SEPARATION DES ACIDES AMINES PAR ELECTROPHORESE SUR PAPIER
Dure : 3H
I. Objectifs : On se propose de sparer par lectrophorse les acides amins d'un mlange : Proline (pHi=6,30), Lysine (pHi =9,74) et Aspartate (pHi =2,98). Durant cette sance, nous mettrons donc en uvre une technique de sparation des constituants d'un mlange diffrente de la CCM (technique qui aura dj t aborde lors de l'tude des glucides), ce qui permettra de comparer les avantages et les inconvnients de ces 2 techniques ainsi que la notion du caractre amphotre des acides amins (qui sera vue dans la partie cours). Les objectifs annexes sont : o Utilisation de la verrerie de laboratoire. o Sensibilisation aux dangers dans le labo de Biochimie et la toxicit des ractifs.
II. Matriel et ractifs
Ractifs Prparation Rpartition Noter Tampon Tris- Barbital pH 6,3 Achet dj prt l'emploi Flacon de 1L/cuve d'lectrophorse Tp lectrophorse Ractif la ninhydrine Peut tre prpar la veille et conserver +4C en flacon brun. Ninhydrine1 g Ethanol196 mL Acide thanoque4 mL
Flacon de 100 mL/ cuve d'lectrophorse Ninhydrine Lysine 20 g/L + Proline 20 g/L + Ac. aspartique 20 g/L L'acide aspartique se dissout en gnral mal dans l'eau. Il est possible d'ajouter un peu d'HCl pour le dissoudre puis de ramener le pH 6,3
Flacon de 20 mL/classe Mlange d'acides amins
Matriel Quantit/lve Papier Wathman N3 ou 4 1 feuille/classe Papier filtre 1 feuille/lve Becher de 50 mL 1 Cuves lectrophorse + gnrateurs 1 cuve/3 lves Applicateur pour lectrophorse ou lame de verre pour microscope 1/classe Eprouvette de 100 mL 1/classe Bac plat de contenance 100 mL pour immerger les bandes de Wathman 2,5x16 cm 1/classe Pince 1 Gants 1 gant/lve Hotte 90C 1/classe
III. Technique/Manipulation/Mode opratoire
1. Prparation de la cuve d'lectrophorse Remplir chaque demi-cuve jusqu'au trait repre avec du tampon Tris-barbital pH 6,30. Couper une bande de papier Whatman de 2,5 cm X 16 cm ; tracer un trait vertical au crayon (trs lger) au niveau duquel sera fait le dpt. Immerger la bande dans le tampon pH 6,3 puis l'essorer entre 2 feuilles de papier-filtre. Tendre la bande sur le chevalet, comme sur le schma ci-dessous :
2. Dpt du mlange d'acides amines Dposer sur la bande le mlange l'aide d'une lame de microscope ou d'un applicateur.
3. Migration lectrophortique Brancher le gnrateur, et appliquer une tension continue de 150 V pendant 1h30. L'intensit doit se situer entre 12 et 21 mA. Aprs 1h30, couper le courant, dbrancher le gnrateur, retirer la bande et la scher l'air.
4. Coloration de la bande Sous la hotte, appliquer l'aide d'un pinceau la ninhvdrine sur la bande pose sur du papier-filtre en vitant tout contact avec les doigts l'aide d'une pince et port de GANTS obligatoire. Mettre l'tuve 90C en surveillant l'apparition de la coloration (2-3 min).
5. Compte-rendu Rsultats o Coller la bande d'lectrophorse colore, en y indiquant le sens des lectrodes par un (+) et un , leur nom, l'endroit du dpt et la coloration effectue. o Refaire un schma montrant la position des lectrodes ainsi que des 3 tches colores. Interprtation o Sachant qu'un acide amin a une charge quand le pH de la solution est > son pHi et qu'inversement, il a une charge (+) quand le pH de la solution est < son pHi, donner la position des 3 amins la justifiant. o Que remarque-t-on pour la proline ? Conclusion o A quoi sert cette technique ? Comparaison avec la chromatographie sur couche mince IV. Exploitation pdagogique Schma de la cuve d'lectrophorse o Position des 3 acides amins
On remarque que la proline n'a pas boug car son pHi =pH de la solution alors que la lysine a migr vers l'anode (pHi >pH de la solution) et que l'acide aspartique a migr vers la cathode (pHi <pH de la solution).
Couleur des acides amins Avec la ninhydrine, tous les acides amins sont colors en violet, sauf la proline (et l'hydroxyproline) qui sont colors en jaune.
Toxicit des ractifs o Dcrire la nature du danger rencontr : Ninhydrine (hydrate de trictohydrindne) : ractif cancrigne donc videmment manipuler avec prcautions et ne pas jeter l'vier !
Comparaison avec la CCM La CCM est une technique de sparation des molcules en fonction de leur affinit relative pour un support solide et un liquide (chromatographie de partage). Elle a un pouvoir rsolutif assez faible, surtout pour les grosses molcules. L'lectrophorse possde un pouvoir rsolutif beaucoup plus important mais ne marche que pour des molcules charges. La conclusion est donc qu'il n'existe pas une technique universelle de sparation des molcules mais qu'il faut adapter la technique en fonction du but recherch.
Remarque : ce TP peut tre ralis l'identique avec des bandes d'actates de cellulose, qui donnent un rsultat beaucoup plus joli ; elles sont videmment plus chres !