Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 1

C A P T U L O 2 . 2 . 4
NOSEMOSI S DE LAS ABEJ AS MEL FERAS
RESUMEN
Hasta este momento se han descrito dos parsitos microsporidianos de las abejas: Nosema apis
(Zander) y Nosema ceranae (Fries). Nosema apis es un parsito de la abeja europea (Apis
mellifera) y Nosema ceranae lo es de la abeja asitica (Apis cerana) (11) y de la abeja europea.
Esta ltima se ha detectado recientemente en varias poblaciones de abejas europeas
geogrficmente separadas en Europa (12), Sudamrica, Norteamrica (14) y Asia (13). No se
conocen bien las consecuencias patolgicas de Nosema ceanae en Apis mellifera. En el captulo
siguiente solo se describe Nosema apis. Ambos tipos son presumiblemente muy similares. Nosema
apis es un parsito que invade las clulas epiteliales del ventrculo de las abejas adultas. Las
infecciones se adquieren por la entrada de las esporas durante la alimentacin o la limpieza. La
enfermedad se presenta en todo el mundo, pero el tratamiento de las abejas puede ayudar a
prevenir la propagacin de la infeccin a las colonias de abejas no infectadas.
El parsito invade la regin posterior del ventrculo, originando una gran cantidad grande de
esporas en un periodo corto de tiempo. El parsito es ubicuo. Los niveles de Nosema aumentan
cuando las abejas estn confinadas, como sucede en otoo y en invierno en los climas ms fros,
cuando la cantidad de cras disminuye, y posiblemente, a principios de la primavera, cuando se
produce un aumento de la progenie. La enfermedad se transmite entre las abejas mediante la
ingestin de agua y del material contaminado de los panales y por la trofalaxis; los depsitos de
miel y las abejas infectadas que queden aplastadas pueden jugar as mismo, un papel importante
en la transmisin de la enfermedad. Las esporas se expulsan con las heces y en ellas pueden
permanecer viables durante ms de 1 ao. Tambin pueden seguir siendo infectivas despus de
su inmersin en la miel y en el interior de los cadveres de las abejas infectadas; sin embargo,
pueden perder la viabilidad si permanecen 3 das sumergidas en miel a la temperatura de la
colmena. La importancia relativa de las heces, la miel y los cadveres como reservorios de las
esporas infectivas no se comprende en su totalidad. Sin embargo, parece probable que la
contaminacin fecal de la cera, especialmente en los panales empleados para la cra, o de otras
superficies interiores de la colmena, proporcione un inculo suficiente para que N. apis se pueda
transmitir con xito a la siguiente generacin de abejas. Las esporas se inactivan con cido actico
o a 60C durante 15 minutos. Para que estos tratamientos que inactivan las esporas en la
superficie de la colmena y en los panales sean efectivos, pueden combinarse con la alimentacin
de las colonias que contenga fumagilina, un antibitico que impede la infeccin de las abejas vivas.
La UE prohbe el uso de fumigacin con antibiticos (EU 3/01/081).
Identificacin del agente etiolgico: En algunos casos agudos se observan marcas fecales
marrones en el panal y en el frontal de la colmena, con abejas enfermas o muertas en sus
proximidades. Sin embargo, la mayora de las colonias no muestran signos claros de infeccin,
incluso cuando la enfermedad es suficiente para causar prdidas significativas en la produccin de
la miel y en la eficiencia de la polinizacin. Durante el invierno, puede haber un incremento de la
mortalidad de las abejas. En las abejas afectadas, el ventrculo, que es normalmente marrn,
puede ser blanco y muy frgil. Los exmenes microscpicos (a 400 aumentos) de los
homogeneizados de los contenidos abdominales de las abejas afectadas revelarn la presencia de
las esporas ovales de Nosema apis, que son aproximadamente de un tamao de 57 34 m
con un contorno oscuro (Nosema ceranae es ligeramente ms pequea). Sus contenidos internos
se pueden diferenciar despus de teir con la tincin de Giemsa, las esporas de Nosema apis
tienen una apariencia caracterstica, con una pared gruesa no teida y el interior azul sin rasgos
distintivos. Los ncleos del interior de las esporas no son visibles. Este mtodo puede ayudar a
diferenciar N. apis de otros microorganismos encontrados en las abejas.
Captulo 2.2.4. Nosemosis de las abejas melferas
2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
La apariencia de las esporas de Nosema apis puede confundirse con la de levaduras, esporas
fngicas, cuerpos grasos y calcferos o quistes de Malpighamoeba mellificae. Estos ltimos son
similares en tamao a las esporas de Nosema, de 67 m de dimetro, pero son totalmente
esfricos en vez de ovales.
nicamente se pueden realizar identificaciones positivas observando las esporas tpicas en el
ventrculo o en las heces. Es posible que no se puedan demostrar las infecciones muy leves. La
extensin de la infeccin se puede determinar mediante el recuento de las esporas en una rejilla
cuadriculada de microscopio y, calculando el nmero medio de esporas por rea, y a partir de esto
se puede estimar el nmero de esporas por abeja.
Pruebas serolgicas: No existen pruebas serolgicas que puedan aplicarse.
Requisitos para las vacunas y el material biolgico de diagnstico: No se dispone de
productos biolgicos.
A. INTRODUCCIN
El microsporidio Nosema apis (Zander) es un protozoo parsito exclusivo de las clulas epiteliales del ventrculo
de las abejas adultas, y la enfermedad se presenta en todo el mundo (16). La infeccin se produce por la
ingestin de esporas con el alimento (19), por la trofalaxis (19) o quizs despus de la limpieza de los pelos del
cuerpo (6, 10, 19).
El tubo polar de la espora es evertido y penetra en la matriz peritrfica del intestino, en particular en la regin
posterior del ventrculo. El esporoplasma atraviesa el tubo y entra en el citoplasma de las clulas epiteliales,
donde se reproduce. Pueden producirse autoinfecciones al mismo tiempo que nuevas infecciones. Despus de
un intervalo corto de tiempo, las esporas se desarrollan en grandes cantidades.
El parsito es ubicuo y se multiplica a una tasa especfica a lo largo del ao. Los niveles de Nosema aumentan
cuando las abejas estn confinadas, como sucede en otoo e invierno en los climas ms fros, cuando disminuye
la cantidad de cras, y posiblemente a principios de la primavera, cuando se produce un aumento de la progenie
(19, 20) En invierno, rara vez aparecen esporas o solo se encuentran en abejas fuertemente infectadas.
Cualquier defensa natural inherente de una colonia de abejas frente a una infeccin fuerte por el parsito
depende tanto del tamao de la colonia como de las condiciones climticas al comienzo del otoo del ao previo
(18). Si estas condiciones no son favorables, se reduce la esperanza de vida del conjunto de la colonia. Esto
puede conducir a la muerte prematura de las abejas durante el invierno o el inicio de la primavera. En un caso
tpico de una colonia mermada debido a la infeccin por Nosema, se puede observar a la reina rodeada por unas
pocas abejas, atendiendo confusamente a la progenie que ya est operculada.
En los excrementos, las esporas pueden permanecer viables durante ms de 1 ao (3). Tambin pueden seguir
viables durante ms de 4 meses despus de la inmersin en miel (21) y durante ms de 4,5 aos en los
cadveres de las abejas infectadas (18). Las esporas pueden perder viabilidad despus de tan solo 3 das al
encontrarse sumergidas en miel a la temperatura de la colmena (17). Es probable que la contaminacin fecal de
la cera, en especial en los panales utilizados para la cra, o de otras superficies interiores de la colmena,
proporcione suficiente inculo para que N. apis se transmita con xito a la nueva generacin de abejas. La
importancia relativa de las heces, la miel y los cadveres como reservorio de las esporas infectivas no se
comprende en su totalidad y parece que la temperatura puede tener un efecto marcado en las tasas a las que las
esporas pierden viabilidad, independientemente del medio en que se encuentren (17).
Las esporas se pueden destruir calentando las herramientas y el equipamiento de la colmena a una temperatura
de al menos 60C durante 15 minutos. Los panales pueden esterilizarse calentndolos a 49C durante 24 horas
(8). Los vapores procedentes de una solucin de cido actico como mnimo del 60% inactivarn las esporas en
unas pocas horas dependiendo de su concentracin; concentraciones mayores son incluso ms efectivas y
destruirn las esporas en unos pocos minutos (2, 9). Tales procedimientos se encuentran bajo la jurisdiccin de
las autoridades de control nacional, con protocolos que varan de un pas a otro. Se puede llevar a cabo la
desinfeccin, por ejemplo, colocando una solucin de cido actico en recipientes en esponjas empapadas en el
lquido. Despus de desinfectar un brote, se aconseja ventilar a fondo todos los panales durante al menos
14 das antes de su utilizacin. Tambin se puede conseguir la supresin de la enfermedad por Nosema
proporcionando a la colonia un antibitico, la fumagilina en forma de jarabe de azcar (8). Esta est prohibida en
muchos pases y en la Unin Europea.
Captulo 2.2.4. Nosemosis de las abejas melferass
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 3
B. TECNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
En las formas agudas de la infeccin, en especial al inicio de la primavera, pueden detectarse en el panal y en el
frontal de la colmena marcas fecales marrones (4). En la entrada de la colmena, se pueden observar abejas
enfermas y muertas, aunque se deberan eliminar otras posibles causas, tales como el envenenamiento por
pesticidas y enfermedades de las abejas adultas (como la acarapisosis) si este es el caso. La deteccin de estas
enfermedades infecciosas requiere un examen microscpico. Durante el invierno, las colonias infectadas por
Nosema pueden verse muy mermadas de abejas o totalmente extinguidas. La mayora de las colonias infectadas
por Nosema aparecern normales, carentes de signos claros de la enfermedad incluso cuando esta sea
suficiente para causar prdidas significativas en los niveles de produccin de miel y de eficiencia de la
polinizacin (1, 11). Solo se puede realizar un diagnstico exacto mediante el examen microscpico del abdomen
o ventrculo de la abeja adulta. Para diagnosticar una infeccin causada por Nosema apis, se extrae con unas
pinzas el par posterior de segmentos abdominales para poner al descubierto el ventrculo completo con los tubos
de Malpighi, el intestino delgado y el recto. Normalmente, el ventrculo es marrn pero, despus de una infeccin
por Nosema, puede volverse blanco y muy frgil. Sin embargo, esta apariencia puede ser debida a otras causas
de problemas intestinales, por ejemplo, por alimentarse de depsitos de comida indigestos, tales como jarabe
que contenga levaduras en crecimiento activo. Para un diagnstico fiable, se aconseja examinar varias abejas en
cada muestra.
a) Microscopio
Es necesario tratar de distinguir entre una infeccin debida a Nosema apis y la causada por Malpighamoeba
mellificae (19). Con bastante frecuencia existe un indicio de disentera en una infeccin por Nosema apis.
En una infeccin por M. mellificae, puede haber diarrea, frecuentemente de un color amarillo sulfuroso y de
un olor peculiar. Las caractersticas de los quistes de M. mellificae se describen ms tarde. Pueden
aparecer infecciones mixtas secundarias (17). Un mtodo no cuantitativo y simple que permite detectar la
infeccin debida a Nosema apis es como sigue: se debera obtener la muestra de abejas de la entrada de la
colmena para evitar individuos de muestra de menos de 8 das, lo que conducira a negativos falsos porque
no se detectaran esporas a partir de los protozoos en cuestin. Se aconseja recoger al menos 60 abejas
con el fin de detectar el 5% de las abejas enfermas con un 95% de confianza (10). Antes de enviarlas al
laboratorio, estas abejas se deberan fijar en formol al 4%, en alcohol al 70% o congelarlas en un
congelador estndar, para evitar que se descompongan y mejorar su recepcin y organizacin en el
laboratorio. Se separan los abdmenes de las abejas que van a ser examinadas y se mantienen en 23 ml
de agua. Se colocan tres gotas de la suspensin en un porta bajo un cubre y se examinan a 400 aumentos
en un microscopio de campo claro o de contraste de fases. Esta es una pequea simplificacin del mtodo
original de Cantwell (7). Las esporas miden aproximadamente 57 m de largo y 34 m de ancho.
(Nosema ceranae es ligeramente ms pequea que Nosema apis). Son completamente ovaladas y poseen
un contorno oscuro. No se pueden observar sus contenidos, que constan de ncleo, esporoplasma y tubo
polar. Habitualmente no son necesarios los colorantes.
Se deben diferenciar las esporas de Nosema de las levaduras, las esporas fngicas, los cuerpos grasos y
calcferos y de los quistes de M. mellificae, que son esfricos y de un dimetro aproximado de 67 m.
Despus de secar al aire, los frotis del tejido infectado fijados con etanol, se tien con la tincin de Giemsa
(al 10% en tampn fosfato 0,02 M) durante 45 minutos. Las esporas de Nosema apis tendrn una
apariencia caracterstica, con paredes gruesas no teidas y un interior azul sin rasgos distintivos y sin
ncleo visible. Las clulas de los insectos, las esporas fngicas y otros protozoos teidos de esta forma
generalmente aparecern con paredes ms delgadas, citoplasma azul/prpura y ncleo de color magenta.
Se debe utilizar un procedimiento estandarizado con el fin de obtener una cuantificacin exacta, fiable y
significativa de los niveles de infeccin por Nosema en las abejas melferas. Un protocolo adecuado es el
que se indica a continuacin:
Se toma una muestra de abejas obreras adultas y se maceran los abdmenes de 10 individuos en 5 ml de
agua con un mortero. Cuando las piezas de tejido son suficientemente pequeas, se filtra la suspensin a
travs de dos capas de gasa (fina tela de tejido flojo de algodn) colocadas en un embudo vertindolo en un
tubo graduado de centrfuga. Se utilizan otros 5 ml de agua para lavar la mano de mortero, recoger el
contenido del interior del mortero y verter la submuestra a travs del embudo. Los niveles de agua se
igualan en los tubos y las suspensiones se centrifugan durante 6 minutos a 800 g. Se decantan los
sobrenadantes y los tubos se rellenan hasta alcanzar 10 ml. Utilizando pipetas desechables y un tetina de
goma, se resuspenden los precipitados sedimentos mediante absorcin y expulsin forzada a travs de las
puntas de las pipetas. Cuando parece que la solucin se encuentra homognea, se toma una muestra para
Captulo 2.2.4. Nosemosis de las abejas melferas
4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
llenar el volumen calibrado situado bajo un cubre de un hemocitmetro (cmara cuentaglbulos). Despus
de unos minutos, las esporas se instalan en el fondo de la cmara. Las esporas de Nosema aparecen
transparentes pero con un contorno oscuro peculiar y son de un tamao de 57 m de largo y 34 m de
ancho. Se observan muy bien a 400 aumentos en un microscopio de campo claro o de contraste de fases.
Se cuentan las esporas de cada cuadrcula. Si una espora se sita sobre el borde de una cuadrcula, solo
se cuentan las que se sitan en los bordes izquierdo y superior de la cuadrcula y no los que se encuentran
en los bordes derecho e inferior. Una espora de Nosema apis, observada en el cuadro central completo (de
1 mm de rea) de la rejilla del hemocitmetro (25 16 =400 cuadros pequeos) equivale a una media de
10.000 esporas por abeja. Si no se observan esporas, el resultado debera considerarse como no
detectado, pero, esto no significa que las abejas no estn infectadas. Los organismos reguladores
correspondientes decidirn sobre el nivel de infeccin til para sus propsitos.
Existe un mtodo de laboratorio para la deteccin simultnea de esporas de Nosema y quistes de
M. mellificae consistente en el examen individual de las colonias utilizando 3060 abejas por colonia. Se
prepara una suspensin de los abdmenes de las abejas muertas macerndolos con 510 ml de agua; el
volumen de agua depende del nmero y condicin de las abejas. Se debe filtrar la suspensin para eliminar
los residuos que interferiran en el examen, primero a travs de un filtro de 100 m y despus a travs de
otro de 40 m. Ciertas partes de los tubos de Malpighi pasan a travs del filtro de 100 m, pero se recogen
en el de 40 m. Se colocan en un porta o en una cmara de recuento de bacterias y se examinan a
400 aumentos. Despus de una infeccin por M. mellificae, solo unos pocos tubos estn llenos de quistes.
En este caso no es visible la estructura normal de los tubos de Malpighi. nicamente los quistes que se
sitan en el interior de estos tubos pueden considerarse como un resultado positivo, porque con frecuencia
los quistes de M. mellificae se confunden con las esporas fngicas y con las levaduras.
b) Cultivo
No existen mtodos de cultivo para el crecimiento de estos microorganismos.
c) Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Se han desarrollado diferentes mtodos para distinguir N. apis de N. ceranae. A continuacin se describe
una PCR mltiple por medio de la cual se pueden identificar claramente los dos patgenos al mismo tiempo
(15).
Preparacin de la muestra para la PCR
Cada muestra de los abdmenes de 1020 abejas adultas se macera en 10 ml de agua destilada (nivel de
PCR), luego se filtra la suspensin y se centrifuga a 800 g durante 6 minutos. Para la extraccin del ADN se
induce la germinacin de la espora con 200 l de tampn de germinacin recin preparado (0,5 M de
cloruro sdico, 0,5 M de carbonato de hidrgeno sdico, pH a 6,0 con cido ortofosfrico), y se incuba la
mezcla a 37C durante 15 minutos. La extraccin del ADN puede realizarse fcilmente utilizando
procedimientos rutinarios o kits comerciales, tales como el High Pure PCR Template Preparation Kit (No.
1796828 Roche Diagnostic).
PCR Mltiple
Con esta tcnica ambos microsporidianos (N. apis y N. ceranae) pueden distinguirse en una nica PCR
debido al uso de cebadores especficos sin interferencia. Las reacciones de la PCR se realizan en
volmenes de 50-l que contienen 5 l de ADN molde, 25 l de High Fidelity PCR Master Mixture (catalogo
no. 12140314001; Roche Diagnostic), 0,4 M de cada cebador, 0,4 mM de cada desoxinucletido trifosfato,
3 mM de Cl
2
Mg, 0,2 mg/ml de albmina de suero bovino, 0,1% de Triton X-100 y 5 l de ADN molde de
N. apis o N. ceranae. Los parmetros para la amplificacin son: un paso inicial de activacin de la PCR de
2 minutos a 94C seguido de 10 ciclos de 15 segundos a 94C, 30 segundos a 61,8 y 45 segundos a 72C,
y 20 ciclos de 15 segundos a 94C, 30 segundos a 61,8C y 50 segundos a 72C ms un ciclo de
alargamiento de 5 segundos para cada ciclo sucesivo y un paso de extensin final a 72 C durante
7 minutos. Los controles negativos (de la extraccin del ADN) se incluyen en todos los experimentos de la
PCR.
Los pesos moleculares de los productos de la PCR se determinan por electroforesis en gel de agar TAE
(Tris-acetato/cido etilendiamino tetraactico) al 2% en tampn TAE estndar, teido con bromuro de etidio
y visualizado por iluminacin UV.
Captulo 2.2.4. Nosemosis de las abejas melferass
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 5
Cebadores seleccionados para la deteccin de N. ceranae y N. apis por PCR mltiple:
Cebador Secuencia
a
Tamao del producto
PCR (pb)
Especifici-
dad
218MITOC FOR 5-CGGCGACGATGTGATATGAAA-ATATTAA-3 218219
b
N. ceranae
218MITOC REV 5-CCCGGTCATTCTCAAACAAAA-AACCG-3
321APIS FOR 5-GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA-3 321 N. apis
321APIS REV 5-GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG-3
a
Se subrayan los extremos CG aadidos a los cebadores.
b
Existe una diferencia de 1-pb en el tamao del amplicn de N. ceranae dependiendo de la secuencias para N. ceranae
disponibles en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
2. Pruebas serolgicas
No se dispone de pruebas serolgicas.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO
No existen productos biolgicos disponibles.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean dar las gracias al Dr. F. Gndinger por sus valiosos consejos.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para las enfermedades de las abejas (vase el cuadro de la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE:
www.oie.int).