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Frederick Griffith (1879 - 1941)

1923: Estudando uma vacina contra


a pneumonia na pandemia de gripe
espanhola aps a 1 Guerra Mundial
Streptococcus pneumoniae
Cepa lisa virulenta (S)
Cepa rugosa no-virulenta (R)
Griffith, F., The significance of pneumococcal types (1928) J. Hyg. 27, 113-159.
O princpio transformante
O experimento de Griffiht havia mostrado que cepas
bacterianas no-patognicas podem se tornar infecciosas
quando misturadas com uma cepa virulenta inativada por calor
(transforming principle)
1944: Identificaram o principio transformante
Oswald Avery
1877 - 1955
Colin McLeod
1909 - 1972
Maclyn McCarty
1911 - 2005
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
O princpio transformante
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
Martha Chase (1930 - 2003)
Alfred Hershey (1908 - 1997)
Usando marcadores radioativos, mostraram que o
DNA de um vrus, e no suas protenas, que programam
as clulas infectadas para fazer cpias do vrus
Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.
A Guerra Natural
Bactrias vs. Fagos (bacterifagos)
Durante a infeco viral, para se defender, as bactrias
precisam destruir o DNA invasor dos fagos sem afetar o
seu prprio DNA
A Guerra Natural
As bactrias desenvolveram um
sistema de defesa contra DNAs
invasores
Duas poderosas Armas
As Enzimas de Restrio
As Enzimas de Modificao
DNA molde
Primers
dNTPs (nucleotdeos)
Tampo da Enzima
Taq Polimerase
PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Os oligos funcionam como iniciadores (primers) para a
sntese de DNA, a qual se inicia com a adio de
nucleotdeos e de uma polimerase resistente a
temperatura
A Taq Polymerase tem a capacidade de estender os
oligos em temperaturas ao redor de 72C
Quanto a sntese esta terminada, aquece-se de novo a
96C para, novamente separar-se as dupla-fitas de
DNA
A repetio (30 40 vezes) deste ciclo de sntese,
rapidamente gera muitas cpias de DNA
Principais vetores
Vetor Inserto
Plasmdio <10 Kb
Bacterifago 7 - 25 Kb
Cosmdio 35 - 50 Kb
BAC 100 - 300 Kb
YAC 200 - 2.000 Kb
Vetores
Elemento central na tcnica de
clonagem molecular
Usado para transferir DNA de um
organismo para outro com a finalidade
de obter DNA recombinante ou um
organismo transgnico
So os veculos que carregam o
DNA recombinante e permitem sua
replicao e/ou expresso na clula
hospedeira
Caractersticas gerais
Capacidade de penetrar na clula
hospedeira
Capacidade de replicar no interior da clula
hospedeira
So facilmente recuperveis
Contm pelo menos um marcador
especfico que permite distinguir as clulas
transformadas das clulas normais no-
transformadas
Possuem stios de restrio nicos que
permitem a insero do DNA-alvo
RNA de Interferncia (RNAi)
O que RNAi?
Mecanismo pelo qual uma molcula de
RNA dupla-fita (dsRNA) suprime a expresso
do gene cuja a seqncia complementar
a sua (gene-alvo)
Como funciona ???
Etapa 2
RISC (RNAi Silencing Complex)
Complexo multi-
protico
Usa o siRNA como
guia para reconhecer
e cortar o mRNA do
gene-alvo
Exonucleases
celulares degradam o
mRNA cortado
Stios de Restrio
Os cortes das enzimas de restrio podem
produzir
Extremidades abruptas (bunt-ends)
Extremidades coesivas (stick-ends)
Northern Blot
No foi inventado por uma pessoa chamada Northern
Semelhante ao southern blot, s que no gel so submetidas a
eletroforese amostras de RNA e no de DNA
Utilizado na anlise de RNAs
Geralmente utilizada para determinar
o tamanho de um transcrito
a presena de um transcrito (tecido-especificidade ou distribuio temporal)
a quantidade de transcrito produzido (nvel de expresso
gnica)
Sonda: fragmento de DNA (sem ntrons) ou de RNA
O RNA deve ser desnaturado (evitar estrutura secundria)
A eletroforese deve ser em condies desnaturantes
Enzimas de Restrio
Enzimas que se ligam ao DNA e o
cortam em stios especficos (stios de restrio)
Tambm chamadas de endonucleases
porque cortam o DNA internamente
Como estimar a quantidade
inicial de molde ???
Usar os dados da fase exponencial
Quantidade de produto proporcional a
quantidade de molde inicial
Neste caso, necessrio avaliar o
produto de PCR a cada ciclo
Usar fluorescncia
A fluorescncia deve ser proporcional
quantidade de produto
Use uma mquina que verifique a
fluorescncia em cada ciclo (Real Time-
PCR)