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Cromatografia a liquido de alto
desempenho(HPLC)
O que HPLC?
Tipos de Separaes
Colunas e fases estacionrias
Fase mel e seu papel nas separaes
!n"e#o no HPLC
$etec#o no HPLC
%ariaes no HPLC tradicional
Cromato&rafia de 'ons
Cromato&rafia por e(clus#o de taman)o
O que HPLC?
* em in&l+s, High Performance Liquid Chromatography
High Pressure Liquid Chromatography -normalmente erdade./
High Price Liquid Chromatography -erdade./
HPLC a automa#o da cromato&rafia a l'quido so0
condies que permitem fornecer separaes
mel)ores em tempos mais curtos.
1 cromato&rafia moderna proaelmente o
mtodo quantitatio mais utili2ado deido a sua
lar&a aplica#o3 rios tipos e taman)os de
molculas podem ser separados usando HPLC ou
ariantes de HPLC...
$etecta0ilidade
1dapta0ilidade 4s determinaes quantitatias
com e(atid#o
1dequa#o para a separa#o de compostos
n#o5olteis ou termicamente insteis
1mpla aplica#o6 aminocidos, prote'nas,
cidos nuclicos, )idrocar0onetos,
car0oidratos, terpenides, a&rot(icos,
anti0iticos, esterides, espcies inor&7nicas
HPLC a mais usada de todas as tcnicas
anal'ticas de separa#o.
8squema de um instrumento de HPLC
Coluna
Componentes de um equipamento t'pico para HPLC
Vlvula de injeo
Fonte regulada
de hlio
Bomba
Vlvula de
controle de sada
Filtro
Seringa
Vlvula de
drenagem
Vlvula para selecionar a proporo de solvente
Para o
detector
Reservatrio
de solventes Filtro
de entrada
Borbulhador
Vlvula de injeo
Coluna
Computador para
controle e painel
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Tipos de Separaes por HPLC
Parti#o em fase normal6 Separa#o de analitos polares
por parti#o em uma fase estacionria li&ada polar9
Parti#o em fase reersa6 Separa#o de analitos n#o
polares por parti#o emuma fase estacionria li&ada apolar9
1dsor#o6 est entre a fase normal e a fase reersa9
Separa#o de analitos moderadamente polares usando
adsor#o em uma fase estacionria pura -por e(9, alumina ou
silica/9
Cromato&rafia de 'ons6 Separa#o de 'ons or&7nicos e
inor&7nicos por atra#o eletrosttica de &rupos i:nicos
presentes emuma resina trocadora de 'ons9
Cromato&rafia por e(clus#o de taman)o6 Separa#o
de molculas &randes 0aseada em camin)os -;t<neis=/ que as
mesmas tomam na fase estacionria9
Sele#o dos tipos de
cromato&rafia l'quida
Os mtodos podem ser
escol)idos 0aseados na
SOL>?!L!$1$8 e na
@1SS1 @OL8C>L1A9
Para molculas n#o5
i:nicas pequenas -M B
CDDD/, fase reersa a
mais adequada9
1s tcnicas na parte
inferior do dia&rama s#o
mais adequadas para
compostos de massa
molecular alta -M E CDDD/9
Os vrios tipos de cromatografia lquido
so complementares do ponto de vista de
suas aplicaes!
Massa molecular < 2000
Solvel em
solventes
moderadamente
polar a polar
(CHCl3, CH3OH)
Solvel
em
CHCl3
Solvel em
lcool, acetonitrila
e acetato de etila
Solvel emsolvente orgnico
Cromatografia
de
adsoro
Silica Slica
Solvel emgua
Polar
no
inico
Inico
Cromatografia
em fase normal
(ligada)
Ciano,
amino, diol
Cromatografia em
fase normal
(ligada)
Cromatogra
fia de troca
inica
Ciano,
amino
Cromatografia
em fase reversa
(ligada)
Solvel em
solventes no
polares a
moderadamente
polares
C18, C8, C4,
C2, C1,
fenil, ciano
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Massa molecular > 2000
Solvel emsolvente orgnico Solvel emgua
Tamanho
molecular
< 30 nm
Tamanho
molecular
> 30 400 nm
Cromato
grafia de
excluso por
tamanho
No inico
polar
Inico
Cromatogra
fia de troca
inica
Cromatografia
em fase reversa
(ligada)
Tamanho
molecular
< 30 nm
Tamanho
molecular
> 30 400 nm
Cromatografia em
fases reversa (ligada)
ou interao
hidrofbica
Cromatografia
por excluso
de tamanho
C18, C8, C4 ou
fenil,ou resina
polieter
C18, C8, C4
O que o analista preisa fa!er?
Selecionar o tipo correto da separa#o para os
analito-s/ de interesse, 0aseado no tipo de amostra,
entre outros fatores
Selecionar uma coluna adequada -fase estacionria/
e uma fase mel9
Selecionar um detector adequado 0aseado na
detec#o uniersal ou no composto especifico
dependendo da e(i&+ncia ou da disponi0ilidade
Otimi2ar a separa#o usando mistura padr#o
1nalisar os padres e a amostra
Condies iniiais para a
romatografia em fase re"ersa
F1S8 8ST1C!OFGA!16 C
HI
ou C
I
em part'culas esfricas de
s'lica com J Kmde di7metro
COL>F16 D,LM ( HJ cm para part'culas de 5-mou D,LM (
N,J cm para part'culas de O,J5Km-corrida mais curta, mesma
resolu#o/
FL>PO6 C,D mLQmin
F1S8 @R%8L6 CH
O
CFQH
C
O para analitos neutros
CH
O
CFQtamp#o aquoso para analitos i:nicos
J S CH
O
CF em H
C
O para HDDS CH
O
CF, elui#o por &radiente
T8@P8A1T>A16 OJ5LD
o
C, se dispon'el controle da temperatura
T1@1FHO $1 1@OSTA16 CJ5JD KL contendo TCJ5JD K& de
cada analito
Colunas e fases estaion#rias
Colunas empacotadas s#o muito usadas em HPLC
8st#o em andamento al&umas pesquisas so0re colunas
capilares do tipo megabore em HPLC9
Fases estacionrias s#o part'culas que tem
apro(imadamente H a CD m de di7metro mdio
Fa cromato&rafia de adsor#o n#o e(iste fase adicional
so0re as part'culas da fase estacionria -s'lica, alumina,
Fluorosil/9
Fa cromato&rafia de parti#o, a fase estacionria reco0re
-freqUentemente por li&a#o coalente/ um suporte slido
-s'lica, alumina, resina de diinil0en2eno/9
Cromato&rafia por parti#o
Cromato&rafia l'quido5l'quido 5 o l'quido
estacionrio mantido por adsor#o f'sica
Cromato&rafia l'quida li&ada V o l'quido
estacionrio encontra5se quimicamente
li&ado, resultando em rec)eios altamente
esteis, insol<eis na fase mel
Siloxano - recobrimento
com fase ligada mais
empregado, formado pela
reao da superfcie
hidrolisada da slica com
um organoclorosilano.
Empacotamentos
de fase ligada
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Cromato&rafia clssica
Part'culas de uma coluna de empacotamento para cromato&rafia
a l'quido clssica tem di7metro mdio entre HDD e CJD Km
Cromato&rafia com fase estacionria pelicular,
entre H e O Kmde espessura
$i7metro das part'culas menor -LD m) e efici+ncia da coluna
maior9 8ssas part'culas s#o facilmente empacotadas em uma
coluna, mas a capacidade de amostra 0ai(a deido a um alor
0ai(o de %s -olume da fase estacionria/
Cromato&rafia moderna -HPLC/
Part'culas micro5porosas de di7metro T J Kmque fornecem colunas
de alta efici+ncia3 tempos rpidos de separa#o, capacidades
moderadas, mas custo alto.
Compara$o das part%ulas
adsor"entes da fase estaion#ria
&ature!a porosa das part%ulas
adsor"entes das fases estaion#rias
@icro5part'culas de O a CD Kmde di7metro s#o usadas
em HPLC fornecendo colunas de alta efici+ncia com
tempos de separa#o rpidos e capacidades de
amostra moderadas, porm custos mais altos.
8feito do taman)o da part'cula na altura do prato
terico, H9
Velocidade linear, cm/s
A
l
t
u
r
a

d
o

p
r
a
t
o
,

H
,

m
m
Sele#o da coluna em separaes
cromato&rficas por parti#o
Polaridades para soluto, fase mel, e fase
estacionria deem ser com0inadas para se o0ter
0oas separaes cromato&rficas por parti#o em
um tempo ra2oel9 $if'cil.
Limitar a escol)a da fase estacionria a um tipo
&eral de componentes da amostra9
Polaridades, em ordem crescente, dos rios
&rupos funcionais dos analitos6 )idrocar0onetos B
teres B steres B cetonas B alde'dos B amidas B
aminas B alcois9 G&ua mais polar do que
qualquer composto.
Sele#o da fase mel em
cromato&rafia de parti#o
Fator de reten#o -k/ o mais fcil de ser
manipulado e(perimentalmente9
Para um desempen)o timo, k dee estar no
interalo ideal entre C e HD
Para misturas comple(as , interalo e(pandido, D,J
a CD9
Fator de separa#o -/ pode ser usado quando
n#o se tem 0om resultados com a altera#o de k
1alia#o, cuidados, manuten#o e
recupera#o de colunas para CL
Condicionamento
Testes de aalia#o V controle da press#o,
efici+ncia da coluna -N/
Fator de assimetria
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$etermina#o da efici+ncia -N/ de uma
coluna -L WHJ cm/ para o pireno -pico L/
pireno
antraceno
bifenila
naftaleno
N
coluna
W J,JL -t
r
QX
0
/
C
W
J,JL -I,LJIQD,HMH/ W
HJ9ODO pratos
N
metro
W HJ9ODOQHJ ( HDD
W HDC9DCC pratosQmetro
$etermina#o do fator de assimetria de
uma coluna cromato&rfica
Clculo do fator de assimetria para
uma coluna de CL
0 ou C? W H,L cm e
a ou 1C W D,N cm
1
s
W 0Qa W H,LQD,N W C,D
%alor eleado, cauda
pronunciada.
Flu(os t'picos utili2ados nas colunas de CL
em fun#o do di7metro interno
$enominaes da
coluna
$imenses -d9i9/ Flu(o t'pico
Tu0ulares a0ertas B CJ Km B CJ nLQmin
Fano0ore CJ Kma HDD Km CJ 5 LDDD nLQmin
Capilar HDD Kma H mm D,J 5 CDD KLQmin
@icro0ore H mm a C,D mm JD 5HDDD K LQmin
FarroX0ore C,D mm a L,DD mm D,C a C,D mLQmin
Padr#o L,D mm a L,M mm H,D a J,D mLQmin
Semi preparatias L,M mm a HD mm J,D V LD mLQmin
Preparatias EHD mm E CD mLQmin
Sistema de
colunas
para HPLC
Entrada
Material de
titnio poroso
Coluna
de
guarda
Coluna
principal
(plstico)
Material de
titnio poroso
Sada
Tubo de
alumnio
anodizado
Colunas anal'ticas
Pr5coluna
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'ases estaion#rias
Polar -Fase Formal/
Silica, alumina
Terminaes 5ciano, 5amino ou diol quimicamente li&ado
F#o5Polar -Fase reersa/
Terminaes C
HI
a C
I
quimicamente li&ado
Terminaes Vde fenil a 5ciano quimicamente li&ado
@isturas de &rupos funcionais podem ser
usadas.
Part'culas empacotadas em uma coluna e(i&e6
@aterial no final da coluna para manter as part'culas na coluna
Filtra#o de amostras para impedir entupimento com detritos
Pr5coluna para prote&er a coluna anal'tica
Aela#o entre polaridade e tempo de elui#o
para cromato&rafia em fase normal e reersa
8feito do comprimento da cadeia so0re o
desempen)o das colunas rec)eadas em fase
reersa tipo silo(ano com part'culas de J Km9
Fase mel6 JD6JD metanol6&ua9 %a2#o H,D mL min
5H
Metil
Octil Octadecil
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(pliaes de romatografia de parti$o
Campo @isturas t'picas
Farmac+utico 1nti0iticos, sedatios,
esterides, anal&sicos
?ioqu'mico 1minocidos, prote'nas,
car0oidratos, lip'deos
Produtos aliment'cios 1doantes artificiais,
antio(idantes, aflato(inas,
aditios
Produtos qu'micos industriais 1romticos condensados,
surfactantes, propelentes,
corantes
Poluentes 1&rot(icos, )er0icidas, fenis,
0ifenilas policloradas
Yu'mica Forense $ro&as, enenos, lcool no
san&ue, narcticos
Cl'nica mdica Gcidos 0'licos, meta0litos de
dro&as, e(tratos de urina,
estr&enos
1plicaes da cromato&rafia por
parti#o de fase li&ada
-a/ 1ditios em refri&erantes3 -0/ !nseticidas or&anofosforados
Otimi!a$o das separaes em HPLC
8scol)a correta da coluna de modo que o equil'0rio
analito
F8
analito
F@
ten)a um fator de reten#o
adequado -n#o muito alto, n#o pr(ima de 2ero ou
i&ual a 2ero/
8scol)a correta da fase mel
$ecis#o no tipo de composi#o da fase mel
composi#o constante W elui#o isocrtica
composi#o ariel W elui#o por &radiente
$etermina#o se a elocidade de flu(o dee ser
constante * &eralmente
$ecis#o em aquecer a coluna
aquecimentos das colunas de HPLC podem
influenciar o equil'0rio *
Fluxo
Solvente
Soluto
dessorvido
Fase
estacionria
Soluto
adsorvido
na fase
estacionria
Solvente
adsorvido
na fase
estacionria
( 'ase )*"el em HPLC+++
Precisa6
solatar as molculas do analito com o solente que est
dentro da coluna
ser adequada para transferir o analito ao lon&o da coluna
durante o processo de separa#o
Precisa ser6
compat'el com o instrumento -0om0as, selos, acessrios/
compat'el com a fase estacionria
prontamente dispon'el -freqUentemente se usa litrosQdia/
de pure2a adequada
composi#o5trao e espectroscpico usualmente.
F#o muito compress'el -causa pro0lemas de
0om0aQflu(o/
lire de &ases -causa pro0lemas de compressi0ilidade/
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8
Solentes da
fase mel
?ol)as 999 ???
Filtra#o da
fase mel
Aemo#o dos
&ases nos
solentes atras
de ultra5som
$e&aseifica#o usando &s inerte
?om0a rec'proca para HPLC -tra0al)a com
alta press#o de sa'da, at HD DDD psi/
Usada para a escala analtica intermediria (fluxos tpicos entre 0,5 e 2 mL/min)
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9
,om-a do tipo pist$o re%proo. -om-a dupla
(dois pistes e um /nio motor)
)inimi!a as irregularidades do flu0o das -om-as1
2ois pistes e um /nio motor.
3ndie de Polaridade para 'ases )*"eis
O Zndice de Polaridade uma medida da polaridade
relatia de um solente9 [ usado para identificar
solentes adequados para a fase mel9
Yuanto mais polar for o solente, maior o 'ndice9
8scol)er um solente -ou mistura de solentes/ com 'ndice
de polaridade que otimi2a a separa#o dos analitos9
&eralmente o 'ndice um ponto de partida9
a polaridade de qualquer mistura de solentes que constitui
uma fase mel pode ser modelada para fornecer um
cromato&rama terico9
&eralmente, otimi2a#o da composi#o do solente
e(perimental9
>m outro par7metro a Fora do 8luente -\
o
/, ener&ia
de adsor#o do solente por unidade de rea superficial9
1umento dos alores da Fora do 8luente ou do
Zndice de Polaridade si&nifica aumento da
polaridade do solente9
Propriedades de fases meis usadas em cromato&rafia
4lui$o isor#tia versus 4lui$o 5radiente
8lui#o isocrtica tem composi#o constante da fase mel
Pode usar uma <nica 0om0a.
Solentes s#o misturados antes de iniciar a anlise.
@ais simples, n#o precisa de uma c7mera de mistura9
Fle(i0ilidade limitada, n#o muito usada em pesquisa9
usada principalmente em anlises de rotina9
8lui#o por &radiente tem composi#o ariel da fase mel
>sa rias 0om0as, conectadas entre si9
freqUentemente C5L 0om0as -sistemas 0inrio a quaternrio/
%ariando componentes da fase mel aria 'ndice polaridade
Pode ser usada para eluir compostos que foram anteriormente
-intencionalmente/ retidos na coluna9
Pode proocar al&uma de&rada#o na fase estacionria9
Coluna precisa retornar as condies ori&inais aps
cada corrida -&asta um tempo adicional/9
%

S
o
l
v
e
n
t
e

B
Tempo
Tempo
%

S
o
l
v
e
n
t
e

B
8lui#o isocrtica
8lui#o por &radiente
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OT6)67(89O 2( POL(:62(24 2( '(S4 );<4L +++
<aria$o da omposi$o da fase m*"el altera a
separa$o+
B = CH
3
CN
A = H
2
O
Tempo (min)
Tempo (min)
A
b
s
o
r
b

n
c
i
a

e
m

2
2
0

n
m
Eluio por
gradiente
Eluio
isocrtica
Melhoria na
eficincia de
separao com o
emprego de eluio
por gradiente!
Cromatograma dos derivados de ortoftaldedo de 30
aminocidos de importncia fisiolgica
Coluna: fase reversa C
18
, 45 m. Solvente A: Na
2
HPO
4
0,05 mol L
-1
,
pH 7,4, 96:2:2CH
3
OH:THF:H
2
O. Solvente B: 65:35:CH
3
OH/H
2
O.
Detector por fluorescncia: excitao 334 nm; emisso 425 nm.
Perfil do
gradiente
6n=e$o em HPLC
]eralmente olume de J a JDD L in"etados diretamente
na coluna
Capacidade n#o muito preocupante, uma e2 que as colunas
tem um olume &rande -empacotadas/
!n"etor o <ltimo componente antes da-s/ coluna-s/
>ma fonte de precis#o po0re em HPLC
erros de C5O S $PA s#o deido 4 in"e#o
1 lula de entrada rotatria o in"etor manual padr#o
!n"etores automticos s#o dispon'eis
$uas posies, carre&ar e in"etar no in"etor t'pico
O olume interno do loop -ala/ determina o olume de
in"e#o9
H/ 5Carre&ar
-loop de amostra&em/
C/ 5 !n"etar -moer o loop
de amostra&em para o
flu(o da fase mel/
Coluna
Amostra
Sada/Descarte
Carregador/Fase mvel
Loop de
amostragem
Amostra
Coluna
Loop de
amostragem
Sada/Descarte
Carregador/Fase Mvel
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Sistema com ala de
amostragem para
cromatografia a liquido
Da bomba
Descarte
Para coluna
Ala
1) - Carregamento da amostra
2) Injeo da
amostra
Para coluna
Descarte
Da bomba
Injeo manual da
amostra na vlvula
rotatria
Injeo
automtica
2ete$o em HPLC
%rios tipos
Ori&inalmente detectores para HPLC eram
instrumentos comuns de la0oratrio, tais como
espectrofot:metros, etc9
Compati0ilidade com solente, estel, etc9
>niersal
Aesponde a todos os analitos
8spec'fico
Aesponde 4s propriedades espec'ficas dos analitos
F#o5destrutio
@aioria
$estrutio
8LS$ -Eaporatie Light !cattering "etector/, @S -Mass
!pectrometry/
$etector de HPLC
$ispon'el
comercialmente
Limite de detec#o em
massa -t'pico/
10sor07ncia Sim HD p&
Fluoresc+ncia Sim HD f&
8letroqu'mico Sim HDD p&
Zndice de refra#o Sim H n&
Condutiidade Sim HDD p&VH n&
8spectrometria de massas Sim B Hp&
FT!A Sim H K&
8spal)amento de lu2 Sim H K&
1tiidade tica F#o H n&
Seletio por elemento F#o H n&
Fotoioni2a#o F#o B Hp&
Desempenho dos detectores de HPLC
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Princ'pio da detec#o no >%5%!S
A = b c, onde:
A = absorbncia medida;
= absortividade da espcie;
c = concentrao
B = caminho tico
(!
o
/ intensidade da lu2 incidente3 -!/ intensidade
da lu2 emer&ente9
2etetor Padr$o de (-sor->nia ?+
!nstrumento de fei(e <nico >%5%!S com uma clula onde
atraessa o flu(o -cuette/
Pode ser qualquer >%5%!S com um clula de flu(o especial
Cone(es e(tras condu2em a um alar&amento da 0anda se a clula
de a0sor#o >%5%!S est distante da sa'da da coluna de HPLC
]eralmente se utili2a l7mpadas t'picas para >%5%!S e
comprimentos de onda padr#o de CJL nm
Pode ser definido para outros comprimentos de onda -maioria/
$etectores de filtro simples n#o s#o mais amplamente utili2ados
>nidades de comprimentos de onda a"usteis s#o econ:micos
F#o5destrutio, n#o5uniersal
Fem todos os compostos a0sorem lu2
Pode passar amostra tras de diersas clulas em diersos
comprimentos de onda diferentes
]eralmente 2era no in'cio de cada corrida usando um comando
de soft#are eletr:nico9 %oc+ pode 2erar em tempo real usando
uma clula de refer+ncia
Uma clula de absoro UV-Vis para HPLC
Para descarte
Detector
Da coluna
Fonte UV
Janelas de
quartzo
2etetor de (rran=o de 2iodo (2(2)
1 ferramenta mais comum para instrumentos de HPLC
usados em pesquisa
0astante erstil 999
1anos na tecnolo&ia de computa#o a partir de
H^IJ learam ao desenolimento de instrumentos de
1rran"o de $iodo
F#o5destrutio, n#o5uniersal
$1$ permite uma aria#o de comprimentos de
onda a cada se&undo ou a al&uns poucos se&undos9
8m cada ponto no cromato&rama se conse&ue um
espectro >%5%!S completo.
]randes olumes de dados
8spectros detal)ados para cada pico e cada re&i#o de
cada pico
8spectros de a0sor#o do eluente de uma mistura de
tr+s esterides, o0tidos em interalos de J se&undos
Corticosterona
Dexametasona
Cortisona
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2etetor de fluores@nia
@uitos compostos a0sorem lu2 e reemitem em
um comprimento de onda menor6 fluoresc+ncia
8(celente seletiidade6 muitos compostos e
impure2as n#o fluorescem, n#o d#o sinal neste
detector
1lta sensi0ilidade6 B H pico&rama -HD
5HC
&ramas/
Pode ser de comprimento de onda fi(o ou
ariel -como na detec#o >%5%!S/
Composto _e(cita#o _emiss#o ! -relatia/
?en2eno CND OHD HDD
Tolueno CND OCD HND
Propil0en2eno CND OCD HND
Fluor0en2eno CND OCD HDD
Cloro0en2eno CNJ OLJ ID
Fenol CIJ OMJ HID
1nilina CHD LDJ CDD
'luores@nia de deri"ados do -en!eno
(nm) (nm)
8squema de um detector de fluoresc+ncia de
comprimento de onda fi(o, tipo fluor'metro
2etetor de %ndie de refra$o
>m dos poucos detectores uniersais para HPLC9 F#o5
destrutio
Aesponde a analitos ariando o !A da fase mel
e(i&e um flu(o de refer+ncia da fase mel separado -!A
diferencial/
1ltamente sens'eis 4 temperatura e deem ser
mantidos em temperatura constante
sens'eis 4 ariaes de temperatura de al&uns D,DDH C
F#o s#o muito sens'eis e n#o s#o compat'eis com
os mtodos de elui#o por &radiente9
$etectores de a0sor07ncia s#o relatiamente 0aratos9
S#o aplicados para determina#o de al&uns analitos
-e(9 a<cares/, <teis em tra0al)os de processos,
monitoramento on5line, etc9
$etector de 'ndice de refra#o
Diagrama esquemtico de um detector por ndice de
refrao diferencial
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2etetor e"aporati"o por espalhamento
de lu! (4LS2)
>niersal, destrutio
`til para molculas muito &randes e sua resposta
apro(imadamente a mesma para todos os solutos
n#o5olteis
1nalitos s#o de5solatados no detector -eapora#o
da fase mel/
@olculas passam atras de um cuette &rande
como a de um instrumento >%5%!S
1 redu#o na intensidade da lu2 detectada -deido
ao espal)amento da lu2 pelos analitos/ medido
Yuanto maior uma determinada molcula e mais
concentrada a solu#o, maior o espal)amento9
8squema de um detector de
espal)amento de lu2 eaporatio
2etetor de espetrometria de massas
1ssim como na C] , um espectr:metro de massas
pode a"udar na identifica#o das espcies 4 medida
que elas eluemna coluna
8(istem pro0lemas ainda no acoplamento da CL
com espectr:metro de massas
O solente dee ser eaporado, entretanto, o
solente de CL produ2 um olume de apor que de
HD a HDDD e2es maior do que o olume do &s de
arraste em C]
$ispositios para solucionar o pro0lema de remo#o
do solente e do interfaceamento da coluna de CL6
ioni2a#o 4 press#o atmosfrica de 0ai(a a2#o9
Diagrama de blocos de um sistema de CL acoplada ao EM.
O efluente da coluna de CL introduzido em uma fonte de
ionizao presso atmosfrica, com um sistema de eletrospray
ou ionizao qumica. Os ons produzidos so selecionados
pelo analisador de massas e detectados pelo detector de ons.
Cromatografia por adsor$o
Cromato&rafia por adsor#o, ou l'quido5slida, a
forma clssica de CL
$eido 4 forte so0reposi#o entre cromato&rafia por
parti#o em fase normal e cromato&rafia por
adsor#o, os princ'pios e as tcnicas s#o semel)antes9
Fase estacionria s#o silica e alumina9 Silica tem
maior capacidade de amostra -prefer'el/
>so da cromato&rafia por adsor#o tradicional tem
diminu'do deido 4 ersatilidade das fases
estacionrias li&adas -cromato&rafia de parti#o em
fase normal/9
Cromatografia de %ons
Tipos de cromato&rafia de 'ons6
!9 coluna <nica -coluna separadora/
!!9 duas colunas -coluna separadora e supressora/
H^NJ V 1lta condutiidade eltrica dos
eluentes foi resolida com a introdu#o da
coluna supressora do eluente9
Coluna supressora uma resina de troca
i:nica que conerte os 'ons do eluente 4
espcies moleculares de ioni2a#o limitada
sem afetar a condutiidade dos 'ons analitos
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15
Cl
-
Br
-
Cl
-
Br
-
Br
-
Cl
-
Br
-
Br
-
Br
-
Cl
-
Cl
-
Cl
-
OH
-
OH
-
Cl
-
Cl
-
OH
-
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
HBr
HBr
HCl
HCl
Cl
-
Br
-
Tempo
Coluna de separao
Coluna supressora
Descarte
Detector de condutividade eltrica
amostra
eluente
(NaOH)
Cromatografia de nions
Aesina 5F
a
A
O
P
5
a Fa
a
OH
5
Aesina 5F
a
A
O
OH
5
a Fa
a
P
5
Fa coluna de separa#o6
Fa coluna supressora6
Aesina 5SO
O
5
H
a
a Fa
a
P
5
Aesina 5SO
O
5
Fa
a
a H
a
a P
5
Aesina5SO
O
5
Fa
a
a Fa
a
OH
5 Aesina5SO
O
5
Fa
a
a H
C
O
1plicaes de cromato&rafia de 'ons
a/ Separa#o de 7nions em coluna de troca ani:nica9 8luente6 FaHCO
O
D,DDCI molQL a Fa
C
CO
O
D,DDCO molQL
0/ Separa#o de 'ons alcalinos terrosos em coluna de troca cati:nica 9
8luente6 dicloreto de fenilenediaminaD,DCJ molQL em HCl D,DDCJ molQL
Separa#o de amino5cidos em
uma coluna de troca i:nica
Trocador cati:nico com taman)o de part'culas de I Km
40er%ios
1- O cromatograma a seguir foi obtido a partir de uma soluo
contendo uma mistura padro de estireno e de seu metablito
(cido mandlico), sob as seguintes condies: coluna C18,
deteco UV 200 nm, fase mvel = gua : metanol (60:40), pH =
2,5 e fluxo 1,0 mL/min.
2 4 6
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
In
te
n
s
id
a
d
e
d
e
s
in
a
l
Tempo (min)
Peak 1
Peak 2
cido mandlico
estireno
(i) De acordo com o modo cromatogrfico utilizado, o pico 1
seria atribudo a qual composto?
(ii) Sugira ao menos uma maneira para confirmar a
identificao desse composto.
(iii) Calcule a resoluo entre os dois picos, sendo que Rs = 2
(tr
2
-tr
1
) / (w
b1
+ w
b2
).
(iv) Caso tenha-se invertido, por desateno, a proporo
gua:metanol de 60:40 para 40:60, o que se espera que
acontea com o tempo de anlise? E com o valor da resoluo?
Justifique.
(v) Seria possvel a anlise de ambos os compostos por
cromatografia de ons? Justifique.
(Cont. Exerccio n
o
1)
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16
2- Um analista recebeu uma amostra de gel dental para
determinar fluoreto, cloreto, sulfato e nitrato. Para tal, fez-se
uso da tcnica de cromatografia de troca inica, preparando
uma mistura de padres contendo os sais de F
-
, Cl
-
, SO
4
2-
e
NO
3
-
. O eluente utilizado como fase mvel para separao da
mistura de nions foi uma soluo Na
2
CO
3
/NaHCO
3
0,01
mol/L, em pH = 10,3. A anlise da soluo aquosa contendo
os padres forneceu o seguinte cromatograma:
0 2 4 6 8 10 12 14
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
In
te
n
s
id
a
d
e
d
e
s
in
a
l
Tempo (min)
(i) Qual a ordem esperada para eluio dos nions da mistura
padro? Explique.
(ii) Aps a separao na coluna, a amostra passa por uma
coluna supressora e, por fim, por um detector condutomtrico
que registra o sinal. Qual a necessidade em se usar uma
coluna supressora entre a coluna de separao e o detector?
(iii) Para a determinao da concentrao de fluoreto na
amostra a partir de uma curva de calibrao (y = 0,0495x +
0,013, onde x a concentrao em mg/L), o analista diluiu 2,0
mL da amostra em um balo de 50,0 mL com gua
deionizada. Aamostra foi filtrada e a soluo injetada. O pico
correspondente ao fluoreto forneceu rea igual a 0,040. Qual a
concentrao de fluoreto na amostra?
(Cont. exerccio n
o
2)
A B CDCEFG0 H CDCIJD onde K B L'
M
N mgOL
Su-stituindo.
CDCE B CDCEFG0 H CDCIJ
K B CDCPQOCDCEFG
K B CDGEG mgOL
'oi feita uma dilui$o P.GCD
ent$o.
CDGEG mgOL R PG mL
K mgOL R ImL
P W HO,MC m&QL
Aesposta do e(erc'cio n
o
C -iii/
[F
-
], mg/L

r
e
a
0,545
0,040
%alida#o em CL
8(atid#o V &eralmente determinada pelo uso
de uma amostra certificada, cu"a concentra#o
do analito de interesse con)ecida -F!ST/9
8(pressa a concord7ncia entre o alor encontrado e o alor aceito
como erdadeiro ou aceito como refer+ncia9
Precis#o V determinada em condies de
repeti0ilidade -ou repetitiidade/ ou em
condies de reproduti0ilidade
Condies de repeti0ilidade
-ou repetitiidade/ V os resultados
independentes s#o o0tidos usando6
o mesmo mtodo
para a mesma amostra
no mesmo la0oratrio
pelo mesmo operador
usando o mesmo equipamento
em um curto interalo de tempo
Condies de reproduti0ilidade V os
resultados s#o o0tidos usando6
o mesmo mtodo
para a mesma amostra
em diferentes la0oratrios
por diferentes operadores
diferentes equipamentos
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Outra forma de alida#o da e(atid#o6
correla#o entre a concentra#o do analito
o0tido por HPLC e eletroforese capilar
Eletroforese capilar
H
P
L
C
y = 0,816x + 1,071
R
2
= 0,8789
.
.
.
.
.
.
.
.
..
..
.
.
.
.
.
..
.
..
.
.
.
.
.
.
..
.
.
.
.
.
. .
Linearidade V determinada por &rficos de
cali0ra#o, que relaciona a resposta do equipamento
em fun#o de rias concentraes do analito em
estudo9
[ a resposta o0tida em fun#o da concentra#o do analito, a
qual dee ser estudada em um interalo de concentra#o
apropriado9
Os &rficos deem ser apresentados com um tratamento
estat'stico6 5 equa#o da reta -b W a( a 0/, onde a W coeficiente
an&ular e 0 W coeficiente linear3
5 anlise de re&ress#o3
5 dados de correla#o -r/ e determina#o -r
C
/9
Concentrao
S
i
n
a
l

d
o

d
e
t
e
c
t
o
r

(

r
e
a

d
o

p
i
c
o
)
Fai(a din7mica e fai(a linear
Faixa dinmica
Faixa linear
Detectabilidade
mnima
Limite de detec#o -LO$/ 5 menor quantidade de
um analito que pode ser detectada, porm n#o
necessariamente quantificada como um alor e(ato9
LO$ W OF, F W ru'do ou
LO$ W concentra#o do analito que produ2 um sinal i&ual a Os,
onde s W desio padr#o do ru'do medido com um 0ranco9
Limite de quantifica#o -LOY/ V menor quantidade
de uma analito que pode ser quantificada com
e(atid#o9
LOY W HDF, F W ru'do ou
LOY W concentra#o do analito que produ2 um sinal i&ual a HDs,
onde s W desio padr#o do ru'do medido com um 0ranco9
Sensi0ilidade de um mtodo V capacidade em
discriminar concentraes pr(imas de um determinado
analito9
$eterminada pela inclina#o do &rfico de cali0ra#o6 quanto
maior o 7n&ulo de inclina#o da reta, mais sens'el ser o mtodo9
Concentrao
S
i
n
a
l

d
o

d
e
t
e
c
t
o
r
A
B
c
H
c
C
Seletiidade V capacidade de um mtodo em
determinar um analito de maneira inequ'oca na
presena de outras su0st7ncias suscet'eis de
interferirem na determina#o9
Seletiidade e especificidade V muitas e2es usados como
sin:nimos -?/
Aecupera#o V medida de efici+ncia do processo
de isolamento do analito de interesse da matri2 em
que encontra5se presente9
Aecupera#o -S/ W alor o0tidoQalor adicionado ( HDD
Ao0uste2 V medida da capacidade de um mtodo
de n#o sofrer alteraes deido a pequenas
ariaes, deli0eradamente introdu2idas nos
par7metros do mtodo9
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18
Aefer+ncias 0i0lio&rficas
Sdoo&, $9193 Holler, F9e9 e Crouc), S9A9 Princ$pios de
an%lise instrumentais& Se(ta edi#o, CDD^, 1rtmed
8ditora S9 19
Lanas, F9 @9 Cromatografia l$quida moderna& CDD^,
8ditora tomo9
Snbder, L9 e firdland, e9e9 'ntroduction to Modern Liquid
Chromatography, e9 gileb h Sons, H^N^9