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TECHNIQUES DE LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DES

BACTRIES PHYTOPATHOGNES
Ce document a pour objectif de prsenter les diverses techniques utilises au
Laboratoire de diagnostic en phytoprotection pour la dtection et lidentification
des bactries phytopathognes.
Lisolement des bactries sur des milieux de culture gnraux ou diffrentiels
demeure souvent ltape de base pour le diagnostic des maladies bactriennes.
la suite de leur mise en culture, les bactries sont identifies par les techniques
suivantes :
Tests biochimiques classiques
Systme API 20E
Systme Biolog
Test srologique ELISA
Test biologique
Une dtection des bactries directement dans les tissus vgtaux peut tre
ralise par les techniques suivantes :
Test srologique ELISA
Immunofluorescence (IMF)
Des tests sont raliss pour vrifier la rsistance de certaines bactries des
produits utiliser dans le cadre de la lutte antiparasitaire.
Rsistance du Xanthomonas campestris au cuivre
Rsistance de Erwinia amylovora la streptomycine.
ISOLEMENT DES BACTRIES PHYTOPATHOGNES SUR DES
MILIEUX DE CULTURE GLOSS
Lisolement des bactries phytopathognes, sur des milieux de culture gloss,
demeure souvent ltape de base pour le diagnostic des maladies bactriennes.
Par la suite, diverses techniques peuvent tre utilises afin didentifier les
bactries isoles. Les milieux de culture utiliss au Laboratoire de diagnostic en
phytoprotection sont de deux types :
milieu diffrentiel : diffrents genres et espces bactriens peuvent y crotre
mais ce type de milieu permet facilement de reconnatre un genre ou une
espce grce son apparence unique et caractristique.
milieu gnral : toutes les espces bactriennes phytopathognes peuvent y
crotre.
Ces milieux de culture doivent contenir tous les lments essentiels la
croissance dune bactrie soit des sources de carbone et dazote ainsi que des
sels minraux.
Parmi les genres bactriens phytopathognes les plus couramment identifis au
Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, nous retrouvons : Agrobacterium,
Clavibacter, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces et Xanthomonas . Cependant,
dautres genres bactriens ont t galement identifis soit Acidovorax,
Rhodococcus , Burkholderia et Ralstonia.
Depuis la mise en place du Laboratoire de diagnostic en phytoprotection (1986),
les principales espces bactriennes identifies sur les plantes cultives reues
sont:
Acidocorax avenae subsp. cattleyae (phalaenopsis)
Agrobacterium tumefaciens (framboisier, bleuet, plantes ornementales,
pommier)
Burkholderia cepacia (oignon)
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (poivron, tomate)
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (pomme de terre)
Erwinia amylovora (pommier, sorbier, poirier, framboisier)
Erwinia carotovora subsp. atroseptica

(pomme de terre)
Erwinia carotovora subsp. carotovora (plusieurs espces vgtales)
Erwinia tracheiphila (concombre)
Pseudomonas corrugata (tomate)
Pseudomonas fluorescens IVb, Pseudomonas marginalis et Pseudomonas
viridiflava (plusieurs espces vgtales)
Pseudomonas syringae pv. apii (cleri)
Pseudomonas syringae pv. lachrymans (cucurbitaces)
Pseudomonas syringae pv. maculans (crucifres)
Pseudomonas syringae pv. syringae (lilas, impatiens)
Pseudomonas syringae pv. tomato (tomate)
Ralstonia solanacearum (tomate)
Rhodococcus fascians (granium)
Streptomyces spp. (pomme de terre, rutabaga, betterave, carotte)
Xanthomonas campestris pv. armoraciae (crucifres)
Xanthomonas campestris pv. begoniae (bgonia)
Xanthomonas campestris pv. campestris (crucifres)
Xanthomonas campestris pv. carotae (carotte)
Xanthomonas campestris pv. cucurbitacearum (citrouille)
Xanthomonas campestris pv. glycines (soya)
Xanthomonas campestris pv. hederae (hedera)
Xanthomonas campestris pv. pelargonii (granium)
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (piment, tomate)
Xanthomonas campestris pv. vitians (laitue)
Xanthomonas fragariae (fraise)
PROTOCOLE POUR LISOLEMENT DES BACTRIES
SUR DES MILIEUX DE CULTURE GLOSS


tissu vgtal
symptomatique
Prlever des pices du tissu
infect et les laver leau du
robinet.
Eau physiologique
strile (NaCl 0,85%)
Sectionner les pices en deux
et les placer dans de leau
physiologique strile. Laisser
tremper de 20 minutes 2
heures, selon la bactrie
recherche.
1/10 1/100
Pour les tissus prsentant une
pourriture molle, faire des dilutions
1/10 et 1/100.
laide dune anse inoculer strile, ensemencer par
puisement des milieux de culture spcifiques la
bactrie recherche, afin d'obtenir des colonies isoles.

1/10 1/100
la suite dune incubation de 24 72 heures
26
o
C, vrifier la croissance bactrienne. Noter
sil y a prsence de colonies caractristiques.
partir dune colonie isole, inoculer
un milieu de culture gnral afin de
raliser subsquemment des tests
didentification.
SPCIFICATIONS SUR LA PRPARATION DES ISOLEMENTS,
SUR LES MILIEUX DE CULTURE GLOSS ET LES TESTS
DIDENTIFICATION
SYMPTME PRINCIPAL
BACTRIE PHYTOPATHOGNE
SPCIFICATIONS POUR LA
PRPARATION DES
ISOLEMENTS
MILIEU DE
CULTURE
TESTS POUR
LIDENTIFICATION DES
BACTRIES
CHANCRE
Erwinia amylovora
Erwinia carotovora subsp. atroseptica*
Erwinia carotovora subsp. carotovora*
Pseudomonas corrugata
Pseudomonas syringae
Faire tremper dans leau
physiologique (0,85 %) de 40
60 minutes.
Enlever lpiderme des tiges
pour E. amylovora et P.
syringae .
*Faire des dilutions 1/10 et
1/100
CCT
MS
MS
KB
KB
API 20E
Tests biochimiques
Tests biochimiques
Biolog
LOPAT
FLTRISSEMENT/DPRISSEMENT
Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis
Erwinia amylovora
Erwinia tracheiphila
Ralstonia solanacearum
Xanthomonas campestris pv.
pelargonii
Faire tremper dans leau
physiologique (0,85 %) 2
heures
Enlever lpiderme des tiges.
LPGA
CCT
NAP
SMSA
LPGA
ELISA
API 20E
Test biologique
Biolog
ELISA
POURRITURE MOLLE
Burkholderia cepacia
Erwinia pectinolytiques
Erwinia amylovora
Pseudomonas fluorescents et
pectinolytiques
Faire tremper dans leau
physiologique (0,85%) de 20
30 minutes.
Faire des dilutions (1/10,
1/100) avant ltalement sur
milieu de culture
LPGA
MS
CCT
KB
Biolog
Tests biochimiques
API 20E
LOPAT
TACHE ET BRLURE FOLIAIRE
Acidovorax avenae subsp.
cattleyae
Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis
Pseudomonas syringae
Xanthomonas campestris
Xanthomonas campestris pv.
campestris et Xanthomonas
campestris pv. armoraciae
Xanthomonas

campestris pv.
pelargonii
Faire tremper dans leau
physiologique (0,85%) de 20
30 minutes
KB
LPGA
KB
LPGA
LPGA
LPGA
Biolog
ELISA
LOPAT
Biolog
Test biologique
ELISA
DESCRIPTIONS MORPHOLOGIQUES DES COLONIES
BACTRIENNES SUR MILIEUX GLOSS
PSEUDOMONAS FLUORESCENTS
Lorsquune bactrie du genre Pseudomonas fluorescent est souponne, un
milieu B de King (milieu KB) est inocul et incub 26
o
C pour 24 72 heures.
Aprs le temps dincubation, nous recherchons sur le milieu de culture la
prsence de colonies bactriennes produisant des pigments fluorescents bleuts.
Ces pigments sont visibles lorsque les milieux de culture sont exposs la
lumire ultra violet (UV). Dans laffirmative, des tests biochimiques connus sous
le nom de LOPAT sont raliss pour identifier lespce bactrienne.
Croissance : gnralement
abondante aprs 48 heures
Colonie : blanchtre crme
Pigment : fluorescent et diffus
dans le milieu
Diamtre moyen : 1 3 mm
(aprs 48 heures dincubation)

ERWINIA PECTINOLYTIQUE
Lorsquune bactrie du genre Erwinia ayant une activit pectinolytique est
souponne, un milieu MS est inocul et incub 26
o
C pour 24 72 heures.
Aprs le temps dincubation, nous recherchons sur le milieu de culture la
prsence de colonies bactriennes oranges ayant une marge nbuleuse. Dans
laffirmative, des tests biochimiques classiques sont raliss pour dterminer
lespce.
Croissance : gnralement
abondante aprs 48 heures
Colonie : orange avec contour
nbuleux
Diamtre moyen : 2 8 mm
(aprs 48 heures dincubation)


XANTHOMONAS
Lorsquune bactrie du genre Xanthomonas est souponne, un milieu LPGA est
inocul et incub 26
o
C pour 24 72 heures. Aprs le temps dincubation, nous
recherchons sur le milieu de culture la prsence de colonies bactriennes jaune
ple jaune vif. Dans laffirmative, pour dterminer lespce ou le pathovar,
nous ralisons les tests suivants :
Xanthomonas campestris test Biolog
Xanthomonas campestris pv. armoraciae test biologique
Xanthomonas campestris pv. campestris test biologique
Xanthomonas campestris pv. pelargonii test ELISA
Croissance : gnralement abondante
aprs 48 heures
Colonie : luisante, marge bien dfinie et
ayant une couleur jaune ple jaune
vif
Diamtre moyen : moins de 1 mm
(aprs 48 heures); il faut souvent
attendre 72 heures pour obtenir des
colonies de 1 2mm


CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS
Lorsque Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis est souponn, un
milieu LPGA est inocul 26
o
C pour 24 72 heures. Aprs le temps
dincubation, nous recherchons sur le milieu de culture la prsence de colonies
bactriennes irrgulires, crme jauntre. Dans laffirmative, pour dterminer
lespce, un test ELISA est ralis.
Croissance : gnralement peu abon-
dante aprs 48 heures
Colonie : ronde irrgulire ayant une
couleur crme jaune
Diamtre moyen : moins de 1 mm
(aprs 48 heures dincubation);
il faut souvent attendre 72 heures
dincubation pour obtenir des colonies
de 1 2 mm.



72 heures
48 heures
ERWINIA AMYLOVORA
Lorsque Erwinia amylovora est souponn, un milieu CCT est inocul et incub
26
o
C pour 24 72 heures. Aprs le temps dincubation, nous recherchons sur le
milieu de culture la prsence de colonies bactriennes particulirement convexes
et bleutes. Dans laffirmative, un test API 20E est ralis pour identifier la
bactrie.
Croissance : gnralement
abondante aprs 48 heures
Colonie : vue du dessus, elles
sont trs convexes, luisantes et
dune couleur gristre bleute
Vue du dessous, elles
prsentent une marge luisante
Diamtre moyen : 2 4 mm
(aprs 48 heures dincubation)



Vue par du
dessus du Ptri
Vue du dessous
du Ptri
TESTS BIOCHIMIQUES CLASSIQUES
Bien que les tests biochimiques constituent une approche classique pour lidentification
des bactries, il nen demeure pas moins quils sont particulirement utiles pour la
dtermination de certaines espces et sous-espces de bactries phytopathognes.
Grce ces tests, il est possible de connatre certaines caractristiques du mtabolisme
des bactries isoles.
Les tests biochimiques permettent donc de vrifier si la bactrie a un mtabolisme
oxydatif ou fermentatif, sil y a formation dun acide la suite de lutilisation dun
hydrate de carbone (ex : glucose, arabinose, sorbitol ...), si un compos particulier est
utilis comme seule source de carbone (ex : citrate, malonate ...), si un acide amin
peut tre transform (ex : arginine, lysine, tryptophane ...), si un enzyme particulier est
prsent (ex : oxydase, catalase, pectinase ...) ou si des molcules complexes sont
dgrades (ex : glatine, amidon ...).
Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, ces tests sont utiliss pour
identifier les Erwinia pectinolytiques et les Pseudomonas fluorescents.
1. Si des colonies bactriennes, sur le milieu MS (Miller-Schroth), possdent les
caractristiques dun Erwinia, les tests effectus pour vrifier sil sagit
rellement dun Erwinia pectinolytique sont: oxydase, catalase,
oxydation/fermentation, dgradation de la pectine (pectinase). Par la suite,
pour diffrencier les espces et les sous-espces dErwinia pectinolytique les
tests suivants sont raliss : transformation du sucrose en substances
rductrices, utilisation du mthyl-glucoside, production dindole et
croissance 35
o
C :
Tests biochimiques et culturaux pour distinguer les Erwinia pectinolytiques
Tests
Erwinia
Oxydase Catalase Oxydation/
Fermentation
Pectinase Mthyl-
glucoside
Sucrose Production
dindole
Croissance
35
o
C
Erwinia
caratovora
subsp.
carovotora
- + + + - - - +
Erwinia
carotovora
subsp.
atroseptica
- + + + + + - -
Erwinia
chrysanthemi
- + + + - - + +
Lgende :
Oxydase
Catalase
Fermentation
Pectinase
Mthyl-glucoside
Sucrose
Indole
Dtermination de la prsence de lenzyme cytochrome C oxydase.
Dcomposition du peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
) par la catalase.
Utilisation du glucose en condition anarobie.
Dtermination de la prsence de pectinases (substrat utilis : lacide
polygalacturonique).
Utilisation du mthyl-glucoside comme seule source de carbone.
Transformation du sucrose en substances rductrices.
Formation dindole partir du tryptophane (acide amin).
2. Si des colonies bactriennes fluorescentes, sur le milieu B de King,
caractristiques dun Pseudomonas sont prsentes, les tests raliser
(connus sous le nom de LOPAT) pour distinguer les espces sont :
production de levane, prsence doxydase, dgradation de la pectine
(pectinase), prsence darginine dshydrolase et lhypersensibilit du tabac.
Tests biochimiques et culturaux pour distinguer les espces de
Pseudomonas fluorescents
Groupe
Tests
Pseudomonas
Levane Oxydase Pectinase
Arginine
dshydrolase
Hypersensibilit
sur tabac
Ia P. syringae
+ - - - +
Ib P. delphini
- - - - +
II P. viridiflava
- - + - +
III P. cichorii
- + - - -
IV a P. marginalis
+ + + + -
IV b P. fluorescens
- + + + -
V a P. tolaasii
- + - + -
V b P. fluorescens
+ + - + -
Lgende :
Levane
Oxydase
Pectinase
Arginine dshydrolase
Hypersensibilit du
tabac
Polymrisation du fructose en polyfructose (levane).
Dtermination de la prsence de lenzyme cytochrome C
oxydase.
Dtermination de la prsence de pectinases (substrat utilis :
lacide polygalacturonique).
Transformation de larginine (acide amin) par larginine
dshydrolase.
Mise en vidence du pouvoir pathogne dune bactrie par le
desschement des zones dinoculation sur les feuilles de tabac.
API 20E
La galerie API 20E (bioMrieux) est une version miniaturise des tests
biochimiques classiques destins lidentification des Enterobacteriaceae
(bactries Gram ngatif et anarobies facultatives) dont font partie les Erwinia.
Ce systme regroupe 23 tests biochimiques. Des substrats dshydrats sont
contenus dans des microtubes. Ces substrats sont mis en solution grce
laddition dune suspension de la bactrie identifier. la suite dune priode
dincubation (24 heures 30
o
C), permettant la bactrie de ragir avec les
substrats, les diverses ractions sont notes afin de dterminer le code
didentification compos de 7 chiffres.
Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, le systme API 20E est utilis
pour lidentification de Erwinia amylovora, agent responsable de la brlure
bactrienne chez les plantes de la famille des Rosaceae.
Pour Erwinia amylovora, les principaux codes didentification obtenus avec API
20E sont 0005522 et 0007522.
A- INOCULATION DUNE GALERIE API 20E
A partir dune culture pure de 18 24 heures, faire une suspension
bactrienne ayant une concentration de 10
8
bactries/ml (standard
McFarland No 5) dans 5 ml de saline strile (NaCl 0,85%) un pH
entre 5,5 et 7,0.
Bien mlanger la suspension bactrienne au vortex 5-10 secondes.
Contrle de qualit : La suspension bactrienne doit tre utiliser dans les 15
minutes suivant sa prparation.
Dposer soigneusement 150 l de la suspension bactrienne dans
chaque cupule de la galerie en utilisant un embout strile.
Ajouter de nouveau 150 l de la suspension bactrienne aux cupules
CIT, VP et GEL (total = 300 l) par puits.
Aprs linoculation, remplir les cupules ADH, LDC, ODC, H
2
S et URE
dhuile minrale.
Ajouter de leau dans les supports, y dposer la galerie et mettre le
couvercle.
Placer les galeries dans une chambre humide (bote de plastique avec
couvercle contenant un papier humide) et incuber 30
o
C pendant 18
24 heures.
B- LECTURE DES GALERIES
Faire la lecture des galeries sous une hotte chimique.
Consigner les ractions sur une fiche de rsultats comme celle-ci :
Lgende :
ONPG -
ADH -
LDC -
ODC -
CIT -
H
2
S -
URE -
TDA -
IND -
VP -
GEL -
Dtermination de la prsence de lenzyme -galactosidase
Transformation de larginine (acide amin) par larginine dshydrolase
Transformation de la lysine (acide amin) par la lysine dcarboxylase
Transformation de lornithine (acide amin) par lornithine dcarboxylase
Utilisation du citrate comme seule source de carbone
Production du sulfure dhydrogne (H
2
S) partir du thiosulfate (S
2
O
3
)
Libration dammoniac partir de lure grce lurase
Formation de lacide indolepyruvique partir du tryptophane (acide amin)
grce la tryptophane dsaminase
Formation dindole partir du tryptophane (acide amin)
Formation dactone partir du piruvate de sodium
Liqufaction de la glatine (protine)
GLU (glucose), MAN (mammitol), INO (inositol), SOR (sorbitol), RHA (rhamnose), SAC
(sucrose), MEL (mlobiose), AMY (amygdaline), ARA (L+arabinose) - formation dacide
la suite de lutilisation dun hydrate de carbone.
Contrle de qualit : Lire et consigner toutes les ractions avant laddition des
ractifs pour la rduction des nitrates et de lindole car ces ractions dgagent
des produits gazeux qui peuvent interfrer avec les autres preuves de la
galerie. Ne pas replacer le couvercle en plastique aprs laddition des ractifs.
La lecture des galeries se fait gnralement au bas de chaque cupule
sauf CIT, IND.
Lire en suivant lordre ci-dessous (consulter le tableau des rsultats
annex cette technique) :
VP - Ajouter 1 goutte dhydroxyde de potassium (40%)
Ajouter 1 goutte dalpha-naphtol (6%)
Attendre 10 minutes
Pendant ce temps, faire la lecture des autres cupules sauf
TDA et IND en inscrivant la couleur et la raction (+ ou -)
sur une fiche de rsultats.
Lire la raction du VP
GLU - Avant laddition des ractifs, observer sil y a prsence
de bulles (+ ou -) qui indiquent une rduction du nitrate
ltat gazeux (N
2
).
Ajouter 2 gouttes dacide sulfanilique (0,8%)
Ajouter 2 gouttes de NN-dimethyl-alpha-naphthylamine (0,05%)
Attendre 2-3 minutes
Pendant ce temps, faire les ractions TDA et IND.
TDA - Ajouter 1 goutte de chlorure ferrique (10%), lire la
raction immdiatement.
IND - Ajouter 1 goutte du ractif de Kovac, lire la raction
immdiatement.
Lire la raction GLU. Si la raction est ngative, ajouter de
la poudre de zinc. Attendre 10 minutes et faire la lecture de
cette dernire raction.
Exemple dune galerie du systme API 20E avant laddition des ractifs
TABLEAU DES RSULTATS MTHODE DE 18 24 HEURES
RACTIONS
TUBE POSITIVE NGATIVE COMMENTAIRES
ONPG Jaune Incolore
Une teinte jaune ple est
souvent obtenue, la
considrer comme une
raction ngative.
ADH Rouge ou orange Jaune
LDC Rouge ou orange Jaune
ODC Rouge ou orange Jaune
CIT
Turquoise ou
bleu fonc
Vert ple ou
jaune
La lecture se fait dans la
partie suprieure de la
cupule (en arobie).
H
2
S Dpt noir Aucun dpt noir
URE Rouge ou orange Jaune
TDA Brun-rouge Jaune
Ajouter 1 goutte de chlorure
de fer 10%. Lire
immdiatement la raction.
IND Anneau rouge Jaune
Ajouter 1 goutte du ractif
de Kovac. Lire la raction
aprs 2 minutes.
VP Rose fonc ou rouge Incolore ou rose ple
Ajouter 1 goutte de KOH
40% puis 1 goutte dalpha-
naphthol 6%. Lire la
raction aprs 10 minutes.
GEL Diffusion du pigment
Aucune diffusion,
incolore
La rpartition des particules
solides travers la cupule
doit tre considre comme
une raction ngative.
RACTIONS
TUBE POSITIVE NGATIVE COMMENTAIRES
GLU
MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
Jaune Bleu ou bleu-vert
La fermentation des sucres
commence dans la partie la
plus anarobique de la
cupule (partie infrieure). Il
faut lire ces ractions
partir de la base de la
cupule vers le haut. Une
couleur jaune au fond
indique une raction
positive.
GLU
Rduction
des
nitrates
N
2
gazeux (prsence de
bulles)
Prsence de NO
2

(rouge)
Prsence de bulles et
coloration jaune
(aprs lajout du ractif
zinc
Jaune
Orange
(aprs lajout du
ractif de zinc)
Avant dadditionner les
ractifs, observer la
prsence de bulles dans la
cupule GLU. Ceci indique-
rait la rduction des nitrates
en gaz (N
2
).
Ajouter 2 gouttes dacide
sulfanilique 0.8% et 2
gouttes de NN-dimethyl-
alphanaphtylamine 0,5%.
Lire la raction aprs 2 ou 3
minutes.
Confirmer si la raction est
ngative en ajoutant de la
poudre de zinc. Lire la
raction aprs 3 ou 4
minutes.
BIOLOG
Les plaques Biolog GN 2 sont utiliss pour identifier les bactries Gram ngatif.
Lidentification des bactries est base sur lutilisation de 95 sources de carbone.
Une coloration pourpre est produite par la rduction de lindicateur, le
ttrazolium, en un compos color le formazan.
Reprsentation dune plaque GN 2 de Biolog contenant 95 sources de carbone.
A- INOCULATION DES PLAQUES BIOLOG GN 2
Contrle de qualit : Les plaques Biolog GN doivent tre temprature de la
pice (environ 21-22
o
C) . La suspension bactrienne doit tre utiliser dans les 15
minutes suivant sa prparation.
Faire un test oxydase sur les bactries identifier (culture de 18-24
heures).
- Oxydase positive : non-entrobactrie
- Oxydase ngative : entrobactrie ou non-entrobactrie
Si le test oxydase est ngatif, faire un test oxydation/fermentation
partir du glucose. Ce test nous permet de connatre si notre bactrie
recherche est une entrobactrie ou une non-entrobactrie.
- Oxydation/fermentation positif : entrobactrie
- Oxydation/fermentation ngatif : non-entrobactrie
Contrle de qualit : Il est essentiel de bien dfinir si la bactrie identifier est
une entrobactrie ou une bactrie non-entrobactrie car la banque de donnes
de Biolog est base sur cette information.
partir dune culture pure de 18 24 heures, utiliser un cotton-tige
strile pour faire une suspension bactrienne dans un tube de 20 ml
deau physiologique strile (NaCl 0,85%). La suspension bactrienne
doit avoir une transmittance de :
- de 52 % + ou 3 % si une non-entrobactrie
- de 63 % + ou 3 % si une entrobactrie
r l'lectrophotomtre ou tubidimtre,
lequel doit tre calibrer avec les
tubes standards de la compagnie
Biolog Inc.
Bien mlanger la suspension bactrienne laide du coton-tige. Si la
suspension bactrienne nest pas homogne (formation damas
bactriens) ajouter 3 gouttes de sodium thioglycolate.
Dposer 150 l de la suspension bactrienne par puits.
Placer les plaques Biolog GN 2 dans une chambre humide et incuber
24 heures 30
o
C.
B- LECTURE DES PLAQUES BIOLOG GN 2
Lidentification des bactries par le systme Biolog sappuie sur une
base de donnes contenant les profils dutilisation de 95 sources de
carbone par la majorit des espces bactriennes phytopathognes.
Entrer la raction de chaque puits dans le logiciel fourni par la
compagnie Biolog Inc.
Contrle de qualit : Le puits A1 doit tre incolore. Sil est violet, ne pas lire la
plaque.
L'oxydation des substrats par la
bactrie se traduit par lapparition
dune couleur pourpre dans les
puits. En labsence de lutilisation
du substrat, le puits demeure
incolore.
C- INTERPRTATION DES RSULTATS
la suite de la saisie des rsultats, sur lutilisation des substrats par la
bactrie inconnue, le systme informatique Biolog compare ce profil
ceux des espces contenues de la base de donnes. Lidentification
est donc ralise en jumelant le profil de la bactrie identifier celui
de lespce bactrienne phytopathogne prsentant le plus de
similarit.
Avec le systme Biolog, une identification est valable si le coefficient
de similarit est suprieur 0,50. Il est essentiel de considrer cette
donne lors de linterprtation des rsultats pour le diagnostic.
Exemple dune identification ralise par le systme Biolog
TESTS SROLOGIQUES
Lutilisation danticorps pour le diagnostic des maladies bactriennes reprsente
une mthode spcifique et rapide. Au Laboratoire de diagnostic en
phytoprotection, les tests srologiques sont utiliss pour dtecter une bactrie
directement dans les tissus vgtaux ou pour identifier une espce bactrienne
isole sur milieu de culture glos.
Les anticorps sont des protines produites par le systme immunitaire des
vertbrs. Lorsquun antigne (composante trangre) est prsent chez un
vertbr, des anticorps sont labors contre celui-ci. Il est possible de produire
commercialement des anticorps destins au diagnostic des maladies
bactriennes. En injectant, dans une souris ou un lapin, une cellule bactrienne
ou une de ces composantes, des anticorps sont synthtiss contre cet antigne.
la suite du prlvement du sang, les anticorps sont purifis et ils peuvent tre
utiliss pour le diagnostic de lespce bactrienne concerne.Sur une cellule
bactrienne, plusieurs sites antigniques sont prsents et chacun induit la
production danticorps. Linjection dun antigne engendre donc la synthse de
plusieurs types danticorps dont lensemble est qualifi danticorps polyclonaux. Il
est possible dobtenir des anticorps ragissant spcifiquement avec un seul site
antignique. Ces anticorps sont dits monoclonaux. La spcificit accrue des
anticorps monoclonaux permet de raliser un diagnostic des plus fiable.
TEST SROLOGIQUE ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay)
Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, le test ELISA est utilis pour
identifier la bactrie responsable de la tache bactrienne chez le granium soit
Xanthomonas campestris pv. pelargonii et la bactrie responsable du chancre
bactrien chez la tomate soit Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis .
Dans ces cas, la bactrie est isole sur milieu de culture et le test ELISA permet
didentifier le pathovar. Pour le Xanthomonas campestris pv. pelargonii et le
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, la technique employe est le
double antibody sandwich .Dune faon gnrale, cette approche comporte
quatre tapes soit le recouvrement des puits dune plaque en polystyrne par un
anticorps spcifique la bactrie recherche, lajout de la suspension
bactrienne, laddition dun anticorps, spcifique la bactrie recherche, auquel
un enzyme a t li (anticorps conjugu) et finalement lajout du substrat de
lenzyme ainsi que la lecture de la plaque une longueur donde approprie.
Dans le prsent cas, lenzyme utilis est la phosphatase alcaline. Laddition dun
substrat, le p-nitrophnyl phosphate, est alors transform par la phosphatase
alcaline en p-nitrophnol lequel est un compos jaune si la bactrie identifier
est du Xanthomonas campestris pv. pelargonii ou du Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis.
1- RECOUVREMENT DES PUITS
oooooooooooooo
ooooooooooooooooo
oooooooooooooooooo
Anticorps de recouvrement Incubation Lavages
2- ADDITION DE LANTIGNE
Suspension
bactrienne
oooooooooooooo
oooooooooooooooo
ooooooooooooooooo
Incubation Lavages
3- ADDITION DE LANTICORPS LI LENZYME (phosphatase alcaline)
oooooooooooooo
ooooooooooooooooo
ooooooooooooooooo
Anticorps li lenzyme Incubation Lavages
4- ADDITION DU SUBSTRAT (p-nitrophnyl phosphate) ET LECTURE
Substrat Incubation Lecture
TEST BIOLOGIQUE
Le test biologique utilis pour le diagnostic des maladies bactriennes sert
diffrencier deux bactries phytopathognes affectant les crucifres soit
Xanthomonas campestris pv. campestris (nervation noire) et Xanthomonas
campestris pv. armoraciae (tache bactrienne). La base de ce test consiste
linoculation de plantules de chou et lobservation de symptmes diffrentiels.
A- INOCULATION DE PLANTULES DE CHOU
La distinction entre le Xanthomonas campestris pv. campestris et le
Xanthomonas campestris pv. armoraciae se fait par linoculation de plantules
de chou au stade premire feuille (environ 8 10 jours aprs le semis).
laide dun scalpel strile, enlever un des cotyldons en ne brisant pas la
tigelle.
partir dune culture pure de 24 heures, inoculer laide dun cure dents
strile la tige lendroit o le cotyldon a t excis. Inoculer 3 isolats
diffrents pour chaque chantillon.
Incuber 24
o
C dans un cabinet de croissance ayant une photopriode de 12
heures et une humidit relative de 80%.
Inoculer des plantules de chou avec des tmoins : Xanthomonas campestris
pv. campestris et Xanthomonas campestris pv. armoraciae.
B- INTERPRTATION DES RSULTATS
Un examen visuel se fait aprs 4, 7 et 14 jours suivant linoculation des
plantules de chou avec la bactrie.
Raction de Xanthomonas campestris pv.
armoraciae :
Aprs 4 7 jours, des lsions noires
apparaissent le long de la tige au site
dinoculation.

Raction de Xanthomonas campestris pv.
campestris :
Aucun symptme avant 10 14 jours.
Les symptmes se caractrisent par un
jaunissement dbutant habituellement la
marge des feuilles, accompagn dun
noircissement des nervures plus ou moins
important selon la virulence de la bactrie.
Absence de noircissement de la tige
comme avec Xanthomonas campestris pv.
armoraciae

RFRENCE
Alvarez, A.M., A.A. Benedict, C.Y. Mizumoto, J.E. Hunter et D.W. Gabriel. 1994.
Serological, pathological, and genetic diversity among strains of Xanthomonas
campestris infecting crucifers. Phytopathology 84 : 1449-1457.
IMMUNOFLUORESCENCE
Limmunofluorescence est utilise pour la dtection de Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus dans les tiges ou les tubercules de pomme de terre
souponns dtre affects par le fltrissement bactrien. Lutilisation dun
compos fluorescent (isothiocyanate de fluorescine) conjugu un anticorps
constitue la base de cette technique. Cest grce lobservation microscopique
sous une lumire ultraviolet quil est possible de visualiser les bactries. Dans le
cas dun chantillon contenant du Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
les cellules bactriennes mettent une fluorescence vert brillant grce
lisothiocyanate de fluorescine.
1- RECOUVREMENT AVEC LANTIGNE
ou
Extraction Incubation dans le tampon Dpt sur lame IMF
Scher 50
o
C
Fixer dans lactone
2- ADDITION DE LANTICORPS SPCIFIQUE Clavibacter michiganensis subsp.
sepedonicus
Anticorps Incubation, lavages et schage
3- ADDITION DE LANTICORPS CONJUGU LISOTHIOCYANATE DE
FLUORESCINE
4- LECTURE AU MICROSCOPE FLUORESCENCE
Les anticorps utiliss sont des anticorps de surface. Nous
pouvons voir au microscope la forme rnale de la bactrie qui
nous parat fluorescente.
TEST DE LA RSISTANCE AU CUIVRE
Le test de la rsistance au cuivre a pour objectif de vrifier si les bactries du
genre Xanthomonas sont sensibles ou rsistantes au cuivre afin dorienter les
producteurs dans leur intervention au champ pour lutter contre certaines
maladies bactriennes associes au Xanthomonas..
A- PRPARATION DES CULTURES BACTRIENNES
Sur milieu de culture levure peptone glucose agar (LPGA), repiquer 4 colonies
bactriennes isoles afin dobtenir des cultures pures. Diviser la bote de Ptri
en 4 quadrants.
Incuber 26
o
C pendant 24 48 heures.
B- RALISATION DU TEST DE RSISTANCE AU CUIVRE.
Identifier 3 quadrants sur les botes de Ptris du milieu levure peptone
glucose agar (LPGA) et dun milieu cuivre pour les bactries tester.
Identifier 2 quadrants pour les tmoins sensible et rsistant au cuivre sur les
mmes milieux.
A partir dune culture pure de 18 24 heures, inoculer la fois un milieu de
culture levure peptone glucose agar (LPGA) qui sera notre tmoin de
croissance des bactries testes et un milieu cuivre contenant 200 ppm de
CuSO
4
. La croissance sur ce dernier milieu rvlera donc la rsistance de la
bactrie au cuivre.
Incuber 26
o
C pour 48 heures.
la suite de lincubation, lire la raction comme suit :
Observation dune croissance sur le milieu cuivre: indique que la bactrie
est rsistance au cuivre
Aucune croissance sur le milieu cuivre: indique que la bactrie est sensible
au cuivre.
Il est bien sr toujours important de se rfrer au tmoin positif de
croissance.
MILIEUX POUR LA CULTURE DES BACTRIES ET LA
RALISATION DES TESTS BIOCHIMIQUES
1. MILIEUX GLOSS POUR LA CULTURE DES BACTRIES
MILIEU CCT (milieu diffrentiel pour Erwinia amylovora)
g/L
Sucre de table 100.000
Sorbitol 10.000
Tergitol anionic 7 (solution de 1%) 30.0 ml
Crystal violet (solution de 0.1% dans thanol) 2.0 ml
Nutrient agar 23.000
* Cycloheximide 0.050
Prparer les diverses solutions.
Dissoudre les produits un un sauf la cycloheximide dans 800 ml H
2
O distille.
Ajouter les diverses solutions aux produits dissous.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Striliser 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
* Dissoudre la cycloheximide dans 10 ml H
2
O distille strile et lajouter lorsque
le milieu a atteint 45
o
C.
Laisser agiter 10 minutes et couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.
NOTES : Striliser au moins 25 30 minutes si nous prparons 3 litres de
milieu.
Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pour
connatre la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de
la bactrie recherche.
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCE
ISHIMARU, C. and E.J. KLOS, 1984. New medium for detecting Erwinia
amylovora and its use in epidemiological studies. Phytopathology vol. 74: 1342-
1345.
MILIEU B DE KING (Kings medium B agar) (milieu diffrentiel pour Pseudomonas
fluorescents)
g/L
Protose peptone #3 (Difco) 20.000
Phosphate de K dibasique (K
2
HPO
4
) 1.145
Sulfate de Mg (MgSO
4
.7H
2
O) 1.500
Agar (Bacto) 15.000
Glycrol 15.0 ml
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Striliser 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri lorsquil a atteint 50
o
C.
NOTES : Striliser au moins 25 30 minutes si nous prparons 3 litres de
milieu.
Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21- 22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pour
connatre la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de
la bactrie recherche.
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCES
KING, E.O., M.K. WARD and D.E. RANEY. 1954. Two simple media for
demonstration of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical
Medicine 44, 301-7.
SHAAD, N.W., 1980. Laboratory guide for identification of plant pathogenic
bacteria. P.3.
MILIEU LPGA (milieu Levure Peptone Glucose Agar)
g/L
Glucose 7.000
Peptone (Bacto) 7.000
Extrait de levure 7.000
Agar (Bacto) 15.000
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Ajuster le pH entre 7.2 et 7.3.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Striliser 15 minutes 121
0
C et 15 psi.
Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri lorsquil a atteint 50
o
C.
NOTES : Striliser au moins 25 30 minutes si nous prparons 3 litres de
milieu.
Laisser 3 jours 22
o
C afin de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pour
connatre la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de
la bactrie recherche.
Conserver la noirceur 4
o
C.
MILIEU MS (Miller-Schroth medium) (milieu diffrentiel pour Erwinia spp.)
g/L
Acide nicotinique 0.500
L-asparagine (en poudre) 3.000
Phosphate de K dibasique (K
2
HPO
4
) 2.000
Sulfate de Mg (MgSO
4
.7H
2
O) 0.200
Taurocholate de Na (Difco) 2.500
Mannitol 10.000
Agar (Bacto) 20.000
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Lorsque ces produits sont dissout, ajouter :
ml/L
Tergitol 7 0.1
Acide nitrilotriactique (soln de 2%) 10.0
2.0 g ac. nitriloactique
1.659 g hydroxyde de K (KOH)
dissoudre dans 100 ml H
2
O distille
Bleu de bromothymol (soln de 0.5%) 9.0
Rouge neutre (soln de 0.5%) 2.5
Hydroxyde de Na (NaOH 1N) 5.0
4 g NaOH/100 ml H
2
O
*Cycloheximide (soln 1%) 5.0
Prparer les diverses solutions sauf la cycloheximide et les ajouter aux
produits dissouts.
Ajuster le pH environ 7.3.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Striliser 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
* Dissoudre la cycloheximide dans 10 ml H
2
O distille strile et lajouter lorsque
le milieu a atteint 45
o
C.
Laisser agiter 10 minutes et couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.
NOTES : Striliser au moins 25 30 minutes si nous prparons 3 litres de
milieu.
Laisser 3 jours 22
o
C afin de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pour connatre
la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de la bactrie
recherche.
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCE
MILLER, T.D. and M.N. SCHROTH, 1972. Monitoring the epiphytic population of
Erwinia amylovora on pear with a selective medium. Phytopathology 62 : 1175-
1182.
2. MILIEUX POUR LA RALISATION DES TESTS BIOCHIMIQUES
MILIEU ARGININE
g/L
Peptone (bacto) 1.000
Chlorure de Na (NaCl) 5.000
Phosphate de K dibasique (K
2
HPO
4
) 0.300
Agar (Bacto) 3.000
Rouge phnol (soln de 0.1%)* 10.0 ml
Arginine HCl 10.000
*Dissoudre 0.1g de rouge phnol dans 100 ml dthanol (solution de 0.1%).
Mlanger les autres produits un un dans 800 ml H
2
O distille ; ajouter le
rouge phnol.
NOTE : Ne pas chauffer le milieu, seulement lagiter laide dun barreau
magntique. Il est normal que lagar ne se dissolve pas
compltement.
Ajuster le pH 7.1.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Distribuer 3ml de milieu par tube (16 mm) en agitant constamment afin de
bien rpartir lagar.
Striliser 10 minutes 121
o
C 15 psi.
NOTE : Il est important de ne pas dpasser le temps de strilisation car
larginine est sensible une strilisation de plus de 10 minutes.
Le milieu sera jaune la sortie de lautoclave et deviendra rose en
refroidissant.
Laisser 5 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C) avant
de lutiliser.
Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pour
connatre les ractions positive et ngative de ce test.
Pseudomonas marginalis (positif) : milieu rose
Pseudomonas viridiflava (ngatif) : milieu jaune orang
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCE
Thornley, M.J., 1960. The differentiation of Pseudomonas from other Gram-
negative bacteria on the basis of arginine metabolism. Journal of Applied
Bacteriology, 23 : 37-52.
MILIEU LIQUIDE INDOLE (production dindole)
g/L
Peptone (Bacto) 20.000
Chlorure de Na (NaCl) 5.000
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Distribuer 3 ml de milieu par tube (16mm).
Striliser lautoclave 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
NOTES : Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pour
connatre les ractions positive et ngative de ce test.
Escherichia coli (positif) : prsence dun anneau rouge en
surface aprs laddition du ractif de Kovac
Erwinia amylovora (ngatif) : prsence dun anneau jaune en
surface aprs laddition du ractif de Kovac
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCE
LELLIOTT, R.A., and R.S. DICKEY. 1984. Genus VII. Erwinia Winslow,
Broadhurst, Buchanan, Krumweide, Rogers and Smith 1920, 209. Pages 469-
476. In Noel R. Krieg and John G. Holt (eds.). Bergeys Manual of Systematic
Bacteriology. Volume 1. Williams and Wilkins, Baltimore, Md.
MILIEU LEVANE
g/L
Nutrient agar 23.000
D - glucose 2.500
Sucre de table 50.000
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Striliser 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri lorsquil a atteint 50
o
C.
NOTES : Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pour
connatre les ractions positive et ngative de ce test.
Pseudomonas marginalis (positif) : strie saillante et brillante.
Prsence dune zone opaque et lumineuse en marge de la strie
(observation en dessous de la bote de Ptri).
Pseudomonas viridiflava (ngatif) : strie prostre.
Conserver la noirceur 4
o
C.
MILIEU METHYL-D-GLUCOSIDE
Solution 1 g/L
Phosphate de K monobasique (KH
2
PO
4
) 4.000
Phosphate de K dibasique (K
2
HPO
4
) 14.000
Chlorure dammonium (NH
4
Cl) 2.000
Solution 2 g/L
Agar (Bacto) 30.000
Acide casamino (Difco) 2.000
Solution 3 g/100ml
Sulfate de Mg (MgSO
4
.7H
2
O) 10.000
Solution 4 g/100ml
methyl-d-glucoside 20.000
Solution 5 g/100ml
Sel de tetrazolium (C
19
H
15
N
4
Cl) 1.000
Prparer toutes les solutions avec de H
2
O distille ; dissoudre les produits un
un dans 800 ou 80 ml H
2
O distille et complter 1 litre ou 100 ml selon la
solution prpare.
Mlanger 500 ml des solutions 1 et 2 (pour obtenir un volume final de 1 litre).
Striliser 20 minutes 121
o
C et 15 psi.
Pendant ce temps, striliser lautoclave : 1.0 ml de la solution 3
50.0ml de la solution 4
2.0 ml de la solution 5
20 minutes 121
o
C et 15 psi.
Laisser refroidir les 3 solutions striles. Ajouter ces solutions striles aux deux
premires lorsque le milieu aura atteint 45
o
C.
Laisser agiter 10 minutes et couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.
NOTES : Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pour
connatre les ractions positive et ngative de ce test.
Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : gros points
bourgognes
Erwinia carotovora subsp. carotovora (ngatif) : Petits points
bourgognes avec contour blanc
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCE
DYE, D.W., 1968. A taxonomic study of the genus Erwinia. I. The amylovora
group. N.Z.J. Sci. 11: 590-607.
MILIEU PECTINASE (activit pectinolytique des Erwinia)
Agar (Bacto) 15.000 g pour 519 ml H
2
O distille
Extrait de levure 1.000 g pour 20 ml H
2
O distille
Sulfate dammonium ((NH
4
)
2
SO
4
) 5.0 ml
(soln de 20%)
Glycrol (soln de 87%) 5.0 ml
* Acide polygalacturonique (soln de 2%) 250.0 ml
* Tampon phosphate 0.1 M pH 8.0 200.0 ml
NaH
2
PO
4
0.640 g
Na
2
HPO
4
12.930 g
dissoudre dans 1 litre H
2
O distille
ajuster le pH 8.0
Acide Casamino (soln de 20%) 10.0 ml
H
2
O distille 100.0 ml
Sulfate de Mg (MgSO
4
.7H
2
O) 1M 1.0 ml
24.648 g / 100 ml H
2
O distille
Prparer les diverses solutions.
Dissoudre lagar et lextrait de levure dans H
2
O distille.
Ajouter les diverses solutions sauf lacide polygalacturonique (2%) et le
tampon phosphate (0.1M) aux produits dissouts.
NOTE : Ajout le sulfate de Mg en dernier.
Striliser 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
*Pendant ce temps, striliser lautoclave lacide polygalacturonique (2%) et le
tampon phosphate (0.1M) 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
Laisser refroidir les solutions striles et les ajouter au milieu lorsque celui-ci
aura atteint 45
o
C.
Laisser agiter 10 minutes et couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.
NOTES : Striliser au moins 25 30 minutes si nous prparons 3 litres de
milieu.
Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21- 22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pour
connatre les ractions positive et ngative de ce test.
Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : prsence
dun halo blanc (zone de prcipitation) aprs laddition
dactate de cuivre.
Erwinia amylovora (ngatif) : absence dun halo aprs
laddition dactate de cuivre.
Conserver la noirceur 4
o
C.
MILIEU PH (milieu Pectine Hildebrand) (activit pectinolytique des
Pseudomonas)
g/L
Bleu de bromothymol 0.015
Chlorure de Ca (CaCl
2
.2H
2
O) (soln de 10%) 10.0 ml
Acide polygalacturonique 22.000
Agar (Bacto) (soln de 4%)* 100.0 ml
Dissoudre dans lordre les 3 premiers produits un un dans 800 ml H
2
O
distille bouillante en maintenant une agitation constante (doit bouillir trs
fortement pour dissoudre lacide polygalacturonique).
Ajuster le pH 8.4 avec du NaOH 1N.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Striliser lautoclave 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
* Dissoudre 4 g. dagar dans 100 ml H
2
O distille ; striliser lautoclave 15
minutes 121
o
C et 15 spi.
Aprs strilisation, ajuster de nouveau le pH 8.4.
Ajouter la solution strile dagar 4%.
Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri lorsque le milieu est un peu
refroidi.
NOTES : Laisser 5 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C avant
de lutiliser.
Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pour
connatre les ractions positive et ngative de ce test.
Erwinia carotovora subsp. carotovora (positif) :
dpression du milieu entourant le point dinoculation
Erwinia amylovora (ngatif) : aucune dpression
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCE
HILDEBRAND, D.C., 1971. Pectate and pectin gels for differentiation of
Pseudomonas sp. and other bacterial plant pathogens. Phytopathology 12 :
1430-1436.
BOUILLON TRANSFORMATION DU SUCROSE EN SUBSTANCES RDUCTRICES (RS)
g/L
Sucrose 40.000
Peptone (Bacto) 10.000
Extrait de buf 5.000
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Ajuster le pH 7.0.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Distribuer 3 ml de milieu par tube (16 mm).
Striliser lautoclave 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
NOTES : Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pour
connatre les ractions positive et ngative de ce test.
Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : milieu jaune
aprs laddition du ractif de Bndict et incubation dans eau
chaude.
Erwinia carotovora subsp. carotovora (ngatif) : milieu bleu
aprs laddition du ractif de Bndict et incubation dans eau
chaude.
Conserver la noirceur 4
o
C.
RACTIF DE BENEDICT (ractif ajout pour la rduction du sucrose)
g/L
Citrate de Na (Na
3
C
6
H
5
O
7
.2H
2
O) 173.0
Carbonate de Na (Na
2
CO
3
) 85.5
Sulfate de Cu (CuSO
4
.5H
2
O) 17.3
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
NOTES : Travailler sous la hotte car il y aura dgagement de gaz.
Conserver la noirceur (bouteille ambre) la temprature de la
pice (environ 21-22
o
C)
RFRENCE
SCHAAD, N.W., 1988. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic
Bacteria, 2
nd
Edition. The American Phytopathological Society.p.53.
3. MILIEUX GLOSS POUR LA DTECTION DE LA RSISTANCE
AUX PRODUITS ANTIPARASITAIRES
MILIEU CUIVRE (milieu pour la rsistance des Xanthomonas au cuivre)
g/L
Nutrient agar 23.000
Sulfate de Cu (CuSO
4
) 0.200
Dissoudre les produits un un dans 800 ml H
2
O distille.
Complter 1 litre avec H
2
O distille.
Striliser 15 minutes 121
o
C et 15 psi.
Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.
NOTES : Striliser au moins 25 30 minutes si nous prparons 3 litres de
milieu.
Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22
o
C) afin
de sassurer de la strilit du milieu.
Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pour
connatre la sensibilit de la bactrie au cuivre : Xanthomonas
campestris vesicatoria (rsistante).
Conserver la noirceur 4
o
C.
RFRENCE
STALL R.E., 1994. University of Florida, Plant pathology department, Institute of
food and agricultural sciences.
TESTS POUR LIDENTIFICATION DES BACTRIES
PHYTOPATHOGNES
ARGININE DSHYDROLASE
Le test arginine dshydrolase sert dterminer si la bactrie transforme larginine (acide
amin) par lenzyme arginine dshydrolase.
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture arginine
avec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).
Ajouter environ 1 cm dhuile minrale strile.
Incuber 26
o
C pour 24 48 heures.
la suite de lincubation, lire la raction obtenue.
Raction positive :
le milieu demeure rose

Raction ngative :
le milieu devient jaune
orang
CATALASE
Le test catalase sert dmontrer si la bactrie possde lenzyme catalase servant
dcomposer le peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
).
Dans un couvercle dune bote de Ptri ou sur une lame, dposer une goutte
de peroxyde dhydrogne 3%.
laide dun cure-dent prendre la bactrie identifier (culture de 18-24
heures) et la dposer dans la solution de peroxyde dhydrogne.
Attendre environ 2 minutes et lire la raction obtenue :
Raction positive :
prsence de bulles rvlant
le dgagement doxygne
Raction ngative :
absence de bulle
HYPERSENSIBILIT SUR LE TABAC
Le test dhypersensibilit du tabac sert mettre en vidence le pouvoir pathogne dune
bactrie par le desschement des zones dinoculation sur les feuilles de tabac.
Dans un tube contenant 2 ml deau physiologique strile (NaCl 0,85%), faire
une suspension bactrienne ayant une concentration de 10
8
bactries/ml
(standard McFarland No 5) de la bactrie identifier (culture de 18-24
heures).
Utiliser un plant de tabac White Burley ayant 5 6 feuilles. Inoculer une
feuille par bactrie identifier ou pour chaque tmoin (bactrie non
pathogne et bactrie pathogne).
laide dune seringue tuberculine de 1 ml injecter la suspension bactrienne
dans lespace intercellulaire le long de la nervure centrale ou dune nervure
secondaire. Linoculation de la suspension bactrienne se fait sur la face
infrieur de la feuille.
Laisser le plant la temprature de la pice pour une priode de 24 48
heures.
Aprs 24 ou 48 heures lire la raction obtenue.
Raction ngative :
aucun changement dans la
couleur et laspect du tissu
Raction positive :
La zone foliaire inocule avec
la bactrie devient
lgrement translucides et a
un aspect humide. Par la
suite, les tissus sasschent
et prennent une coloration
brun clair beige
Contrle de qualit : Un jaunissement ou un brunissement de la zone foliaire
inocule nest pas une raction positive.
LEVANE
Le test levane sert dterminer si la bactrie polymrise le fructose en polyfructose.
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture levane par
stries avec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).
Incuber 26
o
C pour 48 heures.
la suite de lincubation, lire la raction obtenue.
Raction positive :
Strie partiellement saillante et luisante
(vue du dessus).
Prsence dune zone opaque et
luisante en marge de la strie
(vue du dessous).
Raction ngative :
strie prostre
MTHYL-GLUCOSIDE
Le test Mthyl-glucoside sert dterminer si la bactrie peut crotre en
prsence de cette seule source de carbone.
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture mthyl-D-
glucoside par points en dposant des amas de la bactrie identifier (culture
de 18-24 heures).
Incuber 26
o
C pour 48 heures.
la suite de lincubation, lire la raction obtenue :
Raction positive :
gros points bourgognes
Raction ngative :
petits points bourgognes avec un
important pourtour blanc

OXYDASE
Le test oxydase (bioMrieux) permet de mettre en vidence la prsence de lenzyme
cytochrome C oxydase.
Sur un papier filtre strile, dposer un disque doxydase imprgn de
dimthyl-para-phnylne diamine.
Humidifier le disque avec quelques gouttes deau distille strile. Un excs
deau peut nuire la lecture.
laide dun cure-dent prendre la bactrie identifier (culture de 18-24
heures) et la dposer sur le disque.
Lire la raction dans les 30 secondes.
Raction ngative :
absence de coloration
Raction positive :
prsence dune coloration
rose ple violet
OXYDATION/FERMENTATION
Le API OF Medium (bioMrieux) est destin tudier le mtabolisme oxydatif ou
fermentatif des bactries. La faible teneur en peptone et la forte concentration
en glucose permettent dutiliser le API OF Medium pour vrifier si la bactrie peut
utiliser le glucose en prsence et en absence doxygne la suite de lutilisation
du glucose, il y a formation dacide.. Lacidification du milieu fait virer lindicatif
color le bleu de bromothymol, lequel passe du vert au jaune.
Dposer les tubes identifis dans un bcher de 250 ml.
Ajouter de leau (environ 75 ml).
Faire bouillir sur une plaque chauffante jusqu ce que le contenu des tubes
devienne liquide.
Contrle de qualit : Laisser revenir les tubes temprature de la pice avant de
les inoculer. Si le liquide est trop chaud, les bactries seront dtruites.
Casser lextrmit du tube laide du capuchon de plastique.
Inoculer le milieu avec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures) en se
servant dune anse inoculer strile.
Ajouter environ 1 cm dhuile minrale strile.
Replacer le capuchon de plastique sur le tube.
Incuber 26
o
C pour 24 48 heures.
la suite de lincubation, lire la raction obtenu :
Raction ngative :
(mtabolisme oxydatif)
le milieu reste vert
Raction positive :
(mtabolisme fermentatif)
le milieu devient jaune
PECTINASE (ERWINIA)
Le test pectinase sert dterminer lactivit pectinolytique dune bactrie, cest--dire si
elle peut dgrader la pectine contenu dans le milieu de culture.
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture pectinase
(milieu servant mesurer lactivit pectinolytique des Erwinia) par points, en
dposant des amas de la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).
Incuber 26
o
C pour 24 48 heures.
la suite de lincubation, ajouter suffisamment dactate de cuivre (7,5%)
pour recouvrir les points dinoculation (environ 5 ml).
Attendre environ 5 minutes et lire la raction obtenue:
Raction ngative :
absence dun halo blanc
Raction positive :
prsence dun halo blanc
(zone de prcipitation)
PECTINASE (PSEUDOMONAS)
Le test pectinase sert dterminer lactivit pectinolytique dune bactrie, cest--dire si
elle peut dgrader la pectine contenu dans le milieu de culture.
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture Pectine
Hildebrand (milieu servant mesurer lactivit pectinolytique des
Pseudomonas) par points en dposant des amas de la bactrie identifier
(culture de 18-24 heure).
Incuber 26
o
C pour 24 48 heures.
la suite de lincubation, lire la raction obtenue.
Raction positive: prsence dune dpression du milieu
entourant le point dinoculation
Raction ngative : absence dune dpression
PRODUCTION DINDOLE
Le test indole sert dterminer si la bactrie produit de lindole partir du tryptophane
(acide amin).
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture liquide
indole (production dindole) avec la bactrie identifier (culture de 18-24
heures).
Incuber 26
o
C pour 48 heures.
la suite de lincubation, ajouter 3 gouttes du ractif de Kovac (bioMrieux)
sous la hotte chimique.
Lire immdiatement la raction obtenue:
Raction positive :
prsence dun anneau rouge
en surface

Raction ngative :
prsence dun anneau jaune
en surface
TRANSFORMATION DU SUCROSE
Le test sucrose sert dterminer si la bactrie transforme le sucrose en substances
rductrices.
laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture liquide RS
(transformation du sucrose en substances rductrices) avec la bactrie
identifier (culture de 18-24 heures).
Incuber 26
o
C pour 48 heures.
la suite de lincubation, ajouter 2,5 ml du ractif de Bndict.
Dposer les tubes dans un bcher de 250 ml.
Ajouter de leau (environ 75 ml) et amener bullition sur une plaque
chauffante.
Au changement de couleur du tmoin positif (couleur jaune apparaissant), lire
la raction obtenue :
Raction ngative :
le milieu reste
bleu-vert

Raction positive :
le milieu devient
jaune