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MARCADORES
MARCADORES
Bioqumicos
Morfolgicos
Marcadores moleculares
DNA RNA Morfolgicos Morfolgicos
Marcadores moleculares Marcadores moleculares
DNA RNA DNA DNA RNA RNA
Isoenzimas Isoenzimas
Dcadas de 60-70
Permitiram que muitas das dificuldades detectadas pelo uso dos
marcadores morfolgicos fossem resolvidas.
Scandalios (1975) - vantagens importantes sobre os marcadores
morfolgicos convencionais.
Shields et al. (1983)- as protenas so marcadores interessantes
para o estudo gentico, porque elas so produto primrio dos
genes estruturais. Mudanas na seqncia de bases codificadoras,
na maioria dos casos, resultaro em mudanas na estrutura
primria da protena correspondente.
Kessel e Milchemore (1986) e Falco e Contel (1991) - abordam
que as variaes proticas so de grande importncia nos estudos
genticos como indicadores dos nveis de polimorfismo e
relacionamento filogentico, bem como na identificao de raas,
espcies e populaes, representando, desse modo, uma valiosa
ferramenta para estudos evolutivos e taxonmicos.
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Eletroforese de isoenzimas
* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de
uma mesma enzima, apresentando funo idntica ou similar,
presente num mesmo indivduo (Markert & Moller, 1959).
Gel de Araucaria angustifolia
6PGDH -CM
MANTOVANI, 2003
Co-dominncia
Natureza da varia Natureza da varia o o isoenzim isoenzim tica tica
As isoenzimas so diferentes formas moleculares de uma enzima
catalisando a mesma reao na clula.
Quando as isoenzimas so controladas por alelos de um nico loco,
elas so chamada de aloenzimas.
Representam a conseqncia bioqumica da substituio, deleo ou
adio de um ou mais aminocidos no polipeptdico, afetando sua
carga eltrica e, conseqentemente, a sua mobilidade durante a
eletroforese
3
Depois de corrida de eletroforese, o gel de amido pode ser fatiado, como lustrado
abaixo, permitindo o estudo o estudo de diferentes enzimas.
Depois do fatiamento, cada fatia do gel tratado com o substrato especfico da
enzima e uma substncia que reage com o produto da reao com a formao de
uma substncia colorida.
Como as enzimas apresentam
a propriedade de catalisar uma
determinada reao qumica,
isso propicia uma maneira de
detectar a presena da prpria
enzima. Na figura est
esquematizado um mtodo de
deteco de enzima que
produz uma substncia
colorida:
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A estrutura quaternria ativa das isoenzimas podem ser
de trs tipos:
1.- Monmeros: isoenzimas que possuem uma cadeia polipeptdica como
estrutura quaternria ativa.
2.- Dmeros: isoenzimas cuja estrutura quaternria ativa consiste na unio de
dois polipeptdios.
3.- Tetrmeros: a estrutura quaternria ativa das isoenzimas constam de quatro
polipeptdios.
Padro isoenzimtico ou Zimograma, conjunto de bandas pertencentes ao mesmo
sistema enzimtico que se observam na mesma espcie.
Fosfoglucomutase (PGM)
monomrica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomrica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomrica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
MANTOVANI, 2003
Resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas
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Figura 1. Zimograma de PGM de couve. Incio na parte inferior, nodo no topo.1 = Ribeiro Pires 2620 combandas na regio A e B: B,
E, G, H; 2 = 1811 C, G; 3 = Roxa B, C, G, H; 4 = So Roque A, C, E, G, H; 5 = Gigante 915 C, D, F, G, H; 6 = 916 C, G, H; 7 = Crespa
Piracicaba A, E, G, H; 8 = Ribeiro Pires 2446 C, G, H; 9 = Crespa Capo Bonito C, E, G; 10 = Tupi B, G, H; 11 = Jundia C, F, I; 12 =
Mococa C, E, I; 13 = So Jos C, G, H; 14 = Roxa Monte Alegre A, C, F, I; 15 = Verde-Escura A, C, E, F,
So marcadores co-dominantes, as aloenzimas permitem
identificar diretamente os gentipos heterozigotos.
MARCADORES genticos MARCAS GENES?
MARCADORES
Morfolgicos Bioqumicos DNA RNA
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RFLPs
(Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Consiste na anlise de polimorfismo obtido atravs
da digestao do DNA com enzimas de restricao. Os
fragmentos sao caracterizados pela hibridizacao com
sondas especficas, aps separacao por eletroforese.
Southernblot
Sonda
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RAPDs
(Randomly Amplified Polymorphic DNA)
Amplificao de um segmento de DNA delimitado
por dois iniciadores (ou primers, ou
oligonucleotdeos), comumente com 10 pares de
bases, que so complementares a dois stios de
nucleotdeos, um em cada fita do DNA, posicionados
inversamente a uma distncia geralmente no
superior a 4kb.
RAPDs
(Random Amplified Polymorphic DNA)
A
A B
B
8
RAPD
DNA
Primer se liga a muitos locais no DNA
S quando primers ligam em direo
oposta ocorre amplificao
RAPD
DNA
Primers encontram-se na mesma direo,
amplificao NO acontecer
9
RAPD
DNA
> 2,000 bases
DNA
Primers so separados em pouca distncia,
fragmento AMPLIFICADO
100 - 1,500 bases
RAPD
Dominante
10
Microssatlites ou SSRs
(Single Sequence Repeats)
Consistem de pequenas seqncias (sequence
motif) com 1 a 4 nucleotdeos de comprimento,
repetidas em tandem. Essas regioes sao
amplificadas com primers especficos.
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Mononucleotdeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC
Dinucleotdeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC
Trinucleotdeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC
Tetranucleotdeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC
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Deteco de locos SSR
CACACA
GTGTGT
CACACA
GTGTGT
(CA)
3
(CA)
3
CACACA
GTGTGT
CACACACACA
GTGTGTGTGT
(CA)
3
(CA)
5
CACACACACA
GTGTGTGTGT
CACACACACA
GTGTGTGTGT
(CA)
5
(CA)
5
Amostra 1 Amostra 3 Amostra 2
5
5 3 GTGTGTGTGT
CACACACACA
GTGT
3
Taq
iniciador reverse
iniciador forward
P
2
GTGTGT 5 3
3
CACACA 5
P
2
P
1
P
1
GTGTGTGTGT 5
3
3
CACACACACA 5
F
1
F
1
5 3
3
GTGTGTGTGT
CACACACACA 5
5 3
3
GTGTGT
CACACA 5
Na recombinao dos alelos
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Caractersticas

M
homozigoto
heterozigoto

M
homozigoto
heterozigoto
Marcador co-dominante
Marcador multiallico
Microsatlites
SSR Simple Sequence Repeats
Pequenas sequncias (sequence motif) com 1 a 4
nucleotdeos repetidos em tandem - Amplificados via PCR
Classe de marcadores moleculares mais polimrficos
Sinonimias Sinonimias
SSR (Simple Sequence Repeats); SSR (Simple Sequence Repeats);
STMS (Sequence Tagged Microsatellites); STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms); SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);
Onde so encontrados ???
Mamferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
Plantas: (AT)n
Mitocndrias
MICROSSATLITES
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Modelos para explicar os processos mutacionais
envolvidos na formao das repeties
Escorreges da DNA polimerase
Crossing over desigual
Como os microsatlites so formados ?
Fita nascente
Fita molde
Replicao
+1 repeat
-1 repeat
Slippage
Misalignment
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Se voc escolheu os microssatlites como
marcador molecular para o seu estudo
a primeira coisa a fazer verificar se j
existem microsatlites para a sua espcie
no GenBank.
Se no, existem voc ter que desenvolv-los !
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Microsatlites em sequncias
AFLPs
(Amplified Fragment Length Polymorphism)
O ensaio combina a especificidade, resoluo e poder de
amostragem da digesto de enzimas de restrio com a
velocidade e praticidade de deteco do polimorfismo via
PCR.
Co-amplificao especfica de um grande nmero de
fragmentos de restrio.
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AATTCA --------GTTA
TTAAGT---------CAAT
Pr Pr - -amplifica amplifica o o
EcoR EcoR I I primer primer E E- -A
Mse Mse I I primer primer M M - - C C
5------GAATTC --------TTAA-----3
3------CTTAAG---------AATT-----5
AATTC --------T
G---------AAT
AATTC --------TTA
TTAAG---------AAT
Liga Liga o de adaptadores o de adaptadores
Mse Mse I adaptador I adaptador
EcoR EcoR I I adaptador adaptador TA
TTAA
5------GAATTC --------TTAA-----3
3------CTTAAG---------AATT-----5
Mse Mse I I EcoR EcoR I I
Digesto do DNA Digesto do DNA
Mse Mse I I primer primer M M - - CAC
AATTCAACA -----------GTGGTTA
TTAAGTTGT------------CACCAAT
EcoR EcoR I I primer primer E E- - ACA
Amplifica Amplifica o o
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AFLP AFLP
Vantagem indiscutivel
-Grande nmero de fragmentos
-Nmero de marcadores
simultneos analisados
-Facilidade e rapidez com que
realizado,
-Alta resoluo e repetitivo
Desvantagem
-Incapacidade de discriminar o
heterozigoto dos homozigotos.
SEQUENCIAMENTO
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Sequenciamento
Possibilita a caracterizacao direta da
sequncia de nucleotdeos de um fragmento
de DNA.
Usado para estudos do genoma nuclear e
citoplasmtico (cpDNA e mtDNA).
Detecta polimorfismo conhecido como
SNPs (single nucleotide polymorphism) ou
mesmo grande delecoes/insercoes (indels)
Biblioteca genmica
Sequenciamento
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Atributos Isoenzimas
Protenas
de sementes RFLPs RAPDs Microssatlites AFLPs
Nvel de
Polimorfismo
baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto
Estabilidade
ambiental
moderada alta alta alta alta alta
Nmero de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto
Expresso gentica co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante
Nmero de alelos por
loco
2-5 multiallico multiallico 2 multiallico 2
Distribuio no
genoma
regies de cpia
nica
regies de cpia
nica
vrias ao acaso ao acaso ao acaso
Acessibilidade
tecnolgica
muito alta muito alta mdia muito alta muito baixa mdia
Aplicabilidade no
melhoramento
rpido,
baixo custo
rpido,
baixo custo
lento,
custo mdio
rpido, baixo
custo
lento, custo alto rpido, custo
baixo
Identificao de
gentipos
baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta
Avaliao de
germoplasma
mdia baixa alta alta alta muito alta
Mapeamento
gentico
baixa muito baixa alta media muito alta alta
Mapeamento de
regies especficas
baixa inadequado mdia alta mdia muito alta
Mapeamento
comparativo
baixa inadequado muito alta baixa alta baixa
Gentica de
Autgamas
baixa baixa mdia alta muito alta muito alta
Gentica de
Algamas
mdia baixa mdia alta muito alta muito alta
Anlise Filogentica mdia baixa muito alta mdia alta mdia
Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).
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A
1
A
1
A
1
A
2
A
2
A
2
Marcadores dominantes
RAPD
AFLP
ISSR
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
L8
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
L7
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
L6
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
L5
1
0
1
1
0
0
0
1
0
1
L4
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
L3
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
L2
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
L1 Ind.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
L2
L1
L3
L5
L6
L4
L7
L8
Marcadores dominantes
22
A
1
A
1
A
1
A
2
A
2
A
2
Marcadores co-dominantes
Isoenzimas
RFLP
SSR
2/2
1/1
0/0
2/2
1/2
0/0
2/2
2/2
1/1
2/2
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
Gentipo Ind.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
Marcadores co-dominantes
23
O problema da dominncia
1
2
01 02 03
1/1 1/2 2/2
1
01 02 03
1/? 1/? 2/2
1 1 0
1
2
01 02 03
1/1 1/2 2/2
1
01 02 03
1/? 1/? 2/2
1 1 0