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Orientao para
prticas de Laboratrio

Srgio Oliveira Silveira
Laboratrio de Histologia e
Embriologia UFSM
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Sumrio



- Indroduo .......................................................................01
- Tecidos Epitelial ..............................................................01
- Tecido Conjuntivo ...........................................................02
- Tecido sseo ...................................................................06
- Tecido Muscular ..............................................................09
- Tecido Nervoso ...............................................................13
- Tcnica Bsica de Histologia ..........................................17
- Obteno das Peas .........................................................17
- Fixao ............................................................................18
- Principais Fixadores ........................................................20
- Principais Solues Fixadoras .........................................22
- Desidratao ....................................................................24
- Diafanizao ou Clarificao ..........................................25
- Impregnao/ e Incluso ................................................ 25
- Microtomia .....................................................................25
- Colorao ........................................................................29
- Coloraes Especiais ......................................................35
- Descalcificao ...............................................................37
- Descalcificadores ............................................................40
- Indroduo a Biologia Celular ........................................43
- Indroduo a Imunohistoquimica Bsica.........................48









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INTRODUO
A tcnica histolgica constitui o conjunto de processos a que se submetem os
tecidos, neste caso de origem animal, a fim de que possam ser observados de maneira
significativa e adequada permitindo o diagnstico histolgico ou patolgico.

O QUE HISTOLOGIA?
a parte da Biologia que estuda os tecidos (do grego, hydton, tecido + logos, estudo).

MAS O QUE TECIDO?
Tecido uma especializao morfolgica, fsico-qumico e fisiolgica de
clulas(GRASSE).
Tecido um conjunto de clulas da mesma natureza, diferenciadas em determinado
sentido para poderem realizar a sua funo prpria (SCHUMACHER).
Tecido um grupo de clulas que apresentam a mesma funo prpria
(MENEGOTTO). Todos esto corretos. Os tecidos do corpo dos animais vertebrados
desempenham variadas funes que por sua vez so formados por clulas especializadas.
No corpo dos animais pluricelulares exceto espongirios, e constitudo por clulas
agrupadas e organizadas, formando os tecidos. Precisa-se de requisito para termos um
tecido que seja composto de um grupo de clulas, que dever apresentar a mesma funo.
Os tecidos fundamentais nos animais so estes: Epitelial, Muscular, Nervoso, Sangneo e
Conjuntivo. Nos invertebrados estes tipos de tecidos so basicamente os mesmos, porm
com organizaes mais simples. A maioria dos tecidos alm de serem compostos de
clulas, apresentam entre elas substncias intercelulares (intersticiais). Esses tecidos no
existem isoladamente mas associam-se em propores variveis, para formar os diferentes
rgos e sistemas do organismo animal.

Tecido Epitelial
Clulas geralmente polidricas, justapostas, entre as quais encontra-se pouca
substncia extracelular, tm vida limitada e se renovam constantemente.
Possuem adeso mtua, podem apresentar estruturas como vilosidades e clios.
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Pode ser formado por clulas especializadas na produo e secreo (tecido
epitelial glandular)
Pode ser especializado na captao de estmulos provenientes do ambiente
(neuroepitlios)
Revestem a superfcie externa e as cavidades do corpo (tecido epitelial de
revestimento) Esses epitlios dividem o organismo em compartimentos funcionais e tm
papel importante na absoro dos nutrientes - revestimento da superfcie interna do
intestino.
Os epitlios de revestimento so divididos de acordo com critrios morfolgicos,
tendo em vista o nmero de camadas que o constitui e a forma das clulas na camada mais
superficial:
-Epitlio Simples Pavimentoso - revestimento dos vasos (endotlio), da cavidade
peritoneal, pericrdia e pleural (mesotlio). Funo: movimentao das vsceras (mesotlio)
e transporte ativo por pinocitose (endotlio).
-Epitlio Simoples Cbico - revestimento do ovario, intestino. Funo: revestimento,
proteo, lubrificao e absoro.
-Epitlio Estratificado Pavimentoso - revestimento da pele, boca e esfago. Funo:
proteo e dificulta a perda de gua.
-Epitlio Estratificado de Transio - revestimento interno da bexiga e parte das vias
urinrias. Funo: proteo.
-Epitlio Estratificado Prismtico - conjuntiva do olho, serve para proteo.
-Epitlio Pseudo Estratificado - revestimentos da traquia e brnquios. Funo:
proteo e transporte de partculas estranhas para o exterior.

Tecido Conjuntivo
Diversos tipos de clulas, separadas por abundante material intercelular sintetizado
por elas e constitudo por fibras, uma substncia fundamental amorfa e pelo plasma
intersticial.
As fibras do conjuntivo so de trs tipos principais: colgenas, reticulares e
elsticas.
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As fibras colgenas so as mais freqentes e constitudas por uma glicoprotena
denominada colgeno (protena mais abundante do corpo humano), que pode ser de vrios
tipos. So encontrados formando tendes, ligamentos, cpsulas dos rgos, derme, ossos,
dentina, entre outros.
As fibras reticulares so extremamente delicadas e formam o arcabouo dos rgos
hemocitopoiticos (bao, linfonodos, medula ssea, etc.), formam redes em torno das
clulas musculares e das clulas de muitos rgos epiteliais.
As fibras elsticas formam tipo uma malha irregular e tm como componente
principal a elastina (protena estrutural muito resistente).
Clulas do Conjuntivo:
1- Fibroblasto - clula mais comum e principal responsvel pela formao das
fibras e do material intercelular amorfo. uma clula dotada de motilidade, porm muito
lenta. Alguns autores a dividem em fibroblastos quando so ativas (sintetizam fibras) e
fibrcitos quando so inativas.
2- Macrfago - clula com grande capacidade de fagocitar e morfologia bastante
varivel conforme a sua localizao e estado funcional. Apresentam movimentos
amebides ou podem estar fixos. Atuam como elementos de defesa, que penetram no
organismo. Quando estimuladas (presena de substncia estranha)sofrem modificaes
morfolgicas e metablicas, sendo denominados de macrfagos ativados e passam a ter
maior capacidade fagocitria, produo de lisossomos aumentada e secretam diversas
substncias que participam do processo defensivo atraindo leuccitos e estimulando a
atividade de outras clulas. Os macrfagos so originados dos moncitos (clulas do
sangue que atravessam a parede dos capilares, penetram no tecido conjuntivo, onde
adquirem o aspecto morfolgico do macrfago. Portanto, o moncito e o macrfago so a
mesma clula em diferentes fases de maturao.
3- Mastcitos - clula globosa, com ncleo esfrico e central. Tem a funo de
produzir e armazenar mediadores qumicos do processo inflamatrio, tais como a heparina
e histamina. (aumenta a permeabilidade dos vasos sangneos).
4- Plasmcitos normalmente so encontrados em pouca quantidade no tecido
conjuntivo. Tem seu nmero aumentado em regies sujeitos a penetrao de bactrias e
onde h processo inflamatrio crnico. So clulas de formato ovide com grande
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quantidade de R.E. e Aparelho de Golgi. Tem como funo sintetizar e secretar anticorpos
(protenas especficas denominadas imunoglobinas).
5- Clula Adiposa clula especializada no armazenamento de gordura. Ser
descrito posteriormente.
6- Leuccitos So constituintes normais do tecido conjuntivo, porm so oriundos
do sangue. Os leuccitos mais freqentes no tecido conjuntivo so os neutrfilos, os
infilos e os linfcitos. Sero detalhados posteriormente.

Substncia Fundamental Amorfa
Substncia incolor e transparente que preenche o espao entre as clulas e as
fibras. constituda de protenas (proteoglicanas, glicoprotenas adesivas).
Encontrada em abundncia em recm- nascidos.

Variedades do Tecido Conjuntivo
H diversas variaes do tecido conjuntivo, formado pelos componentes bsicos
(fibras, clulas e substncia amorfa) e que refletem o componente predominante, ou a
organizao estrutural do tecido. Tem como funo a sustentao, preenchimento,
armazenamento, transporte, defesa e reparao.

Tecido Conjuntivo Tecido Conjuntivo Propriamente Dito Frouxo
Denso
Tecido Conjuntivo de Propriedades Especficas Tecido Adiposo
Tecido Elstico
Tecido Reticular
Tecido Mucoso
Tecido Cartilaginoso
Tecido sseo

Tecido Conjuntivo Frouxo mais comum, preenche espaos entre as fibras e feixes
musculares serve de apoio para o tecido epitelial e forma camada em torno dos vasos
sangneos e linfticos. um tecido delicado, flexvel e pouco resistente s traes.
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Tecido Conjuntivo Denso tecido menos flexvel e mais resistente, encontrado
formando tendes.
Tecido Conjuntivo Elstico pouco comum e encontrado nos ligamentos da coluna
vertebral.
Tecido reticular muito delicado , forma rede para sustentar clulas especializadas.
Encontrado na medula e rgos linfticos.
Tecido Mucoso tecido que constitui o cordo umbilical, formado com grande
predominncia de substncia fundamental amorfa.
Tecido Adiposo O tecido adiposo o maior depsito de energia (sob a forma de
triglicerdeos) do corpo. Alm da reserva energtica, tem funo de modelar a superfcie,
forma coxins absorventes de choques, principalmente na planta dos ps e das mos,
contribui para o isolamento trmico e preencher os espaos. As clulas do tecido adiposo se
originam no embrio e no se dividem aps o nascimento, o crescimento do tecido se
deve ao acmulo de lipdios nestas clulas.
Tecido cartilaginoso uma forma especializada de tecido conjuntivo de
consistncia rgida. Desempenha a funo de suporte dos tecidos moles, revestimento de
superfcies celulares onde absorve choques, facilita o deslizamento e essencial para a
formao e crescimento dos ossos longos. O tecido cartilaginoso no possui vasos
sangneos, sendo nutrido pelos capilares do conjuntivo que o envolve (pericndrio).
desprovido tambm de vasos linfticos e de terminaes nervosas. Suas propriedades
dependem da estrutura da matriz intercelular, que constituda por fibras colgenas e
elsticas em associao com macromolculas de proteoglicanas (protenas +
glicosaminoglicanas). A firmeza da cartilagem se deve s ligaes entre fibras e as
proteoglicanas.
Este tecido formado de trs tipos de cartilagem, que so:
1) Cartilagem Hialina - o tipo mais freqente encontrado no corpo humano. Sua
matriz possui delicadas fibrilas constitudas principalmente por colgeno tipo II. Forma o
primeiro esqueleto do embrio, que posteriormente substitudo pelo esqueleto sseo.
Entre a parte afinada (difase) e a extremidade dilatada (epfise) do osso longo em
crescimento, observa-se o disco epifisrio, responsvel pelo crescimento do osso em
extenso, que constitudo de cartilagem hialina. encontrada tambm na parede das
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fossas nasais, traquia e brnquios, na extremidade ventral das costelas e recobrindo as
superfcies das articulaes.
Todas as peas de cartilagem hialina, exceto a cartilagem articular, so envolvidas
pelo pericndrio, que alm de ser fonte de novos condrcitos (denominao das clulas de
cartilagem) responsvel pela nutrio, oxigenao e pela eliminao dos refugos
metablicos de cartilagem, pois neles esto localizados os vasos sangneos e linfticos.
Devido, provavelmente, sua irrigao limitada, a cartilagem muito sujeita degenerao
e quando sofre leso regenera-se com dificuldades e, freqentemente, de modo incompleto,
salvo em crianas de
pouca idade.
2) Cartilagem Elstica - encontrada no sistema auditivo interno e externo, na
epiglote e na laringe. Basicamente, semelhante cartilagem hialina, porm inclui, alm
das fibrilas de colgeno, abundante rede de fibras elsticas finas. menos sujeitas a
degeneraes que a hialina.
3) Cartilagem Fibrosa - encontrada nos discos intervertebrais da coluna, nos
pontos em que alguns tendes e ligamentos se inserem nos ossos e na snfise pubiana.
uma cartilagem resistente as tenes e caracteriza-se pela presena de feixes de fibras de
colgeno tipo I.

Tecido sseo
um dos mais resistentes e rgidos do corpo humano. Constituinte principal do
esqueleto, serve de suporte para as partes moles e protege rgos vitais, como os contidos
na caixa craniana e torcica. Aloja e protege a medula ssea, formadora das clulas do
sangue, proporciona apoio aos msculos esquelticos, transformando suas contraes em
movimentos teis. Alm destas funes, os ossos funcionam como depsito de clcio,
fosfato e outros ons, armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada.
um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por trs tipos de clulas, que
so:
1 - Osteoblastos: Geralmente esto situadas na periferia do tecido sseo j formado.
Tem como funo secretar a parte orgnica da matriz (fibras e protenas).
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2 - Ostecitos: Situados em lacunas no interior da matriz ssea (material
intercelular calcificado). So osteoblastos modificados.
3 - Osteoclastos: So clulas de grande porte, moveis que participam da reabsoro
do tecido sseo, principalmente no caso de fraturas e remodelaes em virtude do
crescimento.
O tecido sseo revestido internamente e externamente por membranas de tecido
conjuntivo, denominadas respectivamente de endsteo e peristeo. Estas membranas
possuem clulas osteognicas (clulas que se diferenciam nos tipos especficos do tecido
sseo). O peristeo tem importante papel no crescimento em espessura dos ossos (formam
os osteoblastos) e na reparao das fraturas.
A parte inorgnica neste tecido corresponde a cerca de 50% do peso da matriz
ssea, dando a caracterstica mineralizada da matriz. Esta mineralizao ocorre em virtude
da deposio de ons, principalmente de fosfato e clcio. H tambm, em menores
quantidades, bicarbonatos, magnsio, potssio, sdio e citrato.
Macroscopicamente, os ossos so formados por duas partes: uma parte sem
cavidades visveis, denominado osso compacto, e outra parte com muitas cavidades
intercomunicantes denominado osso esponjoso. Histologicamente estas partes so iguais.
Geralmente, em ossos longos, as extremidades (epfises) so formadas por osso esponjoso e
a parte cilndrica (difise) quase que totalmente compacta. Em ossos curtos e em ossos
chatos esta distribuio varia. As cavidades do osso esponjoso e o canal medular da difise
dos ossos longos so ocupados pela medula ssea.
Histologicamente existem dois tipos de tecido sseo:
O primrio ou imaturo - que possui as mesmas clulas e as mesmos constituintes da
matriz que o secundrio porm as fibras colgenas se dispem irregularmente, sem
orientao definida e contm uma menor quantidade de minerais. Apresenta tambm maior
porcentagem de ostecitos. Este o primeiro tecido a ser formado, sendo gradativamente
substitudo pelo secundrio. No adulto muito pouco freqente, persistindo apenas
prximo a suturas dos ossos cranianos, nos alvolos dentrios e em alguns pontos de
insero de tendes.
O secundrio ou lamelar - apresentam as fibras colgenas organizadas em lamelas.
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O tecido sseo formado ou por um processo denominado de ossificao
intramembranosa ou pelo processo de ossificao endocondral. A ossificao
intramembranosa assim chamada por surgir a partir de membranas de natureza
conjuntiva. O processo ocorre pela diferenciao das clulas destas membranas em
osteoblastos, que iro secretar a parte orgnica da matriz, que posteriormente sofre
mineralizao. o processo formador dos ossos da cabea e dos maxilares. A palpao do
crnio dos recm nascidos revela reas moles (as fontanelas) onde as membranas
conjuntivas ainda no esto ossificadas. Contribui tambm para o crescimento dos ossos
curtos e para o crescimento em espessura dos ossos longos. A ossificao endocondral
ocorre na formao da maioria dos ossos, principalmente os longos. Tem incio sobre uma
pea de cartilagem hialina, de forma parecida do osso que se vai formar, porm de
tamanho menor. Este tipo de ossificao ocorre basicamente em duas etapas; primeiro a
cartilagem sofre modificaes, havendo reduo da matriz cartilaginosa e sua
mineralizao e a morte dos condrcitos; segundo as cavidades previamente ocupadas pelos
condrcitos so invadidas por capilares sangneos e clulas osteognicas vinda do
conjuntivo adjacente. Essas clulas diferenciam-se em osteoblastos, que depositaro matriz
ssea sobre os pontos de cartilagem calcificada. Desse modo, aparece o tecido sseo onde
antes havia tecido cartilaginoso sem que ocorra a transformao deste tecido naquele.
O crescimento dos ossos consiste na formao de tecido sseo novo e reabsoro
parcial do tecido j formado; deste modo o osso consegue manter sua forma enquanto
cresce.
Os ossos chatos (da caixa craniana) crescem por formao de tecido sseo pelo
peristeo situado entre as suturas e na face externa do osso, enquanto que na face interna
ocorre a reabsoro. Desta forma a caixa craniana responde ao crescimento do encfalo.
Nos ossos longos este processo um pouco mais complexo. As epfises aumentam
de tamanho por crescimento radial da cartilagem, acompanhado da ossificao
endocondral. Na difise, o cilindro cresce em comprimento principalmente pela atividade
osteognica dos discos epifisrios e, em espessura, pela adio de tecido sseo pelo
peristeo na superfcie externa, com reabsoro na superfcie interna. dessa maneira que
o canal medular aumenta seu dimetro.
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O disco epifisrio sofre o processo de ossificao aproximadamente aos 20 anos de
idade, quando determina a parada do crescimento longitudinal dos ossos.

Tecido Muscular
responsvel pelos movimentos corporais.
Suas clulas so alongadas caracterizadas pela presena de grande quantidade de
filamentos citoplasmticos responsveis pela contrao.
De acordo com suas caractersticas morfolgicas e funcionais, podem-se distinguir
nos mamferos trs tipos de tecido muscular.
1) Tecido muscular liso - formado por aglomerados de clulas fusiformes que no
possuem estrias trnsversais. O processo de contrao lento e no est sujeito ao controle
voluntrio.
2) Tecido estriado esqueltico - formado por feixes de clulas cilndricas muito
longas e multinucleadas, que apresentam estriaes transversais. Tm contrao rpida,
vigorosa e sujeitas ao controle voluntrio.
3) Tecido estriado cardaco - tambm apresenta estrias transversais, formado por
clulas alongadas e ramificadas, que se unem umas as outras por intermdio dos discos
intercalares. Apresentam contraes involuntrias.
Tecido Muscular Esqueltico
As clulas musculares so to diferenciadas e tm caractersticas to peculiares que
seus componentes recebem nomes especiais. Sarcolema = membrana plasmtica;
Sarcoplasma = citoplasma; Retculo sarcoplasmtico = retculo endoplasmtico; e
Sarcossomas = mitocndrias.
As variaes no dimetro das fibras musculares esquelticas dependem de vrios
fatores como o msculo considerado, a idade, o sexo, estado de nutrio e treinamento
fsico. O aumento da musculatura em funo de exerccio fsico no devido a
multiplicao das clulas (diviso mittica), que somente ocorre no tecido muscular liso.
Este aumento deve-se formao de novas miofibrilas e um aumento pronunciado no
dimetro das fibras musculares.
No msculo, as clulas musculares formam as fibras musculares que se agrupam
formando feixes musculares, estes por sua vez agrupam-se para formar o msculo. Todas
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estas estruturas so envolvidas por uma membrana externa de tecido conjuntivo. O epimsio
envolve o msculo, o perimsio envolve o feixe e o endomsio envolve a fibra muscular.
Este tecido mantm as fibras musculares unidas, permitindo que a fora de contrao
gerada por cada fibra individualmente atue sobre o msculo inteiro. Este papel do tecido
conjunt ivo tem grande significado funcional porque na maioria das vezes as fibras no se
estendem de uma extremidade do msculo at a outra. ainda por intermdio do tecido
conjuntivo que a fora de contrao do msculo se transmite a outras estruturas como
tendes, ligamentos e ossos.
O citoplasma da fibra muscular apresenta-se preenchido principalmente por fibrilas
paralelas, as miofibrilas. Estas so cilndricas e correm longitudinalmente clula,
preenchendo quase completamente o seu interior. Ao microscpio ptico aparecem
estriaes transversais, pela alternncia de faixas claras e escuras. A faixa escura
denominada de Banda A, enquanto que a faixa clara denominada Banda I. No centro de
cada banda I aparece uma linha transversal escura denominada Linha Z, enquanto que no
centro da Banda A, existe uma regio de colorao um pouco mais clara denominada
Banda H.
As miofibrilas do msculo estriado contm quatro protenas principais: miosina,
actina, tropomiosina e troponina. Os filamentos grossos so formados de miosina e se
encontram dispostos na Banda A. Os filamentos de actina so finos e esto associados com
a tropomiosina e a troponina. Esto dispostos na Banda I e entre os filamentos de miosina
nas extremidades da Banda A.
A actina apresenta-se na forma de filamentos em dupla hlice. A tropomiosina
uma molcula longa e fina, que se localiza ao longo do sulco existente entre dois filamentos
de actina. A troponina um complexo de trs subunidades; TnT, que se liga fortemente
tropomiosina; TnC, que tem grande afinidade pelos ons de clcio; e TnI, que cobre o stio
ativo da actina onde ocorre a interao entre a actina e a miosina. Cada molcula de
tropomiosina tem um local especfico onde se prende um complexo de troponina.
A miosina uma molcula grande, tem forma de basto. Numa de suas
extremidades, a miosina apresenta um salincia globular ou cabea, que possui locais
especficos para combinao com ATP. nesta parte da molcula que tem lugar todas as
reaes relacionadas com a quebra (hidrlise) do ATP. Nesta parte tambm se encontra o
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local de combinao com a actina. As molculas de miosina so dispostas de tal maneira
que suas partes em basto se sobrepem e as cabeas situam-se para fora. A parte central da
Banda A (BandaH) corresponde a regio de sobreposio da miosina constituda
exclusivamente da parte em basto das molculas.
O sarcmero em repouso consiste em filamentos de actina (associados a
tropomiosina e a troponina ) e de miosina que se sobrepem parcialmente. Durante o ciclo
de contrao, os dois tipos de filamentos conservam seus comprimentos originais.
Portanto, a contrao devido a um aumento na zona de sobreposio entre os
filamentos. A contrao se inicia na faixa A, onde os filamentos finos e grossos se
sobrepem. Durante o ciclo de contrao a actina e a miosina interagem da seguinte
maneira: durante o repouso, o ATP liga-se cabea da miosina. Para hidrolisar a molcula
de ATP e liberar energia, a miosina necessita da actina, que atua como cofator.
No msculo em repouso, a miosina no pode associar-se a actina, devido a
represso do local de ligao pelo complexo troponina-tropomiosina fixado sobre o
filamento de actina. Todavia, quando h disponibilidade de ons Ca
++
, estes combinam-se
com a unidade TnC da troponina. Isto muda a configurao espacial das trs subunidades
desta protena e expe os locais de ligao da actina com a miosina. Como resultado da
interao actina- miosina, o ATP convertido em ADP + energia. Este processo leva a um
aumento na curvatura da cabea e de parte do segmento em basto da miosina, virando para
trs esta regio e conseqentemente, como a actina est ligada a ele, ela tambm puxada
no sentido da Banda H. Com isso, aumenta a rea de sobreposio dos filamentos e
conseqentemente o msculo se contrai. medida que as cabeas de miosina movimentam
a actina, novos locais para a formao das pontes de actina- miosina aparecem. As pontes
antigas de actina- miosina s se desfazem depois que a miosina se une a nova molcula de
ATP; esta ao determina tambm a volta da cabea de miosina para a sua posio
primitiva, preparando-se para novo ciclo.
O Ca
++
fica disponvel no citoplasma da clula a partir de um estmulo, que provoca
a abertura dos canais de clcio e sua entrada pela membrana plasmtica e/ou REL.
Uma nica contrao muscular o resultado de milhares de ciclos de formao e
destruio de pontes de actina- miosina. A atividade contrtil, que leva a uma sobreposio
completa entre os filamentos finos e grossos, continua at que os ons Ca
++
sejam
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removidos e o complexo de troponina-tropomiosina cobra novamente o local de
combinao da miosina.
Tecido Muscular Cardaco
O msculo do corao constitudo por clulas alongadas, que tambm apresentam
estriaes transversais, mas podem ser facilmente distingidas das clulas musculares
esquelticas pelo fato de s possurem um ou dois ncleos centrais.
Essas fibras so revestidas por uma delicada bainha de tecido conjuntivo,
equivalente ao msculo esqueltico. Uma das caractersticas do msculo cardaco a
presena de linhas transversais denominadas de discos intercalares, e que tm a funo de
adeso. A estrutura e funo das protenas contrteis das clulas musculares cardacas so
semelhantes s descritas no esqueltico.
Logo abaixo da camada de tecido conjuntivo que reveste internamente o corao,
existe uma rede de clulas modificadas, que tm papel importante na gerao e conduo
do estmulo cardaco.
Tecido Muscular Liso
formado pela associao de clulas fusiformes longas que possuem um ncleo
nico e central. Estas clulas geralmente esto dispostas em camadas, sobretudo nas
paredes dos rgos ocos, como tubo digestivo, vasos sangneos, etc. Alm desta
disposio, ocorrem clulas musculares lisas no tecido conjuntivo que envolve certos
rgos, como a prstata e as vesculas seminais, e no tecido subcutneo do escroto e
mamilos.
As clulas musculares lisas so revestidas e mantidas juntas por uma rede muito
delicada de fibras reticulares. A atividade contrtil caracterstica do msculo liso est
relacionada com a estrutura e organizao de seus filamentos de actina e de miosina, que
no exibem a mesma organizao ordenada encontrada nas fibras estriadas. A clula
muscular lisa apresenta feixes de miofilamentos que se cruzam em todas as direes,
formando uma trama. Como acontece no msculo esqueltico, a contrao das clulas
musculares lisas se inicia pela entrada de clcio no citoplasma, porm este no se liga
troponina, liga-se a calmodulina. Esta protena tem alta afinidade por este on e quando
forma o complexo calmodulina-Ca ativa a mudana da conformao das cabeas de
miosina, resultando na contrao.
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Tecido Nervoso
O tecido nervoso acha-se distribudo pelo organismo, interligando-se e formando
uma rede de comunicaes, que constitui o sistema nervoso. Anatomicamente, este sistema
dividido em:
1) Sistema Nervoso Central (SNC) - formado pelo encfalo e medula espinhal;
2) Sistema Nervoso Perifrico (SNP) - formado pelos nervos e por pequenos
agregados de clulas nervosas denominadas gnglios nervosos. Os nervos so constitudos
principalmente por prolongamentos de neurnios (clulas nervosas) situados no SNC ou
nos gnglios nervosos.
O tecido nervoso apresenta dois componentes principais:
1) os neurnios, clulas geralmente com longos prolongamentos; e
2) vrios tipos de clulas da glia ou neuroglia, que sustentam os neurnios e
participam de outras funes importantes.
No SNC h uma segregao entre os corpos celulares dos neurnios e os seus
prolongamentos. Isto faz com que sejam conhecidas no encfalo e na medula espinhal duas
pores distintas, denominadas substncia branca e substncia cinzenta. A substncia
cinzenta assim chamada porque mostra essa colorao quando observada
macroscopicamente. A substncia branca no contm corpos celulares de neurnios, sendo
constituda por prolongamentos de neurnios e por clulas da glia. Seu nome origina-se da
presena de grande quantidade de um material esbranquiado denominada mielina, que
envolve certos prolongamentos dos neurnios (axnio).
Os neurnios reagem prontamente aos estmulos e modificao do potencial de
ao e o estmulo pode restringir-se ao local ou propagar-se ao restante da clula, atravs da
membrana. Esta propagao constitui o que se denomina impulso nervoso, cuja funo
transmitir informaes a outros neurnios, a msculos ou a glndulas.
Os neurnios atravs dos seus prolongamentos geralmente longos e numerosos,
formam circuitos. Da mesma maneira que os circuitos eletrnicos, circuitos neuronais.
As funes fundamentais do Sistema Nervoso so:
1) Detectar, transmitir, analisar e utilizar as informaes geradas pelos estmulos
sensoriais representados por calor, luz, energia mecnica e modificaes qumicas do
ambiente externo e interno;
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2) Organizar e coordenar, direta ou indiretamente o funcionamento de quase todas
as funes do organismo, entre as quais as funes motoras, viscerais, endcrinas e
psquicas. Assim, o Sistema Nervoso estabiliza as condies intrnsecas do organismo,
como presso sangnea, tenso de O
2
e CO
2
, teor de glicose, de hormnios e pH do
sangue; e participa dos padres de comportamento como os relacionados com a
alimentao, reproduo, defesa e interao com outros seres vivos.
As clulas nervosas ou neurnios so formadas por um corpo celular ou pericrdio,
que contm o ncleo, e do qual partem prolongamentos. Em geral, o volume total dos
prolongamentos de um neurnio maior do que o volume do corpo celular.
Os neurnios possuem morfologia complexa, porm quase todos apresentam trs
componentes:
Dendritos: prolongamentos numerosos, especializados na funo de receber os estmulos
do meio ambiente, de clulas epiteliais sensoriais ou de outros neurnios.
Corpo Celular ou Pericrdio: o centro da clula e capaz de receber estmulos.
Axnio: prolongamento nico, especializado na conduo de impulsos que transmitem
informaes do neurnio para outras clulas (nervosas, musculares, glandulares).
A maioria das clulas nervosas possuem muitos dendritos, que aumentam
consideravelmente a superfcie celular, tornando possvel receber e integrar impulsos
trazidos por numerosos terminais axnicos.
Em geral, os dendritos so curtos e se ramificam como galhos de uma rvore. Em
alguns casos tomam configuraes caractersticas, como nas clulas de Purkinje do
cerebelo, onde os dendritos formam um leque. Os dendritos apresentam pequenas projees
citoplasmticas, os espinhos, que geralmente correspondem a locais de contato sinptico.
Cada neurnio possui apenas um nico axnio, que um cilindro de comprimento de
dimetro variveis conforme o tipo de neurnio. Alguns axnios so curtos, mas na maioria
dos casos, o axnio mais longo do que os dendritos da mesma clula. Os axnios das
clulas motoras da medula espinhal que inervam os msculos do p, por exemplo, tm
cerca de 1 m de comprimento.
Nos neurnios cujos axnios so mineralizados, a parte do axnio entre o cone de
implantao e o incio da bainha de mielina determinada segmento inicial. Este segmento
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recebe muitos estmulos, tanto excitatrios como inibitrios, de cujo resultado pode
originar-se um potencial de ao cuja propagao o impulso nervoso.
A poro final do axnio, em geral, muito ramificada e recebe o nome de
telodendro.
A transmisso do impulso nervoso de um neurnio para outro depende de estruturas
altamente especializadas, as sinapses. Embora a maioria das sinapses se estabelea entre o
axnio e o dendrito (axodendrticas) ou entre o axnio e o corpo celular (axossomtica), h
tambm sinapses entre dendritos (dendrodentrticas) e entre axnios (axoaxnicas). H uma
tendncia de se considerar tambm como uma sinapse a terminao nervosa em clulas
efetoras, tais como clulas glandulares e musculares.
Nas sinapses, as membranas das duas clulas nervosas ficam separadas por um
espao de 20-30 nm, denominada fenda sinptica. Essas duas membranas esto firmemente
aderidas entre si, e em alguns casos verificou-se a existncia de filamentos formando pontes
entre as duas membranas.
Sob a designao geral de neuroglia ou glia, incluem-se vrios tipos celulares
presentes no sistema nervoso central ao lado dos neurnios.
Nos preparados corados pela HE as clulas da glia no se destacam bem, aparecendo
apenas os seus ncleos, espalhados entre os ncleos de dimenses maiores dos neurnios.
Calcula-se que haja no sistema nervoso central 10 clulas da glia para cada neurnio,
mas em virtude do menor tamanho das clulas da neuroglia, elas ocupam aproximadamente
a metade do volume do tecido. Distingue-se na neuroglia os seguintes tipos celulares:
astrcitos, oligodendrcitos, microglia e clulas ependimrias.
As clulas da naurologia no geram impulsos nervosos nem formam sinapses.
Todavia, participam do controle da composio qumica do meio onde esto localizados os
neurnios. As clulas gliais possuem na superfcie receptores para molculas
neurotransmissoras, e possuem certas protenas que existem tambm nos neurnios.
Ao contrrio dos neurnios, as clulas da neuroglia so capazes de multiplicao,
mesmo no adulto.
Os astrcitos so as maiores clulas da neurologia, tem muitos prolongamentos e
ncleos esfricos e centrais. Os oligodendrcitos so menores do que os astrcitos e
apresentam poucos prolongamentos. So encontrados tanto na substncia branca como na
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cinzenta, apresentando-se nesta ltima principalmente na proximidade dos corpos celulares
dos neurnios, constituindo clulas satlites, que formam uma verdadeira simbiose com
os neurnios.
O corpo das clulas da microglia alongado e pequeno, com ncleo denso e
tambm alongado. A forma do ncleo destas clulas facilita sua identificao nos
preparados pela HE, pois as outras clulas da neuroglia tem ncleo esfrico. As clulas da
microglia so pouco numerosas e apresentam prolongamentos curtos, cobertos por
salincias finas, o que lhes confere um aspecto espinhoso. A microglia encontrada tanto
na substncia branca como na cinzenta. Suas clulas so macrofgicas, pertencentes ao
sistema mononuclear fagocitrio. As clulas epidrmicas derivam do revestimento interno
do tubo neural embrionrio e se mantm em arranjo epitelial, enquanto as demais clulas
da originadas se diferenciam em neurnios e em clulas da neurologia. As fibras nervosas
so constitudas por um axnio e suas bainhas envoltrias. Grupos de fibras nervosas
formam os feixes ou tractos do SNC e os nervos do SNP. O conjunto destes concntricos
denominado bainha de mielina e as fibras so chamadas fibras nervosas mielnicas. A
conduo do impulso nervoso progressivamente mais rpida em axnio de maior
dimetro e com bainha de mielina mais espessa. No sistema nervoso perifrico as fibras
nervosas agrupam-se em feixes, dando origem aos nervos.













19

TCNICA BSICA DE HISTOLOGIA.

SACRIFICAR, DISSECAR, E SUBDIVIDIR.
O material para estudo histolgico, portanto o mais normal possvel, deve ser obtido
com cuidados que visam rapidez, objetividade, cuidados com o manuseio.
Rapidez Visa obter a pea desejada num tempo curto entre a coleta e a fixao. Tal
cuidado atenta para os fenmenos de morte tecidual e celular que tm incio imediatamente
aps a interrupo da corrente sangnea.
Objetividade Retirar primeiro as peas desejadas para que elas no sofram o
processo de morte tecidual. Os diferentes tecidos tem tempos diferenciados de sobrevida.
Genericamente o tecido nervoso tem o menor tempo, e o tecido epitelial o maior tempo de
sobrevida.
Cuidados com o manuseio Durante a dissecao, as peas devem ser coletadas por
seus elementos de fixao. Em caso de impossibilidade, o manuseio da pea deve ser
bastante cuidadoso.

OBTENO DAS PEAS.
Para obter as peas utiliza-se animais de pequeno porte como cobaias, ratos, coelhos,
ces e gatos, mediante bipsia ou necrpsia.
Bipsia Retira-se o fragmento do animal vivo mediante anestesia ou no, como no
caso de punes ou esfregaos.
Necrpsia Retirada do rgo com o animal j morto. O tempo decorrido entre a
morte, a retirada da pea, e a fixao deve ser o menor possvel.
OBS: A dimenso das peas um fator de grande importncia pois est relacionada
com o poder de penetrao do fixador, Uma pea de grande dimenso apresentar uma
fixao de seus componentes apenas na sua periferia e no no centro da mesma.
Recomenda-se que as peas sejam cortadas em fatias que no excedam a 3mm de
espessura. Esse fatiamento pode ser efetuado imediatamente aps a retirada, ou aps um
pequeno perodo de fixao.
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A congelao de amostras usada para diagnstico rpido: coloraes H.E., Sudam,
Azul de Toluidina. A citologia pode ser: ginecolgica, mama, tireide, prstata, fgado,
lquido amnitico, lquidos pleurais, lquidos abdominais, escarros.


FIXAO

A base para uma boa preparao histolgica a fixao completa e adequada do
tecido a estudar, para tanto devemos obedecer a alguns requisitos.
Intervalo mnimo entre coleta e a fixao
Volume do fixador dever ser no mnimo 10vezes maior que o volume da pea.
Evitar que pequenas peas ( principalmente as de punes por agulha) fiquem coladas
no recipiente.

Fixadores so substncias qumicas que mantm a integridade dos tecidos aps a
morte, sem qualquer alterao da estrutura celular por isso a sua funo .
-Inibir ou parar a autlise;
-Impedir a atividade e proliferao bacteriana;
-Coagular e tornar difusveis as substncias insolveis.
-Preservar e endurecer os tecidos a fim de que resistam as etapas seguintes da tcnica
histolgica;
- Para melhorar a diferenciao tica dos tecidos;
- Facilitar a subsequente colorao.
A fixao deve comear sempre que possvel na sala de cirurgia, ou na sala de
autpsia, ou onde quer que seja colhido o material, e obedece a marcha progressiva da
periferia para o centro, isto as regies superficiais so fixadas mais cedo do que as mais
profundas. O tempo de fixao vai depender do fixador que estiver sendo utilizado podendo
variar de 4 a 72 horas. Este material deve ser imediatamente mergulhado no liquido fixador
adequado . A escolha desse fixador de suma importncia pois dele vai depender os
estudos que se quer fazer como tambm das tcnicas a serem aplicadas. Os tecidos podem
ser de: Cirurgias, Bipsias, Necropsias, Camundongo, Coelho, Gato, Cachorro, Vaca,etc.

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A escolha do fixador se leva em conta:

- Velocidade de penetrao nos tecidos;
- Finalidade do exame a ser realizado;
- Vantagem econmica;
- Sem prejuzo a sade.
Devemos salientar tambm que na fixao alguns fatores interferem para uma maior
rapidez do nosso fixador.
Exemplo. Quando se deseja uma fixao rpida para casos de cortes imediatos de
congelao, emprega-se a formalina aquecida a 50 durante uma hora. Este mesmo fixador
a temperatura ambiente requer pelo menos 12 horas para exercer sua atividade.
A temperatura aumenta a velocidade de fixao, aumenta a penetrao do fixador
atravs do tecido, quanto mais elevada ela for, mais rpida ser a penetrao. Algumas
preparaes requerem no entanto, penetrao lenta para melhor preservao estrutural.
Nestes casos, recomenda-se o resfriamento entre 0 e 60.
Os fixadores mais utilizados em histologia so: formol 10% , formalina tamponada,
Bouin, Zenker, Alfac, Helly, Formol sublimado, Glutaraldedo, etc. Vantagens e
Desvantagens de Alguns Fixadores: os fixadores aditivados fixam em tempos reduzidos
que variam de 1 5 horas devido a mistura de agentes qumicos. O formol um fixador
lento, seu tempo de fixao varia de 1 a 24 horas, seu custo considerado baixo e muito
utilizado em patologia cir rgica. A ao dos fixadores ocorre da periferia para o centro ,
portanto no devemoscolocar muitos fragmentos no vidro, pois eles aderem-se uns aos
outros, dificultando a difuso do fixador.
De acordo com sua propriedade de agir sobre as protenas, os diferentes fixadores so
classificados em: Coagulantes ou Sem Coagulao (Precipitantes.)


Agente Fixador Poder de Penetrao

Com Coagulao: lcool Moderado
Cloreto de Mercrio Moderado
cido Pcrico Moderado

Sem Coagulao : Formol Moderado
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Tetrxido de smio Lento

cido Actico Rpido

importante observar o PH nos fixadores, pois estes podem ocasionar uma retrao
maior no tecido, como tambm alteraes na colorao.
O valor timo do PH nos fixadores de 6,8 a 7,0.
Freqentemente os fixadores so constitudos de um principal, associado
eventualmente a outros. Quase todos os bons fixadores so ,entretanto constitudos de duas
ou mais substncias fixadoras, corrigindo uma , os defeitos da outra.
No entanto , de modo geral , por melhor que seja o fixador sempre ocorre contrao e
diminuio de volume ( entre 20 a 40% ) dependendo do fixador empregado.



PRINCIPAIS FIXADORES

Acetona:
Usada para fixao citolgica, desidrata muito o tecido e o tempo normal de fixao
de 10 a 30 minutos.

cido Actico:
um dos mais usados, entretanto, sempre em combinao com outras substncias
fixadoras. O cido actico tem propriedade de corrigir a ao hidratante de outros
fixadores, evitando- se desse modo artefatos de fixao .
Ele no fixa a proteina citoplasmtica mas , coagula o ncleo da protena, tendo
pouco efeito fixador; no causa endurecimento, penetra bem e dstri o condrioma.
Geralmente empregado em solu aquosa de 0,3 a 5 %.
Tempo de fixao; curto, de 10 a 15 minutos.

cido Pcrico:
Este fixador empregado, associado ao formol ou ao cido actico. Tem ao
fixadora rpida, porm de pequena penetrao, possuindo leve descalsificante e provocando
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edema das fibras colgenas. Aps a fixao, os tecidos devem ser bem lavados em gua de
torneira antes da desidratao pelos lcoois , at que todo fixador seja removido.
Para o preparo da soluo aquosa saturada, a que se usa geralmente, coloca-se
de 1 a 1,5g em 100ml de gua destilada em temperatura ambiente, deixando- se durante 12
a 24 horas ou , se prepara a soluo alcolica com lcool a 80%.
Este fixador fixa as proteinas formando picratos de protena e a mesma
combinao observada com alguns carbodratos. Tem pequena penetrao e causa
endurecimento, mas no provoca retrao ou distoro do tecido.

lcool Etilico :
usado para a fixao de pequenos fragmentos de tecido, entretanto ,
atualmente est sendo pouco empregado devido a numerosas contra indicaes do seu uso.
A fixao rpida( 1 hora) desde que os fragmentos de tecidos tenham a
espessura ,mxima de fixao , pois, ocorrer contrao do tecido e seu endurecimento ser
muito intenso. O tecido depois de fixado , dever passar do lcool absoluto para 95% e
depois a 80%. As alteraes celulares observadas com a fixao pelo lcool so:
- Agregados de clulas tendem a se contrair, levando formao de grupos
celulares.
- O citoplasma se contrai fortemente.
- Os ncleos so distorcidos morfologicamente.
- O citoplasma se retrai e se acumula na membrana do lado oposto ao qual o
fixador penetrou na clula.



lcool Etilico Absoluto.
Ele no bom fixador , pois ao mesmo tempo que fixa desidrata o tecido
tornando o muito duro. Alm disso, tem capacidade de penetrao muito pequena, de
modo que os fragmentos do tecido a serem fixados devem ser pequenos. Em geral usa-se
lcool 95% durante 30minutos.


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PRINCIPAIS SOLUES FIXADORAS.

Formalina Comum:

Formalina 37-40%................100,0ml

Cloreto de Sdio.............. .... .9,0gr

gua Comum......................... 900,0ml

um fixador muito comum, no causando excessivo endurecimento
dos tecidos. No recomendado para uso de rotina, porm ideal para a preservao das
muco-substncias.
Formalina Neutra Tampo 10%

Formalina 37-40%...................................100,0ml

gua Destilada..........................................900,0ml

Fosfato de Sdio Monobsico.......................4,0gr

Fosfato de Sdio Dibsico (anidro) .............6,5gr

o fixador recomendado para o uso de rotina.


Formalina- Acetato de Sdio.

Formalina 37-40%.................................100,0ml

Acetato de Sdio.......................................20,0gr

gua Destilada.......................................900,0 ml



MATERIAL DURO

Para material mais duro se utiliza o formol Glicerinado, onde se obtm
uma boa fixao e uma melhora na hora do corte.
Frmula: Preparar um litro de formol a 10%.
Retirar desse 50ml e acrescentar 5ml de glicerina medicinal.
Ex. Muito bom para tero.
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Para uma Fixao mais Rpida: ( Alguns autores indicam )
No Formol a 10%, acrescentar 10% de cido actico glacial para acelerar
a nossa fixao. Fixao em mdia 6hs.


Bouin:( quente para acelerar a fixao)

Colocar o Bouin com a pea por 40minutos na estufa a 58C. Logo aps
fazer banhos de lcool 100 ( 5minutos); 3 banhos de xilol ( 10minutos ); 3 banhos de
parafina de ( 10 minutos cada). Montar o bloco.

Fixador para Mama.

lcool Absoluto.......................70ml

Formol 37-40%.........................20ml

cido Actico Glacial..............10ml

o mais usado na Patologia.


Carnnoy:

lcool Absoluto.........................60,0ml

Clorofrmio................................30,0ml

cido Actico Glacial................10,0ml

um dos fixadores mais rpidos e penetrantes. O tempo de fixao de
em mdia 3 horas, e usado geralmente para diagnsticos urgentes.
Tem sido muito empregado em citologia nos esfregaos hemorrgicos
para a retirada de sangue ,pois destri as hemceas. No necessrio lavagem em gua
aps a fixao.
Bouin

cido picrico soluo saturada......................375ml

Formalina 37-40%..........................................100ml
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cido Actico glacial........................................25ml

A fixao leva de 4 a 12 horas dependendo do tamanho da pea.
Importante depois da fixao lavar em gua corrente para eliminar o cido picrico residual,
pois este pode interferir na colorao subsequente . Excelente fixador para cromossomas
,rim e fgado.

FAA
lcool 70.......................................................... 85ml
Formalina 37-40 %.............................................10ml
cidoActico glacial...........................................5ml
Fixador muito usado na Botnica
Artefatos de fixao: quando usarmos cido actico, devemos observar este processo,
pois o tempo alm do estabelecido endurece os tecidos e prejudica os procedimentos
futuros. Os fixadores a base de cloreto de mercrio precipitam nos tecidos e s vezes torna-
se invivel para os procedimentos de imunohistoqumica. Em algumas situaes os
fixadores so especficos, por exemplo o Bouin utilizado para estudo do glicognio.

DESIDRATAO.

o processo de retirada de gua do interior da clula. A gua alm de prejudicial, no
se mistura parafina. Para se conseguir a infiltrao suficiente da parafina na incluso,
necessrio que o tecido esteja completamente desidratado.
O lcool etlico o agente mais usual empregado neste processo, sendo utilizado em
uma srie crescente (70%, 80%, 90% e 100%).
O volume de lcool dever ser de 10 a 20 vezes maior do volume da pea.








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DIAFANIZAO OU CLARIFICAO.

Consiste na infiltrao dos tecidos por um solvente da parafina, que seja ao mesmo
tempo desalcolizante. A parafina no se mistura com gua nem com lcool. Ambos devem
ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido.
O solvente mais usado o xilol, e destina-se completa retirada de gua, lcool e
tambm da gordura por ventura existente no material.
A denominao clarificao, refere-se ao processo de desalcoolizao e infiltrao do
solvente da parafina devida ao ndice de refrao dos lquidos empregados para este fim.
O tecido, ou melhor as peas assim tratadas tornam-se semi- translcidas, ou quase
transparentes.
Entre os reagentes mais usados na fase de diafanizao, podemos citar os seguintes:
XILOL
TOLUOL
CLOROFRMICO
LEO DE CEDRO
BENZOL OU BENZENO
TER DE PETROLEO
e outros.


IMPREGNAO
O processo de impregnao dos tecidos se faz por meio da parafina. A parafina um
dos vrios produtos da destilao (refinao) do petrleo, sendo uma mistura de carbonetos
saturados.
A finalidade da impregnao eliminar completamente o xilol contido no material e
a total penetrao da parafina nos vazios deixados pela gua e a gordura, antes existentes
no tecidos. Este processo serve tambm para preparar o material par cortes, removendo o
clarificante, endurecendo-o e dando- lhe a consistncia adequada para que possa ser cortado.
Tambm podemos citar como agentes de infiltrao ou impregnao a celoidina, a
goma arbica, parafina plstica, polietino glicol, parafina esterificada e carbovax..

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INCLUSO.
A parafina o meio de incluso mais usado. Este mtodo o de menor custo e o que
oferece algumas vantagens, entre outras, a possibilidade de conservar os blocos
indefinidamente. A incluso feita em caixas apropriadas, em uma temperatura de
60C.Unsando-se parafina em temperatura muito alta prejudica-se o material.
importante, transferir o material diretamente do ltimo banho de parafina para o
molde de incluso, o mais rpido possvel para evitar que se forme vcuo em volta do
material e que este venha se soltar durante o processo de corte.

MICROTOMIA.

Para se obter cortes de material includo em parafina ou por congelao necessrio
um instrumento especial :o micrtomo
Os micrtomos variam com os fabricantes e tem como fundamento duas peas
principais :o suporte ou mandril e a navalha.
Os micrtomos de acordo com a sua fabricao podem funcionar com a pea fixa e a
navalha mvel (micrtomo para celoidina) ou com a navalha fixa e a pea mvel
(micrtomo para parafina).
A microtomia imprescindvel porque h necessidade de transparncia do tecido. A
observao microscpica depende de um bom corte, ou seja bem distendido, sem ranhuras ,
dentes,e dobras. Os cortes so feitos em micrtomo rotativo com navalhas descartveis
perfil C com espessura de 4 a 6 micrometros.
Mas se sabe que nem sempre fcil tirar cortes perfeitos ,e o que mais surgem so
problemas e dificuldades para conseguirmos bons cortes. Sendo assim para cada problema
identificado vamos adotar um determinado procedimento que ir auxiliar na sua correo.
Os micrtomos devem passar por uma reviso anual, para ajustes de seus
componentes.

-Cortes comprimidos ou apinhados.
- Navalha sem fio ;use outra parte da navalha.
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- Ambiente demasiadamente quente ;resfria a navalha e o bloco.
- Parafina muito mole; use parafina de ponto de fuso mais alto.
- Material infiltrado com parafina mais dura e em blocado com parafina mais mole.
- Cortes alternadamente grossos e finos.
- O porta bloco ou a navalha esto soltos ;Fixe bem todos apertando os parafusos.
- ngulo da lmina incorreta; reajustar a inclinao da navalha.
- Bloco quente ; esfrie o bloco uniformimente.

- Fita com rachaduras ou falhas
- A lmina tm dentes ; use outra parte da navalha e ou uma nova.
- ngulo de corte incorreto; procure o ngulo certo.
- Partculas duras na parafina; reinfiltre o material com parafina filtrada.
- Resduos no bordo da navalha; limpe com o dedo ou com pano embebido em xilol.

- Cortes com dificuldade de ser distendido em banho maria
- Fazer o corte com 5 ou 6 micras e colocar primeiro para distender em gua com
temperatura ambiente, logo aps pesca-se e colocamos em banho maria. Distende bem e
no fica com arte fato.
- Temperatura muito alta do banho maria; observar sua regulagem.


- Cortes se desfazem e o material se separa da parafina
- Material insuficientemente desidratado e mal infiltrado; se for lcool no material
de difcil correo; se for xilol repetir a infiltrao com parafina.
- Material mantido com muito tempo na estufa e tratado com parafina muito quente .
- Material duro demais; amaci- lo em gua e incluir em outro tipo de meio.
- Material muito mole, esponjoso, mal desidratado e includo, correo quase
impossvel, inclua em outro meio ( ex: resina) .

- Cortes aderem a lmina
- Lmina suja; limpar com gase embebido em xilol.
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- Lmina sem fio.
-ngulo do corte muito grande; reajuste a inclinao da navalha.
- Passar na navalha silicone, inclusive no fio, depois secar bem com gase que a
navalha fica lustrosas corte no adere a navalha.

- Cortes aderem ao bloco
- Formao de carga eletrosttica devido ao ar muito seco; umedea o ar .
- Fio da navalha suja; limp- lo com xilol.
- ngulo de espao livre insuficiente; reajuste a inclinao da navalha.

- Lmina faz rudo ao subir e passar diante do bloco
- A parte basal da navalha no tem espao livre ao passar; reajuste o ngulo da
navalha pois est incorreto.
- Navalha de perfil muito fino contra um material muito duro; amolea o material
com gua e use uma navalha de perfil correto;
- Material demasiadamente duro; infiltre em outro material (ex. resina);
- Preservao e durabilidade da navalha;
- Adequar o emblocamento com o tamanho da pea, ou seja, quanto menor for o
bloco de parafina menor ser a superfcie da navalha utilizada, com isso diminumos a rea
de atrito da mesma com a parafina onde h maior perda de fio.

- Para amolecer material duro
- Quando o material no estiver emblocado
- Preparar formol glicerinado;
- Preparar um litro de formol 10%;
- Retirar 50ml deste formol e acrescentar 50,l de glicerina medicinal;
- Deixar por 12 horas e proceder o emblocamento normal.

- Quando o material j estiver emblocado
- Se tivermos um bloco no qual a pea ficou endurecida, desbastamos este e depois
mergulhamos o bloco em soluo de detergente neutro, ou seja, algumas gotas deste em
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uma gase umedecida. Deixe o bloco por aproximadamente 3 a 5 minutos e proceda
normalmente.
- Outro mtodo consiste em realizar o processo inverso, ou seja, desparafinar na
estufa e em seguida desparafinar em xilol. Reidratar e fixar em formol glicerinado (12
horas) e realizar o processo de emblocamento normal.

-Material sseo difcil de cortar
Uma maneira para melhorar os cortes de ossos que no ficaram bem descalcificados
a seguinte:
- Desbaste o bloco at o material ficar exposto;
- Mergulhe o bloco numa soluo de hidrxido de Amnio a 5% por 10 a 15 minutos,
e depois lave em gua corrente por 5 a 10 minutos.
- Enxugar e cortar.
Outro mtodo desbastar o bloco e cortar este numa soluo de 50% de gua e 50%
de glicerina medicinal. Deixar por 1 ou 2 horas. Esses dois mtodos podem ser empregados
para qualquer outro tipo de material mais duro, ou tambm quando o tecido est se
fragmentando. (ex. Fibromas uterinos).




COLORAO
Devemos ter sempre em considerao, que bons resultados de uma colorao devem-
se a vrios fatores, dentre eles temos que reconhecer a valia de um bom aliado, nosso eterno
companheiro O Corante. Mas alm disso devemos observar o seguinte.
O mecanismo das coloraes est relacionado a dois fatores igualmente importantes:
- Os corantes
- Elementos a corar.

Corantes: So substncias coradas, capazes de transmitir a sua cor a outros corpos,
empregados com o fim de tornar mais visveis e distintos uns dos outros elementos
32
integrantes da clula, ou tecido, para que os resultados possam ser comparados ou
estudados.
Corantes naturais: So corantes extrados de produtos animais ou vegetais. Ex.
Carmim, Hematoxilina, etc..

Corantes artificiais: So todos de natureza sinttica.

Para haver colorao necessrio que o material corante se fixe sobre o tecido, para
isso devemos ter por um lado um material bem processado e na espessura ideal, e por outro
o corante dever estar dissolvido nas propores indicadas e no solvente ideal. Os corantes
se classificam tambm em cidos e bsicos. Ao corantes bsicos (com elemento ativo
bsico) coram os elementos cidos do tecido, como o ncleo que denominamos basfilos.

Os corantes cidos atuam de maneira inversa, coram os elementos bsicos por meio
dos seus cidos, e esses elementos so denominados de acidfilos.
Exemplos de corantes bsicos: Verde de Metila, Violeta Cresil, Tionina, Azul de
Toluidina, Hematoxilina etc.

Exemplos de corantes cidos: Orange G, Eosina.

A colorao pode ser progressiva e ou regressiva, a primeira no necessita de
diferenciao e a Segunda necessita.
A colorao considerada o mtodo mais certo de probabilidade, para um bom
diagnstico, agora, se ela falha, so sempre responsabilizados do fracasso, os corantes ou
o mtodo utilizado. Mas s vezes , esse tipo de acusao torna-se severo demais, j que
outros problemas podem ser os causadores do fracasso.
O mtodo importante, o corante tambm, mas uma m fixao, parafina muito
quente, ou uma desidratao incompleta podem trazer como resultado uma colorao
deficiente.
No existe uma colorao completa e de uso rotineiro que satisfaa todas as
exigncias para um bom resultado. Muito pelo contrrio, as coloraes possuem algo em
33
particular que as diferenciam umas das outras. Algumas so vantajosas para certos
elementos e desvantajosas para outros. Num mesmo corte, tambm determinadas
coloraes exigem um fixador em particular para por em evidncia algumas estruturas. Por
isso, um estudo aprofundado na microtcnica requer diferentes coloraes e mtodos.
Como foi mencionado,anteriormente, no s o corante o responsvel por algum fracasso,
devemos observar e ter em conta o seguinte:

Origem do material: em tecidos muito compactos, possuidores de rico componente
epitelial, h tendncia de uma colorao mais rpida e mais provvel do que nos tecidos
pobres em clulas.

Espessura do corte: Nos cortes finos, logicamente, no haver uma sobrecolorao
como nos cortes grossos, mas tambm no existem tcnicas que exigem um corte grosso
para evidenciar elementos tissulares, por exemplo, reticulina e fibras elsticas. Para uma
boa tcnica nuclear, os cortes grossos no trariam benefcio algum.

Tempo de fixao e qualidade do fixador: De relevante importncia, a cada
colorao corresponde um fixador adequado, por isso a permanncia prolongada de
material num fixador oxidante retira parcialmente a apetencia tintorial a certos corantes.
Quando formos utilizar corantes anlicos, temos que observar que a preparao tenha sido
fixada por um fixador apropriado. Temos, por exemplo, se utilizarmos o lquido de
Fleming, que difcil corar com hematena, bons resultados com a safranina e hematoxilina
frrica. Tambm a permanncia exagerada no lcool diminui a colorabilidade do material.

Qualidade do corante: Sempre que comearmos uma nova colorao temos que
investigar a procedncia do corante, bem como a marca. Existem muitos produtos, dentre
os quais achamos os de boa e os de m qualidade. O grau de perfeita purificao de
relevante importncia nos bons resultados da tcnica. Um dos maiores problemas a m
qualidade dos corantes. Poucas marcas renem as perfeitas condies de purificao e
estudos demonstram que muitos corantes tinham misturas como sais ou dextrina.
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A forma ideal de melhorar a qualidade do corante diluir a quantidade a ser utilizada
com lcool absoluto, misturar bem, e deixar evaporar. Uma vez evaporado o lquido, o
material que ficou seco ser utilizado para a mistura definitiva.
Outra maneira de observar se o produto puro ou no obter o mximo de
informaes a seu respeito, como as citadas a seguir:

- Nome
- Composio qumica
- Massa molar
- Descrio (lquido ou p)
- Utilidades (Ex: histotecnologia, citologia, farmacologia)
- Certificado de pureza
- Verificar o aspecto e uniformidade e, principalmente, a umidade.

Qualidade da gua destilada:temos que levar em considerao que a gua a ser
utilizada no preparo das solues corantes ou para lavar lminas deve ser pura e bsica.
No deve ficar turva na presena de Nitrato de Prata nem vermelha com a fenolftalena.
Qumica da colorao: geralmente os tecidos se colorem no mnimo por dois tipos de
corantes em forma sequencial, primeiro o bsico e depois o cido. Os tecidos corados
bsicos s denominados basfilos e os com cido so os acidfilos.
A grande maioria dos basfilos unem-se s cores azul e prpura e os acidfilos s
rseas. Devido a isso, com uma colorao de hematoxilina e eosina teremos o primeiro
basfilo e o segundo acidfilo.
muito diversificada a quantidade de corantes que dispomos no mercado. Porm, so
poucos os utilizados de forma corriqueira, j que as propriedades corantes da maioria deles
so similares, salvo pequenas diferenas na cor.
Tendo como base a classificao dos corantes anlicos feita por EHRLICH, do ponto
de vista dos qumicos, teremos:
Acidocromos: tem como princpio corante cido, por exemplo Eritrosina, Vermelho
Congo, Light Green S.F., Fucsina, Fucsina cida.
35
Basocromos: so formados por uma base corante e um cido indiferente, por exemplo
Pardo de Bismark, Tionina, Azul de Toluidina.
Anfocromos ou Neutros: resultam da unio de uma base corante e um cido corante
A metacromasia deve-se ao fato de que certos elementos captam as molculas livres
da base corante, formadas por hidrlise nas solues aquosas.

Em rotina o mtodo utilizado do H.E (hematoxilina e eosina). Ele composto da
retirada de parafina da lmina, ou melhor, desparafinizao com posterior hidratao. Para
isso dever passar por uma srie de xilois, lcoois e gua destilada, que a bateria mais
usada, dando-se a seguir o corante nuclear. Este dever ser escolhido de acordo com as
necessidades; se progressivo basta lavar bem em gua, se regressivo diferencia se e lava-
se bem, esta lavagem ou viragem consiste em oxidar o corante na cor desejada. O corante
de contraste dever obeceder ao seu preparo.
Por exemplo, se for alcolico, passar em lcool antes de entrar no corante, aps este
estgio os cortes sofrero um processo de desidratao que o inverso da desparafinizao
sendo que ao chegar ao xilol sofrer o processo de montagem. Esta ser feita pela adio
de uma lamnula sobre o corte, tendo como intermedirio (lmina/Lamnula) uma
substncia no muito viscosa, portanto fluida que permitir o corte ser examinado com uma
transparncia total, sem desvio dos raios luminosos. Habitualmente usa-secom
intermedirio o blsamo do Canad, o Entellan, e as resinas sintticas, etc.

-Preparao dos Corantes

Hematoxilina de Harris.
- 1g ............de hematoxilina
- 10ml ........de lcool absoluto
- 20g ..........de almen de potssio
- 200ml ......de gua destilada
- 0,5 g ........de xido de mercrio amarelo.
Dissolver o almen na gua com o auxilio de calor , e a hematoxilina no lcool.
Juntar as duas solues no calor ( usa -se o erlenmeyer no fogo) e quando a soluo estiver
36
em ebulio adiciona-se xido de mercrio. Esfrie o recipiente com gua fria abundante.
Filtrar antes do uso e adicionar algumas gotas de cido actico glacial.

Eosina
Soluo Estoque.
- 10g ..........Eosina Y
-25ml ........gua Destilada
-475ml ......lcool Etilico
Eosina Soluo de Trabalho
-50ml .........Eosina soluo estoque
-150ml .......lcool 95%
-4ml ...........cido Actico Glacial
-200ml .......gua Destilada.
Se quando passou pela Hematoxilina e ficou muito corada a lmina usamos o lcool
cido para descorar um pouco. ( Colorao regressiva)

-lcool cido
-0,5ml ..........cido Clordrico concentrado
-99,5ml ........lcool 70%
Lavar rpidamente e observar no lcool cido e aps gua corrente.
Depois levar at a gua de Amnia.

-gua de Amnia.
-1ml .............Hidrxido de Amnio 28
-100ml ........gua Destilada
Logo aps lavar um pouco em gua corrente e seguir a colorao normal

Tricrmico de Goldner.
Goldner A
-0,2g Ponceu de Xilideno
-0,1g.............Fucsina cida
37
-0,1g.............Orange G
-300ml..........gua destilada Actica a 0,2%

Soluo de cido Fosfotnsgtico a 5 %

Goldner B
0,2mg...........Light- green SF , ou Verde Luz.
100ml...........gua destilada ctica a 0,2 %
Soluo gua Destilada Actica a 0,2 %
Usada para fazer rpidas lavadas entre os corantes Goldner A e B e o cido
Fosfotungstico.

COLORAES ESPECIAIS.
Picrosirus. ( Resina)
-100ml...................Sol. Saturada de c.Pcrico
-0,1g........................Srus Red F3Ba
-Corar por 45 min, em estufa a 60 na soluo Picrosirus.
-Lavar em gua destilada
-Hematoxilina por 2 minutos, secar e montar
-Resultados; Vermelho- Fibras colgenas:
Amarelo- Fibras elsticas, musculares,epitlio,hemceas

Tricrmicode Mallory ( Parafina)
Soluo A
Fucsina cida...............................0,5g
gua Destilada..............................100ml
Soluo B
Azul de Anilina solvel em gua..0,5g
Orange G........................................2g
cido Fosfotungstico......................1g
gua Destilada................................100ml
38
Tcnica.
Desparafinar ,hidratar,corar na Hematoxilina e lavar em gua corrente.
Corar na Sol. A por 5min.
Escorrer e passar diretamente para a Sol. B de 10 a 30 min.
Lavar em 3 banhos de lcool a 95%
Clarificar e montar.
Resultado; ncleo roxo, fibras colgenas em azul, citoplasma rseo e hemaceas em
amarelo.


Tricrmico de Gomori (Tecido Conjuntivo)
Fixador; Formalina Neutra Tamponada
Soluo Tricrmica.
Cromotropo 2R 0,6g
Verde Luz, SF 0,3g
c. Fosfotungstico 0,8g
gua Destilada 100ml

Soluo de gua Acetificada a 0,5%
cido Actico Glacial 0,5ml
gua Destilada 100ml
Desparafinar, e hidratar os cortes
Corar pela hematoxilina frrica de Weigert 10min.
Lavar em gua corrente
Soluo Tricrmica por 15 a 20min.
gua acetificada por 2min.
Lavar em gua Destilada
Desidratar em 2 lcoois 95% rpidamente
Clarificar, e montar.
Resultados;
Vermelho; fibras musculares; verde colgeno, azul a negro ncleos.
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OBS.:
Depois de pronta a lmina com a lamnula, se esta estiver com resduos de entel ou
blsamo passa-se um bom bril seco que esta fica em perfeitas condies.
gua sanitria: se ficar resduos de colorao na lmina aps colocarmos a lamnula,
colocamos em um rpido mergulho neste produto que retirar a colorao excedente.



DESCALCIFICAO


Para que se possa examinar o tecido sseo ou tecido com reas de descalcificao,
deve-se antes de processar, fixar, incluir, e cortar o material.
A descalcificao do tecido sseo baseia-se na propriedade dos minerais contidos nos
ossos tornarem-se solveis em cidos diludos. Qualquer cido capaz de fornecer sais de
clcio solveis em gua, poder ser utilizado no processo.
Os ossos ou outros materiais calcificados devem ser cortados em pequenos pedaos
(cerca de 4 mm) com serra adequada, antes da fixao, pois quanto menor o tamanho mais
rpido ser a descalcificao. S depois de completada a fixao que se coloca a
soluo descalcificadora,
Como agentes descalcificadores so empregados geralmente os cidos: ntrico,
frmico, tricloractico, clordrico, pcrico, sulfossalicclico, EDTA, etc. O cido ntrico
possui uma ao duas vezes mais rpida do que o cido frmico, mas este ltimo preserva
melhor o tecido para a colorao posterior. A Dulcia Tnica um agente descalcificador
muito usado na patologia, a qual encontrada no mercado como um lquido para
permanente de cabelo (da marca Loreal) que no laboratrio serve como agente
descalcificador de unha e ajuda no amolecimento de blocos duros.
O Bouin, EDTA e cido ntrico 1% so geralmente usados na descalcificao de
medula ssea. Quando usado o cido ntrico deixa-se o material neste por 12 horas, em
40
seguida neutraliza-se com sulfato de sdio 4% em 30 minutos, depois lava-se (rpido) e
coloca-se em lcool com glicerina por 1 hora o processo normal.
Durante o processo de descalcificao, vai-se formando o cido fosfrico. Este cido
tem um ph em torno de 6 a 7. Enquanto o clcio est sendo removido, o cido fosfrico
formado torna a soluo descalcificadora em uma soluo tampo. Com este ph ele faz com
que a soluo mantenha suas propriedades e no danifique as estruturas celulares do tecido
exposto ao processo.
To logo o clcio seja removido o ph se altera e por conseguinte comea a alterar as
propriedades corantes na soluo, os ncleos perdem 10% de suas propriedades corantes.
Chama-se a esta alterao de destruio da basofila nucler.
O importante, no processo de descalcificao fazer com que o gs carbnico que
tambm produzido, seja removido. Por isso a soluo deve ser agitada regularmente. A
agitao ou movimento do lquido, ou da pea, e tambm a descalcificao a vcuo so
extremamente teis para acelerar o processo de descalcificao. Porm muitos autores no
recomendam o uso do processo de vcuo.
O lquido descalcificador deve ser renovado freqentemente e a soluo
descalcificadora no deve ser saturada para que se obtenha a descalcificao no menor
espao de tempo possvel. O volume do descalcificador deve ser no mnimo 40 vezes maior
do que o volume da pea.
Segundo alguns autores no recomendvel aquecer a soluo descalcificadora. Caso se
aquea, no deve ultrapassar a 37 C. Quando se aquece a soluo no se acelera o processo
e sim acelera-se a formao de gs carbnico e as protenas presentes no tecido podem
sofrer deformao. Porm outros autores afirmam que se a descalcificao for feita na
estufa a 37 C, por 1 hora e logo aps forem feitas trocas peridicas de 2 em 2 horas e
emblocados no mximo em 24 horas, o processo descalcificador acelerado.
O cido usado, deve ser completamente removido do tecido depois de finda a
descalcificao, pela lavagem abundante e cuidadosa em gua corrente ou lcool, conforme
o descalcificador empregado. Esta lavagem deve ter no mnimo a durao de 4 horas
(quando se usa cido frmico com citrato de sdio) at 24 horas. No existe uma soluo
descalcificadora ideal, a nica diferena entre as vrias solues, que umas agem mais
rpido do que as outras. Tudo depende do tempo em que se retira o material dessa soluo.
41
Conforme alguns autores no recomendado lavar a pea que acabou de ser descalcificada,
j outros indicam que deve se colocar no sulfato de sdio.
Eventualmente uma rea de calcificao poder ser encontrada e, tecido includos no
momento do corte pelo micrtomo. Neste caso melhor mergulhar o bloco no
descalcificador por aproximadamente 1 hora, tempo suficiente para descalcificar o tecido
necessrio para o exame. Esta medida menos prejudicial ao tecido do que inverter o
processo. Mas vale salientar que o processo somente eficaz para a preservao do tecido
sseo.
No final, quando j se tem a lmina pronta, se for detectado um borro na basofilia, motivo
fixao, para que se recupere esta lmina (colorao), corta-se novamente e faz-se a fase
inicial at a gua destilada. Depois trata-se essa lmina com cido peridico a 0,5% por 20
minutos e segue-se normalmente a colorao.
Quando nota-se que a lmina ficou opaca bom utilizar soluo de iodo alcolico.
O tecido sseo um material comum no laboratrio; seu preparo exige muito cuidado. A
princpio, ele fixado e depois descalcificado: utiliza-se vrios descalcificadores como
cido tricloractico, cido ntrico e outros. Devemos tomar muito cuidado, o excesso de
descalcificao prolongada, destri a basofilia dos tecidos, consequentemente a colorao
ruime dificulta a interpretao do diagnstico. Quando isto ocorrer, devemos fazer um
tratamento com cido peridico a 0,5% por uma hora, depois corar pelo mtodo desejado.
Este mtodo melhora a colorao.
A descalcificao da medula ssea pode ser realizada com cido ntrico a 1% em overnight.
Este processo no prejudica as estruturas celulares. Aps a descalcificao da medula e de
outros tecidos sseos, devemos neutraliz- los utilizando carbonato de clcio a 4% por 15
minutos, depois lav- los bem por 30 minutos em gua corrente. A lavagem no deve ser em
excesso. A diafanizao dos ossos tambm deve ser menor que outros tecidos, a
permanncia por muito tempo no xilol provoca endurecimento excessivo.





42
DESCALCIFICAO DE OSSO

Procedimento:
-Deixar de molho na gua ou colocar o material que se queira estudar enterrado (por alguns
dias);
-Deixar descalcificar por 72 horas (dependendo de descalcificador);
-Lavar em gua corrente pelo menos 12 horas (facultativo);
-Colocar no fixador ( escolha) e dar continuidade no processo.

DESCALCIFICAO DE DENTE

Deixar no cido frmico 50% e citrato de sdio 20% por aproximadamente 90 dias.

DESCALCIFICADORES

-cido ntrico (HNO
3
):

Vrios autores enaltecem as propriedades do cido ntrico como descalcificador. Ele no
causa o entumecimento dos tecidos, e as melhores coloraes (mais ntidas) so obtidas em
cortes de materiais por ele descalcificados, provavelmente devido ao seu elevado potencial
de oxidao.
cido ntrico a 5:
*cido ntrico concentrado.................................................................5 ml
* gua destilada.................................................................................95ml
Colocar os fragmentos fixados no descalcificador, trocando a soluo diariamente. Aps a
descalcificao lavar em gua corrente por 30 minutos e em seguida neutralizar em soluo
de formalina 10% ( adicionada de carbonato de clcio ou magnsio em excesso) pelo
menos por 5 horas, lavando aps em gua corrente, durante noite. Evitar descalcificao
excessiva.
OBS: A 7,5% bom para descalcificar ossos do crnio, face e fmur.

43
-cido frmico (HCOOH):
empregado em soluo a 5% ou alcolica, ou em mistura com o formol a 10-20%. A
descalcificao obtida dentro de 3 a 5 dias. Costuma-se usar tambm com solues
tampes como o citrato de sdio d melhores coloraes que o mtodo de descalcificao
com o cido ctrico.
OBS: cido frmico a 20% bom para descalcificar dentes que esto no fixador h vrios
dias.

-cido frmico citrato de sdio:

Soluo A:
gua destilada.............................................250ml
Citrato de Sdio...............................................50g

Soluo B:
gua destilada..............................................125ml
cido frmico puro......................................125ml
No instante do uso juntar partes iguais da soluo A e B.
Este descalcificador preserva bem a morfologia de tecido embora seja muito lento,
recomendados para fragmentos de tamanho pequeno.

-cido clordrico (HCL):

um dos reativos mais usados para a descalcificao. Mesmo em solues muito diludas,
sua ao rpida mas tem o inconveniente de causar um entumecimento aprecivel dos
tecidos. Isto, pode ser resolvido adicionando a ele tampes, ou solues tampes, como por
ex.: sulfato de sdio a 5% ou 10%, ou ainda, us- lo diluindo em lcool combinado com
cido crmico.



44
-cido tricloractico (CCl
3
COOH):

geralmente usado na percentagem de 5% em mistura com o lquido fixador (formal 10%).
A lavagem subsequente deve ser feita em lcool.
cido tricloractico 5%:
* gua destilada.................................................................................95ml
* cido tricloractico...........................................................................5ml
OBS: O cido tricloractico a 10% em gua destilada um bom descalcificador para
medula ssea e ossos sem muita dureza (12h)..

-Bouin: Usado na descalcificao de ossos de crescimento primrio.
* cido pcrico soluo saturada (alcolica)...................................375ml
*formol 40%...................................................................................120ml
*cido glacial..................................................................................25ml.

Descalcificador usado no Dep. de Anatomia Patolgica do Hospital de Massachusetts e
no L.A.P. Unicamp:

EDTA, Tetrasdio...............................................................7g
Tartarato de Sdio e Potssio............................................80g
Tartarato de Sdio............................................................1,4g
cido Clordrico..........................................................1200ml
gua destilada..............................................................9000ml
A escolha das marcad das drogas deste descalcificador tem que ser criteriosa na
qualificao.
Todo tecido tem que estar fixado e recortado no tamanho correto, preferencialmente fixado
durante a noite.
Submeter o tecido ao descalcificador em no mximo 8 horas, sendo conforme tamanho e
concentrao de clcio no framento o tempo pode variar de 2,4,6,8 horas ou ainda ser
necessrio mais tempo, e neste caso nunca deixe o fragmento no descalcificador durante a
noite, repita a operao durante o dia.
45
Teste os fragmentos com um alfinete ou uma lmina de bisturi, se ao penetrar no tecido
ranger revelando textura vtrea continue o processo.
Concluindo o processo de descalcificao lave em gua corrente por uma hora, no deixe
lavando durante a noite, conserve em lcool 70%




INTRODUO A BIOLOGIA CELULAR

A biologia celular (antiga citologia) a parte da Biologia que estuda todas as
organelas celulares e seus componentes. Procura diferenciar as clulas tanto animais como
vegetais, observando tambm as grandes semelhanas.

Histrico

1590: Inveno dos microscpios pelos holandeses Francis e Zacarias Janssen, fabricantes
de culos. Seu microscpio aumentava a imagem de 10 a 30 vezes e foi usado pela primeira
vez para observar pulgas e insetos.

1665: Robert Hooke, em seu trabalho Micrografia, relatou pequenas cavidades(cells) em
cortes de cortia, de onde se originou o termo clula.

1674: Leeuwenhoek observou diversas estruturas unicelulares: espermatozides de peixes,
hemcias. Um dos maiores colecionadores de lentes da poca foi o primeiro a observar os
micrbios.

1831: Robert Bown pesquisando clulas de orqudeas descreveu o ncleo celular.

1838 - 1839: Schwann emitiram a Teoria Celular: Todos os seres vivos (animais e
vegetais) so formados por clulas.
46

Tamanho e forma das clulas

As dimenses das clulas variam de espcie, contudo a maioria tem tamanho
inferior ao do poder de resoluo do olho humano. Em geral, as clulas oscilam entre 0,1
mcron e 1 mm.
As clulas podem ser:
- Microscpicas: a absoluta maioria
- Macroscpicas: Alga Nitella, fibras de algodo, clulas de urtiga, fibras de linho. Os
exemplos so pouco numerosos. A forma muito variada.



Leis celulares

Lei da constncia do volume celular ou lei de Driesch:
O volume constante para todas as clulas de um mesmo tecido, em todos os indivduos
da mesma espcie e mesmo grau de desenvolvimento (ou seja, mesma idade).
De acordo com essa lei, o volume celular independe do tamanho do indivduo. De
fato, analisando-se clulas hepticas de um ano e de um gigante, pode-se verificar que ,
nos dois casos, o volume das clulas o mesmo. Isso significa que a diferena no tamanho
dos rgos deve-se ao nmero de clulas que, no gigante, muito maior. A lei de Driesch
no se aplica as chamadas clulas permanentes.

Classificao de Bizzozero

Conforme a sua durao no organismo, as clulas podem ser classificadas em:
Clulas lbeis: clulas dotadas de ciclo vital curto. Continuamente produzidas pelo
organismo, permitem o crescimento e a renovao constante dos tecidos onde ocorrem.
Exemplos: glbulos brancos (leuccitos), glbulos vermelhos (hemcias ou eritrcitos) e
clulas epiteliais (revestimento).
47
Clulas estveis: clulas dotadas de ciclo vital mdico ou longo, podendo durar
meses ou anos. Produzidas durante o perodo de crescimento do organismo essas clulas s
voltam a ser formadas em condies excepcionais, como na regenerao de tecidos (uma
fratura ssea, por exemplo). Dentre as clulas estveis, podemos citar: ostecitos (sseas
adultas), hepatcitos (clulas do fgado), clulas pancreticas, muscular lisa, etc.
Clulas permanentes: clulas de ciclo vital muito longo, coincidindo, geralmente,
com o tempo de vida do indivduo. So produzidas apenas durante o perodo embrionrio.
Na eventual morte dessas clulas, no h reposio, uma vez que o indivduo nasce com o
nmero completo e necessrio de suas clulas permanentes. Essas clulas simplesmente
aumentam de volume (exceo lei de Driesch), acompanhando o crescimento do
indivduo. Como permanentes, podemos citar as clulas nervosas (neurnios) e as clulas
musculares estriadas.

Observao de clulas

Os instrumentos que permitem uma visualizao da clula so ditos microscpicos.
- In vivo: Observao de clulas em seu estado natural.
- Supravital: observao da clula aps tratamento com substncias qumicas que no
decomponham as clulas, deixando-as vivas.
- Post-mortem: observao de clulas fixadas, isto , substncias que provocam a morte
da clula, sem perda de sua arquitetura normal.
Geralmente aps fixadas as clulas so coradas
- Corantes: Substncias portadoras de grupos qumicos coloridos, utilizados somente em
microscopia ptica, que identificam determinada estrutura celular.

Principais corantes

- DNA Feulgem
- Verde Janus Beta mitocndrias
- Hematoxilina centrolos, retculo endoplasmtico
- Sais de Ag+, Os, U complexo de Golgi
48
- Reativo de Schiff polissacardeos (tcnica de PAS)
- Sudam III gorduras

Vrus

No so clulas, mas dependem delas para sua multiplicao. So formados por
apenas um dos cidos nuclicos (DNA ou RNA). Quando fora de organismos possuem a
forma de cristais (matria bruta).

Clulas procariontes

No possuem envoltrio nuclear nem sistema de endomembranas.

Clulas Eucariontes

Possuem carioteca e sistema de endomembranas.

Bactrias

So unicelulares e hetertrofos. Alguns so importantes no ciclo do nitrognio e
outros so agentes patognicos.

Estruturas celulares:

Membrana Plasmtica - visvel somente ao microscpio eletrnico. Em cortes
extremamente finos, apresenta uma estrutura trplice, sendo constituda por duas faixas
densas, cada qual com aproximadamente 20 Angstrons de espessura, e uma faixa central
clara com 35 Angstrons de espessura. Elstica e lipoprotica, atua selecionando as
substncias que entram ou saem da clula (permeabilidade seletiva), de acordo com suas
necessidades. A membrana celular tambm reveste estruturas celulares: carioteca,
lisossomos, complexo de Golgi, cloroplasto, mitocndria, retculo endoplasmtico; que so
formadas por membranas idnticas membrana plasmtica.

Parede celular - Ocorre na clula vegetal e um reforo externo, formado
geralmente por celulose. Nos fungos a parede celular formada de quitina.



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Efeitos da osmose em clulas animais e vegetais

Glbulos vermelhos colocados em soluo de baixa concentrao (hipotnica)
ganham gua e acabam por romper a membrana plasmtica (hemlise). Se colocada em
soluo hipertnica, perde gua por osmose e murcha, ficando com a superfcie enrugada
ou crenada: o fenmeno chamado crenao.
As clulas vegetais, quando imersas em solues fortemente hipertnicas, perdem
tanta gua que a membrana plasmtica se afasta da parede celular, acompanhando a
reduo do volume interno. Esse fenmeno denominado plasmlise e as clulas nesse
estado so chamadas de plasmolisadas. Se for mergulhada a clula em meio hipotnico, ela
volta a absorver gua, recuperando assim, a turgescncia, fenmeno denominado
desplasmlise. A existncia da parede celular geralmente impede o rompimento da
membrana plasmtica da clula.

Hialoplasma ou citoplasma fundamental - um material viscoso, amorfo, no qual
esto mergulhados os orgnulos. Quimicamente, o hialoplasma constitudo por gua e
molculas de protena, formando um colide. Em observaes ao microscpio eletrnico, o
hialoplasma um meio heterogneo que apresenta filamentos, estruturas granulares e
microtbulos. Sendo um colide, a consistncia do hialoplasma pode variar, passando de
gel ou bastante denso a muito fluido ou sol.

Movimento Browniano
Micelas so as partculas coloidais em dimenses entre 0,1 e 0,001m de dimetro.
Devido a choques com molculas de gua e prpria repulso provocada por cargas
eltricas idnticas, adquirem movimento desordenado, dando estabilidade ao colide onde
esto contidas.

Ciclose
A ciclose um movimento do hialoplasma, de maneira a formar uma corrente que
carrega os diversos orgnulos e a distribuir substncias ao longo do citoplasma. Nesse
movimento, so arrastados os cloroplastos para um local de maior intensidade luminosa da
clula. A ciclose pode ser bem observada no endoplasma de muitas clulas vegetais.

Efeito Tyndall
Fazendo-se passar um feixe de luz atravs do hialoplasma, com a ajuda do
microscpio eletrnico, pode-se observar um desvio dos raios de luz (difrao), devido ao
batimento dos raios nas partculas de micelas que apresentam movimento desordenado.

Clios e Flagelos
So estruturas mveis encontradas tanto em unicelulares como em organismos mais
complexos. Os clios so geralmente curtos e numerosos; os flagelos, longos, existindo
apenas um ou poucos em cada clula. Essas formaes vibrteis tm um papel fundamental:
permitir a locomoo da clula ou do organismo no meio lquido. Em funo de sua origem
em centrolos, tais orgnulos apresentam, em certa extenso do seu eixo central, nove
conjuntos de trincas de microtbulos proticos. Mais adiante, ao longo de seu trajeto,
apresenta nove conjuntos de duplos microtbulos, como um par central.
50
Na base do clio ou flagelo, encontra-se a organela que lhes d origem, denominada corpo
basal ou cinetossomo (antigo centrolo).







Imunohistoqumica bsica
necessrio um conhecimento bsico de alguns princpios de imunologia (antgeno,
anticorpo) para compreenso mais adequada dos mtodos de imunoperoxidase.
Em resumo imunohistoqumica um conjunto de mtodos de deteco de antgenos
em cortes histolgicos altamente dependente do processo de fixao.
-Estudo poderoso para deteco de estruturas bioqumicas e sequncias ao nvel celular.
-Localizao de antgenos em clulas utilizando anticorpos especficos.
-O produto da reao visvel ao microscpio.

Rene as seguintes disciplinas:
Imunologia. Estuda o sistema imune, incluindo reao antgeno-anticorpo.
Histologia. Estuda clulas e tecidos.
Qumica. Estuda as reaes qumicas.

Importncia da imunohistoqumica:
Na patologia a imunohistoqumica assume papel de fundamental importncia.
As neoplasias so neoformaes teciduais (benignas ou malignas) que apesar de se
originarem em tecidos normais, muitas vezes perdem sua capacidade de difereno celular
(no caso das malgnas) tornando impossvel um diagnstico morfolgico (baseado nas
caractersticas de forma de leso).
Da a necessidade da imunohistoqumica para elucidar a origem tecidual e portanto
o diagnstico da leso.

Processo de colorao de tecido utilizando anticorpo.
Utiliza a reao antgeno-anticorpo para localizar um antgeno.
51

-Antgeno
uma substncia estranha no organismo que estimula a formao de um anticorpo
especfico e que reagir com este anicorpo especfico.
O termo antgeno se d a qualquer molcula que possa ser reconhecida pelos
elementos do sistema imune adaptativo, quer dizer, clulas T, clulas B ou ambas.
Os antgenos so capazes de reagir especificamente com os anticorpos induzidos,
possuem reas restritas em sua molcula que determinam a especificidade, denominadas
determinantes antignicos ou eptopos,
Isto quer dizer que em uma mesma molcula de antgeno podem existir vrios
determinantes antignicos e que, quando inoculada em um animal, provocar a produo de
vrios anticorpos com especificidade para cada um dos eptopos.
Para que uma molcula tenha a capacidade antignica esta deve cumprir alguns
requisitos:
Tamanho da molcula. Em geral, a molcula deve ser maior que 10 kD. Para que uma
molcula menor se torne antignica, deve ser inoculada com molculas adjuvantes ou
formar complexos com protena de seu hospedeiro.
Presena de grupos qumicos ativos. Mesmo tendo um peso molecular adequado
capacidade antignica das molculas, dependem da presena de determinados radicais
qumicos cidos ou bsicos e grupos aromticos como anis benznicos.
Estrutura conformacional do determinante antignico. Nos antgenos proticos to
importante o tipo de aminocido que formam a macromolcula como a sua disposio nela.
As cadeias de polipeptdeos lineares so menos antignicas que as cadeias ramificadas,
levando-se em conta o mesmo peso molecular.


-Aplicao do anticorpo no tecido.
-Sob condies ideais a reao antgeno-anticorpo acontece rapidamente.
-Se o antgeno esta comprometido o estado de equilbrio pode demorar para se estabelecer.
-O objetivo adquirir uma marcao forte sem colorao de fundo.

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Mtodos
Direto: Emprega um anticorpo primrio j marcado com uma enzima.
Indireto: J foi conduzido um anticorpo secundrio.
ABC: Sistema indireto onde aumenta o sinal da reao.
Strepto Avidina e Biotina marcados ( aplicao de anticorpo primrio e secundrio marcado
com biotina).
Polmero marcado

Mtodo Strepto Avidina Biotina (LSAB)
3 etapas (mtodos) :
Aplicao do anti primrio
Aplicao do anti secundrio marcado com biotina
Aplicao da Streptavidina marcada com uma molcula de enzima
A molcula de enzima pode ser peroxidase ou fosfatase alcalina.

Vantagens da Imuno
Morfologia preservada;
Identifica uma nica protena;
Auxilia no diagnstico;
Pode ser considerada como outra colorao especial no arsenal diagnstico.

Limitaes:
Especificaes do anticorpo
Geralmente no um mtodo quantitativo.
Mtodo complexo, caro, trabalhoso.
Imaginao do histotcnico o limite.

Histoqumica (utiliza corantes)
Identifica os componentes qumicos das clulas e dos tecidos;
Utiliza corantes, tinturas que reagiro com o tecido e o produto final visvel.
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Colorao por tingimento uma reao qumica entre cidos (eosina) e bsicos (azul de
toluidina)

Imunocitoqumica (protenas)
Torna visvel protenas de interesse em preparao de tecido ou clulas mantendo seu
contexto anatmico.
Uso de um anticorpo (protena) para detectar um antgeno (protena) determinada no tecido.
Deve ser estabelecido uma forma de ligao para formar um complexo estvel entre
a protena e o anticorpo.

Imunocitoqumica, o que necessrio:
Bom anticorpo
Antgeno Condies qumicas de fixao do tecido.
Preservar o antgeno na localizao original, impedir sua destruio e preservar o acesso ao
anticorpo.
Sistema de deteco do complexo antgeno-anticorpo.
Hibridizao In Situ.
Histoqumica

Permite a deteco de molculas de RNA ou DNA nas clulas de origem.
Ligao entre RNA/ DNA presente a uma sonda externa formando um hbrido.
Deve ser estabelecido uma ligao para formar um complexo estvel.

Vantagens:
-Quantitativo
-Mtodo mais avanado para entender biologia celular no contexto anatmico
-Pode detectar molculas de RNA para clula.

Limitaes:
-Mtodo caro, trabalhoso.
-Requer conhecimento de biologia.
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-Resumo do Impacto da fixao e processamento
-A forma do antgeno pode ser afetado pela fixao. Importante: tempo da fixao.

Fixao:
-Preservar a morfologia tal qual o estado natural
-Preservar antgenos e seus stios antignicos para o necessrio reconhecimento.
A fixao um dos aspectos mais crticos da colorao de imunohistoqumica,
portanto, as seguintes condies devem ser observadas:
As amostras do tecido no podem ficar completamente secas, e devem ser colocadas no
fixador o mais rpido possvel. Esfregaos celulares devem ser fixados o mais rapidamente
possvel a fim de garantir a preservao do antgeno.
Pequenos blocos de tecido, de no mximo 2 cm de comprimento por 4 mm de espessura
devem ser colocados em um mnimo de 200 mL de fixador. Pedaos maiores de tecido
impediro a penetrao completa do fixador, o que resultar em uma colorao
inespecfica.
Aps a fixao, as amostras de tecido devem ser rigorosamente lavadas para eliminar
excessos de fixador que possam causar artefatos de colorao.
O fixador mais prtico e provavelmente o melhor para diversas finalidades a formalina
tamponada a 10 %, devido a sua caracterstica de ligaes cruzadas.

Temperatura
-Alta: aumenta a velocidade de fixao e tambm de decomposio

-Processamento
Aps a fixao, as amostras de tecido devem ser desidratadas, limpas e inclusas de
acordo os procedimentos de rotina de processamento. Para se obter os melhores resultados
em imunohistoqumica, as amostras devem ser inclusas em parafina pura pois esta pode ser
completamente e facilmente removida do tecido no momento da colorao. O plstico
contido em alguns meios de incluso frequentemente de difcil remoo, e pode causar
colorao inespecfica alm da inibio da colorao especfica. Visto que muitos
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laboratrios utilizam rotineiramente meios de incluso que contm plstico, certas
precaues devem ser tomadas:
Se o meio de incluso for aquecido a temperatura acima de 62 C, os plsticos
comearo a formar polmeros. Estes dificilmente sero removidos do tecido, e tambm
podem causar danos navalha. Consequentemente, banhos de parafina devem ser mantidos
a uma temperatura mxima de 60 C para impedir a polimerizao.
Para auxiliar a remoo completa dos meios de incluso, as lminas devem ser
colocadas em uma estufa a 60 C durante 20 minutos antes da desparafinizao. Para
impedir a desnaturao do antgeno e danos a morfologia celular, a temperatura no deve
ultrapassar 60 C.

Fixao do tecido
Processamento e incluso
Corte e adeso do material.
Desparafinao
Recuperao antignica
Bloqueio de ligaes inespecficos.
Anticorpo primrio (puro ou marcado)

Anticorpos
uma protena srica que formada em resposta exposio de um antgeno e
reage especificamente com esse antgeno formando imunocomplexos quer no prprio
organismo ou em condies laboratoriais.
Anticorpos pertencem a um grupo de protenas conhecidas como imunoglobulinas
(Ig). esto divididas em cinco classes: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. Cada imunoglobulina
composta por duas cadeias pesadas idnticas (H) e duas cadeias leves (L) idnt icas (fig. 1).
As cadeias pesadas diferem em antigenicidade e propriedades estruturais determinando,
portanto, classe e subclasse das imunoglobulinas. As cadeias levesso do tipo Kappa ou
Lambda. A maioria dos anticorpos empregados em imunohistoqumica pertence a classe
IgG de imunoglobulina e apenas alguns so da classe IgM.
Os anticorpos so obtidos atravs da imunizao de animais com antgenos
especficos e podem ser classificados em poli e monoclonais.

Cada anticorpo possui sua prpria estrutura
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A imuno marca a protena e a hibridizao em sito marca somente o RNA e o DNA.
Usualmente produzidos na classe IgG.
Mais abundante
Resposta imune tardia
Istopos inclusos: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4.
CD15 exceo, pois produzido com classe IgM.

Imunoglobulina

Produzidos pelos linfcitos B em resposta a uma agresso.
IgG: a maior e mais longa resposta do organismo
A resposta encontrada no leite, na saliva, etc.
IgG expressa-se durante reaes antignicas.

Classes de Imunoglobulina

IgG: resposta imune secundrio
IgA : encontrada nos componentes de secreo do leite, saliva. Secreo respiratria e
intestinal

Anticorpos Policlonais. (de espcies diferentes de animais)

Antgeno sinttico ou natural infectado no coelho
Coelho produz anticorpos contra agente invasores

Linfcitos B so clulas que produzem os anticorpos IgG e IgM

Vantagens dos policlonais
Maior sensibilidade
Mais resistentes
Ttulos altos


Limitaes
Impuresas
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Variaes lote a lote
Reatividade de cruzado com outros
antgenos similares


Porque utilizamos os policlonais.
Alguns policlonais apresentam melhores coloraes.
Como exemplo o anticorpo HER2 C-ERB2 (policlonal) cora apenas a membrana
das clulas tumorais.
CB11 (monoclonal) cora membrana e citoplasma.

Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais so produzidos,IN VITRO, por clones de clulas
plasmticas importalizadas. Ao contrrio dos policlonais reagem apenas com uma molcula
(epitopo)presente no antgeno. podem ser produzidos em larga escala pois a clula
imortalizada normalmenteexpandida em meio de cultura.

Vantagens dos monoclonais:
Alta especificidades
Baixa reatividade cruzada.
No h variao lote a lote.
Fornecimento ilimitado.
Alta reprodutibilidade lote a lote.
Altamente homogneos

Limitaes
Coloraes menos intensas que com os policlonais
Alguns podem apresentar baixa afinidade por antgenos que sofreram fixao. ( s em
reatividade se for por congelao, se fixas ele no reconhece.).
Os eptopos alvos devem sobreviver aps a fixao do tecido. Em alguns casos o
antgeno pode ser identificado pelo uso de policlonais porm se o eptopo em questo no
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resistiu fixao o monoclonal no ir reagir. O mesmo vale para condies subtimas de
fixao.
O eptopo alvo deve ser nico para um determinado antgeno. Uma das maiores
vantagens do uso de anticorpos monoclonais, a especificidade, ser perdida caso o mesmo
eptopo esteja presente em diferentes antgenos. A reatividade cruzada de um anticorpo
policlonal pode ser absorvida e evitada mas o mesmo no possvel para o monoclonal.
Existem anticorpos para parafina e para congelao. CD 30 existe para os dois.
Pr tratamento e identificao de colorao de fundo. (Recuperao antignica)

Atualmente a panela a vapor e o banho-maria so os meios mais efetivos e seguros
para a realizao e recuperao antignica, uma vez que permite que o calor seja
uniformemente distribudo por todo o tecido.
H diferentes mtodos de recuperao antignica:
Digesto enzimtica.
Aps o corte hidratado, se utiliza a tripsina, proteinase K, etc.
Aquecimento por calor.
Microondas, panela a vapor, etc.

Digesto enzimtica.

Vantagens:
Rpida, pode ser utilizada em automao

Limitaes:
Alguns anticorpos no apresentam bons resultados.
Verifique o que diz a bula que acompanha o produto.

Microondas.:A vantagem que rpido.
Limitaes:
-Aquecimento no homognio.
-Buracos frios (no microondas h reas que no bate calor).
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-Morfologia pode ser afetada.

Panela a vapor
Vantagens:
Protocolos padronizados.
Processamento de muitas lminas simultaneamente.
Temperatura constante
Limitaes:
Dificuldade para calibrao.(H um desgaste no termostato e h certa dificuldade em
manter a temperatura exata pelo tempo indicado).

Banho Maria
Vantagens:
Temperatura constante.
Resultados reprodutveis.
Limitaes:
Muito tempo para atingir a temperatura
de equilbrio.


Colorao de fundo
O que verdadeiro e o que falso
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Imunoglobubinas Endgenas.
Pode ser reconhecida pela colorao inespefica de vasos e clulas plasmticas.
Desaparece quando o anticorpo secundrio
Recuperao antignica pode aumentar a colorao de fundo.

Coloraes tricromicas
pH (1,5 - 3,0) aumenta a afinidade dos corantes cidos pelo colgeno.
importante observar a gua destilada (melhor a gua deionizada).
Na colorao quando for fixado na formalena, chegando na gua destilada deixar 1 hora
no cido pcrico soluo saturado.
Todo o corante levado na estufa que se desprega no se usa mais.
Na hematoxilina (bsica) sempre deixar um tempo maior em relao aos corantes cidos.