Practica N3: TINCION GRAM

I. INTRODUCCIN

La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gramm en 1884, es una de las
tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos
bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. El mtodo se
fundamenta en el hecho de que el colorante primario (cristal violeta) tie por igual a todas
las bacterias, pero la combinacin con el colorante es ms permanente en los gram
positivos.
Para establecer la diferenciacin en estoados grupos, se aplica un disolvente del
colorante primario que no tiene efecto sobe el grupo de microorganismos que lo retienen
firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo
tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy difcil su
observacin por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la
safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que haban retenido
el color primario, pero tie a los microorganismos decolorados.
Estas diferencias de tincin de las bacterias se explican por cambios en la composicin
qumica y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retencin o eliminacin del
colorante primario despus del proceso de decoloracin.
Otras tinciones que permiten obtener mayor informacin son la negativa y la selectiva. La
tincin negativa facilita las observaciones de la morfologa y tamao de las bacterias sin
alteracin por efecto del calor as como de estructuras especiales, como la cpsula de
algunas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicoclix es una estructura
externa a la clula, formada de polisacridos o polipptidos, que confiere proteccin a las
bacterias contra ala desecacin y la fagocitosis.
La extensin sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias
con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales
como son las cpsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la clula bacteriana
en un fondo oscuro.
Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las
endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y
localizacin son importantes criterios de clasificacin taxonmico.
II. OBJETTVOS

Recordar el manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias
(importancia del objetivo de inmersin)
Utilizar la tcnica de tincin diferencial con el colorante cristal violeta y safranina

Observar las diferentes formas de la estructura microbiolgica, obtenidas en el en
aislamiento de microorganismos.

Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer
comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariota


III. MARCO TEORICO

3.1 FUNDAMENTO
La tcnica se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptdoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmdtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y
ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidogIicano
(tambin conocido como murena)

Por el contrario, la capa de pepdoglucano de las Gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exteror (de composicin distintq a
Ia interna) por medio de lipoprotenas.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por
lipoprotenas. La membrana exterior esta hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacdrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere
su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la
membrana externa de las
Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para
poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto
este complejo se escapa, perdindose Ia coloracin
azul-violcea. Pero por el contrario, Ias Gram positivas, al poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del
solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide
que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-
violeta.

3.2 TINCION
Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los microorganismos y
poder realizar la observacin en microscopio ptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual
se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algn tratamiento
previo.
De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:
Tincin simple:
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular.


a) Tincin diferencial:
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas bacterianas o entre
partes de una misma clula. Estas tcnicas utilizan ms de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tincin.
Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen, etc.

3.3 Tincin diferencial de Gram:
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la
desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada
durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol
etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min.
Lavar y secar.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula
bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis
osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms
delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared
de la clula gram-negativa es peptidoglicano.


Figura N1 : Pared celular Gram
+
Figura N2 : Pared celular Gram
-

3.4 MATERIALES Y METODOS

3.4.1 MATERIALES

Mechero Bunsen: El quemador tiene una base pesada en la que se introduce el
suministro de gas. De all parte un tubo vertical por el que el gas fluye atravesando
un pequeo agujero en el fondo de tubo, donde se produce la combustin

Pinzas: Una pinza o pinzas es una mquina-herramienta simple cuyos extremos
se aproximan para sujetar algo. Funciona con el mecanismo de palancas simples,
que pueden ser accionadas manualmente o con mecanismos hidrulicos,
neumticos o elctricos. Existen pinzas para diferentes usos: corte, sujecin,
prensa o de presin.

Portaobjetos: Un portaobjetos es una fina placa de cristal sobre el cual se
disponen objetos para su examen microscpico. Sus dimensiones tpicas son de 75
mm x 25 mm. El objeto a observar suele disponerse sobre este artefacto para
despus situarse en el microscopio y ser observado. En ocasiones puede cubrirse
la muestra con un cubreobjetos, una hoja de cristal.

Microscopios: El microscopio es un instrumento que permite observar objetos
que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista

Soporte de Tinciones: Es un instrumento de laboratorio, que es como una
enorme liga tensada no flexible que se utiliza con los lquidos de tincin; yo la
utilizaba en botpanica para teir hojas para que sus partes se observen en el
microscopio.

Goteros: Un cuentagotas o gotero es un tubo hueco terminado en su parte inferior
en forma cnica y cerrado por la parte superior por una perilla o dedal de goma. Se
utiliza para trasvasar pequeas cantidades de lquido vertindolo gota a gota.
Gasas: Una gasa es una malla, con ms o menos hilos (lo cual determina la
calidad del resultado final del impreso). Existen mallas para este proceso de
muchos tipos de hilos usados


3.4.2 REACTIVOS

Agua destilada: El agua destilada es aquella sustancia cuya composicin se basa
en la unidad de molculas de H2O. Es aquella a la que se le han eliminado los
iones e impurezas mediantedestilacin. La destilacin es un mtodo en desuso
para la produccin de agua pura a nivel industrial. Esta consiste en separar los
componentes lquidos de una mezcla.

Aceite de inmersin: La funcin del aceite de inmersin es restringir el
movimiento de la muestra, adems de evitar el rozamiento entre el cubre objetos y
el objetivo, generalmente se lo utiliza cuando vamos a observar con el objetivo
100x. Otra funcin del aceite de inmersin es evitar que la luz se desve; al
contrario lo que se pretende es que la luz llegue concentrada hacia la muestra.

Solucin de cristal Violeta: El violeta de metilo, comnmente denominado cristal
violeta o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos
qumicos empleados como indicadores de pH y colorantes.

Solucin de safranina Etanol 95%: Es una solucin colorante bsica para
material nuclear. Se prepara con 3,41 gramos de tinte aadidos a 100 ml. de
alcohol etlico de 95%. Se le deja reposar por dos das removiendo con frecuencia.
Filtre antes de almacenar
Lugol: El lugol o disolucin de Lugol es una disolucin de yodo molecular I2 y
yoduro potsico KI en agua destilada.


IV. MATERIALES Y REACTIVOS

4.1 Materiales

Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen natural, Sarro Dental, etc.
Palillos
Microscopios
Soporte de Tinciones
Goteros
Gasas


4.2 Reactivos

Agua destilada
Aceite de inmersin
Solucin de cristal Violeta
Solucin de safranina Etanol 95%
Lugol
Alcohol acetona


V. METODOLOGIA

Desarrollar la prctica teniendo en cuenta el siguiente procedimiento:

Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.
Colocar una gota de agua destilada o solucin salina sobre el porta objetos y luego
esterilizar el asa bacteriolgica.
Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos,
posteriormente esterilizar el asa.
Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando no quemar la
muestra. Colocar el portaobjetos sobre un soporte.
Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y
enjuagar.
Cubrir la muestra con alcohol cetona. Esperar que transcurran 5 segundos.
Escurrir y enjuagar.
Cubrir la muestra con safranina y esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y
enjuagar.
Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar en el
microscopio a 10x, 100x, etc.

VI. CUESTIONARIO

1. Indique la utilidad de los reactivos utilizados en la prctica.

Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin.
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con
aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor nmero
de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de
cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin.

A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos:
Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular
(Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o
agruparse de manera irregular (Estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena
(Estreptobacilos) o en empalizada.
Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma
rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de
"coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.

2. Causas que alteran la tincin de Gram
I: Edad de la bacteria.
II: Errores del operador.
III: Uso de antibiticos

A pesar de la gran utilidad de la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con
precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas (cultivos viejos
de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teirse como gram
negativos) y la tcnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede
correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian como gram negativas),Es por esta
situacin que junto a la muestra deben teirse controles con bacterias gram positivas
(ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli).

3. Indicar las bacterias resistentes a la tincin Gram

Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tien como gramnegativas:
Mycobacterias (estn encapsuladas).
Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (prdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared,
respectivamente)


4. Cules son las fuentes de errores ms comunes de error en la tincin de Gram.

Los peores obstculos de la Tincin, que impiden conseguir el resultado perseguido, son
los errores del tcnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy
cuidadosos al ejecutar la tcnica. A continuacin describimos algunas de las fuentes de
error: impurezas en los reactivos de Tincin:

Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin.
pH inadecuado.
El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se alteran si el
Ph no es el apropiado.
Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros.
Tiempo de Tincin incorrecto.
Temperatura suficiente.

5. Explique qu reaccin de Gram darn las levaduras. Estas tendrn la misma
importancia que para las bacterias

En esta tincin, las levaduras suelen comportarse como gram positivas. El color depende
de la composicin de la pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como en
las bacterias ya que en ellas existe toda una clasificacin por medio del gram lo que no
sucede con las levaduras.


6. Explique el fundamento de la Tincin negativa realizada en la prctica. Qu tipo de
informacin se obtiene.

La Tincion Negativa es el reverso del procedimiento de Tincin usual: las celular se dejan
sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto es el
perfil de las clulas.
La Tincion negativas es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en
la microscopia ptica. Pero en su mxima utilidad esta en revelar la presencia de capsulas
alrededor de las clulas bacterianas






7. Investigue otra tcnica de Tincin selectiva que permita observar otras estructuras
bacterianas.

Las Tinciones selectivas: Son aquellas que permiten observar un organelo celular
determinado, porque el colorante se combina selectivamente con l. Las tinciones
selectivas ms importantes son:
Tincin de endoesporas.
Tincin de flagelos.
Tincin de ncleo.
Tincin de capsula.

8. A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias segn sean Gram+ o
Gram-?

El distinto comportamiento en la tincin de gram, se piensa que es debido a las diferentes
capas superficiales o paredes de las bacterias (tipo de clula).
Esto se debe a la diferencia en su pared celular y bsicamente hay dos
causas diferentes:
A la cantidad de fosfolipidos que tienen la gram negativas es mayor que las gram
positivas.
A los peptidoglicanos, que es mayor en las gram positivas que en las gram negativas


VII. BIBLIOGRAFIA

Mara A.R. Control microbiolgico Lima Peru
Collins C. H. Mtodos Microbiolgicos
Jawetz E., et al Microbiologa Mdica de Jawets, Melnick y Adelberg
Murray P.P, et al Microbiologa Medica
Caldas A.L., Gua de Microbiologa y Parasitologa bsico clnica
Jonson t.T. and C. L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology 3a Ed.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th)
Edition) Edited by Frances Pouch Downes and Keith Ito, 2001.
Holt, J.G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergeys
Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co.,
Baltimore, USA.

VIII. ANEXOS

Figura N 3: Reaccin y coloracin de las Bacterias.















Figura N 4: Ilustracin de la apariencia de Cocos Gram
+
y Bacilos Gram
-
en diferentes
estados del procedimiento de Tincin de Gram










Cuadro N1: Enfermedades causadas por Tincin Gram en los seres humanos

Cuadro N1: Enfermedades causadas por los Bacilos.
Bacilos BACTERIA ENFERMEDADES
Diphtheriae

Diarrea
Escherichia coli

Bronconeumona
Mycobacterium leprae

Tuberculosis
Corynebacterium

Difteria
Mycobacterium

Salmonelosis
Bacillus cereus Intoxicacin alimentaria por Bacillus
cereus

Cuadro N2: Enfermedades causadas por los Cocos.
Cocos BACTERIA EFERMEDADES
Neisseria meningitidis Meningitis

Staphylococcus
Neumona, sndrome de shock txico,
infecciones de la
piel, meningitis
Streptococcus pneumoniae Neumona, infecciones del odo,
meningitis
Streptococcus pyogenes Infecciones de garganta, fiebre
reumtica
Streptococcus sp. Escarlatina, fiebre puerperal