Universidad Católica de la Santísima

Concepción
Facultad de Medicina
Escuela de Medicina
Dpto. de Bioquímica

PRACTICO NO 1:
“MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS”
(Muestra Problema: MP1 x fd 10)

Integrantes : Valeria Astete

Alejandro Barra
Daniela Barrientos
Juan Pablo Betancur
Carrera : Medicina
Sección :I
Docentes a : Dr. Reginaldo del Pozo,
cargo Ph.D.
BQ Javier Grandón
BQ Mirna Muñoz, M.Sc.
QA Germán Rotter
Fecha del : 18 de Marzo de 2009
práctico
Fecha entrega : 01 de Abril de 2009
 Introducción
Los seres vivos disponemos de una gran cantidad de macromoléculas biológicas que
actúan de forma funcional y estructural en muchos de nuestros procesos bioquímicos. Las
proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes, es por esto que se vuelve
fundamental la determinación de los parámetros normales (ej. concentración) en los que la
funcionalidad de la proteína es óptima, este antecedente cobra un rol fundamental en la
aplicación clínica, tanto en el diagnostico como en el tratamiento de las enfermedades. Esto
impulsa al área científica a la determinación cuantitativa y cualitativa de las proteínas. Para
lograr este análisis se han desarrollado diversos métodos relacionados a las distintas
propiedades de estas macromoléculas.
En este informe se presentan los métodos espectrofotométricos, que se basan en la
propiedad de una gran variedad de biomoléculas de absorber luz a longitudes de onda
características, para la identificación de moléculas y la medición de su concentración en
una solución. La absorbancia leída por el fotodetector del espectrofotómetro corresponde a
la diferencia entre la luz que se hizo incidir en la muestra y la luz transmitida cuando
atraviesa el analito. Para que una muestra pueda absorber luz esta debe ser coloreada, por lo
tanto para medir la concentración de proteínas estas deben interactuar con algún reactivo
que otorgue esta característica, en esta actividad de laboratorio se utilizó el método de
Biuret para teñir muestras proteicas, donde este reactivo (CuSO4 1% en NaOH 14%)
reacciona con sustancias que contengan 2 o más grupos carbamilos (excepto la histidina),
generando un producto coloreado.
Este trabajo práctico que presentamos consistió en analizar primeramente una
solución madre de BSA 10 mg/ml, a distintas concentraciones (blanco de reactivo y
estándares) y tratarlas con el método de Biuret; para posteriormente realizar una curva de
calibración estándar con los datos arrojados por el espectrofotómetro y poder usarlos para
determinar la concentración de una muestra problema (MP1 X fd10).
A continuación se presentan cada uno de los pasos, métodos y cálculos que fueron
necesarios para obtener la concentración de proteínas de una muestra problema,
conocimiento importantísimo a la hora de entender su rol en los distintos procesos
bioquímicos de la vida.
Objetivos
 Familiarizarnos con el método de cuantificación de proteínas mediante técnicas
espectrofotométricas y el reactivo de Biuret, para luego utilizarlo con nuestra
muestra problema.
 Aprender a manejar las técnicas de laboratorio (por ejemplo, lograr un buen uso de
la micropipeta y del espectrofotómetro) para un posterior uso en el área de la
medicina.
 Determinar la concentración o presencia del analito a cuantificar, pero
anteriormente debemos saber cómo diluir un estándar y lograr la concentración
deseada.
 Cuantificar las proteínas en una muestra biológica.
  Utilizar datos obtenidos en el práctico para compararlos con los rangos normales de
cantidad de proteínas de una persona, y así verificar si su estado de salud está
normal o deficiente.
 Aplicar los conocimientos previos adquiridos tanto químicos como biológicos,
llevándolos al ámbito bioquímico y mejorando su aprendizaje.
Materiales y Métodos
Durante el trabajo práctico de métodos espectrofotométricos se utilizaron los siguientes
materiales:
- 3 Micropipetas: 5-50 µl
50-200 µl
100-1000 µl
- Puntas para micropipetas: Amarillas (5-50 µl)
Azules (50-200 y 100-1000 µl)
- Vaso precipitado de 50 ml
- 9 tubos Kahn
- Espectrofotómetro
- 9 cubetas para el espectrofotómetro
- Gradilla para tubos Kahn
- Gradilla para cubetas del espectrofotómetro
- Vórtex
- Reactivo de Biuret (solución de sulfato de cobre 1% en NaOH 14%)
- Solución estándar de BSA (Albúmina sérica de bovino) 10 mg/ml
- Muestra problema : MP1 x fd 10 (concentración desconocida)
- Reloj
- Agua destilada
Durante el práctico tuvimos que preparar 7 diluciones a partir de un estándar de BSA
10mg/ml, la cantidad de solución estándar para cada dilución fue calculada con V1 x C1 =
V2 x C2. En el caso de nuestra muestra problema (MP1 x fd 10), las soluciones fueron
preparadas con 0,5 ml de ella más la respectiva cantidad de reactivo de Biuret (2 ml). La
metodología a seguir fue la siguiente:

Volumen indicado
BSA 10mg/ml +
agua destilada

Extraer volumen + 2 ml Reactivo

indicado* de Biuret
0,
5
ml
BSA 10 mg/ml Agitar en el Vórtex **
 Incubar 15 minutos ***

Cada dilución es trasvasijada

a una cubeta del espectrofotómetro ****

*Debemos saber usar la micropipeta para no dejar burbujas en la solución.

**Al agitar en el vórtex se debe tomar el tubo desde arriba durante aproximadamente 10
segundos.
***Durante la incubación hay que tener cuidado que no caiga nada; además podemos tener
la noción si nuestras muestras están bien diluidas, ya que el color azul-violeta debe ser
creciente a medida que agregamos más solución estándar de BSA 10 mg/ml.
****Cuando ocupemos una cubeta nos debemos fijar si está muy rallada o sucia, si es así es
preferible no ocuparla. Al trasvasijar debemos tomar la cubeta desde arriba porque sino
nuestra huellas podrían aumentar la absorvancia de la muestra. La cubeta se llena
aproximadamente un ¾ de su capacidad.
*****Lo primero que se somete al espectrofotómetro (540 nm) es el blanco de reactivo,
debemos ajustarlo y llevar a cero su absorvancia. Debemos tener en cuenta que el haz de
luz pase por el lado de 1cm de la cubeta. Luego de calcular todas nuestras muestras se
recomienda someter nuevamente el blanco de reactivo al espectrofotómetro para verificar si
aún tiene absorvancia cero y que tan buena fue nuestra medición.

Resultados
Se necesita saber la composición proteica de las distintas disoluciones, por lo tanto, se
determinan los volúmenes de agua y albúmina de cada mezcla con los siguientes datos
conocidos:
• Concentración de la proteína albúmina, solución estándar 10 mg/ml
• Concentración de la nueva solución que se necesita obtener según la muestra
• Se utilizó la ecuación de dilución, igualdad consistente en:
Moles antes de la mezcla concentrados= Moles después de la mezcla diluidos
MOLES INICIALES = MOLES FINALES
C1 x V1 = C2 x V2
C1: concertación de la solución estándar de albúmina 10 mg/ml
V1: volumen necesario de la solución estándar
C2: concentración de la nueva solución que se necesita obtener
V2: volumen requerido de la solución a formar (0.5 ml = 500 µl)
• Estándar 0.5 mg/ml
C1 x V1 = C2 x V2
10 mg/ml x V1 = 0.5 mg/ml x 0.5ml
V1 = 0.025 ml / x 1000 = 25 µl

Luego para obtener el volumen de agua necesario para la dilución:

Volumen de H2O: 500 µl – 25 µl = 475 µl H2O
Este procedimiento se aplica para calcular los volúmenes necesarios de albúmina como de
agua para la preparación de todas las disoluciones utilizadas en el experimento.

Tabla de concentraciones, volúmenes y absorbancias obtenidas:

Para calcular la concentración de la muestra problema, utilizamos la ecuación de la recta,
y=0,0479x

y=absorvancia
x=concentración
b=coeficiente de posición, en nuestra ecuación éste es cero, por lo tanto no influye en los
cálculos

y= absorvancia; en nuestro caso ocuparemos el promedio de la absorvancia obtenidas por

nuestra muestra problema (MP1 x fd 10)
y= (0,099 + 0,100)/2 = 0.0995

Finalmente, para calcular la concentración, debemos reemplazar los datos en nuestra

ecuación:
0.0995 = 0.0479x
Despejamos x:
x= 0.0995 x= 2,0772 mg/ml
0.0479 = 0,20772 g/dl

Como nuestra muestra problema tiene un factor de dilución igual a 10, la concentración se
debe multiplicar por este factor, por lo tanto, la concentración de la muestra problema es:

[muestra problema] = 2,0772 g/dl

Por último, existe un método menos preciso para calcular la concentración de la muestra
problema; lo hacemos mediante la interpolación de los puntos con la recta, esta información
se adjunta en un gráfico hecho en papel milimetrado.
 Conclusión y discusión
La actividad práctica presentada en este informe tuvo como objetivo principal
establecer la concentración de una solución proteica de albúmina (BSA). En este caso se
determinó utilizando el reactivo de Biuret (sulfato de cobre 1% en NaOH 14%) que
reacciona con sustancias que contengan 2 grupos carbamilos (-CONH), como proteínas y
péptidos (a partir de tripéptidos) constituyendo complejos de coordinación coloreados
(violeta), cuya intensidad depende de la concentración de proteína utilizada que puede
detectarse mediante lectura de absorbancia en un espectrofotómetro. Por lo tanto, además
de medir la concentración proteica de una solución, también este método puede emplearse
para diferenciar proteínas de aminoácidos, exceptuando la histidina que por su estructura da
positiva a esta reacción.
Los métodos espectrofotométricos son bastante útiles y confiables, siempre y
cuando se tengan ciertas precauciones de uso. Se debe proceder con limpieza, orden y
concentración, como por ejemplo en la correcta manipulación de la micropipeta con sus dos
topes que pueden alterar la concentración de las disoluciones al prepararlas,
homogeneizarlas correctamente para obtener una lectura uniforme, utilizar cubetas que
estén dentro del rango de absorbancia permitido (+/- 0,010), calibración a 0 absorbancia del
instrumento, etc. Por lo tanto, este práctico nos introduce a la precisión y dedicación que se
debe tener al realizar este tipo de procedimientos, y la delicadeza que significa el trabajo
metódico cuando se trata de diagnosticar a un paciente donde está la vida de una persona de
por medio.
Con los resultados obtenidos tras la lectura de absorbancia de los estándares, se
construye una curva de calibración que se prepara con límites de linealidad determinados,
lo ideal es que todos los puntos estén contenidos dentro de la curva, siguiendo todos una
misma tendencia. Esta curva también nos sirva para interpolar y calcular la concentración
de la muestra problema. En nuestra caso, hubo algunos puntos que se escapaban en de la
línea de tendencia, sin embargo, existe el llamado Índice de Regresión Lineal, dato arrojado
por los cálculos efectuados en Excel, que indica el grado de exactitud de los resultados:
mientras este valor se acerque más a 1, la exactitud es mayor. En nuestro caso, el Índice de
Regresión Lineal fue 0.9992, de modo que, a pesar de que a simple vista en el gráfico no
todos los datos coinciden con la línea de tendencia, estos están bastantes cercanos a los
valores exactos.

Para conocer la concentración de la muestra problema, se llevaron a cabo tres métodos:

1. Por interpolación de la curva de calibración realizada en papel milimetrado: 21
mg/ml
2. Ecuación de la recta a partir de dos puntos contenidos en el gráfico del papel
milimetrado: 21,1 mg/ml
3. Ecuación de la recta derivada de gráfico obtenido a partir de Excel: 20.772 mg/ml
De los cuales el último arroja los valores más exactos debido a que el computador
considera decimales, no así los dos primeros métodos que son hechos por estimaciones, lo
que disminuye la exactitud de los cálculos. Sin embargo, la variación de los valores de
concentración de la muestra problema, son mínimos. El promedio de los tres es de 20,95
mg/ml = 2,095 g/dl.
 En el cuerpo humano, el contenido total de albúmina esta sobre los 300g, donde el
40% (es decir, 120g) está presente en el plasma, siendo la proteína más abundante de éste.
En condiciones normales, la concentración de albúmina va desde los 36 mg/ml a 52 mg/ml
(3,6 g/dl a 5,2 g/dl, aunque pueden variar ligeramente de un laboratorio a otro), y debe
mantenerse constante pues una de sus funciones es la mantención de la presión oncótica de
la sangre (de 20 mmHg) e impedir que el líquido de ésta se filtre hacia los tejidos. La
albúmina se sintetiza en el hígado, por lo tanto, la disminución de su concentración puede
deberse a fallas hepáticas, como también producto de una enfermedad renal donde la
albúmina puede escaparse por la orina. Su disminución también se explica por una
desnutrición o dieta baja en proteínas. Por el contrario, valores incrementados de albúmina
se observan por deshidratación aguda y shock.
Para medir la cantidad de albúmina en la sangre (específicamente en el suero), se
procede a tomar un examen de albúmina sérica. Si consideramos nuestra muestra problema
como un examen de laboratorio y lo comparamos con los niveles normales de
concentración estaríamos en presencia de un paciente con déficit de albúmina sérica a nivel
sanguíneo (20,772 mg/ml) presentando una condición patológica conocida como
hipoalbuminemia.

Bibliografía

• Nelson, D; Cox, M. Lehninger Principios de Bioquímica, Tercera Edición,

Ediciones Omega, 2000, Barcelona, España.

• Grandón. J, Muñoz. M, Del Pozo. R, Rotter. G, Guía de Trabajos Prácticos,

Carrera de Medicina 2009, Universidad Católica de la Santísima Concepción,
Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica.

• Del Pozo. R, Texto guía de Bioquímica Medicina, volumen I, Universidad

Católica de la Santísima Concepción, Facultad de Medicina, 2009.

• MedlinePlus. Albúmina en suero. Visitada el 5 de abril de 2008 de :

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003480.htm