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Qumica Biolgica 2110-2104. Microbiologa y Tcnico de Laboratorio. Ao 2013



Trabajo Prctico N 2: Cuantificacin de carbohidratos totales de Pseudomonas
fluorescens C en diferentes condiciones nutricionales.

Objetivos:
- Familiarizarse con tcnicas de determinacin de glcidos.
- Comprender el uso de la espectrofotometra en tcnicas bioqumicas.
- Determinar el contenido de carbohidratos totales de P. fluorescens C por el mtodo de
antrona.

Introduccin:
Los glcidos estn ampliamente distribuidos en el mundo de los seres vivos y
desempean funciones estructurales y metablicas. Las bacterias poseen un gran
nmero de carbohidratos diferentes: azcares libres, derivados de azcares,
polisacridos simples (polmeros de azcares) y polisacridos complejos (polmeros de
azcares diferentes, aminoazcares, cidos urnicos, etc). Algunas macromolculas
contienen adems componentes no glucdicos (lipopolisacridos, peptidoglucanos,
cidos teicoicos, cidos nucleicos, glucoprotenas, etc).
Los mtodos colorimtricos son tiles para estimar la cantidad de azcares simples y
sus polmeros. Los ensayos ms convenientes para carbohidratos totales involucran
calentamiento de las muestras con H
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para hidrolizar los polisacridos y deshidratar
los monosacridos para obtener las formas furfural e hidroximetilfurfural de las
pentosas y hexosas respectivamente. Estas soluciones son luego tratadas con un reactivo
aromtico (antrona o fenol) para producir un compuesto coloreado que se puede medir
espectrofotomtricamente. Las pentosas, hexosas, heptosas y sus derivados, excepto
aminoazcares, reaccionan generando un producto coloreado, mientras que las triosas y
tetrosas no.
Los mtodos de antrona y fenol son los ms utilizados por su simplicidad,
rapidez y baja interferencia con otros componentes celulares, lo cual los convierte en los
mtodos de eleccin para la determinacin de un ndice confiable de carbohidratos
totales.
Dos desventajas notables de estos mtodos son:
1- Los azcares individuales no pueden ser identificados
2- Trabajar con soluciones concentradas de cidos o fenol es peligroso.

En el presente trabajo prctico se analizar si variaciones en las condiciones
nutricionales pueden afectar el contenido glucdico de un microorganismo. Para ello se
realizar una curva de calibrado del mtodo de antrona utilizando glucosa como
solucin patrn y se determinar el contenido de carbohidratos totales de Pseudomonas
fluorescens C crecida en diferentes medios de cultivo.

PRECAUCIONES PARA TRABAJAR CON EL REACTIVO DE ANTRONA:

Este reactivo est preparado con H
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y ste es un cido muy fuerte. Se debe evitar el
contacto con los ojos y la piel, y si hubiera exposicin a este cido, se debe lavar con
abundante cantidad de agua fra. La dilucin del cido con agua es muy exotrmica y la
solucin resultante se vuelve muy caliente incluso hasta quemar la piel o romper el
contenedor. Esto se previene realizando las soluciones en baos de agua-hielo. Nunca se
debe agregar agua al cido ya que puede producir salpicaduras, por eso NUNCA HAY
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QUE DARLE DE BEBER AL ACIDO!! sino que SIEMPRE se debe agregar el cido al
agua.

Materiales y mtodos:

A) Reactivos:
Soluciones estndares de glucosa: Se utilizarn soluciones madres de 20 g/ml, 40
g/ml, 60 g/ml y 80 g/ml con las cuales se realizar la curva de calibrado del mtodo.
Solucin de H
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: Preparar solucin madre al 75% v/v. TENER EN CUENTA
LAS PRECAUCIONES PARA MANIPULAR ESTE CIDO.
Reactivo de antrona: Preparar la solucin agregando 100 mg de antrona a 2,5 ml
de etanol absoluto y llevar a un volumen final de 50 ml con H
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al 75%. Agitar hasta
disolucin. La solucin debe ser preparada en el momento y conservar a 4 C a resguardo
de la luz en frasco color caramelo.

B) Tcnica:

Cada comisin tendr 5 ml de cultivo de P. fluorescens C crecida en un medio rico (por
ejemplo medio Luria-Bertani) y 5 ml de cultivo del microorganismo crecido en un
medio salino mnimo suplementado con colina como nica fuente de C y N. A partir de
los cuales se realizar la determinacin de carbohidratos totales.

1- Cosechar las clulas por centrifugacin a 5000 rpm durante 5 min y descartar el
sobrenadante obtenido.
2- Resuspender el precipitado en 5 ml de solucin fisiolgica (NaCl 0.9 %) para lavar
las clulas y eliminar restos del medio de cultivo que pueden interferir en la
determinacin. Centrifugar nuevamente a 5000 rpm durante 5 min y descartar el
sobrenadante.
3- Resuspender el precipitado en 5 ml de H
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O destilada. Esta muestra se utilizar para
la determinacin de carbohidratos.
4- Rotular 7 tubos de vidrio como: B, T20, T40, T60, T80, LB, MM
5- Colocar en cada tubo 1 ml de la solucin madre o muestra correspondiente y 1 ml
de H
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O en el tubo del blanco de reaccin.
6- Enfriar los tubos y el reactivo de antrona en hielo.
7- Agregar 5 ml del reactivo de antrona fro a cada tubo y mezclar durante 5 minutos
en fro.
8- Transferir los tubos a un bao de agua a 100 C e incubar EXACTAMENTE
durante 10 minutos.
9- Retirar los tubos y colocar nuevamente en hielo.
10- Medir la absorbancia de cada tubo a 625 nm.
11- Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrn en
funcin de la concentracin de los mismos.
12- Determinar la concentracin de carbohidratos totales en cada unas de las muestras
problema utilizando la curva elaborada anteriormente.






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Resultados:

D.O D.O Corregida
Blanco D.O -Blanco
T20
T40
T60
T80
LB
MM

Grafico























Observaciones sobre el prctico:






Conclusiones: