Manual de Prcticas de Fisiologa Vegetal - Edicin digital - Lallana, V.H. y Lallana Ma. del C. (2003) Pg.

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MANUAL DE PRACTICAS DE FISIOLOGIA VEGETAL
Facultad de Ciencias Agropecuarias - UNER
B. DESARROLLO
B.1. INDUCCION DE CALLOS, UTILIZANDO LA TECNICA DE CULTIVO
IN VITRO
Introduccin:
El cultivo de tejidos, como tcnica, consiste esencialmente en aislar una porcin de la
planta (explanto) y proporcionarle artificialmente las condiciones fsicas y qumicas apropiadas
para que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido. Se basa en el concepto de
"totipotencialidad" de las clulas vegetales, que dice: "una clula vegetal o grupo de clulas
colocadas en condiciones adecuadas es capaz de regenerar un individuo completo e idntico
al que le dio origen".
El cultivo "in vitro" de clulas, tejidos y rganos vegetales, permite estudiar todos los
factores que influyen sobre el metabolismo, crecimiento y desarrollo de los vegetales, ya que
numerosas condiciones (qumicas, fsicas y biolgicas) pueden ser controladas y variadas
segn su objetivo determinado. Esto permite que estas tcnicas tengan un campo de accin
muy amplio dentro de la investigacin cientfica.
Las principales reas de accin que se desarrollan en la actualidad son:
1- Produccin de productos farmacuticos: se puede orientar el mecanismo vegetal hacia la
produccin de un determinado compuesto, obteniendo muy altas relaciones de produccin de
dichas sustancias. Por ejemplo: esencias de plantas aromticas, sacridos para jarabes,
edulcorantes.
2- Mejoramiento gentico de cultivos:
a) cultivo de embriones, ovarios u vulos.
b) cultivo de anteras y microsporas
c) cultivo de protoplastos
d) cultivo de callos y suspensiones celulares
Se pueden obtener variante genticas con resistencia o tolerancia a diversas
adversidades del medio y a patgenos.
3- Recuperacin de clones enfermos y su conservacin en bancos de germoplasma: a travs
de tcnicas de termoterapia (tratamiento de plantas a altas temperaturas) y posterior cultivo "in
vitro" de meristemas, para obtener plantas "libres" de virus.
4- Multiplicacin clonal rpida de plantas seleccionadas (micropropagacin): consiste en la
propagacin "in vitro" de plantas a partir de meristemas, yemas, estacas u otros tejidos.
Es necesario adems adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos
libres de contaminacin microbiana. Aunque estos principios son bsicamente invariables en
todos los laboratorios de cultivo de tejidos vegetales, su aplicacin puede presentar
variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del laboratorio; as
mientras que un laboratorio de investigacin puede ser pequeo en tamao pero muy
especializado en equipos e instalaciones, uno de produccin comercial tiende a ser ms
grande y simple. Un laboratorio de investigacin puede tambin tener un rol de enseanza y,
en este caso, es frecuente que se asignen en l reas especiales para la enseanza y
demostracin.
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El laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer de un rea destinada al
establecimiento, crecimiento y multiplicacin de especies producidas; esta rea es
especialmente necesaria en los laboratorios de investigacin y desarrollo y en los de
produccin comercial. Finalmente, la decisin de establecer un laboratorio de cultivos de
tejidos requiere de un estudio y anlisis crtico acerca de la necesidad de hacerlo, dentro de
un contexto integral del desarrollo de la investigacin y la produccin agrcola o forestal de la
regin o pas. Por lo tanto, el establecimiento y funcionamiento del laboratorio debe ser,
idealmente, el producto de esfuerzos multidisciplinarios.
Usando tcnicas de cultivo de tejidos la formacin de callos puede ser inducida en
numerosos rganos y tejidos de plantas, que usualmente no desarrollan callos en respuesta a
un dao. El material vegetal comnmente cultivado incluye, cambium vascular, parnquima de
reserva, periciclo de raz, cotiledones, mesfilo de la hoja y tejido provascular (Dodd y Lorin,
1982).
Un callo consiste de una masa amorfa surgida de la proliferacin de clulas del
parnquima. Frecuentemente es el resultado de una herida, un callo se forma en el corte de un
tallo o raz. Los callos no tienen patrones predecibles de organizacin, estn presentes en
centros localizados de actividad meristemtica y a menudo aparecen en regiones cambiales
rudimentarias con zonas de diferenciacin vascular. Una de las caractersticas importantes de
callo, desde un punto de vista funcional, es su irregular crecimiento, teniendo el potencial para
desarrollar races normales, brotes y embriones que forman plntulas.
En 1939 los primeros cultivos prolongados de induccin experimental de callos fueron
llevados a cabo simultneamente en los laboratorios de investigacin de Gautheret en Pars,
Nobercout en Grenoble, y White en Pinceton. Estos cultivos fueron derivados originalmente de
explantos de tejido cambial de zanahoria y tabaco.
La caracterstica general del crecimiento de callos, abarca una compleja relacin entre
el material usado para iniciar los callos, la composicin del medio, y las condiciones
experimentales durante el perodo de incubacin. Algunos desarrollos de callos son
fuertemente lignificados y duros en textura, los que no se pueden separar fcilmente en
pequeos fragmentos. Por el contrario los callos frgiles se separan fcilmente y se los
denomina cultivos friables, frgiles (frieble cultures). Los callos pueden ser amarillentos,
blancos, verdes, o coloreados con antocianinas. La pigmentacin ser en todo el callo, o en
algunas regiones sin pigmentar. Su anatoma, es de variacin considerable a lo largo de la
diferenciacin celular.
Los primeros estudiosos asumieron que el cultivo de callos derivados de rganos que
contienen clorofila, podrn ser autotrficos en su nutricin. Los callos con clorofila, de cualquier
manera, son dependientes de azcar exgeno para continuar creciendo, an con adecuada
intensidad de luz (Dodd y Lorin, 1982).
Despus que el callo ha crecido asociado al tejido original por un tiempo, se vuelve
necesario pasarlo a un medio fresco. El crecimiento en un mismo medio por un perodo
extenso, provocar el agotamiento de nutrientes y una desecacin gradual del agar por la
prdida del agua. Los metabolitos secretados por los callos, se pueden acumular en niveles
txicos en el medio. La transferencia del fragmento del callo debe ser suficiente para asegurar
el nuevo crecimiento en el medio fresco. Si el inculo transferido es muy pequeo, va a exhibir
una tasa de crecimiento muy baja, o no va a crecer. Algunos autores (Dodd y Lorin, 1982)
recomiendan que el inculo debe tener 5-10 mm de dimetro y pesar 20-100 mg. Los repiques
sucesivos se realizan cada 28 das en tubos de cultivo que tienen 30 cm3 de medio. El tiempo
entre repiques es variable y depende de la tasa de crecimiento del callo.
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Un callo friable puede ser subdividido con una esptula fina o con un bistur, y
transferido directamente a la superficie del nuevo medio. Los callos duros deben ser
transferidos a la superficie de una caja de Petri, esterilizada, y fragmentado con un bistur.
Solamente se debe transferir tejido sano, el tejido marrn, necrtico debe ser eliminado.
Gauthered, 1959 (citado por Dodd y Lorin, 1982) ha descripto las caractersticas de la
formacin callosa en el cultivo de la raz de zanahoria. Fragmentos del floema proliferan
dbilmente y produce pstulas separadas de clulas, o una capa fina de clulas del
parnquima. Explantos del xilema exhiben dos respuestas diferentes dependiendo de su
origen. Si el explanto se obtuvo de una zona cercana del cambium, los derivados ms
cercanos se dividen vigorosamente y forman un callo grande. Del tejido sacado de la regin
central del cambium resultan solo callos separados en las extremidades de conductos. Los
explantos del floema que bordea el cambium vascular producen los crecimientos ms
vigorosos.
El objetivo del experimento ser inducir la formacin de callos en un explanto primario
extirpado de la raz principal de zanahoria (Daucus carota) y mantener el crecimiento de los
mismos en repiques sucesivos.
Tcnica operatoria:
Se utilizar un medio de cultivo solidificado en agar con diferentes concentraciones
hormonales de Acido naftalenactico (ANA) y Benciladenina (BA) que tienen en comn
componentes del medio nutritivo de Murashige & Skoog.
Medios ANA (mg/l) BA (mg/l)
T1 --- 0,4
T2 0,01 0,3
T3 0,03 0,2
T4 0,2 0,2
- Cortar rodajas de 3 mm de grosor de raz de zanahoria previamente lavada y raspada.
- Sumergir las rodajas en una solucin de Hipoclorito de Sodio al 5% ms una gota de un
tensioactivo (Tween 20), durante 10', agitndolas peridicamente.
- Realizar tres lavados, en el rea estril, con intervalos de 5', utilizando agua destilada
esterilizada.
- Esterilizar pinzas y bistur, utilizando agua lavandina, alcohol 70 y mechero.
- Colocar en una caja de Petri papel de filtro (ambos elementos previamente esterilizado)
las rodajas hasta que se escurran, luego pasarta a otra caja de Petri esterilizada y cortar 10
trozos (3 mm de lado) de la zona del floema cercana al cambium para cada tratamiento.
- Flamear la boca de cada tubo de ensayo, sobre mechero, utilizar una pinza esterilizada
y colocar el explanto de zanahoria sobre la superficie del medio de cultivo, por ltimo tapar el
tubo de ensayo y colocarlo en la cmara de crecimiento..
- Se realizarn observaciones dos veces por semana, realizndose el fraccionamiento y
repique (en un medio fresco) de los callos, una vez que estos logren un desarrollo por lo menos
del doble de su tamao original.
Interpretar los resultados obtenidos y redactar el informe correspondiente.
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Lecturas complementarias:
- Billard, C. 1995. Induccin de callos utilizando la tcnica de cultivo "in vitro". 3 p. En: Gua de
Trabajos Prcticos de Fisiologa Vegetal. Fac. Cs. Agropecuarias. UNER.
- Dodds, J .H. and R, Lorin W.. 1982. Experiments in Plant Tissue Culture. Chapter 4. Initation
and maintenace of callus.
- Raven, P.; Evert, R. y Eichhorn,S.1992. Biologa de las Plantas Tomo II Cap.24.
- Roca, W. M. y L. A. Mroginski. 1991. CIAT. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos
y aplicaciones.
- Tizio, R.M., Stahlschmidt, O., Aguero, C. y otros. Gua de Trabajos Prcticos Fisiologa
Vegetal. Fac. Ciencias Agrarias (U.N. de Cuyo), 27 p.