Bloque II

15/10/2013
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Biotecnologa Industrial
BLOQUE II: Cintica enzimtica y crecimiento microbiano
Tema2: Cintica enzimtica
Tema3: Cintica microbiana
1. Aspectos generales de las enzimas
1. Propiedades
2. Modo de accin
3. Regulacin de la actividad enzimtica
4. Clasificacin y nomenclatura
2. Conceptos bsicos de cintica qumica
3. Cintica enzimtica
4. Modelo cintico de Michaelis-Menten
5. Clculo e interpretacin de Km y Vmax
6. Actividad enzimtica
7. Tipos de inhibicin
8. Otras enzimas
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Las reacciones qumicas que ocurren en los organismos vivos presentan casi siempre
una energa de activacin tan elevada, que en condiciones compatibles con la vida
ocurriran a velocidades casi nulas.
Como consecuencia, una de las principales adquisiciones evolutivas de los seres vivos
fue la aparicin de protenas con actividad cataltica (enzimas), que al disminuir la
energa de activacin de las reacciones hacen posible no slo que stas se produzcan a
gran velocidad, sino que se lleven a cabo en condiciones moderadas de presin,
temperatura, pH, etc., compatibles con la vida.
Las enzimas son generalmente proteinas globulares con actividad cataltica, pero
tambin hay molculas de RNA (ribozimas).
Las enzimas se diferencian de los catalizadores qumicos ordinarios en varios aspectos
importantes:
Velocidades de reaccin ms elevadas
Condiciones de reaccin ms suaves: temperaturas por debajo de 50C, a la presin
atmosfrica y a valores de pH casi neutros.
Mayor especificidad de reaccin: especificidad muy grande, tanto respecto a las
identidades de sus sustratos (reactantes) como de sus productos
Capacidad para la regulacin: propiedad fundamental para la relacin entre la actividad
enzimtica y la homeostasis de los organismo vivos
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1.1 Propiedades generales de las enzimas
Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser protenas y de actuar como
catalizadores. Como protenas, poseen una conformacin natural ms estable que las
dems conformaciones posibles.
As, cambios en la conformacin suelen ir asociados en cambios en la
actividad cataltica. Los factores que influyen de manera ms directa sobre la actividad
de un enzima son:
pH
Temperatura
Cofactor
pH
Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH
2
; tiol -SH,
etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos.
Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra.
Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un
pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el
llamadopH ptimo.
La mayora de los enzimas son bastante sensibles a cambios del pH.
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pH
Temperatura
En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas.
Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas,
a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor.
La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima.
Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la
temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la
desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.
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Cofactor
Esuncomponentenoproteico,necesarioparalaaccindeuna enzima.Elcofactorse
uneaunaestructura proteica,denominada apoenzima,yelcomplejoapoenzima
cofactorrecibeelnombrede holoenzima (formaactivadelenzima).
Aquelloscofactoresqueestncovalentementeunidosalaapoenzimason
denominados gruposprostticos,yaseanorgnicos(coenzimas)oinorgnicos.Los
cofactoressonbsicamentededostipos,ionesmetlicosymolculasorgnicas,
denominadas coenzimas.
Soncompuestosquesemodificanenlareaccinactuandocomoaceptordonadorde
electronesy/ogruposfuncionales.
FAD(flavn-adenndinucletido): transferencia de electrones y protones.
FMN (flavnmononucletido): transferencia de electrones y protones.
NAD
+
(nicotn-adenndinucletido): transferencia de electrones y
protones.
NADP
+
(nicotn-adenndinucletido fosfato):
Coenzima A: transferencia de grupos acetilo (por ejemplo, en
la descarboxilacindel cido pirvico) y de grupos aciloen general.
Coenzima Q: transferencia de electrones en la cadena respiratoria.
Coenzima B
12
: transferencia de grupos metilo o hidrgenos entre
molculas.
TPP (pirofosfato de tiamina): transferencia de grupos aldehdo; forma
parte, entre otros, del complejo piruvato deshidrogenasa.
Vitamina C
1.2 Modo de accin
En las reacciones espontneas, los productos finales tienen menos energa libre de
Gibbs(AG) que los reactantes.Por tanto, en las reacciones espontneas se libera
energa de Gibbs(AG<0).
Sin embargo, el comienzo de la reaccin requiere un aporte inicial de energa. Esta
energa inicial que hay que suministrar a los reactantes para que la reaccin
transcurra se llamaenerga de activacin (E
a
). Cuanto menor es la E
a
ms
fcilmente transcurre la reaccin.
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1.2 Modo de accin
La accin de los catalizadores consiste, precisamente, en disminuir la E
a
.
Los enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la E
a
an
ms que los catalizadores inorgnicos. Por ejemplo, la descomposicin del agua
oxigenada (H
2
O
2
) puede ocurrir sin catalizador, con un catalizador inorgnico
(platino), o con un enzima (catalasa).
Las respectivas E
a
para cada proceso son 18, 12 y 6 Kcal/mol. As, se puede calcular
que el platino acelera la reaccin 20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera
370.000 veces.
1.2 Modo de accin
o Para que una reaccin qumica tenga lugar, las molculas de los reactantes deben chocar
con una energa y una orientacin adecuadas.
o La actuacin del enzima permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro
activocon una orientacin ptima para que la reaccin se produzca, debilitando los
enlaces existentes y facilitando la formacin de otros nuevos.
o Centro activo: se define como el lugar de unin del sustrato al enzima. La configuracin
del sitio activo confiere a los enzimas sus caractersticas de especificidad cataltica
respecto del sustrato.
Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima:
el modelollave-cerradura
el modelo del ajuste inducido
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1.2 Modo de accin
o Modelo llave-cerradura.
El modelo llave-cerradura supone que la estructura del sustrato y la del centro activo
son complementarias, de la misma forma que una llave encaja en una cerradura.
1.2 Modo de accin
o Modelo ajuste inducido.
En algunos casos, el centro activo adopta la conformacin idnea slo en presencia del
sustrato. La unin del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio
conformacional que da lugar a la formacin del producto.
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1.3 Regulacin de la actividad enzimtica
Una molcula de enzima no tiene por qu actuar siempre a la misma velocidad. Su
actividad puede estar modulada por:
cambios en el pH
cambios en latemperatura
presencia decofactores
lasconcentraciones del sustrato y de los productos finales
presencia deinhibidores
modulacin alostrica
modificacin covalente
activacin por proteolisis
isoenzimas
Lasconcentraciones del sustrato y de los productos finales
La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de sustrato.
Adems, lapresencia de los productos finales puede hacer que la reaccin sea ms
lenta, o incluso invertir su sentido.
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Presencia deinhibidores
Ciertas molculas pueden inhibir la accin cataltica de un enzima: son losinhibidores. Estos
inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el
sustrato original (inhibidor competitivo) o bien alteran la conformacin espacial del enzima,
impidiendo su unin al sustrato (inhibidor no competitivo)
1.4 Clasificacin y nomenclatura.
Nombres particulares
Antiguamente, los enzimas recibannombres particulares, asignados por su
descubridor. Al ir aumentando el nmero de enzimas conocidos, se hizo necesaria una
nomenclatura sistemtica que informara sobre la accin especfica de cada enzima y
los sustratos sobre los que actuaba.
Nombre sistemtico: consta de 3 partes:
El sustrato preferente
El tipo de reaccin realizado
Terminacin "asa"
Un ejemplo sera la glucosa fosfato isomerasaque cataliza la isomerizacin de la glucosa-6-fosfato en
fructosa-6-fosfato.
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Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular
Biology (NC-IUBMB): http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
El nombre de cada enzima puede ser identificado por uncdigo numrico,
encabezado por las letras EC (enzymecommission), seguidas de cuatro
nmeros separados por puntos. El primer nmero indica a cual de las seis clases
pertenece el enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada
grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos qumicos especficos que
intervienen en la reaccin.
Ejemplo: ATP_glucosafosfotransferasa(glucoquinasa) se define como EC
2.7.1.2. El nmero 2 indica que es una transferasa, el 7 que es una
fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, y el ltimo 2 indica
que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.
Cdigo de la comisin enzimtica(enzymecomission)
Oxidoreductasas: reacciones de oxidacin-reduccin
Transferasas: transferencia de grupos funcionales
Hidrolasas: reacciones de hidrlisis
Liasas: adicin a dobles enlaces
Isomerasas: reacciones de isomerizacin
Ligasas: son enzimas de sntesis
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El estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas
comienza a finales del siglo XIX.
La mayor parte de los primeros estudios, sobre cintica enzimtica, se
realizaron con la enzima invertasa, que cataliza la reaccin:
Sacarosa + Agua Glucosa + Fructosa
OSullivan y Tompson (1890) estudiaron esta reaccin e hicieron
una serie de importantes observaciones:
La reaccin era dependiente de la acidez del medio de reaccin.
Supuesto que la acidez era la apropiada, la velocidad de la reaccin era
proporcional a la cantidad de enzima.
La velocidad disminua a medida que el sustrato se consuma, y pareca ser
proporcional a la concentracin de sacarosa, aunque haba ciertas
desviaciones respecto de la curva esperada.
A bajas temperaturas la velocidad de reaccin se duplicaba por cada
incremento de 10C. Sin embargo, a diferencia de los catalizadores qumicos,
la invertasapresentaba una temperatura ptima, por encima de la cual la
velocidad caa rpidamente a cero.
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Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son
aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas.
No obstante, muestran un rasgo caracterstico saturacin por el sustrato,
entendida en trminos de ocupacin de los centros
activos de todas las molculas de enzima.
De forma prctica para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la
concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin,
manteniendo la cantidad de enzima constante.
Si representamos v
0
frente a [S]
0
obtenemos una grfica como la de la Figura.
Cuando [S]
0
es pequea, la velocidad inicial es
directamente proporcional a la concentracin de
sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer
orden.
A altas [S]
0
, el enzima se encuentra saturada por
el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]
0
.
En este punto, la reaccin es de orden cero y la
velocidad es mxima (V
max
).
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En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teora y propusieron
una ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de los enzimas.
Para explicar la relacin observada entre la velocidad inicial (v
0
) y la concentracin
inicial de sustrato ([S]
0
) Michaelis -Menten propusieron que las reacciones catalizadas
enzimticamente ocurren en dos etapas:
En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el
complejo enzima-sustrato da lugar a la formacin del producto, liberando el enzima
libre:
Realizaron sus estudios utilizando el concepto de velocidades iniciales de
reaccin y diferentes concentraciones de sustrato. Con lo que eliminaban
factores:
- reversibilidad,
- inhibicin por producto y
- desactivacin de la enzima.
Este modelo es el que, bsicamente, se ha utilizado para el desarrollo de
la Enzimologa clsica.
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Las reacciones enzimticas ms sencillas son las denominadas reacciones
monosustrato, es decir aquellas que implican la accin de la enzima (E) sobre un
unicosustrato (S).
La ecuacin matemtica que describe el comportamiento cintico de una reaccin
de este tipo puede deducirse, mediante dos aproximaciones:
Aproximacin del equilibrio rpido (Michaelis-Menten)
Aproximacin del estado estacionario (Briggs-Haldane).
Aproximacin del equilibrio rpido
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Condiciones de la Ecuacin de Michaelis-Menten
Formacin de un rpido equilibrio entre la enzima libre y el sustrato inicial
La concentracin de substrato inicial es muy superior a la enzima:
Complejo [ES] es despreciable como sumando frente a la [So]
La [S] que aparece en todas las ecuaciones es la inicial [So].
Las velocidades son siempre iniciales
Velocidad inicial es proporcional a la constante de catlisis y a la [ES]
Paso limitante de la reaccin total es el paso de ES P
Valor de la constante de catlisis kcat <<<k
-1
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Aproximacin del estado estacionario
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5. Clculo e interpretacin de parmetros cinticos
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La curva (v [S]), definida por la ecuacin M-M:
El cociente Kcat/Km, constante de especificidad de una enzima, define la eficacia cataltica
y el grado de evolucin de una enzima.
Este valor no puede superar el lmite de difusin de dos substancias que van a reaccionar que
es de 10
8
-10
9
M
-1
s
-1
.
La ecuacin de M-M define una serie de parmetros tiles del comportamiento de una enzima.
Vmax indica aquella velocidad mxima alcanzable por una cantidad determinada de enzima a
concentraciones saturantes de substrato.
La Vmax es igual al producto de la constante de catlisis Kcat por la concentracin total de
enzima presente [Eo], permite obtener el valor de Kcat conociendo la enzima presente.
La constante de Michaelis, Km representa aquella concentracin de substrato para la cual la
velocidad inicial es igual a la mitad de la velocidad mxima. Es una medida de la afinidad de la
enzima por el substrato.
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Slo puede conocerse cuando se tiene a la enzima pura y por tanto se
conoce su concentracin: kcat = Vmax / [E]total
En una reaccin en equilibrio rpido es la constante de velocidad de
primer orden de conversin de ES a EP: (k
2
).
En una reaccin en estado estacionario es una funcin de todas las
constantes de velocidad de primer orden (de pasos que ocurren tras la
unin de los sustratos).
Si uno de los pasos es limitante de la velocidad, kcat es la constante de
velocidad de este paso.
A kcat tambin se le conoce como nmero de recambio, porque indica el
nmero mximo de ciclos catalticos por sitio activo y por unidad de tiempo.
kcat
| |
| |
| |
| |
| | S Km
S
Eo kcat v
S Km
S
V v
+
=
+
= max
| | Eo
V
kcat
max
=
Kcat o nmero de cambio de una enzima:
Corresponde al nmero de moles de substrato transformado por mol de enzima en la
unidad de tiempo (Unidades de t
-1
)
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Cuando estamos estudiando una enzima, por lo menos al principio, es prcticamente
imposible conocer la concentracin inicial real de enzima, [Eo], lo que complica el
uso de la ec. de Michaelis-Mentenen la forma:
Esta dificultad, generalmente, se supera combinando k
cat
y [Eo] en una sola cte:
k
cat
[Eo] =Vmax
Vmax
| |
| |
| | S Km
S
Eo kcat v
+
=
Vmax, o velocidad lmite, debido a su dependencia de la concentracin de
enzima no es una propiedad fundamental de la enzima.
[S]
v = k
cat
[Eo] ----------------
Km + [S]
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Km
En condiciones de equilibrio rpido es la constante de
disociacin del complejo ES.
Km =k-1 / k1
En condiciones de estado estacionario es una constante de
disociacin aparente que puede ser considerada como la
constante de disociacin global de todos los complejos de la
enzima.
Km =(k-1 +kcat) / k1
Por tanto representa la afinidad del enzima por el substrato, para
valores de Km bajos la afinidad por el sustrato ser elevada.
En todos los casos es la concentracin de sustrato a la que
v =Vmax / 2
1
1
k
kcat k
Km
+
=

Valores de Km oscilan entre 10
-3
-10
-6
M
Representa la concentracin de sustrato que hacen la velocidad inicial sea Vmax/2
| |
| |
| | | |
max
2
1
max
V v
So So
So
V v
So Km
=
+
=
=
v
[S]
V
max
Km
Km
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Constante de
especicidad
Eficacia cataltica
S<<<<Km
Km
kcat
Kesp =
El valor mximo que la constante de especificidad puede alcanzar, viene
determinado por la velocidad de difusin de los dos reactantes, Eoy So, que han
de chocar eficientemente para producir la reaccin (bimolecular).
Por muy eficaz que fuese una enzima nunca podra superar ese lmite,
determinado por la difusin de los reactantes.
Ni Vmax ni Kmseparadamente nos dan una idea de la eficacia
cataltica de una enzima
| |
| |
| || | S Eo
Km
kcat
v
S Km
S
V v
=
+
= max
Constante de
especicidad
Constante de especificidad
(Vmax/Km o kcat/Km)
Indica cul es el mejor sustrato de una enzima (aqul que tenga la mayor
constante de especificidad).
Indica la eficiencia cataltica de la enzima a concentraciones de sustrato por
debajo de la saturacin.
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Especificidad versus afinidad
Especificidad: es la capacidad que tiene una enzima de discriminar entre
posibles sustratos. Nos indica la velocidad relativa a la que se llevar a cabo
la reaccin catalizada con estos diferentes sustratos.
Los mejores sustratos, es decir aquellos que producen una reaccin
ms rpida, son los que tienen una mayor constante de especificidad.
Afinidad: es la estabilidad del complejo ES. Nos indica la capacidad que
tiene la enzima de formar un complejo con un determinado sustrato.
Se suele denominar tiempo de especificidad y representa el tiempo que se
necesitara para consumir todo el sustrato si la enzima actuara bajo condiciones
de primer orden, manteniendo su velocidad inicial indefinidamente.
NOTA: Aunque esta es ms bien una definicin abstracta para las condiciones de ensayo
habituales, en el caso de la clula si que tiene sentido, ya que en las clulas, la mayor
parte de las enzimas actan bajo condiciones de reaccin de primer orden y mantienen la
velocidad durante periodos ms o menos largos (debido a la reposicin de sustrato): en
estas circunstancias el tiempo de especificidad, es el tiempo requerido para recambiar
(turnover) el sustrato completamente.
El inverso de Vmax/Km, es decir, Km/Vmaxtiene dimensiones de tiempo:
Tiempo de
especificidad
min
min max
1 1
1
= =

mmol
mmol
V
Km
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Para obtener los parmetros cinticos de una enzima lo que solemos
hacer es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones de S.
Representacin directa v frente a [S]
Lo primero es obtener los correspondientes parmetros cinticos.
Linealizacin de la ecuacin de Michaelis-Menten
v
[S]
V
max
| |
| | S Km
S
V v
+
= max
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Estas dificultades, fueron tenidas en
cuenta por Michaelis y Menten, y
representaban v frente a log[S].
Esta representacin, aparte de su
valor histrico, ha tenido poco xito.
La representacin de v frente a [S] es poco til debido a:
La dificultad para dibujar con precisin una hiprbola rectangular
La dificultad para encontrar las asntotas (Vmax), de manera correcta, y por
tanto el clculo de Km
Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con mayor fiabilidad,
se han propuesto varios procedimientos. La mayora de ellos basados en la
linealizacin de la ecuacin de Michaelis-Menten
Quizs las tres representaciones ms usadas sean:
- Representacin de Linenweaver-Burk o de dobles inversos: (1/v 1/[S])
- Representacin de Hanes ([S]/v [S])
- Representacin de Eadie-Hofstee (v v/[S])
Adems de estas tres representaciones, basadas en la linealizacin de la ec. de
M&M, existe una cuarta basada en la representacin directa v [S], o
representacin de Einsenthal y Cornish-Bowden.
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Si escribimos la ecuacin de Michaelis-Menten en su forma inversa, obtenemos:
1 1 Km 1
---- = ------------- +------------- ---------
v Vmax Vmax [S]
y = b + m x
( )
S V
Km
S V
S
v
S V
Km S
v
max max
1
max
1
+ =
+
=
Representacin de dobles inversos o de Linenweaver-Burk
1/v
1/[S]
1/Vmax
-1/Km
m =Km/Vmax
o
-Pendiente Km/Vmax
-Corte en el eje-x 1/v =0 -1/Km
-Corte en el eje-y 1/[S] =0 1/Vmax
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Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,
La representacin de [S]/v frente a [S], da una recta:
y = b + m x
Representacin de Hanes-Woolf
| |
| | S
V V
Km
v
S
|
.
|
\
|
+
|
.
|
\
|
=
max
1
max
| |
| | S
S V
Km
V v

|
|
.
|
\
|
+ =
1
max max
1 1
| | | |
max max V
S
V
Km
v
S
+ =
[S]/v
[S]
Km/Vma
x
- Km
m = tgo = 1/Vmax
o
Pendiente = 1/Vmax
corta en el eje [S]/v en un punto =Km/Vmax,
corta en el eje [S] en un punto =- Km
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Imaginemos que estamos estudiando una reaccin S P
catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L
-1
) v
o
(mol L
-1
min
-1
)
0,30 0,57
0,50 0,85
0,75 1,18
1,50 1,82
3,00 2,50
7,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representacin de Hanes yLinenweaver-Burk.
.
Si multiplicamos ambos miembros de la ecuacin de inversos por v y Vmax
obtenemos,
Vmax = v + (Km v)/[S]
y reordenando
y = b - m x
Representacin de Eadie-Hofstee.
| | S
v
Km V v = max
| |
max
1
max max
1 1
vV
S V
Km
V v

|
|
.
|
\
|
+ =
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La representacin de v frente a v/[S] nos da una recta de:
- pendiente =-Km
- corte en el eje v =Vmax
- corte en el eje v/[S] =Vmax/Km
v
v/[S]
Vmax
Vmax/Km
m =tgo =-Km
o
Imaginemos que estamos estudiando una reaccin S P
catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L
-1
) v
o
(mol L
-1
min
-1
)
0,30 0,57
0,50 0,85
0,75 1,18
1,50 1,82
3,00 2,50
7,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representacin de Eadie-Hofstee.
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Publicaron un procedimiento, totalmente diferente a los
anteriores, para la obtencin de Vmax y Km, conocido como
representacin lineal directa.
Representacin lineal directa o representacin de Einsenthal y Cornish-Bowden
La ecuacin de M y M podemos transformarla en la ecuacin cannica de
una recta en la que tratamos a Vmax y Km como variables, y a [S] y v
como constantes,
Dividiendo por v y (S)
Reordenando,
1
max
=
+
S
Km
v
V
Si r es la recta que pasa por los puntos (a, 0) y (0,b), la ecuacin la podemos escribir
| |
| |
| | ( ) | |
| | v
V
S
Km
S V S Km v
S Km
S V
v
max
1
max
max
= +
= +
+
=
Reordenando
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Si el primer par de valores observados de v y [S] son v
1
y [S
1
]
y representamos la recta que definen:
Km
Vmax
v1
-S1
Si tomamos ahora un segundo par de valores observados: v2 y (S2), ....
Km
Vmax
v1
-S1 -S2
v2
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Y luego un tercer par: v3 y (S3), ....
Como podemos observar, las distintas rectas se cortan, intersecan, en un punto,
comn a todas ellas, de coordenadas (Km, Vmax).
Km
Vmax
v1
-S1 -S2
v2
-S3
v3
(Km, Vmax)
NOTA: Experimentalmente, de manera general, no obtendremos un punto, si no un entorno de
puntos, y la media de las coordenadas de estos puntos nos dar el valor medio de Kmy Vmax con
sus correspondientes desviaciones estndar.
Km
Vmax
v1
-S1 -S2
v2
-S3
v3
(Km, Vmax)
El nmero mximo de puntos de corte vendr dado por: [n(n-1)]/2, donde
n es el nmero de rectas.
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Suponer que estamos estudiando una enzima E que cataliza la reaccin S
P, y que obtenemos los siguientes datos experimentales:
Concentracin inicial Concentracin de producto (mol L
-1
)
de sustrato (mmol L
-1
) a distintos tiempos (t =min)
t=0 t=1 t=2 t=3 t=4
5,0 0 150 300 450 600
6,5 0 180 360 540 720
10,0 0 235 470 705 940
20,0 0 325 650 975 1300
40,0 0 410 820 1230 1640
Calcular Km y Vmax utilizando todos los procedimientos
estudiados.
Resumen
Estudiada la ecuacin de Michelis-Mentende acuerdo con el orden de reaccin podemos encontrar las
siguientes circunstancias-
a) A concentraciones saturantesde substrato nos encontramos en el orden cero de reaccin
La comparacin de actividades enzimticas en ordncero de reaccin puede servir para comparar
cantidades de una misma enzima en diferentes circunstancias metablicas.
b) A concentraciones de substrato menores que un dcimo de la constante de Michaelis, nos encontramos en
orden uno de reaccin.
c) A concentraciones de substrato del orden de la constante de Michaelis es posible obtener una ecuacin a
partir de la ecuacin integrada de Michaelis-Mentenpermite determinar grficamente los parmetros
cinticos Vmax y Kmestudiando la curva del avance de una reaccin con respecto al tiempo
La ecuacin de Michaelis-Mentenes una cnica, hiprbola que pasa por el centro de coordenadas v:S, cuya
asintotaparalela al eje de las abcisasrepresenta la velocidad mxima.
Diferentes transformaciones algebricaspermiten la linealizacinde la ecuacin de M-M para una
determinacin ms fcil de los parmetros Vmax y Km.
Entre estas se encuentran:
Representacin de dobles inversos o de Linenweaver-Burk.
Representacin de Hanes
Representacin de Eadie-Hofstee
Representacin lineal directa o representacin de Einsenthal y Cornish-Bowden
15/10/2013
35
6. Actividad enzimtica
Actividad enzimtica: son los moles de sustrato transformado por min y por
mL de extracto enzimtico, definindose la unidad enzimtica (UI) como la
cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un umol de sustrato en
1min a 20C.
1 katal (Kat): cantidad de enzima para transformar un mol de sustrato por
seg, equivale a 6 10
7
UI.
Actividad especfica: son los moles de sustrato transformados por min y
por mg de enzima.
INHIBICIN ENZIMTICA
1. Introduccin
2. Inhibicin reversible
2.1 Inhibicin competitiva (inhibicin
especfica)
2.2 Inhibicin no-competitiva
2.3 Inhibicin incompetitiva o acompetitiva
2.4 Inhibicin por sustrato
15/10/2013
36
Las sustancias que disminuyen la velocidad de reaccin,
qumica o enzimtica, se denominan inhibidores.
Los inhibidores se pueden dividir en tres grandes grupos:
- Inhibidores reversibles,
- Inhibidores pseudorreversibles
- Inhibidores irreversibles
1. Introduccin
INHIBIDORES REVERSIBLES la unin del inhibidor a la enzima es
dbil.
INHIBIDORES PSEUDOIRREVERSIBLES la unin del inhibidor a la
enzima es fuerte.
INHIBIDORES IRREVERSIBLES la unin del inhibidor a la enzima es
prcticamente irreversible, generalmente covalente (inhibidores
suicidas).
15/10/2013
37
2. INHIBICIN REVERSIBLE
Los inhibidores reversibles son sustancias que forman
complejos reversibles con la enzima (interacciones
de tipo dbil).
Cumplen las condiciones impuestas al Substrato para la
deduccin de la ecuacin cintica de M&M:
La concentracin inicial de inhibidor [I
o
] >> [E
o
]
Para resolver la ecuacin de velocidad en presencia de inhibidor,
[EI] o [ESI] es despreciable frente a la de [I
o
].
Por lo tanto, en todo momento, [I] = [I
o
]
Por otra parte, la formacin de los complejos EI o ESI es muy rpida, de
forma que se alcanza rpidamente el siguiente equilibrio:
E + I <=====> EI
y podemos definir la constante de disociacin del complejo EI:
[E] [I]
K
i
= ------------
[EI]
15/10/2013
38
Donde. [E] concentracin
de enzima libre [I] concentracin de inhibidor libre
[EI] concentracin del complejo EI
-As mismo, debemos tener en cuenta:
i) que la actividad de la enzima se afecta por la presencia del inhibidor
ii) que las velocidades medidas son velocidades iniciales
iii) que estamos en una situacin de estado estacionario
Consecuentemente, la concentracin de las diferentes especies qumicas en que
puede encontrarse la enzima: [E], [ES], [EI] y en su caso [ESI] son constantes
respecto del tiempo, d[EX]/dt = 0.
Si la enzima, a concentraciones saturante de inhibidor, no presenta actividad cataltica
alguna (v =0) se dice que la inhibicin es completa o total.
Sin embargo, frecuentemente nos referimos a este tipo de
inhibicin como inhibicin lineal, ya que la representacin de
Km
ap
/Vmax
ap
o de 1/Vmax
ap
frente a [I] nos da una linea recta.
Con menor frecuencia est el caso en que el complejo EI s
presenta cierta actividad cataltica residual (v = 0) a
concentraciones saturantes de inhibidor.
Este tipo de inhibicin se conoce como inhibicin parcial, o
inhibicin hiperblica, ya que la curva resultante al representar
Km
ap
/Vmax
ap
o 1/Vmax
ap
frente a la [I], nos da una curva
hiperblica.
15/10/2013
39
Ambos tipos de inhibicin, lineal e hiperblica, pueden a su
vez subclasificarse de acuerdo con los parmetros cinticos
aparentes de Michaelis-Menten que se vean afectados, si
bien, nosotros nos centraremos en la inhibicin lineal.
La inhibicin por inhibidores reversibles lineales,
tradicionalmente, y de acuerdo con el mecanismo de reaccin,
se suele clasificar en tres grupos:
- Inhibicin competitiva --> Inhibidores competitivos
- Inhibicin no-competitiva --> Inhibidores no-competitivos
- Inhibicin acompetitiva --> Inhibidores acompetitivos
2.1. Inhibicin competitiva
En la inhibicin competitiva o inhibicin especfica, el inhibidor compite con
el sustrato por el mismo centro activo de la enzima.
La molcula del inhibidor es, generalmente, en todo o en parte,
un isstero del sustrato, excluyendose mutuamente del centro
activo de la enzima.
Isstero --> Molculas que tienen formas y tamaos similares
15/10/2013
40
Km k
cat
E + S <====> ES ----------> E + P
EI -------->
<
=
=
=
=
=
>

I
K
ic
La enzima, Eo, puede estar como enzima libre, E, unida al
sustrato formando el complejo-ES, ES o como enzima unida al
inhibidor formando el complejo-EI, (EI).
Y de acuerdo con la ecuacin de conservacin de la materia
podemos escribir:
Pero solamente el complejo ES puede dar producto.
[Eo] = [E] + [ES] + [EI]
El valor de la [ES] lo podemos obtener a partir de la cte de
Michaelis:
[E] [S]
Km =------------
[ES]
[E] [S]
[ES] =-----------
Km
Y anlogamente, el valor de la [EI] lo podemos obtener a partir de
la definicin de la constante de disociacin del complejo EI:
K
ic
Vic =kcat [ES]
Velocidad inicial en presencia de inhibidor competitivo
15/10/2013
41
[E] [I]
K
ic
=------------
[EI]
[E] [I]
[EI] =------------
K
ic
Sustituyendo estos valores en la ec. de balance de materia:
Eo = E + ES + EI
[E] [S] [E] [I]
[Eo] = [E] + ------------ + ------------
Km K
ic
Valor de la Enzima libre
Km
S
Km
S
Ki
I
Eo ES
+ +
=
1
1
Km
S
Ki
I
Eo E
+ +
=
1
1
S
Ki
IKm
Km
S
V
Km
S
Km
S
Ki
I
kcatEo vic
+ +
=
+ +
= max
1
1
[E] [S]
[ES] =-----------
Km
Vic=Kcat [ES]
S
Ki
I
Km
S
V vic
+
|
.
|
\
|
+
=
1
max
Ecuacin representa el comportamiento cintico de un inhibidor
competitivo puro
15/10/2013
42
La velocidad de reaccin inicial, en presencia de inhibidor
competitivo vendr dada por la ecuacin:
[S]
v
ic
= Vmax -----------------
[S] + Km
ap
Ecuacin semejante a la ec. de M&M, pero donde el valor de
Km
ap
depende de la concentracin del inhibidor (I) y de la cte de
inhibicin K
ic
.
En este tipo de inhibicin reversible, los valores de las ctes de
inhibicin, K
ic
, suelen ser del mismo orden que las Km.
Oscilando entre 10
-3
y 10
-6
M.
|
.
|
\
|
+ =
Kic
I
Km Kmap 1
El anlisis de la ec. anterior nos indica que el grado de inhibicin, depende:
i) de la concentracin de inhibidor, [I];
ii) del valor de la K
ic
;
iii) de la concentracin de sustrato, [S]
iv) de la constante de Michaelis, Km
- A concentraciones altas de sustrato, [S], el valor de inhibicin
puede ser no significativo.
- Algunos inhibidores de este tipo suelen tener aplicaciones
medico-farmacuticas.
Cules sern los mejores?
aquellos que tengan un valor de Ki pequeo
15/10/2013
43
Determinacin grfica de los parmetros cinticos
en una inhibicin competitiva
Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la ecuacin
de Michaelis-Menten; por ejemplo:
* 1/v
ic
vs 1/[S] -->Representacin de Linenweaver-Burk
* v
ic
vs v
ic
/[S] -->Representacin de Eadie-Hoftee
* [S]/v
ic
vs [S] -->Representacin de Hanes
* v
ic
vs [S] -->Representacin directa o de Eisenthal-
Cornish
1/v
1/[S]
1/Vmax
- 1/Km
[I] =0
[I] >0
-1/Km
ap
Representacin de
Linenweaver-Burk
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44
15/10/2013
45
2.2. Inhibicin no-competitiva
En una inhibicin no-competitiva el inhibidor se une a la enzima
en un centro de unin diferente al centro activo de la enzima.
Las especies qumicas en las que puede encontrarse la enzima sern:
- la enzima libre, E,
- la enzima unida al sustrato, ES (complejo-ES)
- la enzima unida al inhibidor, EI (complejo-EI)
- la enzima unida al sustrato y al inhibidor, ESI o EIS
(complejo- ESI o EIS)
En el caso de la inhibicin no-competitiva pura suponemos que
tanto la enzima libre, E, como el complejo-ES pueden unirse al
inhibidor, y que la constante de disociacin, K
i
, es igual en ambos
casos.
En este caso, tambin, slo el complejo-ES evoluciona dando producto
E y EI unen al sustrato sin que afecten a las constantes
de disociacin (Km)
15/10/2013
46
Los inhibidores no-competitivos,
generalmente no presentan
relacin estructural con el sustrato,
y se unen a la enzima en un sitio
distinto del centro activo.
Cuando [S] no desaparece la inhibicin.
15/10/2013
47
Km k
cat
E + S <====> ES ----------> E + P
Km
EI <=====>
<
=
=
=
=
=
>

I Ki
ESI ---------->
<
=
=
=
=
=
>

I Ki
* La deduccin de la velocidad de reaccin, en este caso, es
anloga a la realizada en el caso de la inhibicin competitiva:
v
inc
= k
cat
(ES)
[Eo] = [E] + [ES] + [EI]+ [ESI]
En una inhibicin no-competitiva pura, la Km de la enzima por el
sustrato no se modifica, sin embargo, la Vmax s se modifica,
transformndose en una Vmax
ap
.
[S]
v
inc
= Vmax
ap
--------------------
[S] + Km
|
.
|
\
|
+
=
Ki
I
V
V
ap
1
max
max
15/10/2013
48
1/v
inc
1/S
(I) >0
- (1/Km)
1/Vmax
ap
1/Vmax
(I) =0
Representacin de Linenweaver-Burk
15/10/2013
49
2.3. Inhibicin acompetitiva
El tercer tipo de inhibicin reversible es la inhibicin acompetitiva,
en la que el inhibidor slo puede unirse al complejo-ES, formando
un complejo-ESI, que no da producto.
* En este caso como en los dos anteriores, nicamente el complejo-ES da producto de
reaccin.
- De acuerdo con el siguiente esquema:
Km k
cat
E + S <====> ES ----------> E + P
ESI ---------->
<
=
=
=
=
=
>

I Ki
* Al igual que los otros dos casos, en este la velocidad de
reaccin viene dada por:
v
iac
= k
cat
(ES)
Y por tanto su deduccin se realizar de manera anloga.
[Eo] = [E] + [ES] + [ESI]
15/10/2013
50
As pues, en una inhibicin acompetitiva se modifica tanto Vmax como Km, y ambas se
ven afectadas por el mismo factor multiplicativo
[S]
v
iac
= Vmax
ap
----------------
Km
ap
+ [S]
S
K
I
K
S
K
I
V
v
iac
m
iac
iac
+
|
|
.
|
\
|
+
|
|
.
|
\
|
+
=
1
1
max
|
|
.
|
\
|
+
=
iac
map
K
I
V
V
1
max
|
|
.
|
\
|
+
=
iac
m
map
K
I
K
K
1
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51
Del anlisis de la anterior figura as como de la ecuacin que nos da v
iac
podemos observar que tanto la Vmax como la Km estn disminuidas por un
mismo factor:
No les parece paradjico que un inhibidor disminuya la Km de
una enzima por el sustrato?
Es decir, que aumente la afinidad de la enzima por el sustrato!
La respuesta la podramos tener en el mecanismo de inhibicin
Al unirse el inhibidor al complejo-ES desplaza el equilibrio y,
aparentemente, por lo tanto, la constante de disociacin Km
ap
disminuye.
|
.
|
\
|
+
Ki
I
1
Representacion de Linenweaver-Burk
Determinacin grfica de los parmetros cinticos en una inhibicin
acompetitiva
1/v
iac
1/S
(I) >0
- (1/Km)
1/Vmax
ap
1/Vmax
(I) =0
- (1/Km
ap
)
15/10/2013
52
2.4. Inhibicin por exceso de sustrato
* Este es otro tipo de inhibicin reversible en el que un exceso de sustrato provoca una
prdida de actividad de la enzima.
* En este caso, el modelo cintico presupone que una segunda molcula de substrato
puede unirse al complejo-ES dando lugar a la formacin del complejo-ES
2
que no da
producto:
Km k
cat
E + S <====> ES ----------> E + P
ES
2
---------->
<
=
=
=
=
=
>

S
Ks
- La ecuacin de velocidad, como siempre, la podemos deducir a
partir de:
v = kcat (ES)
Suponemos que la constante de
disociacin del segundo complejo
[ES
2
] es diferente a la Km
Se denomina Ks
15/10/2013
53
Eo = E + ES + ES
2
v = kcat [ES]
[E] [S]
[ES] =-----------
Km
Ecuacin de conservacin de la enzima
`
2
KmKs
ES
Km
S
E E Eo + + =
| || |
| |
| || |
| |
2
`
ES
S E
Ks
ES
S E
Km
=
=
1
1
2
KmKs
S
Km
S
Eo E
+ +
=
Km
S
KmKs
S
Km
S
V v
Km
S
KmKs
S
Km
S
kcatEo v
1
1
max
1
1
2
2
+ +
=
+ +
=
La representacin de v frente a (S) muestra una curva que
presenta un mximo:
(S) (S)
op
v
Vmax
Igualando a cero la
primera derivada
con respecto a la [S]
La concentracin de sustrato
a la cual se obtiene el
mximo de velocidad
KmKs S
op
=
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54
RESUMEN
Inhibidores: aquellos compuestos disminuyen la actividad de una enzima. Se agrupan en
tres clases: Reversibles, Pseudoirreversibles y suicidas.
Inhibidores reversibles: cumplen las condiciones de Michaelis, la [I
o
] es muy superior a
la [E
o
] siendo el complejo enzima-inhibidor [EI] despreciable frente a [I]
Tres tipos de inhibicin reversible:
a) Inhibicin competitiva el inhibidor compite por el mismo lugar que el substrato. La
velocidad mxima queda inafectada por el inhibidor y aumenta la Kmap.
b) Inhibicin no competitva el inhibidor se une a la enzima en un lugar diferente al
de la unin al substrato. La inhibicin afecta a la velocidad mxima disminuyendo
su. El grado de inhibicin depende solamente de la [I] y de la constante Ki.
c) Inhibicin acompetitiva el inhibidor se une solamente al complejo Enzima-
Substrato, disminuye la velocidad mxima por el factor (1+I/Ki) y, paradjicamente,
disminuye la Km por el mismo valor obtenindose una Kmap menor.
Inhibicin por exceso de substrato puede ocurrir. La curva de velocidad en funcin de
diferentes concentraciones de substrato presenta un mximo. En general se da este tipo
de inhibicin cuando el substrato a grandes concentraciones puede reaccionar con la
protena enzimtica en lugar diferente al de la unin enzima substrato

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