FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE BIOQUMICA
BIO267

GUIA N 1 BIO-267: BIOINFORMTICA I
La definicin ms bsica de bioinformtica corresponde a un hbrido entre la biotecnologa y la
computacin y comprende un grupo creciente de herramientas computacionales que permiten el
anlisis del conjunto de datos estructurales y de secuencias que se han acumulado a lo largo de los
aos.
Las principales herramientas de la bioinformtica son aquellas que nos permiten buscar
secuencias o estructuras especficas dentro de bases de datos que crecen da a da, para luego
compararlas contra secuencias o estructuras especficas (o bien contra bases de datos completas)
con el objeto de estudiar el grado de similitud que se pueda presentar entre protenas o
secuencias de DNA.
Sin embargo, la herramienta ms til que nos entrega la bioinformtica es una de las ms
antiguas. La base de datos Medline o Pubmed engloba un conjunto enorme de publicaciones
indexadas, y nos permite revisar con rapidez la literatura de acuerdo a diferentes parmetros que
incluyen, por cierto, la temtica de la investigacin realizada, los nombres de los autores, el tipo
de publicacin, o la revista cientfica que public el reporte, por nombrar slo algunos.

Actividad prctica N1
En este trabajo prctico aprenderemos a utilizar Pubmed y bases de datos asociadas, como
GeneBank, adems de herramientas de comparacin de secuencias, tanto de protenas como de
DNA.

Anote detalladamente la utilidad de cada pgina, y los resultados que se obtengan de cada una de
ellas.
1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

http://ca.expasy.org/tools/ herramientas bioinformticas

- Herramientas de traduccion de DNA a secuencia de aminocidos.
- http://ca.expasy.org/tools/dna.html
- http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/







GUIA N 2 BIO-267: BIOINFORMTICA II
Actividad Practica N2
1
- Caracterizacin de propiedades fisicoqumicas, punto isoelctrico, MW.
- http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
- http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html
2
- Bsqueda de pptido seal
- http://psort.nibb.ac.jp/form.html
3
- Prediccin de estructura secundaria
- http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_preda.html
4
-Clustal W
- http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html

FORMATO INFORME ACTIVIDAD PRCTICA BIOINFORMTICA 1 Y 2.
INTRODUCCION (0,5 ptos)
pgina. Debe incluir una BREVE resea sobre bioinformtica.
OBJETIVOS (0,2 ptos)
RESULTADOS (3 ptos)
1. Identificacin de una secuencia nucleotdica desconocida mediante programas
bioinformticos
En este punto se debe indicar lo siguiente:
a) Cul es su secuencia? Explicar los programas usados, los resultados y el razonamiento
que lo hicieron decidir a qu corresponde su secuencia (indique el nmero inicial de la
secuencia).
b) Anlisis de la regin codificante de su secuencia. Debe indicar qu porcentaje de la
protena completa tiene usted. Explicar el razonamiento.
c) Estudio de la protena deducida completa. Corresponde a la identificacin y al anlisis de
la protena completa que se deduce de su secuencia.
Identificacin: indicar nmero de acceso de la secuencia, organismo al cual pertenece, condiciones
en las que se obtuvo, funcin de la protena, proceso(s) en los que participa.
Anlisis: indicar el punto isoelctrico, la Masa Molecular, la localizacin subcelular y el nmero de
regiones transmembrana.
d) Comparacin de secuencias relacionadas. Indicar nombre y nmero de acceso de cada una
de las secuencias. Explicar los resultados obtenidos a partir del alineamiento mltiple,
indicar los motivos conservados comunes dentro de estas protenas (mencione los
aminocidos ms conservados dentro de ellos).

DISCUSION (2 ptos)
Debe incluir una pequea introduccin sobre la protena analizada, incluir las 3 publicaciones ms
recientes sobre este tema (incluyendo la cita dentro del texto y la referencia completa en la
bibliografa).
Discuta sobre la metodologa utilizada y los resultados obtenidos.
Incluya la conclusin.
REFERENCIAS (0,3 ptos)


GUIA N 3 BIO-267: Preparacin soluciones
SOLUCIONES

Una solucin es una mezcla homognea de dos o ms componentes. El componente que esta en
mayor proporcin se llama solvente y el o los componentes que estn en menor proporcin se
llaman solutos. En soluciones lquidas, el solvente es un lquido, mientras que los solutos pueden
ser slidos, lquidos o gases. La gran mayora de las soluciones usadas en bioqumica son
soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solucin no basta con indicar sus
componentes sino que tambin la proporcin en que estos estn presentes en la solucin, es
decir, la concentracin de cada uno de los solutos en la solucin.

UNIDADES DE CONCENTRACIN

Las ms usadas en la prctica son de dos tipos:
Unidades de concentracin referidas a volumen: indican cantidad de soluto disuelto por
unidad de volumen de solucin.
Ejemplo: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc.

Unidades de concentracin referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por
unidad de peso de solucin o de solvente.
Ejemplo: % p/p, molalidad.

1. Molaridad (M): nmero de moles de soluto por litro de solucin.

Para preparar una solucin de molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del
soluto.

Peso soluto (g) = nmero de moles de soluto PM (g/mol)

M = moles de soluto / volumen de solucin (L) (1)


Ejemplo: Una solucin 1 M ( 1 molar) de NaCl contienen 1 mol (58.44 g) de NaCl por litro. Un mol
de NaCl corresponde a un valor igual al nmero de Avogadro de molculas, que es 6.023 x 10
23
. La
concentracin de iones en solucin tambin se indica en unidades molares, en este caso el in es
la molcula.
Ejemplo: Consideremos la solucin 1 M de NaCl. Los enlaces inicos de la red cristalina de cloruro
de sodio se rompen al disolverse la sal.
NaCl Na
+
+ Cl
-
Por cada mol de NaCl slido se form 1 mol de Na
+
y 1 mol de Cl
-
.
Luego:
Concentracin de Na
+
= 1 mol
Concentracin de Cl
-
= 1 mol
Ejemplo: Para molculas distintas, como MgCl
2
MgCl
2
Mg
+2
+ 2 Cl
-
Una solucin de cloruro de magnesio 1 M contiene:

Concentracin de Mg
+2
= 1 mol
Concentracin de Cl
-


= 2 mol

La concentracin de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son submltiplos de M:

1 milimolar (mM) significa : 1 mmol en 1 L de solucin
( 1 mmol = 10
-3
moles)
1 micromolar (M) significa : 1 mol en 1 L de solucin
(1 Mol = 10
-6
moles)
1 nanomolar (nM) significa : 1 nmol en 1 L de solucin
(1 nMol = 10
-9
moles)
1 picomolar (pM) significa : 1 pmol en 1 L de solucin
(1 pMol = 10
-12
moles)


2. Normalidad: Nmero de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de solucin. Solamente
para algunos compuestos se define un P
eq
y ste siempre tiene relacin con la reactividad del
compuesto.
En general : P
eq
= PM / n

Para cidos y bases n = nmero de protones que puede ceder (el cido) o captar (la base) por
molcula.
Para compuestos que sufren reacciones redox n = N de electrones captados (agente oxidante) o
cedidos (agente reductor) por molcula.


3. Peso de soluto / volumen de solucin en g/l, mg/l, etc.: es la forma ms sencilla de indicar la
concentracin de una solucin es la forma ms usual, adems de la molaridad.

4. Porcentaje peso / volumen (% p/v) : peso de soluto en gramos por 100 ml de solucin (% g).
Se habla de porcentaje, ya que 100 ml de una solucin acuosa relativamente diluda pesan
aproximadamente 100 gr. Para soluciones muy diludas se usa el submltiplo mg % = peso del
soluto en mg por 100 ml de solucin.

5. Porcentaje peso / peso ( % p/p): peso en gramos de soluto por 100 gramos de solucin. La
concentracin de la mayora de los cidos comerciales viene dada en % p/p. Aqu la proporcin
de soluto puede ser mayor que la proporcin de solvente.
Ejemplo: H
2
SO
4
al 96%. Para transformar % p/p a concentracin molar o normal es necesario
conocer la densidad de la solucin.

Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial de 28 % densidad 1.15 (kg/L).


1. Calculamos cuanto pesa un litro de la solucin:
1 L x 1.15 ( kg. / L) =1.15 kg. = 1.150 g.

2. Ahora calculamos el peso de HCl ( HCl puro ) contenido en este litro: 100 g de solucin
contienen 28 g., 1.150 g. de solucin contienen:
1.150 g. x 0.28 = 322 g.

3. Finalmente, calculamos a cuantos moles corresponde este peso de HCl:

322 g. / 36.5 (g. / mol) = 8.82 moles
Hemos calculado que el litro del cido comercial contiene 8.82 moles de HCl, es decir, es 8.82 M.

6. Molalidad (m): nmero de moles de soluto por 1000 g de solvente. Esta unidad de
concentracin se usa solamente para ciertos clculos fsico qumicos. Expresar la
concentracin en estas unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la
temperatura. Al contrario, una concentracin expresada en unidades referidas a volumen,
como la molaridad, vara con la temperatura, ya que esta afecta el volumen. En soluciones
acuosas diluidas m es prcticamente igual a M.

PREPARACIN DE SOLUCIONES

Para preparar una solucin de un soluto dado se puede usar el soluto puro (generalmente slido)
o una solucin concentrada de l en el mismo solvente (solucin stock). Este ltimo caso
constituye una dilucin.
Para diluciones rige la relacin:

V
1
x C
1
= V
2
x C
2
(balance de masa soluto)

V
1
= volumen de la solucin concentrada
C
1
= concentracin de la solucin concentrada
V
2
=Volumen de la solucin diluda
C
2
= concentracin de la solucin diluda

C
1
y C
2
pueden ser unidades de concentracin de cualquier sistema referido a volumen.

Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solucin 2M de cloruro de
sodio y se afor con agua.

Cul ser la concentracin de la solucin resultante?

Nuestro sentido comn nos dice que la respuesta ser 0.2 M, ya que la solucin se diluy 10 veces.
El clculo segn la relacin dad sera:

C
2
= V
1
x C
1
/ V
2
= 10 ml x 2M / 100 ml
10 ml x 2M = 100 ml x XM donde X = 0.2 M





II pH Y TAMPONES

CIDOS Y BASES

De acuerdo a la definicin de Bronsted:

1. CIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio.
2. BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio.

En medio acuoso, la reaccin correspondiente de un cido HA ser:

HA + H
2
O H
3
O + A-

U obviando la participacin del agua:

HA H
+
+ A- (1)

Considerando esta reaccin en el sentido inverso, la especie A
-
puede captar protones. A
-
es la
base conjugada de HA. Similarmente para una base B:
B + H
+
BH
+
(2)

BH
+
es el cido conjugado de B.

Ejemplos de bases segn Bronsted: los compuestos orgnicos bsicos que deben su basicidad al
grupo funcional amino.

FUERZA DE CIDOS Y BASES

Un cido o una base fuerte es el que est completamente disociado en solucin. En cambio en
cido dbil esta solamente parcialmente disociado y la base parcialmente protonada.

cidos fuertes: HCl, HNO
3
, HClO
4
, H
2
SO
4
(ambos protones), H
3
PO
4
(solamente el primer protn que
se disocia).

Bases fuertes: NaOH, KOH, etc.

cidos y bases dbiles: prcticamente todos los cidos y bases orgnicos pertenecen a este grupo.


CIDOS Y BASES DBILES

a. CIDOS DBILES
Consideramos a modo de ejemplo el cido actico, HOAC.

Frmula estructural: CH
3
- COOH


Este cido dbil posee un solo protn cido. En solucin acuosa coexisten en equilibrio molculas
de la especie protonada con molculas del anin acetato (Oac
-
) y protones.
La relacin entre la concentracin de las especies nombradas a una temperatura determinada est
dada por la constante de equilibrio de la reaccin de disociacin, llamada constante de acidez, K
a
:

HOAc OAc
-
+ H
+
(3)


K
a
= [ OAc
-
] [ H
+
] / [HOAc ] (4)

K
a
del cido actico a 25 C: 1.78 x 10
-5


Se suele expresar la acidez a travs del pK
a
en vez de usar K
a
:

pK
a
= - log K
a
K
a
de HOAc (25 C) = 4.75

Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez calcularemos la
concentracin de las especies presentes en una solucin 0.1 M de HOAc.
Segn la ecuacin 3

[ H
+
] = [ OAc ] = x
[HOAc ] = 0.1 - x

El valor numrico de K
a
indica que HOAc estar poco disociado, por lo tanto es lcito efectuar la
siguiente aproximacin:

[HOAc ] = 0.1

reemplazando en la expresin de K
a
( ver recuadro) (4)

K
a
= x
2
/ 0.1 = 1.78 x 10
-5

X = 1.33 x 10
-3
M

Es decir, en nuestra solucin: la [HOAc ] es virtualmente 0.1 M, en tanto que la concentracin de
[OAc
-
] y de [ H
+
] es 1.33 mM.
Una vez conocida la concentracin de H
+
se puede calcular el pH de una solucin de cido actico
0.1 M empleando la siguiente frmula:
pH = - log [H
+
]
Por consiguiente, el pH de esta solucin ser a igual a log (1.33 x 10
-3
), vale decir pH = 2.88.

b. BASES DEBILES
Para Una base dbil B se puede definir tambin una constante. En este caso, la llamada constante
de basicidad K
b



K
b
= [ BH
+
] / [ B ] [H
+
] (5)

Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases dbiles a travs de la constante de acidez de su
cido conjugado BH
+
( invirtiendo la reaccin 2 ).

Para un par cido / base conjugada se cumple:

K
a
x

K
b
= K
w

Siendo K
w
= constante de disociacin del agua

K
w
= [H
+
] [OH
-
] = 10
-14
( 25 C)


ECUACIN DE HENDERSON HASSELBACH

En forma anloga a lo visto para el cido actico ( HOAc), se puede generalizar para un cido dbil
que denominaremos HA:

K
a
= [A
-
] [H
+
] / [HA ]

Despejando H
+
y aplicando log se obtiene la ecuacin de Henderson Hasselbach


pH = pKa + log [ A
-
] / [ HA ] (6)


Esta ecuacin establece la relacin entre pH, el pKa y la proporcin de la especie protonada (HA) y
la desprotonada ( A
-
). Se usa para calcular el pH de la mezcla de un cido dbil con un cido fuerte
o una base fuerte de un cido dbil con su sal, mezclas tampn, etc.

SOLUCIONES TAMPN

Cuando se titula una solucin de HOAc con una solucin de una base fuerte (NaOH), midiendo el
pH despus de cada
adicin se obtiene el
siguiente grfico, llamado
curva de titulacin :



0
7
14
punto de equivalencia ml NaOH
zona
tamponante

Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4.75 (pka) el pH vara muy poco durante la adicin
de base, se trata de la zona tamponante del par HOAC / OAc
-
.
Las 3 reacciones involucradas son:

1. NaOH Na
+
+ OH
-

2. OH
-
+ H
+
H
2
O
3. HOAc OAc
-
+ H
+


La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentracin de protones en la
solucin. Sin embargo, la tercera reaccin simultneamente repone parte de los protones
neutralizados. El equilibrio de disociacin de HOAc se desplaza hacia la formacin de acetato.

Para:

pH = pK
a
ocurre que HOAC = OAc
-
(verifique esta aseveracin)

A medida que la concentracin de la especie protonada HOAc en la solucin se hace pequea, el
pH comienza a aumentar ms fuertemente, hasta que la solucin pierde su caracterstica de
tampn.

Al titular una solucin bsica que contiene el anin acetato con un cido fuerte se observa el
mismo fenmeno. Estaramos recorriendo nuestra curva de derecha a izquierda.

Solucin tampn (solucin amortiguadora o buffer): es una solucin cuyo pH se mantiene
prcticamente constante cuando se le agregan pequeas cantidades de cido o base. Las
soluciones tampn son sistemas formados por un cido dbil y su base conjugada o por una base
dbil con un cido conjugado.

Rango de un sistema tampn: es el rango de pH en el cual el sistema posee propiedades de
tampn, esta dado por el pKa de la especie protonada. Un tampn es bueno aproximadamente
0.5 unidades de pH alrededor del pKa. Los valores de pKa para algunos tampones de uso comn en
bioqumica estn contenidos en la tabla 1. Tambin se usan mezclas de dos diferentes sistemas
tampn, ejemplos: tampn tris / fosfato, trienolamina / dietalamina, etc.
Capacidad de una solucin tampn: la capacidad de una solucin tampn indica la cantidad de
cido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su pH y depende de:

1. pH: es mxima para pH = pKa
2. Concentracin: a mayor concentracin, mayor capacidad tamponante.

TABLA 1
COMPUESTO pKa (20 C)
cido fosfrico (pKa 1) 1.96
Glicina 2.45
















SELECCIN DE UN TAMPN

Para la seleccin de un sistema buffer adecuado se deben considerar las siguientes variables:
a. El pH al cual deseamos trabajar
b. La capacidad tamponante requerida

Otros aspectos importantes a considerar son:
c. Solubilidad de los compuestos
Ejemplo: una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de sus sales.
d. Variacin del pH con la temperatura
Ejemplo: una desventaja de los tampones de Tris es que su pH vara notoriamente con la
temperatura.
e. Volatilidad: algunos sistemas tampn presentan la desventaja de ser voltiles.
Ejemplo: acetato de amonio, bicarbonato de amonio.
f. Transparencia a la luz U.V. : cuando se desea detectar un compuesto por absorciometra,
es necesario usar un buffer que sea suficientemente transparente (que no absorba) a al
longitud de onda de la determinacin.
g. Interacciones: entre el sistema tampn sobre la actividad de determinada enzima.
cido ctrico (pKa 1) 3.1
cido frmico 3.75
cido actico 4.75
cido ctrico (pKa 2) 4.75
cido ctrico (pKa 3) 5.40
MES (cido conjugado) 6.15
Imidazol (cido conjugado) 7.00
cido fosfrico (pKa 2) 7.21
HEPES (cido conjugado) 7.55
Trietanolamina (cido conjugado) 7.77
TRIS (cido conjugado) 8.08
cido fosfrico (pKa 3) 12.30


Observacin: la concentracin de un buffer es la suma de las concentraciones de la especie
protonada y de la especie desprotonada.

Ejemplo: se desea preparar un litro de buffer acetato 0.1 M de pH = 4.60 a partir de cido actico
2 M y acetato de sodio. La ecuacin de Henderson Hasselbach permite calcular la razn de las
concentraciones de HOAc y OAc
-
necesaria para que el pH de la solucin sea igual a 4.60:

pH = pKa + log [ OAc
-
] / [ HOAc ]


Reemplazando el pk
a
de HOAc y el pH:

4.60 = 4.75 + log [ OAc
-
] / [ HOAc ]

log [ OAc
-
] / [ HOAc ] = - 0.15 lo que implica : [ OAc
-
] / [ HOAc ] = 0.708

Por otra parte: [ HOAc ] + [ OAc
-
] = 0.1

(todas las concentraciones en concentracin molar, M)










En consideracin a que se desea preparar un volumen igual a un litro, se necesitan 0.0415 moles
de acetato de sodio.
NaOAc : PM = 82 lo que implica que 0.0415 moles = 3.4 g.
HOAc : se aplica la relacin de las diluciones

V
1
= 1 L x 0.0585 M / 2 M = 0.0293 L = 29.3 ml

Preparacin de la solucin: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3.4 g. de acetato de sodio
ms 29.3 ml de HOAc 2 M y se afora con agua destilada.







[ HOAc] = 0.1 - [ OAc- ]
Remplazando [ HOAc ] = 0.1 0.708 x [ HOAc]
Resolviendo [ HOAc ] = 0.0585 M y por consiguiente,
[ OAc- ] = 0.0415 M
FOTOMETRIA : ABSORCIOMETRIA

MONTAJE DE UNA TCNICA FOTOCOLORIMETRICA

Principios de absorciometra de UV / visible
La absorciometra aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiacin
electromagntica.

Los diferentes tipos de radiacin electromagntica: rayos X, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz
infrarroja, ondas de radio. Etc., se propagan a la misma velocidad, pero difieren en longitud de
onda y frecuencia. Para estas radiaciones se cumple la siguiente expresin matemtica.

c = x
c = velocidad de la luz en el vaco
= longitud de onda
= frecuencia

El ojo humano detecta la radiacin en un rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada
luz visible ( 1 nm = 10
-9
m ).

La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energa necesaria para
producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor energa a otro de mayor
energa de ciertos compuestos, llamados cromforos. Las sustancias coloreadas absorben luz
visible, su color corresponde a la radiacin no absorbida: la luz solar es blanca, ya que contiene
radiacin de todo el espectro visible, adems de otras radiaciones.

LEY DE LAMBERT - BEER

La ley de Lambert Beer es la ley fundamental de la absorciometra, ya que relaciona la absorcin
de la luz con la concentracin de las soluciones. Consideremos un haz de luz monocromtica (luz
de una solo longitud de onda) que atraviesa una solucin de un compuesto contenido en un
recipiente de vidrio.



El siguiente esquema ilustra la situacin:


I
0
I
--------------------------------> ----------------------------->
Luz incidente Luz transmitida


b
I
0.
: intensidad de haz incidente
I : intensidad de haz transmitido
b: camino ptico

Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I es menor que I
0
. Cuanto mayor es el
nmero de molculas de este cromforo encontradas por el haz de luz en su camino, menor ser
la intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de molculas depende de la distancia recorrida
a travs de la solucin (camino ptico) y de la concentracin. La relacin entre estos parmetros
esta dada por la ley de Lambert Beer :

I = I
0
x 10
- bc
(1)

La forma de esta ley que se usa en la prctica es ms sencilla y se obtiene aplicando logaritmos y
reordenando:

Log I
0
/ I = bc


Se define como absorbancia (A) de la solucin:

A = Log I
0
/ I (2)


Luego:
A = bc (3)
Ley de Lambert - Beer

Por conveniencia se usa el siguiente sistema de unidades:
b = camino ptico en cm.
c = concentracin en M
= coeficiente de extincin molar, en cm
-1
x M
-1



El coeficiente de extincin molar, , a una longitud de onda dada es una caracterstica propia del
cromforo y representa la probabilidad de que el cromforo absorba la radiacin. Para explicar el
significado de se suele sealar que es igual al valor numrico de la absorbancia que tendra una
solucin 1 M del cromforo si el camino ptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carcter
hipottico de esta afirmacin, ya que normalmente no es posible preparar soluciones de
concentracin 1 M de los cromforos ( si el PM es alto, 1 M es una concentracin
extremadamente alta), y por otra parte el orden de la magnitud de los corresponde a valores
muy superiores al rango de absorbencias medibles en la practica. Los coeficientes de extincin
pueden tomar valores hasta 1000.000 cm
1
M
-1
e incluso mayores.

La ley de Lambert Beer indica que la absorbancia a una dada aumenta en forma lineal con la
concentracin (con b = cte.), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial:


pendiente = 1
A
C

T = 10
-cb
T
C

Figura N 1


El grfico de la absorbancia de un cromforo en solucin en funcin de la longitud de onda se
denomina espectro de absorcin o espectrograma de absorcin.
Un espectro de absorcin se obtiene variando para b y c constantes, y por lo tanto representa la
variacin de A con (segn (3) ).
En la figura N 2 se muestra el espectro de absorcin de la riboflavina.

1
10

Figura N 2 espectro de absorcin de riboflavina(en fosfato de sodio, pH 7.0)
El espectro de absorcin de UV/ visible es caracterstico para un cromforo determinado, por lo
tanto se puede usar para su identificacin. Las caractersticas espectroscpicas se pueden resumir
indicando la posicin de los mximos de las bandas de absorcin (
mx
) con los correspondientes.
Por ejemplo, para riboflavinas a pH 7.0:


mx
( M
-1
cm
1
)
266 31.800
373 10.400
445 12.500

La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su nica banda en la regin del visible a 445 nm,
corresponde a absorcin de luz azul.



INSTRUMENTOS DE MEDICIN

Los componentes bsicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometra de UV / visible
son:

Fuente de luz
Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda.
Portador de muestra
Detector
Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor

Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos:
a. Fotmetros de filtro: la seleccin de la longitud de onda se realiza mediante filtros
intercambiables.
b. Espectrofotmetros: poseen un monocromador; son ms sofisticados que los fotmetros de
filtro. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el rango visible solamente y
otros que abarcan el UV y el visible (tiene 2 fuentes de luz ).





LA FUENTE DE LUZ

No existe una fuente de luz que proporcione radiacin de todo el rango espectral UV / visible de
suficiente intensidad, por consiguiente, se usan fuentes diferentes:

Fuente de luz visible: lmpara de tungsteno. Sirve para 340 850 nm aproximadamente.

SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA

FILTROS
No proporcionan luz realmente monocromatica, sino que permiten el paso de un cierto rango de
longitudes de onda alrededor de la longitud de onda mxima transmitancia del filtro.



MONOCROMADORES
Poseen un elemento dispensor, que puede ser un prisma o una red de distraccin. El elemento
dispensor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejo permite
dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida.
Al cerrar ms la ranura aumentar la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasara un cierto
rango de longitud de onda.
En la prctuca se considera que un espectrofotmetro opera con luz prcticamente
monocromtica. La calidad de un espectrofotmetro depende en parte importante de esta
caracterstica.

Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condicin necesaria para
obtener espectros de absorcin. Con un fotmetro de filtro no es posible obtener espectros de
absorcin.

PORTADOR DE MUESTRA:All se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de
referencia. Las cubetas son de vidrio o plstico (para el visible) o cuarzo (para el UV).
DETECTOR
Los detectores son del tipo fotoelctrico: al incidir luz producen corriente elctrica, de intensidad
proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen celdas de capa barrera (solamente para
fotmetros de filtro). Fototubos y tubos fotomultiplicadores.

LECTURA O REGISTRO
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Si el instrumento
informa la transmitancia se calcula A usando la ecuacin (5). La absorbancia se mide en 3 cifras
despus de la coma. El rango de A medible es de 0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000
(dependiendo del instrumento).

APLICACIN DE LA ABSORCIOMETRA EN EL ANLISIS CUANTITATIVO

1. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE UN CROMOFORO PURO
Midiendo la absorbancia de la solucin problema en un espectrofotmetro y conociendo el
correspondiente se puede calcular la concentracin. Normalmente, se usa la longitud de onda del
mximo de una banda, cuyo valor se encuentra en la literatura.
Un mtodo alternativo es construir una curva de calibracin de A en funcin de C, que ser una
recta si se cumple la ley de Lambert Beer (ver Fig. 1). Interpolando en la recta con la absorbancia
de la solucin problema se puede determinar su concentracin. La ventaja del mtodo con curva
de calibracin es que permite usar tambin un fotmetro de filtro.


2. DETERMINACIONES A TRAVS DE UNA REACCIN QUMICA O TEST
Compuestos que no pueden ser determinados en forma directa porque no absorben
convenientemente, se hacen reaccionar con un reactivo especfico formndose un cromforo.
Se realiza en paralelo el test con la muestra problema y con una o varias soluciones del compuesto
a determinar, de concentracin conocida (soluciones patrn). Posteriormente, se mide la
absorbancia.
Esta absorbancia ser proporcional a la concentracin del compuesto que se va a determinar
dentro de cierto rango de concentraciones. Si se us solamente una solucin, se calcula la
concentracin por proporcin directa:

C (problema)
=
A (problema)
C (estndar) A (estndar)

Si se usaron varias soluciones estndar se construye la curva de calibracin del test, y se interpola
en sta. Este grafico ser una recta cuya pendiente se ha llamado factor de calibracin , k:

A = k x C

En forma alternativa a interpolar en la recta se puede calcular C a partir de la absorbancia medida
dividiendo por el factor de calibracin.
CASOS EN LOS CUALES SE REALIZA UN TEST
1. El compuesto no absorbe en todo el UV visible:
Se realiza el test, generndose un cromforo, el cual generalmente absorbe en el visible (se
genera un color) o excepcionalmente solamente en el UV.
Ejemplo: determinaciones de azcares.
2. El compuesto absorbe en una regin espectral (generalmente UV) en la cual no se puede
efectuar la determinacin porque la solucin problema es una mezcla que contiene otros
compuestos que absorben en la misma regin que el compuesto a determinar y / o el
instrumento de la mediada permite medir solamente en el rango visible.
Ejemplo: determinacin de protenas.
Cuando se monta un mtodo fotocolorimtrico, pueden existir tres posibilidades:
a. Que la sustancia sea coloreada y que presente un mximo de absorcin caracterstico solo
para ella y por lo tanto, esta podra usarse para su determinacin fotocolorimtrica.
b. La sustancia en solucin es incolora, y por lo tanto, se aprovecha alguna propiedad
qumica de ella (poder reductor, oxidante, de sustitucin de grupos, etc. ) para desarrollar
una reaccin coloreada que sirve entonces para determinar su concentracin.
c. La sustancia en solucin, a pesar de ser incolora, presenta un mximo de absorcin
caracterstico, generalmente a longitudes de onda cortas (UV) que puede ser usada para
su determinacin.

BIBLIOGRAFA
H. WILLARD, L. MERRIT, J.DEAN INSTRUMENTAL METHODS OF ANLYSIS
G. EWING INSTRUMENTAL METHODS OF CHEMICAL ANLYSIS
A. STROBEL INSTRUMENTACIN QUMICA
S.B. BROWN, ED, AN INTRODUCTION TO SPECTROSCOPY FOR BIOCHEMISTS

ACTIVIDAD PRCTICA: Preparar las siguientes soluciones, e investigar cual es su utilidad en los
laboratorios de bioqumica.
Buffer Tris Glicina Solucin Stock 5X 1 L Buffer Tris Glicina Solucin de Trabajo 1X
15,1 g de Tris Base 25 mM de Tris-Cl
94 g de glicina 250 mM de glicina
50 mL de SDS al 10%
Ajustar pH a 8.3
0,1% SDS

Buffer TAE 50X 1Litro Buffer TAE 1X
242 g de Tris Base 40 mM de Tris-acetato
57,1 mL de acido actico glacial 1 mM de EDTA
100 mL de 0,5 M EDTA pH 8.0

Buffer Lower pH 8.8 1,5 M TRIS Buffer Upper pH 6.8 0,5 M TRIS
Tris 18.165 g Tris 6.055 g
HCl hasta pH 8.8 HCl hasta pH 6.8
SDS 10% 4mL SDS 4% 4mL
H
2
O Hasta 100 mL H
2
O hasta 100 mL

Buffer Fosfato de Sodio 1M (100 mL)
pH 1M Na
2
HPO
4
(mL) 1M NaH
2
PO
4
(mL)
6.8 46,3 35,7
7.0 57,7 42,3
7.2 68,4 31,6

Buffer Carga 6X geles DNA Buffer Citrato (pH 5,0)
50% Glicerol
10 mM TRIS pH 8.0 Citrato de Sodio 0.1 M
1 mM EDTA EDTA 0.15 M
Azul de Bromofenol

Buffer de carga protenas
50 mM Tris-Cl pH 6.8
100 mM DTT
2% (peso/volumen) SDS

0,1% azul de bromofenol
10 % (vol/vol) glicerol
Almacenar a T ambiente sin DTT, agregar DTT
1M antes de usar


Azul de Coomasie
0,25 g de Azul brillante de Coomasie R-250
100 mL de mezcla de [(500 mL de metanol y
400 mL de agua) y 100 mL de Acido actico
glacial]


GUIA N 4 BIO-267: Cuantificacin de Proteinas
Se han descrito un gran nmero de mtodos para la cuantificacin de protenas. Todos
representan ventajas y desventajas, la seleccin de uno en particular va a depender de la protena
que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada, posibles interferencias y la sencillez del
mtodo. En general, los mtodos estn basados en reacciones qumicas, absorcin ultravioleta,
reacciones de fluorescencia y determinacin de nitrgeno.

Mtodo Turbidimtrico: Las protenas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de
cido tricloroactico, sulfosaliclico o ferricianuro de potasio en cido actico. La turbidez
producida en la solucin al momento de la precipitacin depende de la cantidad de protenas en la
muestra y puede ser medida en un espectrofotmetro. Este mtodo tiene desventajas ya que no
todas las protenas precipitan en la misma cantidad e interfieren otras sustancias precipitables por
cidos. La ventaja que presenta su uso es la rapidez de la determinacin. El rango til de trabajo es
entre 0.1 y 0.3 mg de protenas agregadas.
Mtodos Colorimtricos: Se basan en el desarrollo de color al reaccionar las protenas de la
muestra con el reactivo correspondiente. La intensidad del color generado es proporcional a la
cantidad de protenas en la muestra y puede ser medida en un espectrofotmetro. Los mtodos
colorimtricos ms difundidos son;
a- Mtodo de Biuret: El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) reacciona con un
compuesto que contiene dos o mas enlaces peptdicos dando una coloracin violeta. El color
desarrollado se debe a un complejo de coordinacin entre el Cu y cuatro tomos de nitrgeno que
provienen de dos cadenas peptdicas adyacentes.
Los dipptidos y los aminocidos (excepto la serina y treonina) no dan esta reaccin. La
reaccin no es absolutamente especfica para los enlaces peptdicos, interfiriendo una serie de
compuestos en la determinacin de protenas como por ejemplo, sales de amonio. Mediante este
mtodo se pueden valorar protenas en un rango de 1 a 20 mg.
b- Mtodo de Lwry (tambin conocido como Folin-Ciocalteau): en este mtodo el color final de
la reaccin, es el resultado de la reaccin de Biuret de la protena con el in cobre en medio
alcalino y la reduccin del reactivo fosfomolbdico fosfotngstico por los residuos de tirosina y
triptofano presentes en las protenas formando un complejo de intenso color azul. Puede ser
aplicado tanto a muestras slidas como a soluciones y es sensible, pudiendo detectarse hasta 5 g
de protenas.
c- Mtodo de Bradford: Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G 250
de unirse a las protenas. El colorante solo presenta un mximo de absorcin a 465 nm mientras
que cuando est unido a la protena el mximo de absorcin se desplaza hasta los 595 nm. Es un
mtodo sensible que no depende de la naturaleza de los 595 nm. Es un mtodo sensible que no
depende de la naturaleza de los 595 nm. Es un mtodo sensible que no depende de la naturaleza
de la protena de la muestra y no presenta interferencia por otros componentes celulares o sales,
Aunque si interfieren en la determinacin detergentes y lcalis. La coloracin en presencia de
protenas es lineal en el rango de 0 a 30 g. Se recomienda leer a los 10 min de iniciada la
reaccin, debido a que el color no es estable en el tiempo, puesto que la protena comienza a
precipitar debido al medio cido del reactivo. Este efecto es especialmente significativo a altas
concentraciones de protenas. Una de las ventajas de este mtodo es que usa reactivos
comercialmente disponibles y su sensibilidad es comparable a la del mtodo de Lwry.
Mtodos de Absorcin Ultravioleta
La mayora de las protenas tiene un mximo de absorcin a 280 nm debido, primariamente, a
la presencia de tirosina y triptfano y secundariamente, a la presencia de fenilalanina y
cistena. Por consiguiente, el coeficiente de extincin molar a 280 nm vara de una protena a
otra debido a su composicin aminoacdica. Ms an, los cidos nucleicos que muchas veces
estn como contaminantes en las preparaciones de protenas, aunque tiene un mximo de
absorcin a 260, tambin lo hacen a 280 nm, falseando la lectura de las protenas. La razn de
absorbancia a 280 nm / 260 nm ha sido usada para eliminar la interferencia de cidos
nucleicos en la determinacin de protenas. El rango til de trabajo es entre 0.1 y 0.6 mg / ml.
Por debajo de 230 nm, la extincin de una solucin de protenas sube precipitadamente
alcanzando un mximo a 190 nm, se debe principalmente al enlace peptdico. En la prctica es
ms conveniente medir la extincin a 210 nm, ya que el coeficiente de extincin molar a esta
longitud de onda es de cerca de 200 para la mayora de las protenas y todas tienen una
absorcin especfica similar, pues el contenido de enlaces peptdicos es semejante.
Se han descrito una serie de mtodos que utilizan absorbancias menores a 240nm, sin
embargo, se obtiene mejores resultados con el mtodo de Scopes, en el cual se efectan
lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm, pudindose calcular el coeficiente de extincin molar
de una protena a 205 nm con bastante precisin.

CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BIURET
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) reacciona con un compuesto de
contiene dos o mas enlaces peptdicos dando una coloracin violeta. El color desarrollado se
debe a un complejo de coordinacin entre el Cu y cuatro tomos de nitrgeno que provienen
de dos cadenas peptdicas adyacentes.
Los dipptidos y los aminocidos (excepto la serina y treonina) no dan esta reaccin. La
reaccin no es absolutamente especfica para los en laces peptdicos, interfiriendo una serie de
compuestos en la determinacin de protenas como por ejemplo, sales de amonio.
Mediante este mtodo se pueden valorar protenas en un rango de 1 a10 mg.






MATERIALES
Reactivo Biuret: colocar 1.5 g, de CuSO
4
x H
2
O y 6 g. de tartrato de sodio y potasio (NAKC
4
H
4
O
6

x 4 H
2
O). Agregue alrededor de 500 ml de agua destilada y agitar hasta dilucin. Agregue
lentamente y agitando constantemente, 300 ml NaOH 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a
temperatura ambiente. Agregar 1.0 gr., de yoduro de potasio y agitar hasta que este
totalmente disuelto. Llevar a un volumen final de 1000 ml y guardar en un frasco de
polietileno. Este reactivo es estable indefinidamente.
Spectronic 20 (540 nm)
Muestra de albmina: solucin patrn de albmina 10 mg / ml.

CURVA DE CALIBRACIN PARA PROTENAS
1. Disponga de seis tubos y coloque en ellos volmenes de solucin estndar que contengan
2; 4; 6; 8 y 10 mg de albmina. El sexto tubo selo como blanco; 1 ml de agua destilada en
vez de albmina.
2. Enrase a 1 ml de volumen final con agua destilada.
3. Agregue 4 ml a cada tubo del reactivo de Biuret
4. Deje desarrollar el color durante 30 min., luego mida A a 540 nm

DETERMINACIN DE PROTENAS DE LA MUESTRA PROBLEMA
1. En un tubo coloque un volumen X (hasta 1 ml) de la muestra a determinar y enrasar a 1 ml
de volumen final con agua destilada.
2. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret
3. Deje desarrollar color durante 30 min. y mida A 540 nm.


CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BRADFORD
Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G 250 de unirse a la
protena. El colorante slo presenta un mximo de absorcin a 465 nm mientras que cuando
est unido a la protena el mximo es de 595 nm. La coloracin en presencia de protenas es
lineal en el rango de 0 30 g, Interfieren en la determinacin, detergentes y lcalis. Se
recomienda leer a los 10 min. de iniciada la reaccin, debido a que el color no es estable en el
tiempo, puesto que la protena comienza a precipitar debido al medio cido. Este efecto es
especialmente significativo a altas concentraciones de protenas.

MATERIALES
Reactivo de Bradford: disolver 100 mg. de azul de Coomasie G 250 (sigma) en 50 ml de etanol
95 % (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregue lentamente 100 ml de cido
fosfrico 85 % p /v y luego complete a 100 ml con agua destilada. Dejar el reactivo en reposo
todo un da y luego filtrar. El reactivo debe filtrarse toda vez que presente residuo o que el
blanco de reactivo ledo contra agua presente una absorbancia mayor a 0.5.

Para 250ml de Bradford: 25 mg de azul de Coomasie, 12.5 ETOH 95 % , 25 ml H
3
PO
4
.
Solucin patrn de albmina 100g / ml: como se trata de una solucin patrn diluido, debe
tenerse extremo cuidado en la pesada, y evitar que la albmina este con humedad. Si este es
el caso puede secarse en estufa a temperaturas moderadas (30 C).

CURVA DE CALIBRACIN
1. Disponga de 7 tubos y coloque en cada uno volmenes adecuados que contengan 5; 10;
15; 20; 25; 30 g de albmina, el sptimo tubo selo como blanco y agregue 0.8 ml de
agua destilada.
2. Complete todos los tubos a 0.8 ml con agua destilada.
3. Agregue 0.2 ml del reactivo de Bradford
4. Espere 10 min. y mida A 595 nm.


DETERMINACIN DE PROTENAS EN UNA MUESTRA PROBLEMA
1. Coloque en un tubo un volumen X de la muestra a determinar (hasta 0.5 ml) y enrasar a
0.5 ml de volumen final con agua destilada.
2. Agregue 5 ml de reactivo de Bradford.
3. espere 10 min. y lea la A a 595 nm utilizando como blanco el sptimo tubo de la curva de
calibracin.

BIBLIOGRAFA
Skoog & West. Anlisis Instrumental
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company 2
Edicin Pg. 75 77.
Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pg. 248 254.
GUIA N 5 BIO-267: Enzimologa 1

Caractersticas cinticas de Fosfatasa Acida

Las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de monosteres de fosfato con la
consecuente liberacin de fosfato inorgnico y estn ampliamente distribuidas en la
naturaleza.
Algunas de estas enzimas slo actan sobre ciertos sustratos. En esos casos, es fcil
asignarles una funcin fisiolgica, sin embrago, otro grupo de fosfatasas se encuentran en las
clulas de casi todos los organismos y tienen especificidad por un amplio rango de sustratos
por lo que generalmente se clasifican como fosfatasas cidas o fosfatasas alcalinas en base a
sus valores de pH ptimo.
Las semillas de plantas son especialmente ricas en fosfatasas cidas, aumentando su
actividad durante la germinacin y disminuyendo a medida que la planta se desarrolla. Este
tipo de enzimas se encuentra tambin en animales donde son importantes marcadores de
procesos fisiolgicos y patolgicos. Por ejemplo, la fosfatasa cida prosttica junto al antgeno
prosttico especfico es un marcador clsico de los procesos prostticos patolgicos. La
fosfatasa cida tambin se encuentra presente en el suero, y est formada por varias
isoenzimas. Una de ellas proviene de los osteoblastos y es resistente a tartrato. La
determinacin de esta enzima en suero es til para la deteccin del hiperparatiroidismo,
patologa donde su actividad se incrementa.
La fosfatasa alcalina se encuentra ampliamente distribuida y en mamferos se conocen
isoenzimas de intestino, placenta, tipo placenta y un no tejido especfico que se puede
encontrar en hueso, hgado y riones. La enzima de placenta ha sido encontrada slo en los
homnidos.

Mtodos
El ensayo que realizar aprovecha la amplia especificidad de sustrato de las fosfatasas, usando
el sustrato artificial p-nitrofenilfosfato. El grado de hidrlisis de este sustrato se determina por
la medicin espectrofotomtrica del p-nitrofenol liberado en la reaccin, ya que en medio
alcalino el p-nitrofenolato es de color amarillo y absorbe luz en la regin de los 405 nm.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Materiales
Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0
Sustrato pnitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
Solucin de pnitrofenol 60 M en NaOH 0.02 M
Solucin de 0.02 M NaOH
Solucin stock de enzima 5 mg / ml en BSA 0.1 % diluda 1:20
Bao termoregulado a 37 C

Curva de calibracin para la formacin de pnitrofenol

a) Curva de calibracin:

Coeficiente de extincin molar de p-Nitrofenol en 0.02M de NaOH=18.8x10
3
a 405 nm

El mtodo colorimtrico relaciona la absorbancia y los moles de p-nitrofenol
experimentalmente.

Protocolo:

Tubos p-Nitrofenol
60 M
moles de
p-Nitrofenol
NaOH 0.02 M Abs (405 nm)
1 0 6 0 (blanco)
2 1 5
3 2 4
4 3 3
5 4 2
6 5 1


Graficar moles versus absorbancia. Siguen la ley de Lambeert-Beer ?




















b) Bsqueda del rango:

El ensayo de la fosfatasa es un ensayo de tiempo fijo. Por lo que se debe determinar una
apropiada dilucin de enzima stock que rendir una formacin de producto constante en el
tiempo a travs del ensayo a realizar. Esto es importante porque la fosfatasa est sujeta a
inhibicin.

Protocolo:

Preparar un tubo conteniendo 2.0 mL de buffer citrato-EDTA pH 5 y 2 mL de p-nitrofenil
fosfato (NPP 2,5mM). Incubar a 37 C en bao de agua por unos minutos.
Diluir la enzima stock a 10 mL con albmina al 0.1 %
Agregar 1.0 mL de enzima diluida al tubo y mezclar.

Tiempo Alcuota NaOH 1M Abs (405 nm)
0 0.5 5.5 0 (blanco)
5 0.5 5.5
10 0.5 5.5
15 0.5 5.5
30 0.5 5.5


Graficar cantidad de moles de p-nitrofenol formados versus el tiempo.


BIBLIOGRAFA
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company, NY. 2
Edicin Pg. 77 85; 105 108.
Lehninger, A y col. Principios de Bioqumica.
Stryer, A. Bioqumica.
GUIA N 6 BIO-267: Enzimologa 2

Las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de monosteres de fosfato con la
consecuente liberacin de fosfato inorgnico; tienen un rango de sustrato amplio y se
clasifican de acuerdo a su pH ptimo como fosfatasas cidas o fosfatasas alcalinas.
Las fosfatasas cidas son muy comunes en semillas de plantas, donde aumentan su
actividad durante la germinacin. Tambin se encuentran en animales donde son responsables
de procesos fisiolgicos y patolgicos.
En este prctico aprovecharemos la amplia especificidad de sustrato de las fosfatasas,
usando el sustrato artificial p-nitrofenilfosfato.
Mtodos
La hidrlisis de este sustrato se determina por la medicin espectrofotomtrica del p-
nitrofenol liberado en la reaccin, ya que en medio alcalino el p-nitrofenolato es de color
amarillo y absorbe luz en la regin de los 405 nm.


II Prctico: Determinacin de Parmetros Cinticos

Preparar un tubo conteniendo 2.0 mL de buffer citrato-EDTA pH 5 y x mL de p-nitrofenil
fosfato (NPP0.025 M). Incubar a 37 C en bao de agua por unos minutos.
Diluir la enzima stock a 10 mL con albmina al 0.1 %
Agregar 1.0 mL de enzima diluida al tubo y mezclar.


Tubo pNPP (0.025 M) ml Citrato 0.1 M (mL) H2O hasta 4.5 mL Fosfatasa 1/20
1 0.05 2 0.5
2 0.10 2 0.5
3 0.20 2 0.5
4 0.50 2 0.5
5 1.00 2 0.5

Esperar 0 min, remover 1 mL de cada mezcla y agregarla a 5 mL de NaOH 0.1 M, blanco
Esperar 15 min, remover 1 mL de cada mezcla y agregarla a 5 mL de NaOH 0.1 M, medir.
GUIA N 7 BIO-267: Cromatografa Exclusin molecular
Los mtodos ms efectivos para fraccionar protenas usan la cromatografa en
columna, que aprovecha diferencias de carga, tamao, afinidad de unin, y otras propiedades
de las protenas para su separacin. En esta tcnica, un material poroso slido con las
propiedades qumicas adecuadas (fase estacionaria) se empaca en una columna. Una solucin
tamponada (fase mvil) se aplica sobre la fase estacionaria y percola (filtra) a travs de ella. La
solucin de protenas a separar se aplica de la misma manera sobre la fase estacionaria y
tambin filtra a travs de esta matriz slida; las protenas individuales migran a travs de la
columna a diferentes velocidades dependiendo de sus propiedades.
La cromatografa de exclusin es una tcnica til para separar compuestos de
diferente peso molecular. Cuando se coloca una solucin acuosa con macromolculas que
difieren en tamao y se pasa a travs de una columna empacada con gel de dextrano
(Sephadex) las molculas ms grandes son incapaces de penetrar los poros del gel (se
excluyen) y se mueven ms rpido a travs de la columna (tienen menos trayecto que
recorrer) que las pequeas. Estas ltimas, difunden a travs de los poros segn su tamao. Las
diferentes molculas eluyen de la columna en una secuencia decreciente en tamao
molecular.


Protocolo Cromatografa de exclusin molecular:
Montaje de la columna:
1. poner una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna empujarla con bagueta
2. poner un papel filtro cortado a medida sobre la lana de vidrio
3. colocar manguera y apretar con pinza en el soporte
4. Poner la resina
5. Escurrir agua hasta eliminar las burbujas
6. Agregar la resina (3ml) sin dejar que se seque mediante la adicin de buffer
7. Pasar 2 volmenes de buffer
8. Dejar a ras de la resina, sin que se seque
9. Agregar 0,5 ml de muestra problema
10. Pasar 10 volmenes de buffer (1 volumen 3 ml)
11. Recibir en tubos eppendorf fracciones de 1 ml
12. Medir a 280 nm
13. Graficar Abs 280nm vs n fracciones
GUIA N 7 BIO-267: Cromatografa intercambio inico
La cromatografa de intercambio inico aprovecha diferencias en la carga neta de
diferentes protenas a un pH determinado para producir su separacin. La matriz de la
columna es un polmero sinttico que posee grupos cargados unidos a l; aquellas que poseen
unidos grupos aninicos se llaman intercambiadores de cationes y las que poseen unidos
grupos catinicos se llaman intercambiadores de aniones. En el paso de elucin, los iones que
estn electrostticamente unidos a la matriz slida son reemplazados por iones en solucin de
la fase mvil.
La afinidad de cada protena por los grupos cargados en la columna es afectada por el
pH, el cual determina el estado de ionizacin de la protena y la concentracin de iones salinos
que compiten con ella por la unin a la columna. El pH y la concentracin de iones del buffer a
usar se eligen cuidadosamente de manera de lograr que la protena a purificar se una
fuertemente a la matriz. Varias protenas se unirn a la matriz con diferentes afinidades y en el
proceso de elucin aquellas protenas unidas con baja afinidad migrarn ms rpido que las
unidas con mayor afinidad. Las protenas fuertemente unidas se pueden eluir al cambiar el
buffer de elucin por uno de mayor concentracin de sales (proceso discontinuo). La
separacin se puede optimizar al cambiar gradualmente el pH y/o la concentracin de sales de
la fase mvil creando una gradiente de pH o sales.
Los intercambiadores inicos celulsicos son los ms usados para separar molculas
biolgicas. En ellos la celulosa (derivada de madera o algodn) es derivatizada con grupos
ionizables para formar el intercambiador. El intercambiador celulsico aninico ms usado es
el DEAE-celulosa (dietilaminoetil-celulosa), mientras que la carboximetil (CM)-celulosa es el
intercambiador catinico ms usado.


CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO IONICO
Materiales
Columna de vidrio de 10 ml
DEAE celulosa (Dietilaminoetil celulosa)
Muestra albmina 20 mg / ml.
Tampn fosfato de sodio 20 mM pH 7.0
Soluciones NaCl 0.05 M; 0.1 M; 0.2 M; 0.5 M en tampn fosfato de sodio 20mM pH 7.0

MONTAJE DE LA COLUMNA
Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una bagueta.
Mediante una pinza cierre la salida de la columna y llene sta con tampn fosfato 20 mM pH
7.0. Soltando la pinza, deje escurrir el tampn hasta la mitad de la columna.
Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si hubiera quedado
alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de nuevo.
A la columna llena hasta la mitad con tampn, comience a agregar DEAE, previamente
equilibrada en el tampn fosfato. Abra la pinza dejando escurrir tampn, sin dejar que se
seque el lecho de celulosa que va formando. Contine agregando celulosa hasta completar un
lecho de aproximadamente 4 ml. Haga pasar 20 ml de tampn por la columna con el fin de
equilibrarla.
COLOCACIN DE LA MUESTRA
Una vez equilibrada la columna, deje escurrir el tampn, cuando est a punto de empezar a
secarse la superficie del lecho de la columna, agregue 1 ml de muestra. Una vez que la muestra
ha entrado al lecho de la columna, agregue un poco de tampn lavando las paredes y espere a
que penetre. Luego lave la columna con 12 15 ml de tampn recolectando fracciones de
aproximadamente 3 ml.
ELUCIN DE LA MUESTRA
Con el fin de eludir la muestra, agregue sucesivamente de 15 ml de las soluciones NaCl en
concentraciones crecientes. Colecte el eludo de la columna en fracciones de 3 ml cada una.
CUANTIFICACIN DE LA MUESTRA EN EL ELUATO
La cuantificacin de la protena en las distintas fracciones se realizar por la tcnica de Biuret.
Para ello tome 1 ml de las fracciones impares y agregue 4 ml de reactivo de Biuret. Prepare el
blanco correspondiente y un par de estndares apropiados (4 y 8 mg de albmina).

Con los resultados de concentracin de protenas, construya un grfico en que en la ordenada
se seale el nmero de fraccin y en la abscisa la concentracin de protenas por fraccin.
Adems, indique con una flecha los cambios de solucin salina.
GUIA N 8 BIO-267: Electroforesis geles agarosa Lisis Alcalina

La electroforesis en geles de agarosa, es una tcnica que nos permite separar
fragmentos de DNA de acuerdo a su tamao molecular al someterlos a un campo elctrico.
Debido a la carga elctrica negativa inherente a la estructura del DNA, no es necesario ningn
tratamiento especial a la muestra antes de cargarla en el gel (la muestra, entonces, puede ser
DNA disuelto simplemente en agua destilada).
La migracin de la muestra en un gel de agarosa se ver afectada principalmente por el
tamao de la muestra y la concentracin de la agarosa, de manera que concentraciones ms
altas de agarosa permitirn la separacin de fragmentos pequeos de DNA, pero dificultarn la
resolucin de fragmentos grandes de DNA. De esta forma, la concentracin de agarosa a
utilizar en el gel se debe decidir en base a los fragmentos de DNA que se intenta separar.
Al correr estndares que consisten en fragmentos de DNA de peso molecular conocido,
se puede estimar el tamao de fragmentos desconocidos al comparar su migracin con la de
los estndares. Para esto es necesario trabajar con fragmentos lineales de DNA, ya que el DNA
circular presenta una migracin alterada debido al fenmeno de sobreenrollamiento.


Lisis Alcalina
Da 1
En 5 mL de LB agregar la cepa que posee el plasmidio (5 uL)
Agregar Antibiotico (ej: Amplicilina) 1 X en el tubo (5uL)
Crecer hasta saturacin OD: 0,6
Da 2 Lisis Alcalina
1. Peletear las clulas 1 min a 12000 rpm a 4C
2. Resuspender el pellet en la solucin 1 (100 uL)
3. Agregar 200 uL de solucin 2 fresca

100 uL SDS 10 %
40 uL NaOH 5M
860 uL de agua Mili Q
1. Agregar 150 uL de solucin 3
2. Dejar 5 min en hielo
3. Centrifugar 5 min a 12000 4C
4. Secar sobrenadante (dejar limpio)
5. Agregar 1 Volumen de isopropanol
6. Precipitar 20 minutos a -20 C
7. Centrifugar 30 segundos a 14000 RPM
8. Secar y resuspender en 50 ul de agua mili Q
Solucin 1
50 mM glucosa, 25 mM Tris HCl pH:8.0, 10 mM EDTA

Solucin 3
Acetato de Potasio 5M 60 mL, acido actico glacial 11,5 mL, agua 28,5 mL
GUIA N 9 BIO-267: Electroforesis geles poliacrilamida

La electroforesis es una tcnica basada en la migracin de protenas cargadas en un
campo elctrico. Es especialmente til como un mtodo de anlisis que permite visualizar y
separar protenas rpidamente de modo de estimar el nmero de stas en una mezcla o el
grado de pureza de una preparacin.
Las tcnicas electroforticas tambin permiten determinar algunas propiedades importantes
de las protenas, como su punto isoelctrico y su peso molecular aproximado.
La electroforesis se realiza generalmente en geles preparados con el polmero
entrecruzado poliacrilamida. La poliacrilamida acta como un tamiz (colador) molecular que
hace ms lenta la migracin de las protenas en forma proporcional a su relacin carga-masa,
dependiendo de su forma y tamao.
La electroforesis en presencia de dodecil-sulfato de sodio (SDS) es muy usada para la
estimacin de la pureza y peso molecular de protenas. El SDS es un detergente que se une a la
mayora de las protenas, probablemente por interacciones hidrofbicas, en cantidad
proporcional al peso molecular de ellas (aproximadamente una molcula de SDS cada dos
residuos de aminocidos) y otorga una gran carga neta negativa a las protenas convirtiendo a
la carga intrnseca de sta en insignificante. De esta forma, la electroforesis en geles de
poliacrilamida en presencia de SDS (SDS_PAGE) separa las protenas casi exclusivamente en
base a su peso molecular de modo que los polipptidos ms pequeos migran ms rpido y los
ms grandes migran ms lento.
Despus de la electroforesis las protenas pueden ser visualizadas al incubar el gel en presencia
de un colorante como el azul de Coomassie R-250 que se une a las protenas, pero no al gel.
Al comparar las migraciones de protenas desconocidas respecto de las migraciones de
protenas de peso molecular conocido presentes en un estndar de peso molecular se puede
estimar el peso molecular de las primeras. Si una protena consiste en dos o ms subunidades,
stas se separaran con el tratamiento con SDS y aparecern como bandas independientes en
el gel.


ELECTROFORESIS DISCONTINUA DE PROTENAS SERICAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN
CONDICIONES DESNATURANTES

PARTE EXPERIMENTAL

A.- SOLUCIONES
A. Acrilamida bisacrilamida: 45% - 1.2% ( 46.2 %T 2.6 %C).
Precaucin: la acrilamida es neurotxica. EVITE EL CONTACTO DIRECTO. Agregar a la
solucin una punta de esptula de carbn activado agitar durante 2 horas, filtrar por
papel whatman. Guardar a 4C.
B. Tampn gel separador
1.5 M Tris HCl pH 8.8, 0.4 % SDS (guardar a 4C).
C. Tampn gel espaciador
0.5 M Tris HCl pH 6.8, 0.4 % SDS (guardar a 4C).0.5 M
D. Persulfato de amonio 1%
Preparar solucin fresca; duracin una semana (guardar a 4C)
E. Temed ( N; N; N; N tetrametiletilendiamina)
F. Tampn de corrida 4X
0.1 M Tris, 0.768 M glicina, 0.4 % SDS. Diluir con agua antes de usar, no es necesario
ajustar pH. (guardar a 4C).
G. SDS 20% P /V (guardar a temperatura ambiente)
H. Azul de Bromofenol:
0.2 % azul de Bromofenol en 0.1 M Tris HCl pH 6.8
I. Tampn de muestra (5X)
0.125 M Tris HCl pH 6.8, 5 % SDS, 25% glicerol, 0.05% azul de Bromofenol (guardar
a -20C).
J. Fijador: 30% etanol, 10% cido actico
K. Solucin de teido
0.3% azul de Coomasie R 250 en 50% metanol y 10% cido actico. Se disuelve el
azul de Coomasie en metanol (agitar 8 horas), se filtra, se agrega cido actico y el
agua.
L. Solucin de desteido: 7% cido actico 30% metanol

B.- PREPARACIN DE GELES
M. Gel separador
Acril Bis 45 1.2&
Tris HCl 1.5 M pH 8.8, 1.2% SDS
Persulfato 1%
Agua
TEMED
Importante: todas las operaciones se realizan en hielo para evitar polimerizacin.

N. Gel espaciador
Acril Bis 45 1.2&
Tris HCl 0.5 M pH 6.8, 0.8 % SDS
Persulfato 1%
Agua
TEMED



PROCEDIMIENTO

A. Limpiar las placas de vidrio con acetona y etanol.
B. Engrasar los espaciadores (0.15 cm de grosor) y armar la placa fijando pinzas.
C. Agregar el volumen necesario de la mezcla del gel separador hasta una altura de 6 cm.
D. Borra el menisco, agregando suavemente por las paredes tampn 1.5 M Tris HCl pH 8.8,
1.2% SDS, diluido 1: 4.
E. Dejar gelificar por 20 min.
F. Eliminar tampn diluido y lavar la superficie con agua destilada.
G. Preparar el gel espaciador
H. Agregar el volumen necesario sobre el gel separador. Colocar peineta de 8 10 surcos,
evitando que queden burbujas de aire. Dejar gelificar por 20 min.
I. Una vez gelificado el gel espaciador, retirar la peineta y el espaciador basal y colocar las
placas en la cmara electrofortica.
J. Agregar el tampn de corrida al depsito inferior evitando atrapar aire en el borde del gel.


Figura 1: Esquema del aparato de electroforesis discontinua en geles de poliacrilamida.



C.- PREPARACIN Y APLICACIN DE LA MUESTRA
A. La cantidad de protenas sericas a aplicar es de 30 a 60 g por surco.
B. Diluir las muestras con buffer muestra 1: 5. Agregar - mercaptoetanol 5% final y hervir
por 2 min.
C. Los volmenes recomendables a aplicar por surco son de 40 70 L
D. Aplicar las muestras con micro pipeta adecuada y agregar nuevamente tampn de corrida
sobre las muestras y el depsito superior.

D.- CORRIDA ELECTROFORTICA
A. Conectar los electrodos ( polo +, abajo)
B. Aplicar 10 15 mA hasta que el indicador del frente inico llegue a 1 cm del borde del gel
(ms o menos 2 horas)
E.- FIJACIN Y TINCIN
A. Transcurrido el tiempo de corrida, retirar los espaciadores y placas de vidrio y sumergir el
gel en solucin fijadora por una hora. Luego, trasladar a la solucin colorante tambin una
hora.
B. Cambiar a solucin decolorante hasta que las bandas se observen sobre fondo claro.

F.- CALCULO DEL PESO MOLECULAR DE LA ALBMINA
A. En forma paralela a las protenas sericas, se someter a electroforesis albmina srica
bovina pura ms otras protenas de peso molecular conocido. Mida las distancias de
migracin y grafique log peso molecular versus distancia. Por interpolacin determine el
peso molecular de la albmina srica.