ate la embriogeneza zigotic i se im!une inerea sub control a 3 )aze consecuti"e 8
(i inducerea unor linii embriogenice din materialul "egetal de baz% (ii meninerea i
multi!licarea liniilor embriogenice% (iii maturizarea embrionilor somatici i con"ertirea
#n !lntue "iabile.
'n cazul embrionilor somatici se induce dez"oltarea de celule somatice% !entru a
se )orma embrioni com!lei% asemntori cu cei ai embrionilor zigotici (S$ar! i alii%
13<>% ?ang i alii% 133>% du! cum se arat #n @ig. 1. 'n esen% ambii embrioni trec
!rin aceleai stadii de dez"oltare% adic cel globular% #n )orm de inim% tor!edou%
cotiledonar i matur. Ele a!ar #n mod natural la anumite s!ecii% #n cadrul unui !roces
cunoscut sub denumirea de embriogenez somatic direct (?illiams i Ma$es=aran%
13<7. 'n sc$imb% embrionii somatici se dez"olt din celule culti"ate in "itro% #n cadrul
unui !roces numit embriogenez somatic indirect.
3
Embrionii somatici se !ot di)erenia )ie direct din materialul "egetal de baz )r o
)az #n care s inter"in calus% )ie indirect% du! o )az cu calus (?illiams i
Ma$es=aran% 13<7.
Embriogeneza somatic indirect este metoda cea mai )rec"ent de generare de
embrioni somatici !entru #ntrebuinri !ractice i s(a descris la sute de s!ecii. An ti!
s!ecial de embriogenez somatic indirect este embriogeneza somatic secundar sau
embriogeneza re!etiti"% care const #n !roducerea de embrioni somatici !rin )olosirea de
embrioni somatici dre!t materiale "egetale de baz iniiale.
Embriogeneza somatic secundar s(a descris #n cazul a a!roa!e o sut de s!ecii
(RaemarBers i alii% 1335. 9ei #n cazul embrionilor secundari se #nregistreaz )rec"ent
rate sczute de con"ertire #n !lante% i ei se !ot )olosi la a!licaii !ractice. Multe au )ost
studiile care au tratat !roblemele de controlare i gestionare a instituirii iniiale de linii
embriogenice i cele legate de eta!a de con"ertire ulterioar (S$ar! i alii% 13<> :
6isserat i alii% 13;3. @aza de multi!licare a )ost analizat com!arati" mai !uin% dei
contribuie direct la !roducia !lantei )inale i in)lueneaz ca!acitatea embrionilor
rezultai de a germina i de a de"eni rsaduri.

1>
@ig. 2.2.1. 9escrierea embriogenezei somatice la gua"a. 0(inducerea calusului: C(inducerea
embriogenezei somatice: /( regenerarea si maturarea embrionilor: 9(!roli)erarea !lantulelor: E(
inradacinarea: @( aclimatizarea: +( !lantarea in sol la g$i"eci: .(stabilirea culturii (du!a Damle
si colab.% 2>11
,),),) FACTORI CARE INFLUENTEAZA EMBRIOGENEZA SOMATICA
8tt9:;;<<<)=#r*d)#o1;do#;53-,.7>.;=o1at#2%1*r?o@%n%== d% &a 3/6 9ana &a 3/A
,)3)IMPORTANTA EMBRIOGENEZEI SOMATICE
'n ultimii ani dez"oltarea celulelor "egetale i te$nica de culti"are a esuturilor au do"edit c
au !otenial considerabil !entru #mbuntirea mai multor !omi )ructi)eri. Embriogeneza
somatic este un !roces de dez"oltare de celule somatice% care din !unct de "edere mor)ologic
seamn cu embriogeneza zigotic i re!rezint o cale im!ortanta !entru regenerarea !lantelor
din sisteme de culti"are de celule% dar i o metod )olosit #n mod obinuit la !roducerea !e scar
larg de !lante i semine sintetice. 'n ma&oritatea recoltelor )ructi)ere im!ortante% cultura tisular
este bine instituit !entru regenerarea !lantelor !rin intermediul embriogenezei somatice.
Muli au )ost cei care au accentuat c embriogeneza somatic este metoda !re)erat !entru
amleiorrile genetice i multi!licarea de germo!lasme !reioase #n cazul unei serii #ntregi de
!lante lemnoase !erene (+u!ta i 9urzan% 13<; : Ra& C$ansali% 133>.
9at )iind c adesea culturile embrionare somatice deri" dintr(o singur celul% acesta este un
sistem ideal de inducere de mutaii% deoarece a&ut la !re"enirea mutanilor. 4rocenta&ul de
germinare embrionar somatic este )oarte slab% ceea ce a de"enit un obstacol im!ortant #n
multi!licarea "egetal !e scar larg a mutanilor dorii indui #n mod "oit. Multi!licarea de
!lante ade"rate !rin embriogenez somatic "a a&uta la !ro!agarea de genoti!uri noi% de elit%
!e !erioade scurte de tim!.
/a la embriogeneza somatic% nu este ne"oie de inducere se!arat de rdcini% ast)el ca
!lntua se !oate multi!lica i aclimatiza re!ede. 0cest lucru a atras atenia biote$nologilor%
deoarece asigur sisteme utile de !roducere de !lante transgenice% !recum i material !entru
!roducerea de semine arti)iciale.
11
4rocesul de embriogenez somatic nu este im!ortant numai !entru !roducerea de !lante i
!roduse secundare% ci i !entru !lantele transgenice i genetica celulelor somatice. El &oac un
rol im!ortant #n !ro!agarea clonal. 0tunci c-nd se include #n !rograme de re!roducere i te$nici
moleculare i biologice clasice a,ate !e celule% embriogeneza somatic re!rezint un instrument
!reios !entru s!orirea ritmului de #mbuntire genetic a s!eciilor !entru recolte comerciale
(Stasolla i Eeung% 2>>3.
'ns embriogeneza somatic are i alte a!licaii !ractice !entru ameliorarea recoltelor
(trierea celulelor% trans)ormarea genetic% !roducerea de $ibrizi somatici i !lante !oli!loide%
!strarea germo!lasmelor% eliminerea "irusurilor% !roducerea de metabolii in vitro i iniierea de
micorize in vitro.
1a ma&oritatea organismelor embrionul re!rezint o entitate distinct% care )unc ioneaz ca
un stadiu intermediar al tranzac iei de la ciclul biologic gameto)ic la cel s!oro)itic8

1a !lantele su!erioare embrionii se dez"olt de regula de la zigotul rezultat du!a )uziunea
gametilor% i se numesc embrioni zigotici. /u toate acestea% si embriogeneza ase,uat sau
ad"enti"e care !resu!une dez"oltarea embrionilor din celule ce nu rezult !rin )uziunea
gametilor% re!rezint un )enomen natural bine cunoscut. 0st)el de s!ecii ale genului Citrus sau la
unii re!rezentanti ai )amiliei Rutaceae% !e lang embrionul zigotic se dez"olt adesea embrioni
ad"enti"i din celulele nucleare% ale integumentului sau din celulele endos!ermului. /iar i
celulele sacului embrionar ca sinergidele sau anti!odele !ot e"olua in embrioni care !osed
12
numarul cromozomal gametic% iar !roembrionul% embrionul sau sus!ensorul acestuia !ot da
nastere la embrioni multi!lii.
'n tim! ce inciden a embriogenezei ase,uate natural se limiteaz de ragul la esutul intra(
o"ular al unor s!ecii% in condi ii F in vitroG e,ist !osibilitatea inducerii embriogenezei ase,uate
at-t din esut micelar cat i din esuturi gametice ne)ertilizate sau din di)erite celule somatice.
9escris mai intai in 135< de catre @. /. Ste=ard si H. Reinert in culturile ini iale din tesutul
radicular de la 9aucus carota% embriogeneza non(zigotic sau somatic a )ost de&a indusa la
destule s!ecii !entru a se !utea a)irma ca acest )enomen nu este limitat numai la unii ta,oni% daca
celulele culti"ate se a)la sub in)luenta unor stimuli !oziti"i% !rinci!alele conditii )iind8
(!rezen a unei au,ine este critic !entru initierea embriogenezei% iar eliminarea acesteia din
ediul de cultura stimuleaz maturarea embrionilor somatici.
(!rezen a azotului sub )orm de amoniu este necesar at-t !entru inducerea cat si !entru
maturarea embrionilor somatici.
'n consecin % !entru inducerea embriogenezei somatice se recomand ca regul general
utilizarea unui mediu de cultura !rimar% inducti"% care trebuie sa contin o surs au,inic i un
mediu secundar% li!sit de reglatori ai cresterii% dar care s con in un su!liment substan ial de
azot sub )orma de amoniu.
4rintre au,ine 2% 4% 9 s(a do"edit a )i deosebit de e)icace% )iind utilizat in !este 5>I din
e,!erimente in care embriogeneza a )ost realizat cu succes la di)erite s!ecii. Jn general ins% at-t
ti!ul de au,in c-t si concentra ia o!tim !entru inducerea dez"oltarii embriogenice in cazul
unui genoti! !articular% trebuie stabilite em!iric.
Embriogeneza somatica este direct% atunci c-nd embrionii se dez"olt direct de la
celulele e,!lantului si indirect% atunci cand inter"ine )aza intermediar din calus.
/ele doua ti!uri ale dez"oltarii embriogenezei Fin vitroG direct i indirect% !ot )i deci
caracterizate in )unc ie de momentele relati"e ale determinrii si di)eren ierii lor in celulele
embriogenice. 'n tim! ce embriogeneza direct deri" de la celule !ro(embriogenice determinat%
cea indirect necesit di)eren ierea celulelor cu )unc ii s!ecializate% !roli)erarea calusului i
inducerea determinarii embriogenice la unele celule. @enomenul embriogenezei indirecte e,!lica
redeterminarea celulelor di)eren iale s!re direc ia embriogenic de dez"oltare sub ac iunea unor
)actori c$imici%)izici si biologici: ca8 genoti!ul% caracteristicile e,!lantului ini ial% reglatorii
cre terii% condi iile de incubare% etc.
,)3).)SELECTIA IN VITRO
13
1iniile celulare !entru culti"area esuturilor se !ot tria in "itro cu sco!ul de a li se testa
rezistena la di"erse stresuri. 6e$nicile de culti"are tisular s(au )olosit mult #n sco! re!roducti"%
mai ales la trierile !entru tolerana la stres. Selectarea se )ace !rin inducerea unui agent stresant
#n culturile de esut ce conin celule care se di"id. K metod e)icace de obinere de !lante cu
caracteristicile dorite este adugarea unui agent selecti" care s omoare ma&oritatea celulelor (cu
e,ce!ia celor rezistente dintr(o cultur tisular.
0ceast !rocedur se numete triere in vitro (/$a=la i ?enzel% 13<;. 0"-nd #n "edere
c unitatea de selectare in vitro !oate )i o singur celul% !resiunea !entru triere se !oate e,ercita
uni)orm i de manier re!roductibil. 9e asemenea% trierea in vitro este #n !rinci!iu mai e)icient
dec-t selectarea #ntregii !lante. Este o surs de "ariabilitate genetic% care !rin modi)icri
genetice de(a lungul !rocesului de culti"are in "itro #i d natere unui )enomen numit "ariere
somaclonal. Selectarea in "itro o)er un !otenial imens !entru generarea ra!id i e,$austi"
de somaclone utile sau de mutani care s reziste la di"eri )actori biotici i abiotici.
0ceast metod a )ost e)icient #n s!ecial la selectarea !lantelor tolerante la ierbicide i
rezistente la boli. 'n !ractic% a!licarea te$nicilor de triere in "itro #n cadrul !rogramelor de
#mbuntire a recoltelor este )oarte limitat. 9in ma&oritatea semnalrilor reiese o corelare
negati" #ntre rs!unsurile in vitro i in vivo la rezisten.
,)3),) TRANSFORMAREA GENETICA
6rans)ormarea genetic o)er ocazia de a se mane"ra genetic !lante la ni"el celular i
asigur mi&loacele de modi)icare a trsturilor $orticole se!arate )r a a)ecta mult alte as!ecte
ale )enoti!ului (Sing$ i alii% 2>>4.
4rinci!alul obiecti" al te$nicilor de trans)er genetic este de a crea "arieti #mbuntite
!rin #ncor!orarea de gene im!ortante #n !lantele de cultur e,istente (Sing$ i alii% 2>>4. 'ns
!rin te$nicile de trans)ormare a !lantelor nu se trans)orm toate celulele% iar !lantele regenerate
din esuturi trans)ormate !rin organogenez sunt adesea mutani.
Embrionii somatici se nasc din celule singulare% ast)el c regenerarea !rin embriogenez
somatic reduce )ormarea de mutani. 6otui% se !are c !rin embriogenez somatic "ariaiile
somaclonale sunt mai mici com!arati" cu organogeneza.
4omii )ructi)eri sunt considerai material recalcitrant la studiile de trans)ormare genetic%
!rinci!alul im!ediment la aceasta din urm )iind regenerarea !lntuelor trans)ormate. 0legerea
materialelor "egetale de baz ca!abile s se trans)orme i s se regenereze este un )actor crucial%
ast)el c te$nicile de culti"are e)icient de esuturi de"in baza !entru studiile de trans)ormare
14
genetic (+iri i alii% 2>>4. Regenerare cu succes a unor !lante trans)ormate genetic s(a reuit la
mai multe s!ecii de !omi )ructi)eri tro!icali (+omez(1im i 1itz% 2>>4.
0!licaiile te$nologiei de trans)ormare genetic au un !otenial mai mare #n cazul
!omilor )ructi)eri sau al !lantelor !erene dec-t c$iar i #n cel al !lantelor ierbacee% deoarece la
c-tiguri #n materie de ameliorri genetice se !oate a&unge #ntr(un rstim! destul de scurt ra!ortat
la te$nicile de $ibridizare% triere i mutagenez )olosite #n mod obinuit% care necesit zeci de ani.
'n !rezent aria de cercetare de!inde de cel !uin trei )actori% care trebuie #ngemnai !entru
)iecare s!ecie sau genoti! care necesit #mbuntire 8 (1 dis!onibilitatea genelor i !romotorilor
s!eci)ici de a )i trans)erai i e,!rimai : (2 !unerea #n !ractic de te$nici )iabile !entru
trans)erarea genelor care "izeaz celulele i selectarea celulelor trans)ormate : i (3 regenerarea
celulelor trans)ormate #n !lante #ntregi care se !ot rs!-ndi #n mas% !re)erabil !rin mi&loace
ase,uale.
4entru trans)erarea la !lante im!ortante din !unct de "edere agricol se caracterizeaz i se
cloneaz actualmente o #ntreag "arietate de gene !osibil utile% multe dintre acestea urm-nd a )i
de )olos la ameliorarea recoltelor de )ructe. 'n mod asemntor% s(au realizat o serie #ntreag de
metode di)erite de trans)ormare genetic a !lantelor% unele dintre acestea mani)est-ndu(i
a!licabilitatea i la !lantele lemnoase !erene. 6rans)erul stabil% integrarea i e,!rimarea unei
gene(model (cum sunt )ototrans)eraza neomicinic sau L(glucuronidaza s(au demonstrat doar la
!uine s!ecii de )ructe i gene care regleaz metabolismul celular sau as!ectele )iziologice ale
creterii i dez"oltrii.
,)3)3) VARIATIA SOMACLONALA
Sco!ul culturii tisulare !oate )i !strarea )idelitii genetice a stocurilor. /ultura tisular
!e termen lung se mai !oate )olosi i la intensi)icarea "arierii genetice utile. *ariabilitatea
genetic #n cazul materialului !ro"enit din cultura tisular% numit "ariaie somaclonal (1arBin
i Sco=cro)t% 13<1 !re"aleaz mai ales dac materialul se !streaz #ntr(o stare nedi)ereniat%
#n care di"iziunea are loc cu re!eziciune (calusul sau sus!ensia celular% o !erioad mai lung
de tim!.
'n )ond% )rec"ena "ariaiei somaclonale !oate )i de 1>.>>> ori mai mare dec-t "itezele de
mutaie s!ontan la !lantele #ntregi (1arBin i Sco=cro)t% 13<1. S(a sugerat c "ariaia
genoti!ic #n r-ndul !lantelor regenerate at-t din culturile de celule somatice% c-t i gametice
(adic "ariaiile somaclonale i gametoclonale este o surs util de germo!lasm !osibil
"aloroas !entru re!roducerea !lantelor.
15
'n !o)ida multor solicitri de !osibile #ntrebuinri ale "ariaiei somaclonale% !-n #n
!rezent nu s(a #nregistrat nici un singur e,em!lu de "arietate nou ameliorat considerabil !entru
"reo s!ecie im!ortant dez"oltat ca urmare a "ariaiei somaclonale i care s se culti"e #n sco!
comercial.
,)3)/) MARBERI MOLECULARI
MarBerii moleculari sunt a"anta&oi #n s!ecial !entru #mbuntirea trsturilor
agronomice la culturile de )ructe !erene% ameliorare care alt)el ar !resu!une mult tim! : #n !lus%
ar )i greu s se marc$eze genele care con)er rezisten #m!otri"a agenilor !atogeni% insectelor%
nematodelor% toleran la stresurile abiotice% !arametri calitati"i i cantitate. /utarea de marBeri
a)ereni embriogenezei "egetale este un as!ect im!ortant al re!roducerii moderne de !lante
(Sc$ell i alii% 1334.
0!el-nd la trierea cu a&utorul marBerilor% re!roductorul ar !utea alege marBerii
moleculari ai genoti!urilor rezistente care sunt str-ns legai de genele rezistente. 'n cazul
utilizrii comerciale a !rocesului de !ro!agare in "itro a !omilor )ructi)eri este ultraim!ortant s
se estimeze )idelitatea genetic a com!onentelor regenerante% mai cu seam #nainte de
trans!lantarea lor !e c-m!.
4-n acum s(au )olosit mai multe strategii !entru a!recierea acestei )ideliti a !lantelor
crescute in "itro% #ns i ele au !ro!riile lor limitri. 'n sc$imb% marBerii moleculari )aciliteaz cu
mai mare !recizie e,aminarea !lantelor crescute in vitro% ast)el c aceti marBeri rm-n
nea)ectai de )actorii de mediu i dau natere la rezultate mai )iabile i mai re!etiti"e. S(au
#nregistrat mai muli marBeri )iziologici% bioc$imici i moleculari legai de com!etena
embriogenic a celulelor% cum ar )i izozimele i marBerii moleculari. Modelele izozimice a&ut
mult la o #nelegere mai bun a mecanismelor de baz ale di)erenierii celulare i !romo"eaz
dez"oltarea !lantelor.
4e l-ng studiile clasice% #n care izozimele erau )olosite ca marBeri !entru e"enimente #n
)azele mai t-rzii ale !lantei care crete (de e,. organogeneza sau germinarea seminelor% #n
ultimii douzeci de ani s(a demonstrat utilitatea lor ca marBeri #n !rimele stadii de dez"oltare a
!lantei (cu alte cu"inte embriogeneza tim!urie. 6e$nicile de cultur tisular i #n s!ecial
embriogeneza somatic au !ermis a!licarea analizei izozomice #n cazul !rocesului embriogenic%
deoarece datorit lor s(au admis cantiti destul de mari de material "egetal #n stadiul de
dez"oltare dorit.
9e&a s(a !ublicat o trecere #n re"ist am!l cu !ri"ire la )olosirea izozimelor dre!t
marBeri bioc$imici #n cadrul embriogenezei somatice (Sc$ell i alii% 1334.
17
E,ist mai multe gene candidate care s(ar !utea )olosi !e !ost de marBeri moleculari ai
celulelor com!etente se!arate. Ana din aceste gene% cea Binazic de ti! rece!tor !entru
embriogeneza somatic% s(a constatat c e"ideniaz celulele de sus!ensie 9aucus i 9act2lis
se!arate care sunt ca!abile s )ormeze embrioni somatici (Somle"a i alii% 2>>>.
,)3)5) APLICATII
1 4roducia !e scar larg 8 Embrionii somatici au un mare a"anta& com!arati" cu
re!roducerea tradiional !rin !ro!agare% dat )iind c dintr(un singur material "egetal de baz se
!oate !roduce o cantitate e,traordinar de embrioni.
2 Multi!licarea ra!id 8 multi!licarea ra!id !rin embriogenez somatic la culturile de
celule i )olosirea de bioreactoare !entru te$nologia de dez"oltare
3 Scurtarea ciclului de re!roducere 8 0cest !roces scurteaz ciclul de re!roducere a
s!eciilor de !omi% s!orind ast)el germinarea embrionilor $ibrizi.
4 6ransgenicitatea 8 9ez"oltarea embriogenezei somatice ar !utea duce la e,!loatarea
transgenitii din !ers!ecti"a di"erselor surse de stres biotic i abiotic.
5 0!licaiile moleculare i bioc$imice 8 0cestea asigr o surs im!ortant de analizare a
e"enimentelor moleculare i bioc$imice care se !etrec #n tim!ul inducerii i maturizrii
embrionilor.
CONCLUZII
Embriogeneza somatic este o metod !romitoare !entru stabilirea !rotocoalelor de
multi!licare ra!id a genoti!urilor noi% de elit% !entru !roducerea de semine sintetice% !entru
demersurile de triere in vitro #n cazul solicitrilor de ordin biotic i abiotic% !recum i !entru
studiile de mani!ulare genetic.
6rans)erarea genelor #n celulele !lantelor embriogenice re!rezint de&a o concuren
!entru re!roducerea tradiional a !lantelor i a de"enit un instrument indis!ensabil !entru
ameliorarea recoltelor. Ana din cele mai im!ortante condiii !reliminare !entru mani!ularea
genetic a !lantelor in vitro este abilitatea de a crete celule somatice #n mediu steril i de a
regenera !lante "iabile din aceste culturi.
9e aceea embriogeneza somatic re!rezint un cadru mai e)icient !entru studiile care
im!lic !roducerea de !lante trans)ormate genetic.
1;
CAPITOLUL 3
CULTURA DE EMBRIONI LA POMII FRUCTIFERI2REALIZRI
CURENTE
3).) APLICAII
Embriocultura este una din )ormele cele mai tim!urii de cultur in vitro )olosite #n cazul
!roblemelor !ractice i este% !robabil% te$nica de cultur tisular care s(a do"edit a )i cea mai
"aloroas !entru re!roductori% a!licaia sa de baz la re!roducerea !lantelor )iind !entru
$ibridizarea inters!eci)ic. 0"ortul embrionar tim!uriu a!are #n !rinci!al din cauz c
endos!ermul nu se dez"olt cum trebuie. 1a #ncrucirile inters!eci)ice% cele intergenerice i cele
dintre di!loide i tetra!loide% endos!ermul se dez"olt adesea ori !uin% ori deloc% #ns aceast
!roblem se !oate rezol"a !un-nd ase!tic embrionul #ntr(un mediu de cultur cu substane
nutriti"e.
Embrionii din unii $ibrizi ne"iabili i(ar !utea iniia dez"oltarea e"it-nd barierele
ostzigotice din !lanta(mam. 4-n acum s(au #nregistrat mai multe cazuri reuite de embrioni
nscui din $ibrizi inters!eci)ici i $ibrizi intergenerici. /ultura embrionar se !oate )olosi cu
succes ca instrument #n cadrul !rogramului de re!roducere la cais i cire% #n sco!ul a&ungerii la
un !rocenta& mai mare de rsaduri din $ibridizarea !lani)icat sau !entru a nu ne mai con)runta
cu li!sa germinrii s-mburilor.
Embriocultura !oate scurta ciclul de re!roducere !rin eliminarea latenei la semine% care
este cauzat de in$ibatorii endogenici% de cerinele #n materie de lumin i de de!ozitare la uscat%
de tem!eraturile sczute i de imaturitatea embrionilor. @actorii care induc latena la semine
acioneaz asu!ra c!tuelii seminelorMs-mbu(rilor% asu!ra endos!ermului sau asu!ra ambelor.
4rin scoaterea embrionilor din raza de in)luen a acestor )actori ei "or !utea germina i crete
re!ede% ast)el c se "a scurta ciclul de re!roducere. Ni embrionii izolai se !ot iaro"iza% tim!ul de
germinare !ut-ndu(se uneori diminua cu 4> de zile. +erminarea seminelor mature #n cazul
cireului de cultur care se coace de tim!uriu Sile&(9elamarBa este de > I !rin metodele
tradiionale de culti"are a seminelor : #n sc$imb% embriocultura a s!orit cu succes germinarea
!-n la 3> i 7> la sut #n cazul mostrelor de embrioni% la 21 i% res!ecti"% 2< de zile de la
#n)lorirea com!let.
4e l-ng utilizrile embrioculturii% aceast !rocedur este de a&utor i la studiile de baz.
/reterea de embrioni #n a)ara o"ulului (e, o"ulo este un mod minunat de studiere a nutriei i
1<
metabolismului embrionilor #n di)eritele stadii de dez"oltare. 6e$nica se mai !oate )olosi i la
e,aminarea condiiilor de cretere !entru embrioni% a e)ectelor )ito$ormonilor% a condiiilor de
mediu !entru embriogeneza zigotic i a !osibilitilor de regenerare a embrionilor #ntregi i a
segmentelor acestora.
Embriocultura se !oate #ntrebuina i la detectarea locurilor #n care se a)l !romotorii i
in$ibatorii de germinare% la studiile embriogenetice i la !strarea criogenic. +erminarea
caisului care se coace de tim!uriu s(a #mbuntit !rin )olosirea unui mediu cu amestec de alge i
sucroz.
9e asemenea% cultura embrionar se mai !oate )olosi i la !ro!agarea !lantelor !e cale
"egetati". Embrionii din gru!urile de s!ecii #nrudite #ndea!roa!e care au trsturi i &u"enile%
dar i adulte se )olosesc dre!t material de #nce!ut !entru !ro!agarea "egetati"% embrionii )iind
rece!ti"i% deoarece sunt tineri. Embriocultura se !oate )olosi la studierea germinrii !recoce%
adic a germinrii embrionilor #nainte de #nc$eierea dez"oltrii embrionare obinuite.
9e regul germinarea !recoce duce la )ormarea de rsaduri slabe. 4entru a #nelege
)actorii care regleaz dez"oltarea ordonat a embrionilor #n natur% acetia se !ot !une #n medii
de cultur #n condiii "ariate% !entru a se "edea cum anume se simuleaz dez"oltarea
embriologic. +erminarea !recoce se #nt-m!l din cauz c in$ibatorii se !ierd #n momentul
scoaterii ca!sulei semineiMs-mburelui sau !otenialul osmotic negati" este mai mare in vivo.
+erminarea !recoce s(a !re#nt-m!inat la 4runus !rin cultura o"ular% unde integumentul a
acionat ca un in$ibator natural.
Embriocultura a )ost )oarte util la stabilirea "iabilitii seminelor% #ntrebuinare care a
reieit din constatrile de #nce!ut c e,ist o corelare bun #ntre creterea embrionilor e,cizai ai
s-mburilor de !iersic neco!i ulterior O4runus !ersica (1. Catsc$.P i germinarea s-mburilor
co!i ulterior. 4rin cultura embrionar se !oate testa cu ra!iditate "iabilitatea
seminelorMs-mburilor atunci c-nd se !oate e"ita latena lor.
3).).)TEHNICILE
'n ma&oritatea situaiilor embrionii se aeaz #n mediul steril al o"ulului% ast)el #nc-t nu
mai e ne"oie s se sterilizeze su!ra)aa acestora. 'n sc$imb% su!ra)aa o"ulelor #ntregi sau a
o"arelor se sterilizeaz% du! care embrionii se scot ase!tic din esuturile din &ur. 9at )iind c
embrionul este adesea !rote&at bine de aceste esuturi% !entru dezin)ectarea su!ra)eelor se !ot
utiliza !roceduri un !ic mai dure.
0st)el% culturile a,enice de embrioni se realizeaz adesea cu uurin. Embrionii necesit
dezin)ectare direct dac #n"eliurile seminelor M s-mburilor sunt cr!ate sau dac #nuntrul
13
acestora e,ist !atogeni endo)itici. 9isecarea embrionilor !oate conduce la !robleme. Embrionii
mari nu sunt greu de e,cizat% #ns !entru cei mici trebuie )olosite instrumente de micro(disecare%
!entru a nu(i rni. Embrionii se deterioreaz uor atunci c-nd li se taie #n"eliul : #n !lus% este
im!ortant ca embrionul e,cizat s nu se usuce #n tim!ul inerii #n mediul de cultur. 4rocesul de
e,cizare a embrionilor imaturi "ariaz de la o s!ecie la alta% #ns de multe ori se !oate )ace o
incizie la ca!tul micro!ilar al o"ulului t-nr% ca!tul cellalt a!s-ndu(se !entru a )ora
embrionul s ias !rin desc$iztur. 9ac embrionul este #ncon&urat de endos!erm lic$id%
!resiunea !e care o e,ercit acesta ar !utea duna esutului embrionic )ragil dac nu se "a a"ea
gri&. 'n momentul #n care se e,cizeaz embrioni tineri sau a)lai #n stadiul de mi&loc este
im!ortant s se !streze intaci sus!ensorii.
3).),)CERINE PENTRU REUIT
Reuita dez"oltrii unui embrion de!inde de muli )actori. /a #n cazul ma&oritii
celorlalte !rocese% succesul este in)luenat )oarte mult de genoti!ul !lantei. Embrionii unora
dintre s!ecii sunt mai uor de crescut #n cultur dec-t alii% #ntre !lantele de cultur #nrudite str-ns
a!r-nd uneori di)erene.
9u! cum s(a artat mai sus% embrionii mici sunt greu de crescut in "itro% #ns se !ot
)olosi te$nici s!ecializate !entru #mbuntire. Atilizarea endos!ermului(FdoicG !resu!une
introducerea unui embrion $ibrid #ntr(un endos!erm disecat dintr(un o"ul auto!olenizat care se
dez"olt #n mod normal% o"ul !ro"enit de la unul dintre !rini sau de la o ter s!ecie% embrionul
i endos!ermul trans)er-ndu(se #m!reun la su!ra)aa mediului de cultur.
1a alte s!ecii s(au ada!tat "ariante modi)icate ale endos!ermului(doic% cum ar )i
im!lantarea sau trans!lantarea de embrioni. 4rin sal"area de embrioni se !oate atinge o rat de
succes de 3>(4> I graie #ncrucirilor intergenerice% com!arati" cu !rocenta&ul de 1 I al
situaiilor #n care nu se )ac trans!lanturi de embrion ( endos!erm(doic. Embrionii mici sau tineri
care se a"orteaz #n !rimele stadii de dez"oltare sunt adesea greu de izolat. Embrionii de cais de
5(3 mm au germinat i au a&uns !lante #ntr(un !rocent considerabil mai mare dec-t #n celelalte
dou stadii mai mature.
/erinele nutriti"e ale embrionilor tineri "ariaz )oarte mult% iar riscul de deteriorare a lor
este )oarte mare. 'n ast)el de situaii embrionii s(ar !utea sal"a !rin metode de culti"are o"arian
sau o"ular. K"arele se e,cizeaz du! !olenizare i li se scot caliciul% corola i staminele.
2>
Su!ra)aa o"arului se sterilizeaz i se introduce cu ca!tul tiat al !edicelului #n mediul de
cultur cu substane nutriti"e. 9ac totul decurge bine% o"arul "a da natere unui )ruct cu
seminele dez"oltate com!let.
'n cazul culturii cu o"ule% o"arul sterilizat se desc$ide% iar o"ulele )ertilizate se scot a)ar
i se trans)er !e su!ra)aa mediului de cultur. Moti"ele !entru recu!erarea cu succes a
$ibrizilor mai degrab din cultura o"arian sau o"ular dec-t din cea embrionar sunt legate
!robabil de anumii )actori nutriionali i )izici% dar i de !rote&area embrionului !rin esuturile
materne ori s!oro)itice.
1umina i tem!eratura sunt doi )actori de mediu e,trem de im!ortani !entru
embriocultur. Aneori embrionii cresc mai bine dac se in !e #ntuneric #n !rimele 1(2 s!tm-ni
de cultur% iar a!oi se duc la lumin !entru a se )orma cloro)ila. Embrionii izolai germineaz
adesea #ntr(o gam de tem!eraturi mai am!l dec-t seminele intacte. Anii embrioni necesit o
tratare la rece% la 4 Q/% !entru a se #n"inge latena. /ulti"area de embrioni de cire imaturi i
maturi a )ost reuit atunci c-nd acetia s(au tratat la rece (la 4 Q/ tim! de 4> de zile i%
res!ecti"% 7> de zile. Calla i CroziB au strati)icat embrioni de cire la 4 Q/ tim! de 12> de zile.
6em!eratura o!tim !entru creterea embrionilor de!inde de s!ecia !lantelor% #ns #n mod
normal se )olosete o gam cu!rins #ntre 25(3> Q/.
1a cultura embrionar se iau #n considerare i condiiile de cretere ale !lantei(mam.
Endos!ermul i cotiledoanele se "or dez"olta mai mult dac !lanta(mam se "a culti"a #n
condiii bine inute sub control : !rin urmare% se "a !romo"a creterea embrionar.
3).)3)MEDIILE
Muli oameni de tiin sunt de !rere c cel mai im!ortant as!ect al embrioculturii este
alegerea mediului. 4entru cultura embrionar s(au )olosit mai multe )ormule de sruri minerale%
)r a se )ace !rea multe a!recieri cu !ri"ire la rolul elementelor luate se!arat. Mediul C5 al lui
Muras$ige i SBoog i cel al lui +amborg% cu anumite modi)icri% sunt mediile de baz cele mai
)olosite la embrioculturi. Rizzo i alii (133< au )olosit trei medii OMS% Dno!! i cel !entru
!lantele lemnoase (41P la cultura embrionar !entru !iersic% embrionii aezai #n mediul 41 cu
sucroz #n !ro!orie de 3 I germin-nd mai bine.
/erinele nutriionale e,acte de!ind de stadiul de dez"oltare a embrionului. Rag$a"an a
identi)icat dou )aze de dez"oltare embrionar. 'n cea $eterotro)ic% embrionul t-nr de!inde de
endos!erm i de esuturile materne #ncon&urtoare i are ne"oie de un mediu mai com!le, i de o
!resiune osmotic mai mare dec-t embrionii mai #n "-rst.
21
9ez"oltarea continu a embrionilor tineri necesit medii com!le,e% su!limentate cu
combinaii de "itamine% aminoacizi% $ormoni de cretere i% #n anumite cazuri% e,tracte naturale%
de genul suc de tomate i la!te de cocos% care s susin dez"oltarea. 'n )aza autotro)ic 5 al
doilea stadiu de cretere embrionar 5 embrionul este ca!abil% din !unct de "edere metabolic% s
sintetizeze din sruri i za$r substanele necesare creterii sale. 'n aceast )az embrionii !ot s
germineze i s creasc #ntr(un mediu anorganic sim!lu% su!limentat cu o surs de carbon% cum e
sucroza. Ritratul de amoniu i nitratul de !otasiu sunt cele mai )rec"ente surse de R anorganic #n
embrioculturi. 0moniul din mediu este esenial sau !re)erenial !entru creterea cores!unztoare
i di)erenierea embrionilor imaturi. 9e regul amoniul se combin cu un acid organic% #ndeosebi
cu anionii de malat sau de citrat. 9intre di"erii aminoacizi% glutamina i as!aragina sunt cei mai
e)icieni. .idrolizatul din casein este un amestec com!le, de aminoacizi i se )olosete de
regul #n mediile de embriocultur !entru a stimula creterea. 9e obicei se adaug i "itamine 5
biotin% tiamin% acid !antotenic% acid nicotinic% acid ascorbic% inositol i !iro,idin 5 #ns nu s(
au do"edit a )i eseniale. 0dugarea de aminoacizi la mediul de cultur e de natur s stimuleze
creterea embrionilor. 9e !ild% glutamina este cel mai e)icient aminoacid !entru creterea
embrionilor dez"oltai #n culturi. Ni as!aragina !oate s!ori creterea embrionar% #ns !oate )i i
in$ibatoare. .idrolizatul din casein este un amestec com!le, de 1< aminoacizi% care s(a )olosit
)oarte mult dre!t aditi" la mediile de culti"are a embrionilor. 0tunci c-nd se adaug singuri la un
mediu% nici unul dintre aminoacizi nu egaleaz e)ectul bene)ic al $idrolizatului din casein% #ns
#n urma inducerii i maturrii embrionilor somatici s(a demonstrat c aminoacizii de genul
!rolin% serin i glutamin !ot #nlocui $idrolizatul din casein.
1ucrarea de re)erin a lui "an K"erbeeB i alii a artat c embrionii de dinainte de
stadiul !ost(tor!edic se !ot culti"a #n mediul de cultur dac aici se adaug endos!erm lic$id de
cocos. Modi)icarea mediului #n sensul mimrii endos!ermului care #ncon&oar embrionii imaturi
din o"ul a dus la reuit% ceea ce #nainte nu )usese !osibil. 4rin )olosirea de la!te de cocos #n
mediile !entru embrionii tineri se !oate e"ita germinarea !recoce. /a substitut !entru la!tele de
cocos se !ot )olosi alte substane naturale 5 la!te degresat% dro&die de bere uscat (e,tract de
mal% $idrolizat din casein i !roduse di)uzate din seminele mai multor s!ecii de !lante% #n
)uncie de s!eciile care se analizeaz.
9ei se )olosesc medii sintetice% aceste e,tracte naturale din !lante se !reteaz la surse
aminoacide !entru creterea de embrioni imaturi #n medii de cultur. Sucroza este cea mai
)olosit surs de energie / !entru embrioculturi% deoarece ea este #n !rinci!al o surs de energie%
cu toate c &oac i un rol im!ortant #n meninerea !otenialului osmotic adec"at al mediilor
nutriti"e. Embrionii maturi se cresc de obicei #n medii cu sucroz #n !ro!orie de 2(3 I : #n
sc$imb% cei imaturi cresc mai bine la <(12 I% unde se mimeaz !otenialul osmotic ridicat din
22
cadrul sacului embrionar t-nr. 'n general% cu c-t e mai t-nr embrionul e,cizat% cu at-t mai mare
trebuie s )ie osmolaritatea mediului. Rag$a"an este de !rere c aceast osmolaritate ridicat
!re"ine germinarea !recoce i #m!iedic celulele care se a)l #n stadiul de di"iziune s se
alungeasc.
0mestecul de alge este agentul cel mai des )olosit !entru solidi)icarea mediilor de
cultur% la embrioculturi utiliz-ndu(se de regul concentraii de >%5(1%5 I. /oncentraiile mari de
amestec de alge !ot in$iba creterea din cauza calitii acestuia% a srurilor contaminatoare sau a
)a!tului c nu este su)icient a!. 'n loc de amestecul de alge% cu a&utorul sistemului de s!ri&inire
cu silicat de mic !entru embrionii mici ai !iersicului de cultur #n stadiul inci!ient de maturitate
s(a a&uns la culturi reuite i la )olosirea de !rini materni #n cadrul !rogramelor de re!roducere.
Reglatorii de cretere a !lantelor &oac #n general un rol minor #n cultura embrionar. 9e
au,ine e,ogene se !are c nu este ne"oie !entru creterea in "itro a embrionilor !lantelor% iar
e,!unerea de )a "ine #n s!ri&inul cazurilor obser"ate #n care inducerea somatic de embrioni
este in$ibat de concentraii mari de au,in e,ogen #n mediu% dar este stimulat de concentraii
sczute sau #n absena ei. 0tunci c-nd se )olosesc !e !ost de $ormon singur% citoBinele sunt
ine)iciente sau a&ut #ntr(o msur )oarte mic la creterea embrionilor tineri. /u toate acestea%
ele #ncura&eaz creterea i di)erenierea embrionilor atunci c-nd sunt combinate cu anumite
au,ine. Monnier sugereaz c la mediile de cultur embrionar n(ar trebui adugai $ormoni%
deoarece duc la anormaliti structurale. 0u,inele i citoBinele nu se )olosesc #n general la
embrioculturi dec-t dac e ne"oie de inducere de calus. +iberelinele stimuleaz uneori
germinarea !recoce sau se )olosesc la eliminarea latenei.
3),)SALVAREA EMBRIONILOR
INTRODUCERE
6ermenul de Fsal"are embrionarG se re)er la o serie de te$nici in "itro care au sco!ul de
a !romo"a dez"oltarea unui embrion imatur sau slab care s a&ung !lant "iabil. Sal"area
embrionilor s(a )olosit )oarte mult la !roducerea de !lante din $ibridizrile la care nedez"oltarea
cum trebuie a endos!ermului a !ro"ocat a"ortarea embrionilor. 'n cadrul !rocedurilor de sal"are
emrbionar mediul art)icial cu substane nutriti"e ser"ete dre!t #nlocuitor al endos!ermului%
!ermi-ndu(i ast)el embrionului s(i continue dez"oltarea. 6e$nicile de sal"are embrionar sunt
!rintre cele mai "ec$i i mai reuite !roceduri in "itro.
23
Ana din #ntrebuinrile de baz ale sal"rii embrionare a )ost !roducerea de $ibrizi
inters!eci)ici i intergenerici. 1a incom!atibilitate inters!eci)ic se !oate a&unge dintr(o serie
#ntreag de moti"e% una dintre cauzele obinuite )iind a"ortarea embrionar. 4roducerea de
semine mici i restr-nse #n urma $ibridizrii am!le arat #ncruciarea #n care s(a )cut )ertilizare%
#ns dez"oltarea seminelor a )ost #ntreru!t. 4rocedurile de sal"are a embrionilor s(au do"edit a
)i )oarte reuite !entru de!irea acestei bariere din calea $ibridizrii e,tinse #n cazul unei game
"aste de materiale "egetale (/ollins i +rosser% 13<4. 'n !lus% sal"area embrionar s(a )olosit i
la recu!erarea $a!loidelor materne care s(au dez"oltat ca rezultat al eliminrii cromozomiale #n
urma $ibridizrii inters!eci)ice.
6e$nicile de sal"are a embrionilor s(au )olosit i la obinerea de descendeni !rin
$ibridizri intra(s!eci)ice care #n mod normal nu !roduc semine "iabile. 9e e,em!lu% din
#ncruciri dintre membri di!lozi i tetra!loizi din aceeai s!ecie s(au recu!erat tri!loide% iar
descendeni s(au obinut din #ncruciri #n care !e !ost de !rini materni s(au )olosit genoti!uri
de )ructe stenos!ermacar!ice )r semineMs-mburi% care se coc de tim!uriu. 6e$nicile de sal"are
embrionar s(au utilizat i #n situaii #n care nu e,ist !ericol de a"ortare embrionar% adic
!entru de!irea latenei seminelor i studierea dez"oltrii i germinrii acestora. 0!licaiile
di"erse ale sal"rii embrionare #n cercetrile asu!ra !lantelor au )ost trecute #n re"ist de Cridgen
(1334% /ollins i +rosser (13<4% Ramming (133> i S$arma i alii (1337.
'n )uncie de organul crescut #n mediul de cultur% sal"area embrionar se re)er la cultura
de embrioni% de o"ule sau de o"are. 4rocesele de dezin)estare i de e,cizare a e,!lantelor sunt
di)erite #n cazul acestor trei te$nici% #ns )actorii care contribuie la recu!erarea cu succes a
!lantelor "iabile sunt aceiai.
3)3)FACTORII IMPLICAI CN SALVAREA EMBRIONAR
MEDIILE
Mediile C(5 ale lui Muras$ige i SBoog (MS (Muras$ige i SBoog% 1372 i ale lui
+amborg (+am(borg i alii% 137< sunt mediile de baz cele mai )olosite la studiile !ri"itoare la
sal"area embrionar (Cridgen% 1334. 6i!urile i concentraiile de su!limente necesare !entru
medii de!ind )oarte mult de stadiul de dez"ol(tare a embrionului.
Rag$a"an (13;7 a identi)icat dou )aze ale dez"oltrii embrionilor. 'n cea $eterotro)ic
embrionul t-nr% care este adesea numit !roembrion% este de!endent de endos!erm. Embrionii
!ornii #n aceast )az necesit un mediu com!le,. 0minoacizii% mai ales glutamina i as!argina%
se adaug )rec"ent la mediu. 0colo se mai !ot introduce i di"erse "itamine. E,tractele naturale%
24
cum e la!tele de cocos i $idrolizatul de casein% s(au )olosit uneori #n loc de aminoacizi
s!eci)ici. Embrionii tineri au ne"oie de un mediu cu !otenial osmotic mare. Sucroza ser"ete
adesea at-t dre!t surs de carbon% c-t i dre!t osmoticum. /oncentraia osmotic mare din mediu
!re"ine germinarea !recoce i s!ri&in dez"oltarea normal a embrionilor. 'n cazul celor $etero(
tro!ici se )olosete de regul sucroz de 232(352 mM (<(12 I. 'n locul acesteia sau !e l-ng ea
s(au )olosit cu succes i alte za$aruri% #ns sucroza este !e de!arte cea mai )olosit substan
dulce !entru sal"area embrionilor.
/ea de(a doua eta! a dez"oltrii embrionare este cea autotro)ic% care de regul #nce!e la
s)-ritul )azei de mi&loc% #n care se )ormeaz embrionul (Rag$a"an% 13;7. 'n acest moment
embrionul este ca!abil s sintetizeze din sruri i za$aruri substanele necesare creterii sale.
+erminarea "a a"ea loc de obicei #ntr(un mediu anorganic sim!lu% su!limentat cu sucroz de 5<(
<< mM (2(3 I.
1a studiile des!re sal"area embrionar% mai cu seam #n cazul embrionilor $eterotro!ici%
s(au )olosit )oarte mult reglatori de cretere% #ns e)ectele lor nu au )ost deloc con)orme. 'n
general% concentraiile sczute de au,ine au im!ulsionat creterea normal% iar acidul giberelic a
dus la lrgirea embrionilor : #n sc$imb% citoBinele au in$ibat creterea (S$arma% 1337. 4e l-ng
adugarea de "itamine i aminoacizi #n mediu% reglatori de cretere mai !ot )i i anumite e,tracte
naturale.
9u! cum s(a menionat anterior% cerinele !entru medii di)er #n )uncie de stadiul de
dez"oltare a embrionilor. 'n cazul culturilor #nce!ute cu embrioni )oarte tineri e !osibil s )ie
ne"oie de cel !uin o )ormul de mediu. 9e !ild% embrionii $ibrizilor inters!eci)ici 6ri)olium s(
au !us !rima dat #ntr(un mediu de cultur cu concentraie mare de sucroz% cu un ni"el de
au,in moderat i un ni"el de citoBinin sczut. 9u! 1(2 s!tm-ni de stat #n acest mediu
embrionii s(au o!rit din cretere. 0ceasta s(a reluat du! ce au )ost trans)erai #ntr(un mediu cu o
concentraie mai mic de sucroz% cu un ni"el de au,in sczut i unul moderat de citoBinin
(/ollins i +rosser% 13<4.
'n cazul $ibrizilor inters!eci)ici ar )i util s se dez"olte medii #n care s se culti"e
embrioni dintr(una sau ambele s!ecii !arentale. /u toate c ne"oile nutriti"e ale $ibridului !ot )i
di)erite de ale !rinilor% )ormulele mediilor !arentale "or ser"i dre!t !unct de !lecare bun !entru
$ibrid.
TEMPERATURA I LUMINA
/erinele #n materie de tem!eratur i lumin "ariaz de la s!ecie la s!ecie. 4otri"it lui
S$arma (1337% necesitile embrionilor !entru cretere sunt adesea aceleai cu ale !rinilor lor%
25
embrionii !entru culturile din anotim!urile mai reci a"-nd ne"oie de tem!eraturi mai &oase dec-t
cei !entru culturile din anotim!urile calde. /ulturile se incubeaz )rec"ent la 25(3> Q/% dei #n
cazul anumitor s!ecii e ne"oie de tem!eraturi simitor mai sczute. 1a s!eciile care de regul
#nregistreaz laten a seminelor e !osibil s )ie necesar tratare la rece.
/ulturile se #nce! de obicei la #ntuneric% !entru a se !re#nt-m!ina germinarea !recoce%
du! care se mut #ntr(un mediu cu lumin% !entru a se !utea dez"olta cloro)ila du! 1(2
s!tm-ni de stat #n #ntuneric.
MOMENTUL INIIERII CULTURII
0tunci c-nd se #ncearc s se sal"eze embrioni !ro"enii din #ncruciri incom!atibile
este crucial ca res!ecti"ele culturi s se #ncea! #nainte de a"ortarea embrionilor. 'ns de "reme
ce este mai greu s se creasc embrioni tineri dec-t cei care au a&uns #n )aza autotro)ic de
dez"oltare% ansele de reuit sunt ma,imalizate !rin lsarea embrionului s se dez"olte c-t mai
mult in "i"o. 4entru stabilirea momentului cedrii endo(s!ermului i al a"ortrii embrionilor se
!ot )ace e,aminri $istologice% #ns ast)el de e"aluri !ot )i )oarte laborioase. /ulturile de obicei
se #nce! la inter"ale di)erite du! !olenizare% !entru a s!ori ansele de sal"are a !lantelor "iabile.
9in moment ce se !reconizeaz o interaciune #ntre medii i momentul iniierii culturii% este
im!ortant ca #n momente de cultur di)erite s se testeze o gam #ntreag de medii 8 de la cele
com!le,e% cu concentraie mare de sucroz% !-n la cele sim!le% cu sucroz sczut.
3)/)PROCEDURILE GENERALE DE SALVARE A EMBRIONILOR
CULTURA EMBRIONAR
4rocedura de sal"are a embrionilor care se )olosete cel mai mult este embriocultura%
unde embrionii se e,cizeaz i se aeaz direct #n mediul de cultur. @ructul rezultat din
!olenizarea controlat a !lantelor de ser sau crescute !e c-m! se culege #nainte de momentul #n
care se consider c ar a"ea loc a"ortul embrionar. 9e "reme ce embrionii se a)l #ntr(un mediu
steril% nu este ne"oie s se dezin)esteze i embrionul #n sine. 'n unele cazuri se sterilizeaz
#ntreaga su!ra)a a o"arului : #n alte cazuri se scot o"ulele din o"ar #n condiii nonase!tice% iar
a!oi se dezin)esteaz. 'n oricare dintre situaii% #n mod normal se !oate )ace o dezin)estare mai
dur% dat )iind c embrionul este !rote&at de esutul #ncon&urtor.
27
E,cizarea cu gri& a embrionului este e,trem de im!ortant !entru reuita culturii
embrionare. 9e regul este ne"oie de un stereomicrosco!% care trebuie am!lasat #n #n"elitoarea
!entru curgerea laminar #n aa )el #nc-t s nu #m!iedice circulaia aerului. /el mai !otri"it !unct
de incizare a o"ulului di)er de la s!ecie la s!ecie. 'n anumite cazuri embrionii se !ot e,trage
!rin tierea ca!tului micro!ilar al o"ulului i a!oi !rin a!sarea uor a ca!tului o!us al
o"ulului% !entru ca embrionul s )ie #m!ins a)ar !rin desc$iztur. Este crucial ca embrionul s
se aeze direct #n mediul de cultur du! e,cizare% !entru a nu se usca. 'n cazul embrionilor mai
tineri i #n )orm de inim embrionul "a trebui e,cizat cu sus!ensorul intact (.u i ?ang% 13<7.
9at )iind c este e,trem de im!ortant i adesea )oarte greu s nu se e,cizeze embrioni )r a(i
a)ecta% ar )i util s se creeze i s !un #n !arctic o te$nic de e,cizare #n condiii nonase!tice.
/ultura embrionar este uneori !recedat de cea o"ular sau o"arian. Anul din
a"anta&ele acestei te$nici (numite c-teodat cultur o"ulo(embrionar sau o"aro(embrionar este
ca e,cizarea embrionului s se am-ne !-n c-nd acesta de"ine #ndea&uns de mare ca s se !oat
scoate )r a se strica. 9e asemenea% s(a constatat c !rezena intetegumentului #n tim!ul culturii
o"ulare sau o"ariene reduce riscul de germinare !recoce (Ramming% 133>. Kdat e,cizat%
embrionul !oate intra #n contact direct cu mediul. 'n !lus% #n cazul s!eciilor a)ectate de laten
scoaterea embrionului ar !utea elimina e"entualele e)ecte in$ibatoare induse de esuturile
o"ulare din &ur.
1a sal"area de embrioni s(au )olosit culturi de rsaduri (?illiam i alii% 13<2. 0ceast
te$nic !resu!une inserarea embrionului dintr(o #ncruciare incom!atibil #n endos!ermul scos
dintr(o #ncruciare com!atibil #nrudit. S!re e,em!lu% embrionul unui $ibrid inters!eci)ic se
!oate introduce #n endos!ermul dintr(o #ncruciare intras!eci)ic #n care este im!licat una din
s!eciile !arentale% du! care embrionul i endos!ermul se aeaz #m!reun #n cultur.
CULTURA OVULAR
Embronii sunt greu de e,cizat atunci c-nd sunt )oarte tineri sau !ro"in de la s!ecii cu
semine mrun(te. 4entru a nu(i a)ecta #n tim!ul !rocesului de e,cizare% uneori ei se !un la
crescut #n mediul de cultur de c-nd se a)l #nc #n interiorul o"ulului.
0ceast te$nic se numete o"ulo(cultur sau embriocultur in o"olo. /a la cultura
embrionar% o"arele se str-ng #nainte de momentul #n care se !resu!une c ar !utea inter"eni
a"ortul. Se sterilizez su!ra)aa o"arului% iar o"ulele se scot i se aeaz #n cultur. 0ceast )az
!oate )i de la e,trem de uor de realizat 5 #n cazul s!eciilor cu semineMs-mburi mari% #n care este
!rezent numai un singur o"ul 5 !-n la greu de )cut sau )oarte #ndelungat 5 #n cazul s!eciilor
!olio"ulate cu semineMs-mburi mici. 4entru e,cizarea o"ulelor e !osibil s )ie ne"oie de
2;
stereomicrosco!. 'n !lus% s(a constatat c introducerea de esut !lacentar #n culturile o"ulare este
bene)ic la anumite s!ecii (Rangan% 13<4.
Recent s(au o!erat modi)icri la te$nica standard de o"ulo(cultur !entru utilizarea la
!iersic (4runus !ersica O1.P Catsc$ (4into i alii% 1334. Ana dintre te$nici 5 !er)orarea o"ulului
5 !resu!une realizarea de gurele #n )iecare o"ul c$iar #nainte de aezarea acestuia #n mediul de
cultur. 0ceste !er)orri% care trebuie )cute cu gri& !entru a nu se a)ecta embrionii% s!oresc
absorbia de a! i de substane nutriti"e. S(au creat dou ti!uri de sisteme de s!ri&inire a
o"ulelor 8 cel cu $-rtie de )iltru !resu!une creterea de o"ule #n !artea de sus a $-rtiei de )iltru
aezate deasu!ra mediului lic$id% #n "reme ce te$nica cu silicat de mic im!lic aezarea
o"ulelor cu !artea micro!ilar #n &os% #ntr(un amestec de mediu steril lic$id cu silicat de mic
(s!ri&inul cu silicat de mic. Sistemul de !er)orare o"ular i cel cu silicat de mic e !osibil s
nu se !oat !une #n !ractic la s!eciile cu semine mici% #ns mrimea o"ulelor n(ar trebui s
limiteze testarea sistemului de s!ri&in cu $-rtie de )iltru la alte s!ecii dec-t !iersicul.
CULTURA OVARIAN
'n cazul culturii o"ariene sau al celei cu !asti% #n cultur se aeaz o"arul #ntreg. Se
adun o"arele i se iau &os e"entualele !ri rmase din )lori. 4rin !rotocoalele de dezin)estare "a
trebui s se curee su!ra)aa de substanele contaminante )r a se a)ecta o"arul% du! care o"arul
se aeaz #n cultur cu ca!tul tiat al !edicelului #n mediu. 1a s)-ritul e,!erimentului se scot
seminele din )ructul care se dez"olt #n cultur.
1a sal"area embrionilor de $ibrizi inters!eci)ici de 6uli!a s(a )olosit o te$nic numit
Fcultura cu )elii de o"arG (*an /rei& i alii% 1333 8 o"arele s(au tiat !e trans"ersal #n seciuni%
iar ca!tul tiat de la baz s(a aezat #n mediul de cultur. 1a 6uli!a cultura o"ular i cea cu
)elii de o"are a dus la !rocente de germinare asemntoare% #ns !rocedura re)eritoare la cultura
cu )elii de o"are s(a considerat su!erioar celor dou te$nici% deoarece nu a !resu!us at-t de mult
tim!.
2<
$tt!8MM===.biolog2.gatec$.eduM!eo!leMinde,.!$!SidT&err2(!ullman
23
CAPITOLUL /
/).) MATERIALE I METODE
/).).)
/).),)
CAPITOLUL 5
REZULTATE I DISCUII
II) PARTEA E4PERIMENTAL
3>
5).)
CAPITOLUL 6
CONCLUZII
CAPITOLUL 7
B*&o@ra"%
EUEM41A
B'rn%tt%$ F)S)$ .>77) 4ero,idase and its relations$i! to )ood and Vualit2. 0 re"ie=. H. @ood Sci%
428 1(5.
C8o<$ I)$ Datt=$ B)M)$ .>66) Krigin o) o))(odors in )rozen green beans.@ood 6ec$nol.% 238 113(
114.
Hart0&%r$ E)R)$ G'%rrant$ N)B)$ .>5,) E))ect o) blanc$ing and o) )rozen storage o) "egetables
on ascorbic acid retention and t$e concomitant acti"it2 o) certain enz2mes. @ood Res.% 1;8 15(23.
31