Sunteți pe pagina 1din 131

Enzimele n procese metabolice

1
Enzime
1. Definiie
2. Istoric
3. Caracteristici ale catalizei enzimatice
4. Mecanisme de aciune cinetica reaciilor enzimatice
5. Structur
6. Specificitate
7. Localizare intracelular
2
Enzime. Definiie
catalizatori biochimici propriu-zii (biocatalizatori),
biocompui de natur organic,
proteine nalt specializate
biomolecule caracterizate prin - eficien
- specificitate
- putere catalitic deosebit
- capacitate de reglare mult superioar
catalizatorilor, utilizai in vitro, n chimia anorganic i organic
acioneaz n condiii blnde de reacie (condiii fiziologice,
compatibile cu viaa celulei umane):
pH neutru (~7);
temperatura organismului uman (~36C);
presiune atmosferic normal.
3
CARACTERISTICILE CATALIZEI ENZIMATICE
I. Caracteristicile aproximativ comune catalizei chimice
+ Mresc viteza de reacie fr s se consume
+ Dup terminarea unei reacii pot cataliza transformarea altei
molecule de substrat
+ Cantiti mici de enzime sunt capabile s transforme cantiti
mari de substrat
+ Nu modific starea de echilibru, ci viteza cu care se ajunge la
echilibru
+ Catalizeaz n general reacii reversibile
4
II. Caracteristicile specifice catalizei enzimatice, sunt determinate de:
1. Structura proteic
2. Natura biocompuilor transformai
3. Condiiile existente n organismele vii:
Numar mare de transformare (turnover)
CONDIII BLNDE DE REACIE (pH, temperatur, presiune)
Transform substane cu inerie chimic mare
Vitez foarte mare
5
Particularitile catalizei enzimatice:
+ Cataliz microeterogen (i omogen i eterogen): enzimele sunt
compui macromoleculari fixai pe formaiuni subcelulare
+ Eficien extraordinar
+ Grad (foarte) mare de specificitate (menine ordinea n celule)
+ Enzimele catalizeaz numai reaciile care sunt termodinamic posibile
AG < 0
+ Procesele enzimatice sunt procese autoreglate (enzimele catalizeaz
n general reacii care se petrec n lan)
+ mbtrnirea enzimelor (natura proteic)
(n organismele vii au loc permanent procese de degradare i de sintez
proteic)
6
MECANISMUL CATALIZEI ENZIMATICE
EXPLICAIA EFICACITII ACIUNII ENZIMELOR
Enzimele mresc viteza reaciilor chimice
Eficacitatea catalizatorilor, n general i deci i a enzimelor poate fi
explicat aplicnd LEGEA LUI ARRHENIUS:
Accelerarea vitezei unei reacii cu enzime n raport cu viteza unei
reacii fr catalizator poate fi chiar de 10
6
10
17
ori !
=> VITEZA DE REACIE DEVINE ASTFEL APROPIAT DE LIMITA TEORETIC
dlnk
dT
=
Ea
RT
2
n care:
k=constanta de vitez
Ea=energia de activare
T=temperatura (grade Kelvin)
R=constanta gazelor
7
=> Ca i n cazul unor reacii spontane din chimia general
accelerarea vitezei unei reacii chimice are loc prin mai multe modaliti:
1.) Creterea numrului de molecule bogate n energie care s realizeze
ciocnirile eficace dintre molecule DAR, acestea sunt condiii improprii
organismului viu!!
2.) Scderea energiei de activare - n organismul viu
Energia de activare= energia n exces necesar moleculelor dintr-un mol de
substan la o temperatur dat pentru a atinge starea de activare.
Energia de activare reprezint diferena de energie dintre moleculele active
i cele neactive.
8
Enzimele scad energia de activare prin formarea unui complex
intermediar activat enzim-substrat (ES) nalt energetic, cu
reactivitate mare (i cu energie de activare sczut)
Enzimele ajut reactanii s nving bariera energetic nainte ca
reacia s aib loc
Enzimele permit realizarea a numeroase reacii n condiii fiziologice
9
MECANISME CARE INTERVIN I POT EXPLICA FORMAREA
COMPLEXULUI ACTIVAT ENZIM - SUBSTRAT [ES]
=> Efect de PROXIMITATE
(POZIIONARE, APROPIERE, VECINTATE) dintre
centrul activ al enzimei i moleculele care urmeaz a fi
transformate.
=> EFECT DE AEZARE CONFORMAIONAL FAVORABIL
=> EFECT DE CATALIZ COVALENT
Exemplu: formarea unei baze Schiff ntre substrat i unele grupri
funcionale din centrul activ al enzimei.
EFECT DE CATALIZ ACID-BAZ
10
ENZIMELE INDUC ARANJAREA SUBSTRATULUI NTR-O POZIIE RELATIV
FAVORABIL LA GRUPRILE CATALITICE NLESNINDU-LE INTERACIUNILE
(EFECT DE APROPIERE).
Interaciile dintre centrul activ i substrat au loc prin intermediul acelorai
legturi care stabilizeaz i structura proteic, i anume:
interacii hidrofobe, electrostatice, de hidrogen, sau de tip van der Waals.
11
FORMAREA COMPLEXULUI ACTIVAT ENZIM - SUBSTRAT [ES]
Pentru realizarea actului catalitic, enzima E trebuie s se fixeze pe
substratul specific S pentru a forma
COMPLEXUL ENZIM-SUBSTRAT [ES]
O reacie enzimatic parcurge mai multe stadii:
E + S ES ET E + P
Enzimele au eficacitate catalitic deosebit datorit formrii unei
combinaii specific reactive ntre gruprile catalitice i substrat
COMPLEXUL ACTIVAT [ES]
12
Centrul activ al enzimei (galben) cu o conformaie
adaptat la substrat (rou).
13
Formarea complexului enzim-substrat [ES] activat i n starea de
tranziie, i formarea produsului de reacie
14
Exemplul clasic:
Reacia catalizat de CATALAZ
H
2
O
2
+ H
2
O
2
2 H
2
O + O
2
AG < 0
+ Descompunerea H
2
O
2
LA CLDUR: ENERGIA DE ACTIVARE = 18 kcal (76 kJ/mol)
+ Descompunerea H
2
O
2
CU CATALIZATOR MINERAL (Pt):
ENERGIA DE ACTIVARE = 8 kcal (49 kJ/mol)
+ Descompunerea H
2
O
2
CU ENZIMA CATALAZA:
ENERGIA DE ACTIVARE = 2,3 kcal (8 kJ/mol)
Aplicnd legea i ecuaia lui Arrhenius s-au calculat constantele de vitez pentru:
Recia catalizat de PLATIN
Reacia catalizat de CATALAZ
S-A DEMONSTRAT C :
Deci, la 37
O
C CATALAZA DESCOMPUNE PEROXIDUL DE HIDROGEN DE CIRCA UN
MILION DE ORI MAI REPEDE DECT PLATINA
k catalaz
k platin
= 10
6
15
H
2
O
2
+ H
2
O
2
2 H
2
O + O
2
AG < 0
Scderea energiei de activare n reacia de descompunere a peroxidului
de hidrogen, n prezena platinei i a enzimei catalaza
CATALAZA
16
CENTRII ACTIVI AI ENZIMELOR
Centrul activ al enzimei sau centrul catalitic al enzimei reprezint o
parte special structurat a enzimei care fixeaz substratul asupra
cruia acioneaz.
Reprezint regiuni bine determinate de pe suprafaa enzimei.
17
STRUCTURA ENZIMELOR
Cu foarte rare excepii enzimele sunt proteine sau heteroproteine
Excepiile, descoperite n ultimii 20 de ani structur de acizi
ribonucleici
Exemple: Ribonucleaza P Complex protein Acid ribonucleic
DOU MARI CATEGORII DE ENZIME DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL:
I. CU STRUCTUR UNITAR: - PROTEINE SIMPLE - CONSTITUITE NUMAI DIN
AMINOACIZI
II. CU STRUCTUR BINAR: - HETEROPROTEINE PROTEINE CONJUGATE:
PROTEIN + COFACTOR (PARTE NEPROTEIC)
18
I. ENZIMELE CU STRUCTUR UNITAR, PROTEINE SIMPLE
Exemple:
RIBONUCLEAZA (124 RESTURI DE AA) ARE 12.700 DALTONI TRIPSINA
(24.000 DALTONI)
PEPSINA (33.000 DALTONI)
MURAMIDAZA (LIZOZIM) 129 AA
Activitatea acestor enzime depinde numai de structura proteinelor
1 DALTON = 1,661 x 10
-24
grame
19
I. ENZIMELE CU STRUCTUR UNITAR
Centrul activ este reprezentat de un numr mic de aminoacizi.
Exemplu: la chimotripsin centrul activ este format din HISTIDIN i SERIN
OBSERVAIE! Aminoacizii din centrul catalitic al enzimei:
Pot fi la distan din punct de vedere al structurii primare
Dar spaial apropiai din punct de vedere al structurii tridimensionale
Ribonucleaza: centrul activ His + Ser
Colinesteraza: centrul activ Ser
Hexokinaza: centrul activ- gruprile SH ale cisteinei
20
Centrul activ al
chimotripsinei
His + Ser
Centrul catalitic al anhidrazei
carbonice
Zn
2+
+ 3 molecule de His + H
2
O
21
II. ENZIMELE CU STRUCTUR BINAR: HETEROPROTEINE PROTEINE
CONJUGATE:
PROTEIN + COFACTOR (PARTE NEPROTEIC)
Structura binar este indispensabil manifestrii aciunii catalitice
COMPONENTA PROTEIC SE NUMETE APOENZIM
COFACTORUL poate fi:
+ COENZIM (legtura dintre apoenzim i componenta neproteic este
labil, se poate separa prin dializ sau prin alte mijloace de partea
proteic)
+ GRUPARE PROSTETIC (cofactorul se fixeaz pe apoenzim prin
legturi covalente i nu pot fi separate prin dializ)
22
COFACTORII, din punct de vedere chimic pot fi:
VITAMINE
HORMONI
METALE
Coenzimele i gruprile prostetice au structuri chimice, funcii i
mecanisme de aciune diferite.
Unii cofactori sunt considerai cosubstrate
DE EXEMPLU: REACIILE REDOX
+ ROLUL COMPONENTEI PROTEICE:
Confer specificitatea de substrat
Dirijeaz i specificitatea de aciune
+ ROLUL COFACTORULUI:
Particip la realizarea funciei catalitice
Confer specifictatea de reacie (de aciune)
23
II. ENZIMELE CU STRUCTUR BINAR : 2 CENTRI ACTIVI
1. Unul aflat pe fragmentul proteic
2. Altul aflat pe fragmentul neproteic
III. ENZIMELE ALLOSTERICE pot avea i 3 CENTRI ACTIVI
24
Reprezentarea schematic a structurii enzimelor i a centrilor activi:
(a) protein-enzima, cu structur unitar;
(b) heteroproteina, cu structur binar (apoenzima + cofactor)
25
STRUCTURA ENZIMELOR
STRUCTURA APOENZIMEI
STRUCTURA PRIMAR
Se refer la scheletul covalent al lanului polipeptidic i la secvena de
aminoacizi componeni.
Se specific:
numrul de aminoacizi
felul aminoacizilor
succesiunea lor n lan
tipurile de legturi
locul punilor disulfurice (-S-S-)
Structura primar a enzimei
Ribonucleaza A din pancreasul bovin
26
STRUCTURA SECUNDAR
Desemneaz aranjamentul obinuit ntr-o singur dimensiune n spaiu,
prin dispunerea elicoidal a catenei polipeptidice.
Conformaia unic, n zig-zag, este determinat de starea
de hibridizare a atomilor participani la structura lanului
Exist dou tipuri de lanuri:
- o-helix
- |-helix (tip foaie pliat).
Structur secundar de tip -helix (a) i |-helix (tip foaie pliat) (b)
27
STRUCTURA TERIAR
Desemneaz asamblarea n spaiul tridimensional (organizarea spaial)
a lanurilor polipeptidice cu structur primar i secundar bine definite
Determin tipurile de legturi noncovalente stabilite ntre radicalii
aminoacizilor care pot stabiliza conformaia respectiv
Exist dou tipuri diferite de structuri teriare :
1) globular (ghem), Ex: albumina, ribonucleaza, lizozimul
2) fibrilar (fibre), Ex: colagenul
Caracteristicile structurii teriare:
Imprim enzimelor diferite proprieti biologice.
Este stabilizat prin:
- interaciuni electrostatice;
- legturi de hidrogen;
- interaciuni de tip hidrofob;
- puni disulfurice;
- interaciuni ntre radicalii polari ai aminoacizilor. 28
Structura schematic tridimensional a Ribonucleazei A:
(a) tip panglic sau ribbon- ilustreaz structurile de tip o- i |-
helix ale lanurilor polipeptidice, (b) tip bilue sau space filling
ilustreaz atomii din componena lanurilor polipeptidice
29
STRUCTURA CUATERNAR
Protomerii se leag ntre ei prin legturi de tip noncovalent, realizate prin
puncte sau suprafee complementare.
Caracteristic enzimelor de tip allosteric, cu funcii nalt specifice.
Activitatea catalitic a enzimelor depinde de integritatea conformaiei
proteinei native.
Prin denaturare sau disociere n subunitile componente, activitatea sa
catalitic se pierde (de obicei).
Specific protein-enzimelor oligomere, poate rezulta din:
- asocierea unor lanuri polipeptidice cu structur teriar;
- asocierea unor protomeri (dimeri, trimeri, tetrameri, etc)
30
Integritatea structurii primare, secundare, teriare i cuaternare
sunt eseniale pentru activitatea catalitic a enzimelor !
Niveluri de organizare n structura apoenzimei
31
SPECIFICITATEA ENZIMATIC
1. SPECIFICITATEA DE REACIE = capacitatea enzimei de a cataliza un
anumit tip de reacie (sau reacie nrudit) posibil din punct de vedere
termodinamic.
Exemple:
oxidoreductaze
transferaze
- Determinat n special de structura chimic a cofactorului (coenzimei sau a
gruprii prostetice)
Excepii:
Enzimele dependente de piridoxal-fosfat (PLP) sunt enzime care au n
structura lor vitamina B
6
activat, pot cataliza reacii de:
decarboxilare
transaminare
izomerizare
- Mecanismele sunt diferite !
32
2. SPECIFICITATEA DE SUBSTRAT = proprietatea enzimei de a aciona
asupra unei anumite substane sau asupra unui grup de substane
cu unele caracteristici chimice comune.
Determinat de natura apoenzimei (partea proteic a enzimelor).
Asigur ordinea desfurrii reaciilor chimice n celul, mpiedicnd
formarea i degradarea haotic a diferiilor constitueni.
Gradul de specificitate variaz de la o enzim la alta.
Modelul cheie-lact
de reprezentare a
specificitii
enzimatice pentru un
anumit substrat
33
A. Specificitatea absolut de substrat
Exemple: ureaza, fumaraza, arginaza
- acioneaz asupra unui singur substrat cataliznd un singur tip de
reacie chimic.
34
Specificitatea stereochimic
Configuraia spaial a moleculelor substratului.
Specificitatea optic tipuri de specificitate
absolut de substrat
Specificitatea geometric
Capacitatea de a recunoate specific substraturi care conin centrii
asimetrici.
Acioneaz asupra unuia dintre izomerii optici
Exemple: L aminoacid oxidaza, D aminoacid oxidaza, maltaza
fumaraza, enzim ce catalizeaz reacia de hidratare numai pentru
izomerul trans, acidul fumaric
lactat dehidrogenaza (LDH) acid L-lactic
OBSERVAIE: Existena specificitii se poate corela cu necesitile metabolice ale
celulei.
Asimetria structural
este o caracteristic
generala a sistemelor
biologice !
35
B. Specificitatea relativ de substrat
Catalizeaz acelai tip de reacie dar pot aciona asupra mai multor substrate cu
structuri chimice comune.
Exemple:
Peptidazele hidrolizeaz legturile peptidice.
Specificitatea peptidazelor = anumite legturi peptidice la care particip
aminoacizi determinai:
Exemplu: Pepsina hidrolizeaz numai legturile peptidice realizate
ntre un aminoacid dicarboxilic i un aminoacid cu structur aromatic.
Fenoloxidazele - catalizeaz reaciile de oxidare a diferiilor fenoli.
Glucozidazele - hidrolizeaz legturile glucozidice dintre un glucid i un alt
compus (agliconul).
36
LOCALIZAREA ENZIMELOR N ORGANE I ESUTURI
- Repartizarea poate fi neuniform.
- Se cunosc enzime prezente n cvasi-totalitatea esuturilor animale.
Exemple:
enzimele din lanului respirator
enzimele din ciclul Krebs
fosfatazele
Alte enzime nu sunt elaborate dect de ctre anumite celule ale unor organe.
Exemplu:
pepsina
Un caz interesant: existena mai multor izoforme enzimatice -
izoenzime- n organe diferite, n cadrul aceluiai organism.
Exemplu:
La om exist izoenzime ale lactat dehidrogenazei (LDH) n funcie de organ
(esut muscular, hepatic).
37
LOCALIZAREA ENZIMELOR N SISTEMUL DIGESTIV
Glande salivare
-amilaza
Glande fundice ale
stomacului
Pepsina
Intestin subire
Zaharaza
Maltaza
Lactaza
Pancreas
exocrin
-amilaza
Chimotripsina
Tripsina
Lipaza
38
39
LOCALIZAREA INTRACELULAR A
ENZIMELOR
Tehnici moderne de fracionare a
omogenatului celular prin
ultracentrifugare diferenial =>
Repartizarea enzimelor pe
diferite formaiuni subcelulare;
Orientarea reaciilor enzimatice
n funcie de nevoile celulei =>
reglarea metabolismului celular
Diferitele organite subcelulare conin enzime marker specifice
Mitocondriile
Sediul respiraiei celulare i a fosforilrii oxidative, deci
conin enzimele necesare acestui proces
Nucleul
Enzimele necesare biosintezei acizilor nucleici
Exemplu: ADN polimeraza
40
Reticulul endoplasmic rugos (RER)
Asociat cu ribozomii, conine o mare varietate de enzime care
asigur att sinteza de proteine i polizaharide (glicoproteine)
Reticulul endoplasmic neted (REN)
Enzimele necesare oxidrii i detoxifierii compuilor
xenobiotici (medicamente, pesticide)
Lizozomii
Sunt bogai n enzime hidrolitice, de degradare
FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII
ENZIMATICE
1. Temperatura mediului de reacie
2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori
1. TEMPERATURA MEDIULUI DE REACIE
Temperatura mediului de reacie efector fizic
Temperatura poate modifica:
- stabilitatea enzimei;
- afinitatea enzimei pentru substrat;
- viteza de scindare a complexului enzim-substrat [ES];
- afinitatea enzimei pentru diferii activatori i inhibitori: temperatura
influeneaz pozitiv viteza de reacie pn la atingerea unei temperaturi
optime, dup care viteza de reacie scade rapid.
Temperatura optim = temperatura
corespunztoare vitezei maxime de
aciune a enzimei
(aproximativ 40- 50C)
t
10 10
t
V 10
Q Q 2 3
V

+
= =
2. INFLUENA pH-ului MEDIULUI DE REACIE ASUPRA
ACTIVITII ENZIMELOR
pH-ul mediului de reacie = concentraia ionilor de hidrogen
pH-ul optim al unei enzime: pH-ul mediului de reacie pentru care
activitatea enzimei respective ca i viteza de reacie este maxim.
pH-ul optim poate varia n funcie de: - natura substratului,
- concentraia de substrat,
- originea enzimei,
- temperatur, presiune.
Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim de aciune este chiar
pH-ul normal al mediului n care ele i ndeplinesc funcia catalitic.
La majoritatea enzimelor pH-ul optim este n jurul valorii 7
Influena exercitat de pH-ul mediului se datoreaz:
- ionizrii centrilor activi din molecula enzimei;
- ionizrii substratului, modificndu-se astfel activitatea sa pentru centrii activi
ai enzimei
Exemplu amilaza salivar acioneaz numai la nivelul cavitii bucale deoarece
este inhibat de pH-ul acid al stomacului.
Pentru majoritatea
enzimelor, variaia vitezei
de reacie n funcie de
pH are aspectul unei
curbe n form de clopot
(pH = 5,5-8).
Excepii:
pepsina, tripsina, papaina,
arginaza, colinesteraza
FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII ENZIMATICE
1. Temperatura mediului de reacie
2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori
45
INFLUENA CONCENTRAIEI ENZIMEI ASUPRA VITEZEI DE REACIE
Viteza unei reacii enzimatice depinde de concentraia enzimei din mediul de reacie.
v = k [E]
unde k constanta caracteristic pentru fiecare reacie enzimatic
v viteza de reacie
[E] concentraia de enzim
Viteza de reacie este proporional cu concentraia enzimei.
Dar, cu ct concentraia de enzim este mai mare cu att cantitatea de substrat
necesar desfurrii reaciei va fi mai mare.
46
Influena concentraiei de enzim [E] asupra vitezei de reacie:
- n condiii normale (N),
- n cazul reducerii concentraiei de substrat (B),
- n prezena activatorilor (A) sau a inhibitorilor (I) enzimatici n mediul de reacie,
- n prezena unor impuriti (C).
Poriunea din grafic O C = perioad de lag
47
FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII
ENZIMATICE
1. Temperatura mediului de reacie
2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori
48
INFLUENA CONCENTRAIEI SUBSTRATULUI ASUPRA VITEZEI REACIILOR
ENZIMATICE
Ecuaia Michaelis-Menten
Formarea complexului activat enzim - substrat (ES)
Prima teorie privitoare la dependena vitezei
unei reacii enzimatice de concentraia
substratului a fost elaborat n 1913, la Berlin,
de Leonor Michaelis i de Maud Menten.
49
Ipoteza formrii unui complex activat ntre enzim i substrat, notat ES.
E + S ES ET* EP E + P
Schematic, reacia enzimatic se desfoar astfel:
E + S ES E + P
unde se noteaz: [E] = concentraia total a enzimei
[S] = concentraia substratului
[ES] = concentraia complexului activat enzim-substrat
([E]-[ES]) = concentraia enzimei libere
Se consider c reacia global este ireversibil, deci c produsul de reacie nu rmne
legat de enzim.
50
Fiecare din cele trei reacii se caracterizeaz printr-o vitez de reacie,
respectiv printr-o constant de vitez specific:
E + S ES E + P
k
+1 k
+2
k
-1
Se consider prima parte a reaciei, care este reversibil:
E + S ES
k
+1
k
-1
Cele dou viteze de reacie, pentru ambele sensuri, sunt
proporionale cu concentraiile reactanilor:
v
+1
= k
+1
([E] - [ES]) [S]
1 1
v k [ES]

=
La echilibru, cele dou viteze de reacie sunt egale : v
+1
= v
-1
k
+1
([E] - [ES]) [S] = k
-1
[ES]
E + S ES E + P
51
n orice moment al reaciei vitezele de formare i de scindare ale complexului
ES sunt aproximativ egale, aa nct [ES] poate fi considerat constant.
([E] - [ES]) [S]
[ES]
k
-1
k
+1
=
= K
M
unde K
M
a fost denumit iniial constanta Michaelis, fiind de fapt
constanta de disociere a complexului enzim-substrat.
([E] - [ES]) [S] [ES]
= K
M
[E] [S] - [ES] [S] [ES]
= K
M
[ES] [S] [ES]
=
K
M
+
[E] [S]
[ES](
= K
M
+
[E] [S] [S] )
[ES]
=
K
M
+
[E] [S]
[S]
(2)
k
+1
([E] - [ES]) [S] = k
-1
[ES]
Se separ constantele de vitez i rezult:
k
+1
[ES] k
+1
[ES]
52
Se mparte ecuaia cu factorul k
+1
[ES]:
([E] - [ES]) [S]
[ES]
k
-1
k
+1
=
= K
M
([E] - [ES]) [S]
[ES]
k
-1
k
+1
=
= K
M
K
M
(1)
Prelucrma doua parte a reaciei enzimatice:
E + S ES E + P
k
+1 k
+2
k
-1
+2
k
+2 2
[ES] E P v k [ES]
+
+ =
[ES]
k
+2
=
v
+2
(3)
ntr-o reacie enzimatic se urmrete formarea produsului de reacie P, deci
viteza de reacie notat v
+2
poate fi considerat viteza propriu-zis a reaciei
enzimatice notat v, vitez de interes practic.
[ES]
k
+2
=
v
(4)
Se egaleaz relaia (4) cu relaia (2):
k
+2
=
K
M
+
[E] [S]
[S]
v
k
+2
=
K
M
+
[E] [S]
[S]
v (5) (6)
Din relaia (4) rezult:
v = k
+2
[ES]
(7) unde k
+2
= constant catalitic (indic
eficacitatea enzimei)
k
+2
=
V
max
[E] (8)
=
K
M
+
[S]
v
V
max
[S]
Ecuaia Michaelis-
Menten
(9)
53
v V
max
[ES] = [E]
Ecuaia Michaelis-Menten: expresia matematic ce
definete relaia cantitativ dintre viteza unei reacii
enzimatice, concentraia de substrat i valoarea
constantei lui Michaelis K
M
.
Ecuaia permite calcularea K
M
, n funcie de
concentraia substratului.
=
K
M
+
[S]
v
V
max
[S]
Influena concentraiei substratului [S] asupra cineticii reaciilor
enzimatice. Reprezentarea grafic a ecuaiei Michaelis-Menten
saturare
=
K
M
+
[S]
V
max
V
max
[S]
2
2K
M
+ [S] = 2 [S], deci K
M
= [S]
54
=
V
max
2
v
PRELUCRRI ALE ECUAIEI MICHAELIS-MENTEN
E + S ES E + P
k
+1 k
+2
k
-1
Ecuaia Michaelis-Menten se baza pe o ipotez care nu corespunde realitii:
k
-1
>> k
+2
k
+2
= constanta de vitez a reaciei de descompunere a complexului enzim-
substrat, n enzim i produi de reacie (adic n substrat transformat), este
suficient de mic pentru a nu influena mersul reaciei, care este condiionat
exclusiv de k
+1
i k
-1
.
Deci n teoria Michaelis-Menten nu are loc transformarea substratului; se consider
k
+2
ca fiind foarte mic, ceea ce nu corespunde realitii.
n mod real se micoreaz [S] i crete [P] !!
Aceast contradicie aparent a teoriei Michaelis-Menten se poate elucida dac
cinetica reaciilor enzimatice este interpretat inndu-se seama de cinetica strii
staionare.
55
TEORIA BRIGGS I HALDANE. CINETICA STRII STAIONARE
G.E. Briggs i J.B.S. Haldane au analizat ecuaia general a reaciilor enzimatice
i au elaborat n anul 1925 o teorie mai cuprinztoare.
Echilibrul dinamic ntre
concentraiile de
substrat (S), enzim (E),
complex enzim-
substrat (ES) i produs
de reacie (P), n cursul
unei reacii enzimatice.
Concentraia total de
enzim, [E]
T
= [E] + [ES]
56
Faza staionar sau starea staionar poate fi definit ca perioada de timp n care viteza de
formare a produsului reaciei i concentraia tuturor produilor intermediari rmn
constante.
57
concentraie
staionar a
complexului [ES]
La un moment dat, viteza de formare a complexului ES este proporional cu
produsul concentraiei substratului [S] i a enzimei libere ([E]-[ES])
ALTE PRELUCRRI ALE ECUAIEI MICHAELIS-MENTEN
Ecuaia Lineweaver-Brk
Hans Lineweaver i Dean Brk au propus n 1934 inversarea ecuaiei Michaelis-Menten
=
K
M
+
[S]
v
V
max
[S]
=
K
M
+
[S]
v
V
max
[S]
1
(17)
Ecuaia Lineweaver-Brk:
=
K
M
+
[S] v
V
max
1
.
1 1
V
max
Ecuaie de tipul y = ax + b:
y =
1
v
;
x =
1
[S]
unde:
(18)
58
Importana practic a reprezentrii Lineweaver-Brk
Se poate determina experimental viteza de reacie (1/v)
corespunztoare la cel puin trei valori cunoscute ale
concentraiei de substrat (1/[S]).
Dreapta stabilit experimental intersecteaz
axa 1/v n punctual 1/V
max
;
prin prelungirea ei, dreapta intersecteaz
axa abscisei n punctul 1/K
M
,
obinndu-se astfel grafic valoarea K
M
.
Atunci cnd x = 0 i y = 0,
se determin coordonatele la origine.
pentru y = ax + b, atunci cnd y = 0 1/v = 0, ecuaia (18)
devine:
Mult mai exact pentru evaluarea experimental a K
M
!
Atunci cnd x = 0, deci 1/[S] = 0, relaia (18) devine:
=
K
M
+
[S] v
V
max
1
.
1 1
V
max
(18)
=
K
M
[S] V
max
1
-
= =
K
M 1
V
max
[S]
1
1
V
max
V
max
-
1
K
M
=
1
V
max
1
v
59
Semnificaia biochimic a constantei Michaelis-Menten (K
M
)
K
M
este un parametru cinetic, practic i util pentru caracterizarea unei enzime;
- este o caracteristic a fiecrei enzime, independent de concentraia de enzim;
- se exprim n uniti de concentraie de substrat (moli/litru).
Valorile K
M
variaz :
n funcie de structura substratului ;
n funcie de pH-ul mediului de reacie ;
independent de concentraia enzimei.
K
M
este o constant ce poate fi determinat practic din datele experimentale
Pentru o reacie enzimatic simpl, K
M
red capacitatea de disociere a lui ES n E i S.
K
M
red tria legturii ntre E i S.
1/K
M
reprezint n prim aproximaie afinitatea enzimei pentru substratul su.
E + S ES E + P
k
+1 k
+2
k
-1
-1 2
M
1
k k
K
k
+
+
+
=
valori mici ale K
M
, (1/K
M
mare) => afinitate mare a enzimei pentru substrat (10
-5
- 10
-8
mol/L) ;
valori mari ale K
M
(1/K
M
mic) => afinitate mic (legturi slabe ntre E i S) (10
-1
- 10
-2
mol/L).
60
Valorile constantelor Michaelis-Menten pentru unele enzime
Denumirea
enzimei
Codul EC Sursa biologic Substrat K
M
(M)
Alcool
dehidrogenaza
1.1.1.1 Drojdie Etanol
NAD
+
Acetaldehid
NADH
1,3 x 10
-2
7,4 x 10
-5
7,8 x 10
-4
1,0 x 10
-2
Lactat
dehidrogenaza
izoenzima H
4
1.1.1.27 Inim de bou
Bacillus subtilis
Lactat
NAD+
Piruvat
NADH
Lactat
NAD+
Piruvat
NADH
1,7 x 10
-2
1,0 x 10
-4
1,4 x 10
-4
2,4 x 10
-5
3,0 x 10
-2
9,0 x 10
-4
8,0 x 10
-4
6,5 x 10
-5
Aspartat
aminotransferaza
2.6.1.1 Inim de porc L-aspartat
2-oxoglutarat
Oxalacetat
L-glutamat
3,9 x 10
-3
4,3 x 10
-4
8,8 x 10
-5
8,9 x 10
-3
Pepsina 3.4.23.1. Mucoasa
stomacal
porc
Acetil L-
alanildiiodtirozina
Acetil L-fenilalanil-L-
fenilalanin
7,5 x 10
-5
4,3 x 10
-4
61
Pentru multe enzime valoarea K
M
= 10
-2
- 10
-8
M
n cinetica enzimatic se utilizeaz i o alt constant, notat K
cat
care
se definete prin raportul :
max
cat
T
v
K
[E]
=
[E]
T
- concentraia totala de enzim
Constanta catalitic (K
cat
) red numrul de transformri substrat => produs pe
care fiecare centru activ le catalizeaz intr-o unitate de timp (turnover).
Cunoscnd valorile i semnificaiile lui K
M
i K
cat
se poate calcula raportul K
M
/K
cat
,
raport care red eficiena catalitic a enzimei.
Medicamentele
influeneaz
viteza reaciilor
enzimatice i
eficiena
catalitic a
enzimelor
Enzima Substratul K
M
(M) K
cat
(S
-1
) K
cat
/ K
M
Acetil colinesteraza Acetil colin 9,5 x 10
-5
1,4 x 10
4
1,5 x 10
8
Anhidraza carbonic CO
2
1,2 x 10
-2
1,0 x 10
6
8,3 x 10
7
Anhidraza carbonic HCO
3
-
2,6 x 10
-2
4,0 x 10
5
1,5 x 10
7
Catalaz H
2
O
2
2,5 x 10
-2
1,0 x 10
7
4,0 x 10
8
Chimotripsin
Esterul etilic al
N-acetil-glicinei
4,4 x 10
-1
5,1 x 10
-2
1,2 x 10
-1
Fumaraz Fumarat 5,0 x 10
-6
8,0 x 10
2
1,6 x 10
8
Ureaz Uree 2,5 x 10
-2
1,0 x 10
4
4,0 x 10
5
62
FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII ENZIMATICE
1. Temperatura mediului de reacie
2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori
63
EFECTORII ENZIMATICI DEFINIIE
64
Se numesc efectori enzimatici substanele care pot mri sau
micora activitatea catalitic a unei enzime, deci care pot
accelera sau respectiv diminua viteza unei reacii enzimatice.
- activatori
- inhibitori
EFECTORII ENZIMATICI
1. Activatorii enzimatici
substane nespecifice;
natur anorganic sau organic;
capabili s accelereze viteza unei reacii enzimatice.
65
Tipuri de de mecanisme de activare enzimatic
1. Activarea prin aciunea protectoare a unor substane asupra enzimelor
2. Activarea prin favorizarea legturii dintre enzim i substrat
3. Activarea prin favorizarea trecerii unor enzime din starea inactiv (zimogene,
proenzime) n forma catalitic activ
4. Activarea enzimelor cu rol reglator prin adenozin monofosfat ciclic (AMPciclic,
AMPc).
5. Activarea prin control genetic
66
1. Activarea prin aciunea protectoare a unor substane asupra enzimelor:
Exemplu: cisteina i glutationul redus (GSH)
gruprile SH libere = aciune activatoare, protectoare a gruprilor SH eseniale,
situate n centrul activ al unor enzime;
unele vitamine: tocoferoli, filochinone, acid ascorbic protejeaz multe enzime
de aciunea toxic a peroxizilor lipidici care apar uneori n cursul metabolismului.
Tipuri de mecanisme de activare enzimatic
2. Activarea prin favorizarea legturii dintre enzim i substrat.
Unii ioni metalici pot nlesni formarea complexului ES prin diferite mecanisme:
Exemple:
meninerea substratului n centrul catalitic al enzimei: ionii de magneziu (Mg
2+
) n cazul
pirofosfatazei ,favorizeaz legtura dintre enzim i substrat;
ali ioni metalici pot fi chiar cofactori enzimatici:
ATP (adenozin trifosfat) aza, fosfotransferazele, fosfohidrolazele activate de
Mg
2+
;
amilaza (de origine animal) activat de Na
+
i anionul clorur, (Cl
-
);
tirozinaza, ceruloplasmina, citocrom oxidaza activate de Cu
2+
;
alcool dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza, carboxi-peptidaza, anhidraza
carbonic activate de Zn
2+
;
enzimele din procesul coagulrii - activate de Ca
2+
;
citocromii, peroxidaze, catalaza activate de Fe
2+
sau Fe
3+
;
arginaza activat de Mn
2+
;
67
3. Activarea prin favorizarea trecerii unor enzime din starea inactiv (zimogene,
proenzime) n forma catalitic activ.
Mecanismul: hidroliza unor legturi peptidice specifice.
Are loc nlturarea unui inhibitor, i demascarea centrului catalitic.
Exemplu:
Proenzimele inactive (digestive) sunt convertite la enzime active prin proteoliz
limitat (pepsina, chimotripsina, tripsina, enzimele coagulrii sngelui, fibrinolizei)
Tripsinogen
(inactiv)
Enterokinaz
(activator)
Tripsin activ + Inhibitor
68
4. Activarea enzimelor cu rol reglator prin adenozin monofosfat ciclic (AMPciclic, AMPc).
Exemplu:
Protein kinazele, enzime cu rol n fosforilarea unor protein-enzime din interiorul celulei.
Enzime formate din 4 subuniti :
- 2 subuniti catalitice care cuprind situsul activ;
- 2 subuniti reglatoare care au un centru de fixare pentru AMP ciclic
AMPciclic (AMPc) se formeaz din ATP prin activarea enzimei adenilat-ciclaz
O
N
N
N
N
O P
P
O
P
O
O
O
N
N
N
N
P O
NH
2
OH OH
CH
2 HO
O
O
OH HO
OH HO
adenozin trifosfat (ATP)
adenilat ciclaza
EC 4.6.1.1
NH
2
OH
CH
2
O
OH
+
PPi
AMP ciclic
3
'
5
'
69
Enzima (form inactiv) + AMP ciclic
Enzima n form
activ
(subunitatea catalitic)
+ subunitatea
reglatoare
Mecanismul de activare enzimatic a protein kinazei A sub aciunea AMPc
70
EFECTORII ENZIMATICI
2. Inhibitorii enzimatici
Substane care prin prezena lor n mediul de reacie diminueaz sau
anihileaz activitatea enzimelor.
Studiul inhibiiei enzimatice - importan teoretic i practic.
Din punct de vedere:
- biochimic
informaii utile asupra specificitii de substrat a enzimelor;
studiul grupelor funcionale din centrul catalitic al enzimei;
studiul grupelor funcionale ce intervin n meninerea conformaiei active
specifice a enzimei.
- fiziologic - informaii privind mecanismele de reglare a proceselor fiziologice
- farmacologic, patologic i toxicologic, o serie de inhibitori enzimatici sunt
utilizai n toxicologie - ca antidoturi, i n patologie - ca medicamente care s
moduleze unele procese declanatoare de dezechilibre ce produc diverse
maladii.
71
CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE
I. Dup cinetica reaciei enzimatice
Inhibiie reversibil
Inhibiie ireversibil
Competitiv
Necompetitiv
Mixt
(noncompetitiv)
II. Dup mecanismul inhibiiei
Inhibiie prin exces de substrat
Inhibiie prin analogi structurali
ai substratului
Inhibiie prin ageni complexani
Inhibiie prin legare covalent a
inhibitorilor de enzime
Inhibiie alosteric
Inhibiie "feed-back"
(retroinhibiie)
Inhibiie prin control genetic
(represie enzimatic) 72
CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE
I. Dup cinetica reaciei enzimatice
Inhibiie reversibil
Inhibiie ireversibil
Competitiv
Necompetitiv
Mixt
(noncompetitiv)
73
INHIBIIA IREVERSIBIL = INACTIVARE
otrvuri enzimatice sau otrvuri catalitice
Caracteristicile inhibiiei ireversibile:
legare covalent (deci puternic) de centrul catalitic al enzimei.
aciune lent, este necesar un anumit timp de contact dintre inhibitor i
enzim.
Nu este afectat de diluia mediului de reacie i nici de concentraia de
enzim.
inhibiie NESPECIFIC.
Exemple:
toate enzimele care au n centrul catalitic aminoacizi cu gruparea SH vor
fi inhibai ireversibil de anumii inhibitori.
enzimele care au n centrul catalitic serina, deci un aminoacid cu gruparea
OH vor avea ca inhibitori ireversibil ali compui.
74
Enzim - CH
2
-SH + I-CH
2
-C
O
NH
2
Enzim-CH
2
-S-CH
2
-C
O
NH
2
Exemple de inhibitori ireversibili cu proprieti alchilante:
Monoiod-acetamida este un agent inhibitor cu proprieti
alchilante pentru fosfataze.
Alchileaz gruprile SH din structura unor centri activi ai
enzimelor.
75
Diizopropil-fluorofosfat (DFP sau DIFP) - compus organofosforic
(pesticid).
Inhib prin fosforilare enzimele care au n centrul activ serina.
Exemple: acetilcolinesteraza, chimotripsina.
DFP este un toxic nervos : inhib acetilcolinesteraza => blocarea
transmiterii influxului nervos => paralizie.
76
INHIBITORII REVERSIBILI
Caracteristici generale:
n general, prin dializ se poate elimina inhibitorul;
se poate restaura activitatea enzimatic;
este un proces rapid;
nu este o inhibiie specific
exist mai multe modaliti de inhibiie reversibil
competitiv
necompetitiv
noncompetitiv
(denumit i mixt)
E + I EI
k
I
k
I
- constanta de inhibiie
77
- inhibitorul se fixeaz pe acelai centru catalitic al enzimei;
- inhibitorul intr n competiie pentru centrul activ al enzimei;
- presupune o analogie de structur dintre substrat i inhibitor;
- legtura dintre enzim i inhibitor este de aceeai natur cu cea dintre enzim
i substrat;
- inhibitorul competitiv reduce numrul de molecule de enzim care leag
substratul;
- se pot, deci, substitui reciproc n funcie de concentraia lor n mediul de
reacie;
- deci inhibiia competitiv poate fi reversat prin creterea concentraiei
substratului;
- din punct de vedere cinetic V
max
rmne constant, K
M
crete
INHIBIIA COMPETITIV Caracteristici generale
78
MECANISMUL INHIBIIEI COMPETITIVE
Reaciile dintre enzim, substrat i inhibitor n cazul inhibiiei competitive
79
MECANISMUL INHIBIIEI COMPETITIVE
-
1
K
M
V
max
1
1
v
fr inhibitor
i - competitiv
[S]
1
0
-
K
M
1
E + I EI
k
I
[E][I]
[EI]
=
k
I
+
[I]
[S]
=
v
V
max
[S]
1 K
M
+ (
)
k
I
+
[I]
[S]
=
v V
max
1
K
M
+
1
1 1
V
max
(
)
k
I
Ecuaia Lineweaver-Brk va avea forma:
V
max
= constant; 1/V
max
= constant; K
M
crete 80
Exemplu: inhibiia competitiv a succinat dehidrogenazei
INHIBIIA COMPETITIV
COOH
CH
2
CH
2
COOH
COOH
CH
C H
COOH
Succinat
dehidrogenaza
FAD
FADH
2
Acid succinic
Acid fumaric
COO
CH
2
CH
2
CH
2
COO
-
-
CH
2
COO
COO
-
-
COO
COO
-
-
81
INHIBIIA NECOMPETITIV
(UNCOMPETITIVE INHIBITION)
]
K
] I [
[1
i
+
Caracteristici generale:
Formarea complexului activat [ES] are loc normal
Inhibitorul se leag n alt centru catalitic dect substratul
Inhibitorul se combin numai cu complexul [ES], dnd un complex inactiv [ ESI ]
Complexul inactiv [ ESI ] se formeaz urmnd un mecanism secvenial ordonat,
plecnd numai de la complexul [ES].
Complexul [ ESI ] fiind inactiv, are loc inhibarea reaciei enzimatice, nu se mai pot
forma produi finali de reacie.
Din punct de vedere cinetic, fiecare parametru V
max
i K
M
este micorat prin acelai
factor, care depinde de concentraia inhibitorului i constanta reaciei
de inhibiie.
Acest tip de inhibiie se ntlnete n cazul enzimelor
ce catalizeaz reacii ntre dou substrate.
82
MECANISMUL INHIBIIEI NECOMPETITIVE
Reaciile dintre enzim, substrat i inhibitor n cazul inhibiiei necompetitive
83
MECANISMUL INHIBIIEI NECOMPETITIVE
-
1
K
M
V
max
1
1
v
fr inhibitor
i - necompetitiv
[S]
1
0
-
K
M
1
1 +
[I]
K
I
( )
Ecuaia Michaelis-Menten devine :
+
[I]
1
(
)
k
I
+
[I]
1
(
)
k
I
[S]
= v
V
max

K
M
+
[S] .
V
max
i K
M
- micorai prin acelai factor
]
K
] I [
[1
i
+
ES + I ESI
k
I
84
Exemplu:
Acetazolamida diuretic foarte utilizat, acioneaz inhibnd necompetitiv
enzima anhidraza carbonic la nivelul rinichiul
Exemplu: enzimele care necesit ioni metalici pentru activitatea lor vor fi
inhibate necompetitiv de ageni capabili s lege ionul metalic respectiv
EDTA
(etilendiamino
tetracetic)
Agent de chelare care leag reversibil Mg
2+
85
CO
2
H
+
+ H
2
O
HCO
3
-
+
anhidraza
carbonic
INHIBIIA MIXT (denumit i NONCOMPETITIV)
(NONCOMPETITIVE INHIBITION)
Caracteristici generale:
Inhibitorul se poate lega de enzim direct, simultan cu legarea
substratului, dar se poate lega i cu complexul activat ES
Inhibitorul se leag n alt centru activ dect substratul (deci se poate lega
de enzim simultan cu substratul)
Aciunea inhibitorului nu poate fi reversibil prin creterea concentraiei
substratului
Din punct de vedere cinetic: scade v
max
i K
M
rmne relativ aceeai
E
ES
EI
+S
+I
ESI E + P
86
MECANISMUL INHIBIIEI NONCOMPETITIVE
Reaciile dintre enzim, substrat i un inhibitor noncompetitiv
87
MECANISMUL INHIBIIEI NONCOMPETITIVE
Ecuaia Michaelis-Menten devine:
+
[I]
1
(
)
k
I
[S]
= v
V
max

K
M
+
[S] .
-
1
K
M
V
max
1
1
v
fr inhibitor
i - noncompetitiv
[S]
1
0
1 +
[I]
K
I
K
M
V
max
1 +
[I]
K
I
( )
( )
-
K
M
'
1
Exemplu: ionii unor metale grele:
Cu
2+
, Hg
2+
, Ag
2+
i derivaii lor,
inhib unele enzime care au
grupri SH n centrul activ.
Scade v
max
i K
M
rmne relativ acelai
88
CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE
II. Dup mecanismul inhibiiei Inhibiie prin exces de substrat
Inhibiie prin analogi structurali ai substratului
Inhibiie prin ageni complexani
Inhibiie prin legare covalent a inhibitorilor de enzime
Inhibiie allosteric
Inhibiie "feed-back" (retroinhibiie)
Inhibiie prin control genetic (represie enzimatic)
89
Inhibiia prin exces de substrat
Cnd n mediul de reacie concentraia substratului este foarte mare,
n afar de complexul activat ES, se formeaz i complexul ESS inactiv sau
mai puin activ.
Efectul inhibitor al substratului este cu att mai pronunat cu ct
concentraia acestuia este mai mare
Viteza de
reactie
[S]
E + S ES E + P
+ S
ESS
ES + S
90
La concentraii mari de substrat, se
depete capacitatea catalitic a
enzimei i are loc un efect invers, de
ncetinire a vitezei de reacie.
CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE
II. Dup mecanismul inhibiiei
Inhibiie prin exces de substrat
Inhibiie prin analogi structurali ai substratului
Inhibiie prin ageni complexani
Inhibiie prin legare covalent a inhibitorilor de enzime
Inhibiie alosteric
Inhibiie "feed-back" (retroinhibiie)
Inhibiie prin control genetic (represie enzimatic)
91
Inhibiia prin analogi structurali ai substratului
Inhibitorii de tip competitiv
ai succinat dehidrogenazei
(malonat, oxalat, glutarat)
Acidul fluorocitric inhibitor al aconitazei
COOH
CH
2
CH
2
COOH
CH
2
COOH
COOH
COOH
COOH
Exemple:
COOH
COOH
CH
2
C
CH
2
HO COOH
COOH
COOH
CH
C
CH
2
HO COOH
acid citric
F
acid fluorocitric
92
CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE
II. Dup mecanismul inhibiiei
Inhibiie prin exces de substrat
Inhibiie prin analogi structurali ai substratului
Inhibiie prin ageni complexani
Inhibiie prin legare covalent a inhibitorilor de enzime
Inhibiie allosteric
Inhibiie "feed-back" (retroinhibiie)
Inhibiie prin control genetic (represie enzimatic)
93
Inhibiia prin ageni complexani
Inhibitorii complexani = substane chimice capabile de a complexa metalul din structura
unor enzime (la unele metal-enzime, metalul se afl n centrul activ al enzimei).
Exemple:
Ionul cianur pentru numeroase metalenzime:
succinat-dehidrogenaza (Fe
2+
)
citocromi (Fe
2+
)
citocromoxiaza (Fe
2+
, Cu
2+
)
Monoxidul de carbon fixeaz fierul din citocromoxidaz
Fluorurile inhib enzimele cu calciu i magneziu
EDTA (etilendiamino-tetracetat) poate complexa Mg
2+
din structura a numeroase enzime
(ATP-aza, pirofosfataza).
94
Inhibiia prin legarea covalent a inhibitorilor cu enzimele
Este un tip ireversibil de inhibiie
Sunt compui care blocheaz gruprile funcionale de la nivelul centrului
activ al enzimei
Exemple:
-Agenii alchilani care blocheaz gruprile SH ale cisteinei din centrul activ
al unor enzime (ex: monoiodacetat)
- Compui care esterific gruprile OH ale serinei din centrul activ al
acetilcolinesterazei (ex: diizopropilfluorofosfatul-DIFP)
- Substanele care pot acetila gruprile NH
2
ale lizinei din structura
enzimelor (ex: acidul acetilsalicilic acetileaz unele grupri NH
2
din centrul
activ al ciclooxigenazei enzim din metabolismul acidului arahidonic)
95
INHIBIIA ALLOSTERIC
Efectorii allosterici
Acioneaz asupra conformaiei spaiale a enzimelor de tip allosteric
ENZIME ALLOSTERICE
Termenul de allosteriam desemneaz proprietatea caracteristic a unor
enzime de a funciona prin variaii (allo) ale conformaiei tridimensionale (steriam).
Caracteristici structurale
Sunt proteine complexe cu rol reglator n reaciile metabolice
Sunt formate din subuniti monomere identice (protomeri)
Structura cuaternar reprezint asocierea simetric a protomerilor componeni
Sunt enzime care se pot combina cu mai multe substrate, avnd mai muli centri
activi
Enzimele allosterice pot adopta n mod reversibil mai multe stri conformaionale
distincte care difer prin:
- Numr de protomeri
- Distribuia protomerilor
- Afinitatea protomerilor pentru efectorii stereospecifici
96
Enzimele allosterice au mai multe situsuri de legare (cel puin 3 situsuri catalitice)
- un situs de tip catalitic care realizeaz transformarea propriu-zis a
substratului, i care se afl situat pe subunitatea catalitic a enzimei;
- mai multe situs-uri allosterice de care se pot lega efectorii enzimatici
(activatori sau inhibitori), situai pe subunitatea reglatoare a enzimei.
ntre situsul catalitic i cel allosteric exist anumite interacii (efect cooperant).
Legarea inhibitorului allosteric la situsul allosteric induce modificarea tridimensional
a moleculei proteinei enzimatice
Centrul activ catalitic al enzimei devine inapt pentru a fixa substratul
97
Reprezentarea
schematic a
inhibiiei
allosterice
Enzimele allosterice manifest o comportare cinetic diferit de cea
postulat n teoria Michaelis Menten.
Aspectul sigmoid este atribuit
structurii cu mai muli
protomeri, a existenei mai
multor situsuri de legare
pentru fiecare molecul de
enzim ntre care se manifest
efecte de cooperare.
98
Legarea primei molecule de substrat de un protomer, va induce modificri
conformaionale a protomerului vecin pentru a-l face apt s lege urmtoarea
molecul de substrat (efect cooperant). Procesul decurge pn cnd se leag
toate moleculele de substrat
LEGAREA SECVENIAL, REVERSIBIL, A SUBSTRATULUI N MODELUL
ENZIMELOR ALLOSTERICE
Mecanismul de aciune al unor
medicamente are la baz efectul
allosteric asupra unor enzime
99
Exemplu de enzime allosterice:
Protein kinazele de tip A, C, G care transfer grupri fosfat de la molecula
de ATP la gruprile OH ale unor aminoacizi specifici din structura
anumitor proteine (serin, treonin, tirozin), cataliznd astfel reacii de
fosforilare a unor enzime
O
N
N
N
N
O P
P
O
P
O
OH
O P
OH
OH
O
NH
2
OH OH
CH
2 HO
O
O
OH HO
OH HO
adenozin trifosfat (ATP)
Rest de serin, treonin
sau tirozin din structura
proteic a unei enzime
+
Protein
kinaze
+
ADP
Protein-enzim
fosforilat
100
Deci rezult ca produs de reacie protein-enzime n stare fosforilat, care pot
reprezenta formele active ale acestor enzime, care intervin n numeroase
procese energetice, de cretere i difereniere celular.
Modul de aciune al protein kinazei A i
al reglrii sale allosterice de ctre AMPc
(mesager secundar intracelular)
Enzima
101
Inhibiia de tip feed-back (retroinhibiia)
A B C D E F
E
1
E
2
E
3
E
4
E
5
-
Reprezint un caz special de inhibiie allosteric
Const n inhibiia activitii primei enzime de ctre produsul final al
lanului metabolic din care face parte:
Acumularea excesiv de produs final F n celule, determin printr-un
mecanism allosteric, inhibiia enzimei E
1
care catalizeaz transformarea
substanei A n substana B.
Exemplu: Hemul acumulat (n procesul de biosintez a hemoglobinei) i
poate inhiba propria biosintez.
102
Aceste mecanisme sunt importante n reglarea metabolismului
intermediar celular (enzima E
1
se numete enzim reglatoare de proces).
Se permite astfel meninerea unui echilibru dinamic ntre produii de
catabolism i procesele de biosintez.
Aceasta dovedete o bun strategie din partea celulei
Are loc reglarea unei ci metabolice la nivelul primei etape, economisind
la maxim metaboliii
103
Importana inhibiiei de tip feed-back
Inducie i inhibiie enzimatic prin control genetic
1961, F. Jacob i J. Monod
104
Enzimele pot fi prezente n celul
n cantiti aproximativ constante
= exprimare constitutiv
(enzimele lanului respirator
mitocondrial)
Anumite enzime pot fi prezente n
mod obinuit sub forma unei
exprimri mai slabe (sau chiar s
nu fie deloc exprimate) dar a cror
biosintez s creasc semnificativ
(chiar de mii de ori) n anumite
condiii, n special atunci cnd
substratul lor este prezent n exces
= enzime inductibile.
Mecanismul inhibiiei prin produs final
105
Unele medicamente pot induce biosinteza de enzime necesare propriei lor
metabolizri => Importan farmacologic i toxicologic- st la baza fenomenului
de obinui la medicamente i a toxicomaniei.
Inducia enzimatic st i la baza fenomenului de rezisten la medicamente.
Ca rspuns la lezrile celulare cauzate de expunerea la compui xenobiotici
(medicamente, compui toxici poluani), celulele elaboreaz mecanisme de aprare
adaptativ ce includ, ntre altele, i inducia unor gene specifice care codific n
special biosinteza unor enzime de biotransformare.
Inhibiie i inducie enzimatic prin control genetic Importan practic
106
Medicamente
inhibitori enzimatici
107
Inhibiia enzimatic este implicat i n explicarea
mecanismelor biochimice de aciune ale unor medicamente la
nivel molecular, celular, n esuturile int.
Medicamente inhibitori enzimatici
108
Clasificarea medicamentelor inhibitori enzimatici
Medicaia antihipertensiv (anti-HTA)
- inhibitori ai enzimei de conversie .............................captopril, enalapril, perindopril
Medicaia antiinflamatoare
-inhibitori ai fosfolipazei A
2
.........................antiinflamatoare steroidiene, AIS
-inhibitori ai ciclooxigenazelor (I i II) .......... antiinflamatoare nesteroidiene, AINS
Medicaia antiastmatic
-inhibitori de lipooxigenaz
Medicaia hipocolesterolemiant
-inhibitori ai HMG-CoA reductazei ...............statinele
Medicaia antigutoas
-inhibitori ai xantinoxidazei ................................................alopurinol
Medicaia bacteriostatic. Sulfamidele bacteriostatice
-inhibitori ai enzimei de sintez a acidului folic .................sulfamidele antibacteriene
Medicaia anticanceroas
- inhibitori de replicaz ......................................6-mercaptopurina
- inhibitori de timidilat sintetaz .........................5-fluorouracil
- inhibitori de dihidrofolatreductaz ....................metotrexat
- inhibitori de amidotransferaz...........................azaserina
- inhibitori ai ADN-topoizomerazelor (I i II)......... etoposid
109
Clasificarea medicamentelor inhibitori enzimatici
Medicaia antiviral
Anti-HIV
-inhibitori ai revers transcriptazei .......................azidotimidin (AZT)
-inhibitori ai proteazei .........................................amprenavir
- inhibitori ai integrazei ........................................zintevir
Antivirale n general
- inhibitori ai proteinkinazei virale..........................................maribavir.
- inhibitori ai ADN-polimerazei virusului herpetic ..........aciclovir (zovirax)
-inhibitori ai neuraminidazei virusului gripal............oseltamivir, zanamivir
Medicaia anti-Parkinson
- inhibitori ai DOPA-decarboxilazei........................................carbidopa
- inhibitori ai monoaminoxidazei izoforma B.......................selegilina
-inhibitori ai catecol-O-metiltransferazei (COMT) ................tolcapon
Medicaia diuretic
- inhibitori ai anhidrazei carbonice ............................acetazolamida
110
Medicaia antihipertensiv
Inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei
(Angiotensin Converting Enzyme ACE)
ACE catalizeaz reacia
de transformare a angiotensinei I
(decapeptid) n angiotensin II (octapeptid).
N
HS
CH
3
O
O
OH
captopril
N
N
H
NH
2
O OH
O
OH
O
lisinopril
Hipertensiunea arterial (HTA):
Tensiunea arteriala sistolica > 140mmHg i/sau
Tensiunea diastolica > 90mmHg.
111
Inhibitori
ACE
112
Medicaia antiinflamatoare
Principalii factori biologici endogeni
proinflamatori sunt prostaglandinele,
prostaciclinele, tromboxanii,
leukotrienele, biomolecule care fac
parte din categoria eicosanoizilor
derivai din acidul arahidonic.
Semnele clinice ale inflamaiei: calor,
tumor, dolor, rubor, functio laesa.
Inhibitori ai enzimelor care intervin n
formarea factorilor proinflamatori.
113
114
O
O
Acizi grasi eseniali
fosfolipide membranare
COOH
LEUCOTRIENE
Acid 5,8,11,14
eicosatetraenoic
(substrat fals)
COX 1 i COX 2
PGG
2
COOH
OH
PGH
2
izomeraze
reductaze
izomeraze
PGE
2
PGF
PGD
2
PGE-Metabolit
PGF-Metabolit
PGD-Metabolit
prostaciclin-sintaza
PGI
2
hidroliza
PGF
1o
2o
| oxidare
PGF
1o
metaboliti urinari
Stimuli
Fizici, chimici,biologici
- -
Lipooxigenaza
Tromboxan-sintaza
TXA
2
TXB
2
Fosfolipaza A
2
1. Inhibitori ai fosfolipazei A
2.
Fosfolipaza A
2
: eliberarea, din fosfolipidele membranare, a acidului arahidonic
care este substrat pentru formarea compuilor proinflamatori.
Medicamente cu structur corticosteroidic (antiinflamatoare steroidiene, AIS),
foarte eficiente dar cu numeroase efecte adverse.
Medicamente utilizate n afeciuni inflamatorii severe: poliartrit reumatoid,
reumatism poliarticular acut, artrita acut gutoas, etc.
2. Inhibitori ai ciclooxigenazelor (I i II) din cascada acidului arahidonic.
Compui cu structuri diverse non-steroidice (antiinflamatoare nesteroidiene, AINS).
Ciclooxigenaza = enzim ce determin apariia unor substane pro-inflamatoare. 2
izoforme: COX-1, enzim constitutiv i COX-2, enzim inductibil n timpul inflamaiei
(accentueaz rspunsul inflamator).
=> dou categorii de AINS:
- inhibitori COX neselectivi (denumite AINS clasice), medicamente ce inhib att COX-
1, ct i COX-2: acidul acetilsalicilic, diclofenac, indometacin,ibuprofen, piroxicam, etc.
- inhibitori selectivi COX-2: celecoxib, rofecoxib, parecoxib, etc.
N
N
CH
3
SO
2
NH
2
F
3
C
celecoxib
115
Mecanismul prezumtiv de aciune al acidului
acetilsalicilic, inhibitor COX neselectiv
116
Medicaia antiastmatic
Astmul bronic este o afeciune
inflamatorie a cilor respiratorii, cu
caracter cronic, care se manifest
clinic, periodic, prin crize de dispnee
expiratorie, cu senzaie de sufocare.
Medicamente care reduc
intensitatea i frecvena crizelor de
astm bronic: inhibitorii selectivi ai
enzimei 5-lipoxigenaz - zileuton
ce catalizeaz biosinteza leucotrienelor
(LT) bronhoconstrictoare, din acid
arahidonic.
Inhibarea formrii leucotrienelor
conduce la bronhodilataie, efect
antiastmatic selectiv.
S
CH-N-C-NH
2
O OH
CH
3
zileuton
117
Hipocolesterolemiante.
Statinele
- Statinele = compui ce inhib competitiv enzima
3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductaza
(HMG-CoA reductaza), care intervine n biosinteza
colesterolului cataliznd transformarea HMG-CoA n acid
mevalonic.
- Principalii compuii inhibitori ai HMG-CoA reductazei
aprobai pentru utilizare terapeutic sunt statinele:
atorvastatina,
fluvastatina,
lovastatina,
simvastatina,
rosuvastatina
O
O H
3
C
CH
3
O
O
HO
CH
3
H
H
3
C
H
3
C
simvastatin
O
O H
3
C
CH
3
O
O
HO
CH
3
H
H
3
C
lovastatin
118
Medicaia antigutoas
Guta este o maladie cronic,
determinat de dezechilibrul
ntre formarea acidului uric i
eliminarea sa.
Medicamentele uricoinhibitorii micoreaz concentraia seric a
acidului uric prin inhibarea biosintezei acestuia.
Alopurinolul = analog structural al hipoxantinei (precursor n
biosinteza acidului uric), ce inhib xantinoxidaza, enzim ce
catalizeaz principale etape din catabolismul nucleotidelor purinice.
N
N
N
N
O
N
N
N
O
N O
N
N
O
N O
O
N
N
N
O
N
N
H
H
hipoxantina
xantin-oxidaza
H
H
H
xantina
xantin-oxidaza
H
H
H
H
acid uric
GUTA
acumulare
H
H
alopurinol
2 mecanisme:
competitiv
ca analog structural;
necompetitiv
prin intermediul
aloxantinei, metabolit
activ al alopurinolului.
119
Medicaia bacteriostatic.
Sulfamidele bacteriostatice
Sulfamidele = antagoniti structurali ai acidului p-aminobenzoic
Medicamente care inhib enzimele care intervin n sinteza acidului folic, n
mod special dihidropteroat sintetaza, enzima ce catalizeaz ncorporarea
acidului p-aminobenzoic n acid dihidropteroic, precursor al acidului folic.
=> efect antimicrobian
NH
2
SO
2
NH
2
sulfanilamida
NH
2
COOH
acidul para-amino-benzoic
120
Medicaia
anticanceroas
Anticanceroasele (citostaticele) sunt
substane capabile s reduc volumul
tumorilor, s amelioreze starea clinic, s
prelungeasc supravieuirea sau s induc
vindecarea n afeciunile canceroase.
Analogii structurali ai bazelor azotate purinice sau pirimidinice, medicamente ce
blocheaz activitatea enzimelor ce intervin n biosinteza acizilor nucleici, deci biosinteza
proteic n celulele tumorale. Astfel, prin acest mecanism se oprete creterea tumoral
(aciune antineoplazic).
1. Inhibitori ai enzimei
dihidrofolatreductaza:
medicamentele analogi
structurali cu acidul folic
(coenzim n reacii de metilare
i factor de cretere celular).
N
N N
N
O
NH
2
H
2
N
CH
2
-N
CH
3
10
C - NH - CH
CH
2
COOH
CH
2
COOH
metotrexatul
metotrexatul = antimetabolit al acidului folic
121
2. Inhibitori ai replicazei din biosinteza ADN.
medicamentele analogi structurali ai bazelor azotate purinice: 6-mercaptopurina,
6-tioguanina, cladribina, pentostatin, azouridina, bromodeoxiuridina, etc.
N
N
N
N
H
SH
mercaptopurina
N
N
N
N
H
SH
H
2
N
tioguanina
O
N H
N
O
O
HO
HO-CH
2
OH
azouridina
O
N H
N
O
O
Br
HO
HO-CH
2
bromodeoxiuridina
3. Inhibitori ai timidilat-sintetazei din
biosinteza ADN.
medicamentele analogi structurali ai
bazelor azotate pirimidinice:
5-fluorouracil,
floxuridina,
3azido-2,3-dideoxi timidina (denumit
zidovudin, azidotimidin sau AZT), etc.
N
N
N
O
N H
N O
O
CH
3
HOH
2
C
+
-
3'-azido-2',3'-dideoxi timidina
(AZT)
3
'
2
'
122
4. Inhibitori ai amidotransferazei, enzim care intervine
n biosinteza nucleotidelor purinice.
Azaserina - medicament analog structural al glutaminei
O
N
COOH
HC - NH
2
CH
2
CH
2
O
C
N Cl
-
+
azaserina
5. Inhibitori ai ADN-topoizomerazelor (I i II), enzime
responsabile de clivarea i refacerea lanurilor de ADN,
medicamente:
etoposid, teniposid medicamente ce formeaz un complex
cuaternar cu topoizomeraza II, producnd rupturi ireversibile la
nivelul ADN-ului dublu catenar;
topotecan, irinotecan medicamente ce formeaz un
complex cuaternar cu topoizomeraza I.
O
O
O
O O
O
O O
O
CH
3
H
3
C
OH
O
OH
HO
H
3
C
H
etoposid
N
N
O
HO
O
OH
H
3
C-H
2
C
O
CH
2
-N
CH
3
CH
3
topotecan
123
Medicaia antiviral
Substane biologic active care intervin
n sistemele enzimatice implicate n
multiplicarea viral.
1. inhibitori ai revers transcriptazei virusului imunodeficienei umane (HIV): azidotimidin
(AZT), abacavir, didanozin, lamivudin, etc. Aceste medicamente sunt analogi structurali ai
bazelor pirimidinice din structura ADN.
2. inhibitori ai integrazei HIV: zintevir.
3. inhibitori ai proteazei HIV: amprenavir, atazanavir, ritonavir, nelfinavir.
4. inhibitori ai proteinkinazei virale: maribavir.
5. inhibitori ai ADN-polimerazei virusului herpetic: aciclovir (zovitax), penciclovir, ganciclovir.
6. inhibitori ai neuraminidazei virusului gripal: oseltamivir, zanamivir.
N H
N
N
N
O
H
2
N
CH
2
O-CH
2
-CH
2
-OH
9-[(2-hidroxietoxi) metil] guanina
aciclovir (zovirax)
O
N
N H
O
O
N
N H
O
O
O
N H
N
N
N
O
CH
3
H
2
N
stavudina
zalcitabina (ddc)
HO-H
2
C
HO-H
2
C
HO-H
2
C
didanozina (ddi)
124
Medicaia anti-Parkinson
LEVODOPA = precursorul metabolic fiziologic al dopaminei, fiind
folosit ca medicaie de substituie n parkinsonism.
Reacia este catalizat de DOPA-decarboxilaz i are loc la
nivel periferic dar i la nivel central.
Asociat cu LEVODOPA, se administraz:
1. Inhibitori ai dioxifenilalanin (DOPA)-decarboxilazei
benserazida i carbidopa (inhib decarboxilarea L-DOPA n
periferie fr a o modifica la nivel central)
Sindromul Parkinson se caracterizeaz, n
principal, prin scderea concentraiei
neuronale a neuromediatorului
dopamin
N
N
OH
HO
HO
H
H
O
NH
2
OH
benserazid
N H
CH
3
OH
HO
HO
O
NH
2
carbidopa
OH
CH
2
CH
COOH
OH
N H
2
CO
2
OH
CH
2
OH
CH
2
-NH
2
Dopamin
L - DOPA
DOPA- Decarboxilaza
125
2. Inhibitori ai monoaminoxidazei izoforma B (MAO-B): selegilina =
inhibitor selectiv i ireversibil al enzimei MAO-B, enzim ce metabolizeaz
dopamina;
3. Inhibitori ai catecol-O-metiltransferazei (COMT) - tolcapon, entacapon =
inhibitori selectivi i reversibili ai COMT, enzim ce metabolizeaz, de asemenea,
dopamina.
N
CH
CH
3
CH
3
selegilina
126
NOMENCLATURA I CLASIFICAREA
ENZIMELOR
127
Istoric privind nomenclatura enzimelor
I ETAP : denumiri vechi - nu au terminaia az
Pepsina, tripsina, chimotripsina
Ptialina din saliv (amilaza)
Emulsina din intestin (lipaza)
n general sunt hidrolaze, enzime cu rol n digestie.
De exemplu: amilaza are ca denumirea tiinific sistematic -1,4-glucan-
4-glucan hidrolaza, iar amilaza: -1,4-glucan-malto-hidrolaza.
II ETAP: se introduce terminaia -aza, la denumirea substratelor care se
transform.
De exemplu: ureaza, amilaza, arginaza, fumaraza, tirozinaza, hexokinaza,
lipaza, etc.
Aceste denumiri nu explic tipul de reacie care are loc.
128
lll ETAP: Apar denumiri de enzime care cuprind:
- denumirea substratului
- tipul de reacie
- terminaia aza
Exemplu : Succinat dehidrogenaza (SDH)
Lactat dehidrogenaza (LDH)
Malat dehidrogenaza (MDH)
Piruvat decarboxilaza
Piruvat carboxilaza
Precizeaz tipul reaciei dar sunt incomplete.
Sunt denumiri convenionale.
Denumiri de lucru
Se precizeaz donorul de hidrogen (exemplu: succinat), dar nu se precizez acceptorul de
H.
129
IV ETAP: n 1957-1961 Uniunea Internaional de Biochimie (din cadrul IUPAC), Comisia
de Enzimologie (EC) a elaborat o nomenclatur sistematic precum i o clasificare a
enzimelor bazat pe tipul de reacie chimic catalizat de o anumit enzim.
Aceast abordare a fost determinat de creterea continu a numrului de enzime
izolate i caracterizate din punct de vedere structural i al mecanismului de aciune.
Deci din 1961 enzimele sunt grupate in 6 clase, fiecare enzim avnd numere de cod
(denumire ,,EC") = DENUMIRE SISTEMATIC
Conform recomandrilor acestei Comisiei de Enzimologie (EC), denumirea unei
enzime trebuie s cuprind detalii privind:
-numele substratului asupra cruia acioneaz enzima (cu evidenierea
donorului i a acceptorului de electroni, de hidrogen, sau de grupri funcionale,
etc);
-numele tipului de reacie catalizat;
-sufixul az.
Deci numrul de cod al fiecrei enzime (EC) este alctuit din 4 numere:
- primul numr : codul pentru clasa de enzime (16)
- al doilea numr : codul pentru subclas (substratul donor de grupri) (199)
- al treilea numr: codul pentru sub subclas (acceptorul acelei grupri 199)
-al patrulea numr : locul individual al enzimei.
Acest tip de nomenclatur este deosebit de precis, descriptiv i
informativ, permind introducerea de enzime nou descoperite.
130
CLASIFICAREA ENZIMELOR CONFORM COMISIEI DE ENZIMOLOGIE (EC)
EC : 1 Oxidoreductaze
Reacii de transfer de electroni sau de electroni i de protoni (deci de hidrogen) termen
mai general echivaleni reductori.
EC : 2 Transferaze
Reacii de transfer a unei grupri funcionale de pe un donor pe un acceptor.
EC : 3 Hidrolaze
Reacii de hidroliz a biomoleculelor, adic reacii de fixare a moleculei de ap pe o legtur
specific substratului care se scindeaz. Determin ruperea unei legturi cu ajutorul unei
molecule de ap.
EC : 4 Liaze
Reacii de rupere a unei legturi carbon-carbon, carbon-azot, carbon-oxigen etc.
EC : 5 Izomeraze
Reacii de izomerizare, epimerizare, racemizare, conversie cis-trans, adic, altfel spus, reacii
de tranfer de grupri n interiorul aceleiai molecule.
EC : 6 Ligaze
Reacii de formare a unor legturi carbon-carbon, carbon-azot, carbon-oxigen, etc. Sunt
reacii consumatoare de energie (de molecule ATP sau de alt nucleotid cu legturi
macroergice).
131