MNP - MICROBIOLOGIA 22 Mayo 2014

Departamento De Patologa Clnica
Servi ci o de Mi crobi ol og a
Hosp. de Emergencias Jos Casimiro Ulloa
PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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Manual de Mi crobi ol og a
Versin 01

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HOSPITAL DE EMERGENCIAS JOS CASIMIRO ULLOA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGA CLNICA

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS EN MICROBIOLOGIA

Jefe del Departamento de Patologa Clnica
Dra. Violeta Dvila Ildefonso
Responsable del Servicio de Microbiologa
Dr. Csar Balczar Briceo.

LIMA PERU
2013

PRIMERA EDICION
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NDICE
Pgina

Generalidades 3
Registros 3
Obtencin de muestra 6
Condiciones generales para la obtencin de muestra 7
Criterios para el rechazo de muestras 9
Obtencin de muestras para Hemocultivo 9
Obtencin de muestras para Urocultivo 10
Obtencin de muestra de Heces 12
Obtencin de muestra de Secreciones 12
Examen parasitolgico de Heces 13
Reaccin inflamatoria en Heces 13
Raspado de piel y uas 15
Envo y transporte de muestras 16
Procesamiento de muestras 19
Medidas de Bioseguridad 21
Coloraciones 22
Coloracin Gram 23
Coloracin alcohol cido resistente Tincin de Ziehl Neelsen 26
Bioseguridad en baciloscopas 31
Aislamiento bacteriano 32
Cultivo bacteriano 33
Recuento de colonias 36
Identificacin bacteriana 37
Antibiograma 62
Antibiograma para Staphylococcus 66
Antibiograma para Streptococcus 67
Antibiograma para Enterococcus 69
Antibiograma para Pseudomonas 70
Antibiograma para Acinetobacter 71
Antibiograma para Enterobacteriaceae 72
Antibiograma para Haemophylus 74
Antibiograma para Vibrio cholerae 75
Estudio de resistencia bacteriana 76
Anexos: 98
Anexo 1: Formatos de Microbiologa, solicitudes y registros 99
Anexo 2: Preparacin de colorantes 101
Anexo 3: Descripcin y utilizacin de los medios de cultivo 103
Anexo 4: Sistemas de identificacin multipruebas 108
Anexo 5: Imgenes de Quistes y trofozoitos de parsitos intestinales 113
Anexo 6: Imgenes de huevos y larvas de parsitos intestinales 114
Anexo 7: Glosario 115
Bibliografa 117

PRIMERA EDICION
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GENERALIDADES

1.-OBJETIVO
Establecer los procedimientos tcnicos para realizar los diagnsticos microbiolgicos de
infecciones causados por microorganismos.

2.- AMBITO DE APLICACIN
Comprende:
Obtencin de muestras de los pacientes.
Envo de muestras al laboratorio.
Procedimientos tcnicos de laboratorio para el aislamiento e identificacin de las bacterias
involucradas en el proceso infecciones.
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
Procedimientos para la investigacin parasitolgica y reaccin inflamatoria.
Procedimiento para la investigacin de rotavirus
Control de calidad y registros necesarios para su control.

3.-RESPONSABILIDADES
3.1.-El Departamento de Patologa Clnica del HEJCU a travs de la seccin de Microbiologa es el
responsable de elaborar, revisar y actualizar el presente Manual, de acuerdo a los procedimientos
aprobados por el Hospital de Emergencias Jos Casimiro Ulloa.
3.2.-Los Directores del Hospital de Emergencias Jos Casimiro Ulloa, son responsables de autorizar,
proporcionar los recursos necesarios y designar al personal responsable para la aplicacin de las
disposiciones contenidas en el presente Manual.
3.3.-El personal del HEJCU, es responsable de planificar las acciones, organizar, controlar y
capacitar al personal para cumplir las disposiciones contenidas en el presente Manual.
3.4.-Los jefes o responsables de los laboratorios, deben asegurar el control interno de la calidad, la
idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones.
3.5.-El personal mdico, tcnico y operativo, es responsable de seguir las especificaciones
contenidas en el presente Manual y aplicar los procedimientos especficos indicados.

4.- ACTIVIDADES
El Servicio de Microbiologa realiza las siguientes actividades:
4.1 Heces: investigacin de parsitos intestinales, ectoparsitos, reaccin inflamatoria, Investigacin
de rotavirus por Inmunocromatografa.
4.2 Secreciones: exmenes directo y mediante coloracin Gram, Ziehl Neelsen,
4.3 Aislamiento, identificacin y estudio de antibiticos de las diferentes muestras enviadas al
servicio, tales como sangre, lquidos corporales y catter venoso central.
4.4 Investigacin de la resistencia antibitica de los diversos patgenos aislados.
4.5 Investigacin de sustancias antibacterianas en orina.
4.6 Control de calidad de los medios y discos de sensibilidad
4.7 Participacin en control de calidad externo por dos instituciones, el Instituto Nacional de salud y
el Programa Externo de Evaluacin de la Calidad (PEEC) de la Universidad Cayetano Heredia.

REGISTROS

La aplicacin de las disposiciones contenidas en el presente Manual exige la generacin, uso y
conservacin de registros para demostrar el cumplimiento de las especificaciones y requisitos que
aseguran la confiabilidad y garanta de los diagnsticos de las infecciones por microorganismos.

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El personal directivo del establecimiento de salud determina el perodo de conservacin de los
diferentes registros. Este perodo es definido por las disposiciones contenidas en la reglamentacin
aplicable al establecimiento de salud.

Los principales registros generados en la aplicacin del presente manual son los siguientes:

1.-Formulario de solicitud de examen.
2.-Rotulado de la muestra.
3.-Libro de registro de la muestra para exmenes varios en microbiologa.
4.-Libro de registro de los cultivos, incluye: identificacin bacteriana, recuento de colonias,
antibiograma, estudio de mecanismos de resistencia bacteriana, estudio de sustancias inhibidoras en
orina
5.-Registro de baciloscopas.
6.- Registros de los controles de calidad.
7.-Registros del control de operacin de los equipos.

Formulario de solicitud de examen
El formulario de solicitud de examen, debe ser llenado con letra y es firmado por la persona que
tom la muestra e incluye los siguientes datos:

a) Fecha de solicitud.
b) Nombre, edad y sexo del paciente.
c) Nmero de cama (cuarto o sala).
d) Tipo de muestra.
e) Examen solicitado.
f) Sospecha clnica.
g) Enfermedad de base.
h) Informacin sobre uso de antimicrobianos.
i) Hora de la obtencin de la muestra (*).
j) Mdico solicitante.
k) Responsable de la obtencin de la muestra.
l) Para infecciones del torrente sanguneo se registra la temperatura del paciente al
momento de la obtencin de muestra. En caso de muestra seriadas, indicar si es primera,
segunda o tercera muestra. (Ej. Hemocultivo, urocultivo y otros).

(*) Es un dato bastante importante en el control de la calidad y anlisis de la viabilidad de la muestra.

Rotulado de la muestra
El personal responsable de la obtencin de muestra se asegura de identificar las muestras con los
datos de los pacientes. Cada muestra se rotula con la siguiente informacin:

a).- Identificacin del paciente.
b).- Tipo de muestra.
c).- Fecha y hora.
d).- En infecciones del torrente sanguneo anotar el nmero de hemocultivo tomado.

Libro de registro de la muestra para exmenes varios microbiologa.
El personal responsable del rea se encargar del llenado correspondiente del Libro de registro de
muestras varias, para ello primero deber registrar la muestra antes de procesarla para evitar
confusiones o sub registro.

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Este libro comprende a:
Muestras de heces para estudio de rotavirus, parsitos, reaccin inflamatoria y thevenon.
Raspado de piel para investigacin de hongos o caros.
Test de Graham, para investigacin de oxiuros.
Registro de exmenes en fresco: para parsitos, hongos, etc.
Coloracin de Gram o azul de metileno para secreciones.
Coloracin Wright para investigacin de parsitos o herpes zoster.

En este libro no se registrar ningn cultivo.

Libro de registro de cultivos. (ver anexo 1C pgina 107)
El personal responsable del rea se encargar del llenado correspondiente del Libro de registro de
cultivos, para ello primero deber registrar la muestra antes de procesarla para evitar confusiones o
sub registro.
Este libro comprende:
Identificacin de muestra.
Cultivo bacteriano.
Recuento de colonias.
Aislamiento e identificacin bacteriana.
Estudio de antibiograma, es preferible anotar los halos de los discos en mm.
Estudio de mecanismos de resistencia antibitica.

Registro de baciloscopas.
El personal responsable del rea se encargar del llenado correspondiente del registro de muestras.
Este libro adems de los datos del paciente, se anotar todos los datos de las lecturas de baciloscopia
y el informe correspondiente. (El MINSA proporciona este registro). Adems se debe hacer el
reporte mensual a la Direccin de Salud (DISA Lima V)

Registros de los controles de calidad.
Actualmente los registros se estn realizando en hojas individuales, pero ya se ha implementado el
registro para ser foliado en un libro.
En este libro se est registrando:
Medio de cultivo, lote y fecha de vencimiento
Preparacin de medios: volumen preparado y fecha de la preparacin
Control de medios preparados: contaminacin de placas
Estudio de Timina y timidina en Agar Mueller Hinton.
Estudio de hemlisis en agar sangre.
Control de pH del Mueller Hinton.
Espesor del medio del Mueller Hinton.
Control de sangre de carnero.
Control de cepas ATCC.

Registros del control de operacin de los equipos.
Los registros de estn realizando en forma individual por equipo y comprende:
Control de temperatura
Control de mantenimiento.

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OBTENCION DE
MUESTRAS

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OBTENCION DE MUESTRAS

PROCEDIMIENTOS DE OBTENCION DE MUESTRAS

La efectividad de un laboratorio microbiolgico y el xito de los procedimientos dependen en gran
medida del modo de obtencin, transporte, rapidez y oportunidad con que las muestras llegan al
laboratorio. Estos procedimientos son prioritarios para que el laboratorio contribuya eficientemente
en el diagnstico, es por ello que todos los miembros del equipo de salud involucrados deben
entender la naturaleza crtica de mantener la calidad de la muestra durante todo el proceso.

CONDICIONES GENERALES PARA LA OBTENCION DE MUESTRA.

1. Antes de recoger la muestra, considerar el riesgo/beneficio de la recogida de la muestra para el
paciente.
2. El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de instruccin
sobre los procedimientos a realizar.
3. La muestra se debe recoger, siempre que sea posible, antes de iniciar cualquier terapia
antimicrobiana. Si el paciente ya hubiera recibido alguna dosis de antimicrobiano al momento de
obtener la muestra, el Laboratorio debe ser informado al respecto.
4. Elegir el lugar correcto, se debe obtener la muestra del sitio de infeccin identificado por medio
de una tcnica asptica que asegure la no contaminacin de la muestra con flora normal,
contaminacin ambiental, del personal y del propio enfermo. (ver tabla 1)
5. Obtener una suficiente cantidad de muestra para asegurar el aislamiento del germen relacionado
con el proceso infeccioso en estudio y evitar los resultados falsos negativos. Una muestra muy
pequea puede ser causa de resultado falso negativo.
6. El material destinado a cultivo no debe estar en contacto con sustancias desinfectantes o
anestsicas locales, siempre que sea posible, dada la accin antimicrobiana de stas.
7. La muestra debe transportarse en envases adecuados, una vez obtenidas se colocan en un
recipiente secundario apropiado para su transporte al laboratorio con cierre a prueba de fugas
para evitar cualquier derrame y por lo tanto los riesgos que de ellos derivan.
8. La muestra debe etiquetarse con el nombre del paciente, el servicio solicitante, el tipo de muestra
y la fecha de recogida. En determinados casos ser importante precisar la hora de recogida.
9. Se recomienda que cada muestra se introduzca en una bolsa de plstico que a su vez se
introducir en otra donde se incluya la hoja de solicitud. As se evita que los posibles derrames
de la muestra humedezcan la hoja de solicitud.
10. El envo al laboratorio de microbiologa debe ser lo ms pronto posible con objeto de asegurar la
supervivencia de microorganismos de difcil crecimiento y de evitar el sobre crecimiento de la
flora microbiana normal. Una demora puede ocasionar resultados falso positivos (ver tabla 2), ya
que un nmero de 10 colonias, puede llegar a ser ms de 100,000 colonias en 3 horas 20 minutos
y un recuento de 10,000 colonias, que es generalmente negativo en caso de orina, en 1 hora con
20 minutos, seran 160,000 colonias, lo cual es considerado positivo, errneamente. La muestra
de orina no debe permanecer ms de media hora a temperatura ambiente, en todo caso debe
conservarse a T de 2 a 8 C durante dos a 12 horas, o con un conservante como es el cido
brico combinado con el formiato de sodio en donde pueden permanecer las bacterias hasta 48
horas a T ambiente, sin riesgo de reproduccin o contaminacin (ver tabla N 3).

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Tabla 1.- Muestras clnicas recomendadas para el diagnstico microbiolgico de las infecciones ms comunes

Tomado de: Procedimientos en Microbiologa Clnica, Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, 2010

Tabla N 2.- Tasa de reproduccin bacteriana calculada* en muestra simple, segn el tiempo en que se demore en cultivar.

Elaborado por Dr. Balczar
*Calculo basado en un promedio de replicacin de 20 minutos, frecuente con estafilococo aureus y Escherichia coli.
Tipo de infeccin Muestra Comentarios
Abscesos: heptico, cerebral, cutneo, etc. Aspirados de abscesos
Hongos, anaerobios y germenes comunes
Artritis Lquido sinovial
Germenes comnes, BK, Neisseria .
Bacteriemia/sepsis Hemocultivo Dos a tres muestras
Cervicitis (cuello uterino) Exudado endocervical Neisseria Gonorrehae, chlamydia, HPV
Colecistitis Lquido biliar
Grmenes comunes
Conjuntivitis Exudado conjuntival/raspado
Germenes comnes.
Diarrea Heces/ Aspirado duodenal Salmonella, Shigella, Campylobacter, Vibrio.
Empiema y abscesos pulmonares Lquido pleural. Germenes comunes, anaerobios, hongos
Endocarditis Hemocultivo /Vlvula/Verrugas Dos a tres muestras
Faringoamigdalitis Exudado farngeo
Streptococcus viridans, beta hemolitico
Imptigo, foliculitis, erisipela, celulitis,
lceras, heridas y quemaduras
Preferiblemente aspirados tomados con
jeringa y biopsias de tejido.
Germenes comunes, no es recomendable
muestras tomadas con torundas
Infeccin urinaria Orina (miccin media o sonda) No vlida la orina de 24 horas
Infeccin urinaria Orina por puncin suprapbica Diagnstico de anaerobios o ITU en nios
Meningitis Liquido cefalorraqudeo
Neisseria meningitidis y germenes comunes
Nasofaringitis Nasofarngea Diagnstico tosferina/Infecc. Vricas
Neumona Aspirado transtraqueal, broncoaspirado Germenes comunes, hongos, Bk
Ndulos genitales Aspirado del ndulo
Invest. Hongos, cuerpos Donovan,
Osteomielitis Biopsia sea o exudado
Grmenes comnes, anaerobios
Otitis externa Exudado odo externo
Germenes comunes, hongos.
Otitis media Timpanocentesis
Germenes comunes, anaerobios, hongos
Peritonitis /abscesos viscerales Lquido peritoneal/aspirado Enterobacterias y anaerobios.
Rinitis Exudado nasal S. aureus, N. catharralis (bramanhela)
Sinusitis Aspirado sinusal No vlidos los exudados nasales
lceras genitales Raspado de la lcera
Haemophylus ducrey, treponema pallidum
Uretritis Exudado uretral
Neisseria Gonorrehae, chlamydia, HPV
Vulvovaginitis Exudado vaginal Deteccin de S. agalactiae, hongos.
Tiempo min N colonias N colonias N colonias N colonias N colonias N colonias N colonias
00:00:00 1 10 50 100 500 2000 10000
00:20:00 2 20 100 200 1000 4000 20000
00:40:00 4 40 200 400 2000 8000 40000
01:00:00 8 80 400 800 4000 16000 80000
01:20:00 16 160 800 1600 8000 32000 160000
01:40:00 32 320 1600 3200 16000 64000
02:00:00 64 640 3200 6400 32000 128000
02:20:00 128 1280 6400 12800 64000
02:40:00 256 2560 12800 25600 128000
03:00:00 512 5120 25600 51200
03:20:00 1024 10240 51200 102400
03:40:00 2048 20480 102400
04:00:00 4096 40960
04:20:00 8192 81920
04:40:00 16384 163840
05:00:00 32768
05:20:00 65536
05:40:00 131072

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CRITERIOS PARA RECHAZAR UNA MUESTRA

Debe controlarse cada hoja de pedido y etiqueta de la muestra para ver si se ha incluido toda la
informacin esencial.
Es necesario seguir estrictamente los procedimientos descritos, ya que la muestra obtenida puede
ser rechazada por el personal de laboratorio de acuerdo a los siguientes criterios:

a) No indicar tipo de muestra o procedencia.
b) No indicar tipo de examen en la orden.
c) Inadecuada temperatura del transporte.
d) Demora en el envo al laboratorio.
e) Medio de transporte inadecuado.
f) Muestra sin rotular o mal rotulada.
g) Muestra que tenga evidencias de haberse derramado.
h) Recipiente inadecuado (con rajaduras por ejemplo).
i) Muestra con contaminacin obvia.
j) Muestra seca en el hisopo.
k) Una sola muestra de hisopado con varias solicitudes para mltiples exmenes.
l) Volumen inadecuado.
m) Cualquier muestra recibida en formol
n) Esputos recogidos durante 24 horas.
o) No son aceptables para cultivo de anaerobios: el lavado gstrico, secrecin prosttica
tomada a travs de puncin transuretral, hisopado de ileostoma, colostoma o farngeo,
muestra de heces, con excepcin del aislamiento de clostridium: perfringens, septicum o
difficile. Tampoco se acepta muestras de piel o para control de ambientes.

En casos de muestras rechazadas el personal de laboratorio debe explicar al mdico solicitante las
razones y observaciones en la ficha de solicitud de diagnstico correspondiente. En el caso de
muestras que no puedan ser obtenidas nuevamente, la interpretacin de la coloracin Gram debe ser
revisada cuidadosamente.

Es importante el examen microscpico del material clnico, ya que permite conocer no slo la
calidad de la muestra, sino tambin la presencia de microorganismos, lo que proporciona suficiente
informacin para un diagnstico presuntivo inmediato.

Antes de rechazar una muestra debido a una informacin inapropiada o incompleta, debe
establecerse contacto con la persona responsable para efectuar las correcciones necesarias para as
poder completar la informacin y continuar con el procesamiento de la muestra.

OBTENCION DE MUESTRA DE SANGRE PARA HEMOCULTIVO

Condiciones especficas.
El momento ptimo de obtencin de la muestra para hemocultivo es justo antes del pico mas alto de
fiebre, sin embargo esta situacin ideal no es frecuente. Alternativamente las muestras pueden
obtenerse de acuerdo con el caso. Para ello se debe considerar lo siguiente:
BACTEREMIAS CONTINUAS: En cualquier momento, ej. Endocarditis.
BACTEREMIAS INTERMITENTES: Una hora antes del pico febril, ej. Brucelosis.
Es recomendable tomar mnimo dos muestras con un intervalo de 1 hora entre ellas.

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Obtencin de muestra de sangre:
El Procedimiento de Obtencin de Sangre se realiza mediante una jeringa de 10 o 20 ml y debe ser
realizado en forma asptica, con un mechero encendido al lado.
La proporcin entre el volumen de sangre obtenida y el volumen del caldo de cultivo debe estar en
una relacin de 1:5.
El volumen de sangre depender de la edad del paciente; por cada venopuncin se recomienda:
Adultos: 5 10 ml
Nios: 1 5 ml

Inoculacin de la muestra de sangre al medio de cultivo.
1.-Utilizar un medio bifsico o monofsico para este procedimiento. Desinfectar la tapa del frasco de
hemocultivo con alcohol de 70% o alcohol yodado.
2.-Inocular la muestra de sangre al frasco con medio de cultivo a travs de la tapa. Debe realizarse
inmediatamente de obtenida la muestra para evitar que se coagule.
3.-Mezclar el contenido del frasco inclinndolo suavemente dos o tres veces, para homogenizar la
muestra. En caso que se use el medio bifsico, baar la fase slida con la sangre.
4.-Descartar la aguja y la jeringa en un contenedor resistente a las punturas. No volver a introducir la
aguja en su funda.
5.- Etiquetar el frasco con el cdigo e iniciales del paciente, indicando el nmero de hemocultivo I, II
o III, es decir primera, segunda o tercera muestra as como la fecha, hora y temperatura.
6.-Transportar el hemocultivo inmediatamente al laboratorio de acuerdo a la norma

NOTA: Si por alguna razn se obtiene menor volumen de sangre que el deseado, no debe
descartarse, pero deber tomarse una nueva muestra.

Retiro de catter venoso central.
Antes se usaba la tcnica de Maki, pero esta tiene sus inconvenientes, ya que casi nunca se enva dos
centmetros de catter, la tcnica de rodamiento es imperfecta, ya que es difcil manipular el catter,
si se deja el catter en caldo por ms de 2 horas es probable que crezcan grmenes contaminantes y
por ltimo casi siempre se contamina con grmenes de la piel al momento del retiro del catter, tales
como Staphylococcus epidermidis o saprophyticus.
En lugar de la tcnica de Maki es recomendable cultivar dos muestras de sangre, una extrada a
travs del mismo catter antes de retirarlo y la otra toma de muestra se realiza del brazo contrario al
lugar de insercin de catter. Ambas muestras deben dar el mismo resultado, de lo contrario se
considera como contaminacin de una de las muestras.
OBTENCION DE MUESTRA DE ORINA PARA UROCULTIVO

Objetivo
Describir el procedimiento de obtencin de muestras de orina para cultivo, obtenida del chorro
medio o por aspiracin a travs de catter vesical permanente.

Campo de aplicacin
El presente procedimiento se aplica en la obtencin de muestras de orina de pacientes para el
diagnstico de infecciones del tracto urinario.

Condiciones Generales
La orina es un excelente medio de cultivo para la proliferacin bacteriana, por esta razn, la muestra
debe ser procesada dentro de las 2 horas despus de haber sido obtenida o debe refrigerarse a 4 C
(mximo 24 horas) hasta su procesamiento.

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Generalmente el desarrollo de dos o ms tipos de colonias (en pacientes sin sonda vesical) indica que
la muestra se ha contaminado por recoleccin incorrecta o demora en la siembra.

OBTENCION DE MUESTRA DE ORINA DEL CHORRO MEDIO

Obtencin de muestras de orina en pacientes mujeres hospitalizadas.

Materiales y equipos
a) Guantes de ltex estriles.
b) Cinco o ms piezas de gasa estril de tamao adecuado pudiendo ser 4 x 4
c) Jabn
d) Agua tibia estril.
e) Frasco estril de boca ancha para la muestra de orina.

Procedimiento
a) Mantener la privacidad de la paciente.
b) Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha de obtencin de la muestra, hora y el
procedimiento a utilizar para la obtencin de la muestra.
c) Lavarse las manos con jabn y abundante agua.
d) Preparar una pieza de gasa para la limpieza de los genitales externos humedecindola con agua y
una pequea cantidad de jabn. Preparar dos piezas ms de gasa para el enjuague con agua tibia.
e) Separar los labios mayores con dos dedos de una mano y limpiar el rea expuesta pasando la
gasa de adelante hacia atrs.
f) Descartar la gasa.
g) Con otra gasa humedecida enjuagar el rea de adelante hacia atrs. Repetir el procedimiento con
otra gasa.
h) Finalmente secar el rea de adelante hacia atrs con un trozo de gasa seca.
i) Mantener separados los labios mayores mientras la paciente empieza a orinar. Luego del chorro
inicial colocar el frasco estril para colectar el chorro medio.
j) Al terminar de orinar, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo.
k) Transportar el frasco con la muestra de orina inmediatamente al laboratorio.

Obtencin de muestra de orina en pacientes varones.

Materiales
a) Guantes de ltex.
b) Cinco o ms piezas de Gasa estril.
c) Jabn.
d) Agua tibia estril.
e) Frasco estril de boca ancha para la obtencin de la muestra.

Procedimiento
a) Mantener la privacidad de la paciente.
b) Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha de obtencin de la muestra, hora y el
c) Lavarse las manos con jabn y abundante agua.
d) Preparar una pieza de gasa con agua y una pequea cantidad de jabn. Preparar dos piezas ms
de gasa para el enjuague con agua tibia.
e) Realizar la higiene de los genitales. Retraer el prepucio antes de lavar el glande con la gasa
humedecida con jabn. Descartar la gasa.

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f) Enjuagar el glande, usando una gasa hmeda. Repetir el procedimiento con otra gasa.
g) Secar la zona, usando una o ms piezas de gasa seca.
h) Indicar al paciente que mantenga el prepucio retirado e inicie la miccin directamente en un
recipiente (orina para descartar).
i) Despus del chorro inicial colocar el frasco estril para colectar la muestra del chorro medio.
j) Obtenida la muestra inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo.
k) Transportar el frasco con la muestra de orina inmediatamente al laboratorio.

OBTENCION DE MUESTRA HECES

Materiales
a) Guantes de ltex.
b) Frasco estril.

Procedimiento
a) Recolectar la muestra en frasco estril con tapa hermtica, de boca ancha.
b) En caso de lactantes se puede realizar hisopado rectal o la tcnica de paal invertido. En la cual
mediante una paleta o un hisopo estril se toma la muestra. No se aceptan paales con heces en
el servicio.
c) Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha de obtencin de la muestra, hora y el
d) La muestra debe llevarse inmediatamente al laboratorio, para su procesamiento, Debido a que el
cultivo se realiza en forma inmediata, no requerimos de medio de transporte de Cary Blair.
e) Lavarse las manos con jabn y abundante agua.

Recomendaciones:
til para coprocultivos, estudio parsitos, reaccin inflamatoria y estudio de rotavirus.
Las muestras slidas slo se aceptan para investigacin de parsitos intestinales, pero no es
til para cultivo de heces, salvo que se trate de un trabajo de investigacin epidemiolgica.
No dejar las heces expuestas al aire. Tape el envase
No realizar el examen luego de estudios radiogrficos con bario
No realizar en perodo menstrual.
Se deben examinar lo ms rpido posible.
Cuando se reciben mltiples muestras al mismo tiempo, se deben procesar primero, las que
son lquidas, tengan sangre o moco, ya que pueden haber amebas y estas se destruyen rpido.

OBTENCION DE MUESTRAS DE SECRECIONES

La mayora de secreciones, como son Lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido sinovial,
lquido asctico, secrecin peritoneal, secrecin vaginal, secrecin de heridas operatorias, son
tomadas por el personal mdico, por lo que no incidiremos en ello

Las otras muestras como secrecin farngea, secrecin de odo, raspado de piel, son tomadas en el
mismo laboratorio. Para ello deber consultarse con el manual de toma de muestras del
Departamento de laboratorio.

EXAMEN PARASITOLGICO DE HECES

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OBJETIVO: Permitir la deteccin de parsitos como: Helmintos (gusanos), huevos o larvas y
protozoarios.

1.- PRINCIPIO: La confiabilidad de los resultados depende del cuidado al recolectar las heces
fecales.
Recoleccin de una cantidad suficiente. (2 a 3 gramos)
Un frasco o vaso descartable de plstico
Examen de las heces cuando an estn frescas.

Examen parasitolgico directo.

2.- MATERIALES:
Lmina Porta objetos para el microscopio.
Cubre objetos de 20 x 20 mm.
Aplicadores de madera.
Solucin salina fisiolgica (ClNa al 0.9%).
Solucin de lugol.
Libro de registro

3.-METODO:

a) Primero registre y anote el cdigo correspondiente del libro en la papeleta
b) Realizar dos preparaciones hmedas, en dos lminas porta objetos, previamente numeradas:
1.- Con una con gota de solucin salina fisiolgica (ClNa al 0.9%).
2.- Con una gota de lugol (solucin yodada).
c) Con un aplicador o mondadientes tome una pequea porcin de la muestra.
Si las heces estn bien formadas, tmese una porcin de la superficie y otra de la parte
central de la muestra.
Si contienen moco y sangre o son lquidas, tmese de la porcin del moco sanguinolento
o del lquido.
d) Mezcle la porcin tomada de la muestra primero con la solucin salina y luego con el lugol.
e) Coloque un cubre objeto sobre cada gota, la preparacin debe ser no muy densa.
f) Elimine el exceso de lquido con papel absorbente. Evite el derrame y la contaminacin.
g) Examine las preparaciones con el microscopio, utilice objetivos de 10x y 40x.

4.- INFORME.
a) Registre el resultado en el libro, considerando: color, consistencia y aspecto de la muestra,
as como la presencia o ausencia de parsitos en cruces. Reportar la presencia de leucocitos o
sangre, si los hay.
b) Registre el resultado en el sistema informtico e imprima.
c) El informe debe llevar la firma del tecnlogo y el visto bueno del mdico de servicio.

REACCION INFLAMATORIA EN HECES.

OBJETIVO: Detectar la presencia de leucocitos y la variacin porcentual de los mismos, en las
heces (polimorfo nucleares o mono nucleares).

1.- PRINCIPIO: La presencia de leucocitos y su frmula diferencial orientar al Clnico, a sospechar
si la causa del cuadro diarreico, es de tipo bacteriano o viral.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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14
La confiabilidad de los resultados depende del cuidado al recolectar la muestra fecal.
Recoleccin de una cantidad suficiente. (2 a 3 gramos)
Un frasco o vaso descartable de plstico.
Examen de las heces cuando an estn frescas (primera media hora).
2.- MATERIALES:
Porta objetos para el microscopio.
Azul de metileno al 1%
Aplicadores de madera.
Libro de registro

3.-METODO: Puede usarse cualquiera de estos tres mtodos:
a.- Preparacin hmeda:
- Con solucin salina: til para observar parsitos mviles, amebas (protozoarios) o
larvas. Tambin se puede usar para observar moco y leucocitos, y tiene el inconveniente
que si la muestra tiene ms de hora de recogida, a veces es difcil la observacin de
leucocitos, porque estos ya estn degenerados (autolisados).
- Con Azul de Metileno: til para la observacin de leucocitos, para ello se mezcla una
gota de solucin acuosa de azul de metileno al 1%, en un portaobjetos, se coloca una
lmina cubreobjetos y se espera de 1 a 3 minutos, para permitir que el colorante penetre
a los leucocitos viables y luego se observa al microscopio a 40x, los leucocitos tomaran
el color azul del colorante.
- Con Lugol: con este mtodo tambin se pueden ver los leucocitos y hemates, adems de
servir para ver quistes y huevos de parsitos. No es til para ver formas mviles.
- Con solucin de Turck y azul de metileno: Hasta ahora en las pruebas realizadas en este
laboratorio, ha dado mejores resultados para la investigacin de leucocitos y permite
diferenciar mejor los leucocitos polimorfonucleares, del Blastocystis hominis, con el los
culaes se pueden llegar a confundir con las preparaciones anteriores (aunque por
experiencia podemos decir que los trofozoitos de Blastocystis hominis generalmente
estn separados y a veces en pares (conjugacin sexual), en cambio los leucocitos se
encuentran casi siempre aglutinados. Para este mtodo usamos 5 ml de solucin de
Turck (la que se usa para el recuento de leucocitos) y le agregamos 3 a 5 gotas de azul de
metileno al 0.5%. Cogemos una gota y la mezclamos con la muestra de heces (moco
generalmente), en un portaobjetos y la cubrimos con una laminilla. La preparacin cida
del Turck, produce un aclaramiento de las heces, lo cual permite visualizar mejor las
estructuras, tanto de leucocitos, como del Blastocystis. (Mtodo del Dr. Balczar).
b.- Preparacin de frotis: En una lmina porta objetos realizar un extendido de la muestra, dejar
secar a temperatura ambiente, luego flamear en el mechero y llevar a colorear, con Wright o
azul de metileno, esto le permite observar la cantidad y el porcentaje diferencial de
leucocitos en las heces, tambin permite identificar a los trofozoitos de amebas. Es til
adems para diagnosticar algunas diarreas con componente alrgico.

4.- INFORME.
Se registra el resultado en el libro y en el sistema informtico; considerando: color, consistencia,
aspecto y la presencia de moco y/o sangre, en la muestra a examinar.

Resultado:
Negativo: si no se observa leucocitos de ningn tipo.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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15
Positivo: si se observa la presencia de leucocitos. Debe especificarse el porcentaje o el
predominio celular: Polimorfonucleares, eosinfilos, linfocitos o monocitos.
Tambin se informa el resultado de la sangre oculta (Thevenon), as como la presencia o no de
sustancias reductoras.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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RASPADO DE PIEL O UAS

PREPARACION HUMEDA CON NaOH al 10% o KOH al 10%

OBJETIVO: Permitir la deteccin de estructuras micticas en raspado de piel, pelo, uas o
secreciones y la deteccin de caros en raspado de piel.

1.- PRINCIPIO: Las sustancias lcalis como los hidrxidos, permiten separar a las clulas epiteliales
de las piel o del pelo (disolviendo las uniones entre ellas) o facilitar la licuacin del moco (en caso de
las secreciones), permitiendo hacer visibles las estructuras micticas que se hallan en las muestras a
investigar.

2.- MATERIALES:
Porta objetos para el microscopio.
NaOH al 10% o KOH al 10%.
Lanceta para el raspado o asa de platino para las secreciones.
Libro de registro

3.-METODO: Hay dos mtodos, pudiendo usarse el que mejor se adapte el laboratorio.

1.- Indirecto: Se realiza el raspado de escamas de piel o cuero cabelludo, usando un bistur o una
lanceta y se colocan sobre una placa Petri o una lnula de reloj. Posteriormente se colocan las
escamas sobre una lmina portaobjetos conteniendo 1 gota o 50 l de NaOH o KOH al 10%, se
cubre con una laminilla cubreobjetos y se coloca en cmara hmeda, que consiste en una placa Petri
con soportes para colocar la lmina, se coloca unos 5 ml de agua corriente y se tapa con la contratapa
del Petri, dejndose incubar entre 15 a 30 minutos, para facilitar la separacin de las clulas
epiteliales. Luego se observa al microscopio a 40 x

2.- Directo (utilizado por el Dr. Balczar):
a) Para piel, cuero cabelludo o uas:
Colocar 1 gota o 50 l de NaOH o KOH al 10% en una lmina portaobjetos. Luego se topa
el borde posterior de la lanceta, en el lquido y as embebido, se raspa los bordes de la lesin
o zona sospechosa, en forma suave, (piel, uas o pelo), repetir esta accin varias veces hasta
conseguir una muestra adecuada. Se debe evitar el sangrado. En caso de sospecha de caros,
procurar sacar la costra, en cuyo lecho se observara un surco, en estos casos que casi siempre
sangra la herida al realizar el raspado.
b) Para secreciones:
Colocar 1 gota o 50 l de NaOH o KOH al 10%, en una lmina portaobjetos y se le agrega 1
gota de la muestra, se mezcla y se le coloca un cubreobjetos, y se observa directamente al
microscopio a 10 x y 40 x, cerrando el condensador para permitir el contraste de luz. Una luz
intensa no permite visualizar estructuras.

4.- INFORME.
Se registra el resultado en el libro y en el sistema informtico;

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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17
ENVIO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

OBJETIVO
Describir el procedimiento y condiciones para el transporte de muestras al laboratorio.

CONDICIONES ESPECFICAS
La muestra debe ser mantenida lo ms cerca posible de su estado original, debiendo evitarse
temperaturas extremas o desecamientos excesivos.
Por lo general, volmenes de 1 a 5 ml de muestra deben enviarse al laboratorio dentro de 15 a 30
minutos.

PROCEDIMIENTO
a) Para su transporte al laboratorio se colocan las muestras en un envase primario, el cual puede ser
de material plstico u otro, resistente a roturas o filtraciones.
b) Todas las muestras deben ser enviadas al laboratorio lo ms pronto posible sobre todo los
dispositivos intravasculares y el lquido cefalorraqudeo, el resto de muestras deben llegar al servicio
de laboratorio en un tiempo prudencial de 15 a 30 minutos, de extradas. Si el proceso va a demorar,
pueden mantenerse bajo condiciones adecuadas, en los medios de transporte que se recomiendan
segn el tipo de muestra (ver tabla N 39
c) Por lo general no se almacenan las muestras por ms de 24 horas.
d) En caso que se requiera transferir la muestra a otro laboratorio, los responsables de su envo eligen
el sistema de embalaje apropiado para la conservacin de las muestras durante el tiempo que
demanda el transporte hasta llegar al laboratorio y debe cumplir con los siguientes pasos (fig. 1):
Recipiente primario, a prueba de filtraciones, etiquetado, que contiene la muestra. Este recipiente debe
envolverse en material absorbente.
Recipiente secundario, a prueba de filtraciones, que encierra y protege el recipiente primario. Se pueden
colocar varios recipientes primarios envueltos en un recipiente secundario. Se debe usar suficiente material
absorbente para proteger a todos los recipientes primarios y evitar choques entre ellos.
Recipiente externo de envo. El recipiente secundario se coloca en un paquete de envo que protege al
recipiente secundario y su contenido de los elementos externos, tales como dao fsico y agua, mientras se
encuentra en trnsito.

Tabla N 3.- Sistemas de transporte primario para la investigacin de microorganismos aerobios

Sistema de transporte Comentarios
Torundas con medio de
transporte
Torundas en tubos de plstico con medio de transporte que mantiene un pH favorable y
previene la desecacin de la muestra.
tiles para la investigacin de Chlamydia spp. y Bordetella spp.
Pueden ser txicas para N. gonorrhoeae , U. urealyticum y virus. tiles para la toma de
muestra de conexiones de catteres intravasculares.
Torundas de dacrn tiles para la investigacin de virus
Torundas de algodn
Pueden inhibir a Chlamydia spp. Cuando la torunda es de madera, puede inactivar a
virus del grupo Herpes e interferir con las pruebas de identificacin de Ureaplasma .
Torundas para exudados
nasofarngeos
Torundas flexibles que emplean alambre en lugar de madera
Tubos estriles de boca ancha
tiles para el transporte de orinas, esputos, broncoaspirados, lavados
broncoalveolares, heces, biopsias.
Tubos estriles Lquidos estriles, catter telescopado, aspirados de abscesos y heridas
Tubo estril con medio de transporte (Cary Blair) para enteropatgenos en heces.
Tubo con fijador (alcohol polivinlico) para parsitos en heces.
Tubo con conservante (cido bricoformiato de sodio) para orinas. Mantiene la
poblacin bacteriana durante 48 h a temperatura ambiente sin necesidad de
refrigeracin.
Placas de Petri estriles tiles para pelos, escamas cutneas y uas
Torundas de alginato clcico
Tubos estriles con medio de
transporte o conservante

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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Fig. 1.- Empaquetado y etiquetado para el envo de sustancias infecciosas

El transporte de material biolgico requiere de coordinacin entre la Jefatura del Departamento de
Patologa clnica, la Direccin del Hospital y el laboratorio de referencia, lo cual incluye una carta
emitida por la Direccin general del Hospital. Adems debe coordinarse con el servicio de transporte
del hospital y cada uno debe asumir sus responsabilidades para garantizar que el producto llega a su
destino oportunamente y en buenas condiciones.
Los formularios con datos, cartas y otras informaciones de identificacin de la muestra deben
colocarse pegados con cinta adhesiva en el exterior del recipiente secundario. Para ello se debe tener
en cuenta:
Los recipientes de las muestras deben ser hermticos y a prueba de fugas de lquidos.
Si el recipiente es un tubo, debe estar cerrado hermticamente, con tapa de rosca y colocado en
una gradilla, de tal forma que mantenga su posicin vertical.
Los recipientes con muestras y gradillas deben colocarse en una caja resistente de metal o
plstico y a prueba de fugas de lquido, que contenga una cubierta segura y que cierre
perfectamente.
La caja donde se transportan los materiales deber ser asegurada firmemente en el vehculo de
transporte.
Cada caja de transporte deber estar etiquetada de forma adecuada y de acuerdo a su contenido.
Los formularios con los datos de identificacin de los especmenes deben acompaar a cada caja
de transporte.
El vehculo de transporte deber ir provisto de material absorbente, desinfectantes, un
contenedor para desechos a prueba de fugas lquidas y guantes resistentes de uso mltiple.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

19
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Tabla 4.- Transporte y conservacin de muestras para diagnstico microbiolgico

Para virus: Se aceptan torundas de algodn, dacrn o rayn con bastn de aluminio o plstico. No aceptar torundas de
alginato o con bastn de madera.
Muestras del tracto respiratorio inferior: aspirado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado por telescopado, aspirado
traqueal, puncin transtorcica aspirativa con aguja ultrafina.
Abreviaturas: TA: temperatura ambiente, SAF: acetato sdico-formalina, FOR: 10% formalina, MIF: mertiolato-ioduro-
formalina.

TRANSPORTE CONSERVACIN
Bacterias
Envase para anaerobios (pref.) o
jeringa sin aguja (pref.). Hacer
Gram y cultivo (Amies/Stuart)
<2 h, TA <24 h, TA
Hongos
Torunda. Una para tincin, otra
para cultivo (Amies/Stuart)
<2 h, TA <24 h, TA
Biopsias Bacterias/Hongos Estril <15 min, TA <24 h, TA
Catter/material prtesis Bacterias/Hongos Estril <15 min, TA <24 h, 2-8C
Catter urinario No es aceptable Enviar orina
Catter drenaje No es aceptable Enviar lquido drenaje
Genital (lcera) Trep. pallidum Campo oscuro Inmediata
Torunda con medio transporte
(cultivo)
Torunda para Gram
Bacterias Estril con Cary Blair <2 h, TA <24 h, 2-8C
Clostridium difficile Estril <1 h, TA 48 h, 2-8C cultivo
Parsitos SAF, FOR+PVA, MIF+PVA Indefinido, TA Indefinido, TA
Rotavirus Estril 2-8C
Jugo gstrico Micobacterias Estril
<15 min, TA o
neutralizar en la 1
hora de la recogida
<24 h, 2-8C
Lesiones fngicas (piel,
pelo, uas)
Hongos
Inoculacin directa al medio de
cultivo
<24 h, TA
Bacterias,
Hongos,
Parsitos
Mdula sea Bacterias/Hongos Estril/botellas de hemocultivos <24 h, TA <24 h, TA
Ocular (Raspado corneal)
conjuntival
Bacterias/ Hongos/ virus
1
Inoculacin directa en medios de
cultivo
<15 min, TA <24 h, TA
Odo externo Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte <2 h, TA <24 h, 2-8C
Orina Bacterias/Hongos Estril. <2 h, TA <12 h, 2-8C
Leptospira Estril <1 h, TA
Parsitos Estril <2 h, TA <24 h, 2-8C
Orina suprapbica Bacterias Transporte para anaerobios <2 h, TA <24 h, 2-8C
Rectal Bacterias Torunda
1
con medio de transporte <2 h, TA <24 h, TA
Sangre Hemocultivo Botellas de hemocultivos <2 h, TA <24 h, TA
Piel Leishmania Raspado directo
Bacterias
Hongos
Virus
1
Tracto respiratorio superior
(nasofarngeo)
Bordetella pertussis Torunda
1
seca de alginato Inmediato /2-8C
<2 h, TA <24 h, TA
Abscesos/heridas
quemaduras/mordeduras
Tracto respiratorio superior
(farngeo, nasal) e inferior
2
Torunda
1
con medio de transporte <2 h, TA <24 h, TA
Genital (vaginal) Bacterias/Hongos <2 h, TA <24 h, TA
Lquidos estriles Estril/botellas de hemocultivos <15 min, TA <24 h, TA
Heces
Muestra Determinacin Envases
Tiempo y temperatura
Genital
(cervical/rectal/uretral)
Bacterias (gonococo)
Inoculacin directa sobre medios
de cultivo. Torunda con medio
transporte

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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20
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
Antes de procesar la muestra debe comprobarse su trazabilidad, es decir, que haya correspondencia
de la muestra con la solicitud que incluye: Nombre completo del paciente, nmero de historia o de la
seguridad social o DNI, servicio solicitante, nombre del mdico solicitante, tipo de muestra, mtodo
de obtencin, fecha y hora de recogida, enfermedad de base y motivo de la peticin.
Adems se debe verificar que el medio de transporte sea el adecuado, para el estudio que se va a
realizar.
El procesamiento depende bsicamente del tipo de muestra y el microorganismo a aislar, para ello la
muestra puede ser pre-tratada de varias formas, como son:

Centrifugacin
- Centrifugar todos los lquidos en volumen superior a 1ml a 2.500 rpm durante 15 minutos
- Centrifugar sangre a 3.500 rpm durante 3-5 minutos para deteccin de antgenos y/o anticuerpos

Homogeneizacin

Mediante hoja de bistur
Traspasar la muestra a una placa de Petri estril. Con ayuda de una hoja de bistur desmenuzar el
tejido hasta obtener una consistencia homognea.
Traspasar la muestra homogenizada a un contenedor estril con ayuda de una pipeta Pasteur.
Mediante mortero
Traspasar la muestra al interior de un mortero estril y aadir 1-2 ml de caldo de cultivo.
Con ayuda de la mano del mortero triturar la muestra mediante movimientos rotatorios.
Traspasar la muestra utilizando una pipeta Pasteur estril a un contendor estril.
Mediante Stomacher
Colocar la muestra en el interior de una bolsa de Stomacher y aadir 1-2 ml de caldo de cultivo
Colocar la bolsa en el interior del Stomacher, dejando unos centmetros de la bolsa sobresalir
sobre la tapa del Stomacher.
Cerrar la tapa y conectar el Stomacher durante 1 a 5 minutos.
Desconectar el Stomacher, extraer la bolsa y traspasar su contenido a un contenedor estril.
Las muestras que se procesen para hongos no se homogenizan sino que se deben cortar en
pequeos trozos con la ayuda del bistur y se inoculan directamente sobre los medios de hongos
con objeto de evitar que determinados hongos no septados sean inviables.

Preparacin de extensiones
Mediante impronta en piezas de tejido
Colocar el tejido en una placa de Petri y cortar una porcin con la ayuda de una hoja de bistur.
Tomar la pieza cortada y realizar impresiones por la superficie del corte sobre un portaobjetos
Extensiones finas: material muy purulento
Tomar una porcin de la muestra y colocarla sobre un portaobjetos
Colocar otro portaobjetos sobre la muestra y presionar los dos portaobjetos
Desplazar el portaobjetos superior sobre el que contiene la muestra hasta separarlos

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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21
Realizar una extensin fina, si es gruesa repetir los pasos hasta conseguirla.
Lquidos
Depositar una gota de lquido sobre un portaobjetos y dejar secar
Centrifugar unas gotas a 1 ml de lquido 5-10 min. a 2500 rpm
Muestras en torunda (ver tabla N3)
Colocar la torunda sobre un portaobjetos
Aadir sobre la torunda una pequea cantidad de caldo de cultivo
Realizar movimientos rotatorios, exprimiendo la torunda sobre el portaobjetos

Inoculacin de la muestra en los medios de cultivo: seleccin de los medios: (ver tabla 7)

Piezas no triturables
Piezas pequeas, se introducen en caldo Trypticase soya e incubar 24 horas, tras lo cual se har
coloracin Gram y subcultivos en agar sangre.
Piezas grandes, se aade 10-20 ml de caldo de enriquecimiento al contenedor estril e incubar
inmediatamente. Tras 24 horas se har coloracin Gram y subcultivos en agar sangre.
.
Muestras lquidas recibidas en jeringas o tubos estriles
Inocular 2 o 3 gotas de la muestra en uno de los cuadrantes de la placa de Petri.
Realizar estriamiento de la muestra mediante un asa estril por todos los cuadrantes de la placa

Muestras recibidas en torundas
Hacer rotar la torunda varias veces en uno de los cuadrantes de la placa
Con un asa estril, realizar estras desde la zona de la descarga por el resto de los cuadrantes de
las placas.
Introducir la torunda en un caldo de cultivo y exprimirla bien mediante movimientos rotatorios
sobre las pares del tubo. Cortar la parte superior y dejar la porcin inferior en el caldo de cultivo.
Repicar a las dos horas como mximo, para evitar contaminacin.
Tcnica de Maki para cultivo de catteres intravasculares
Con la ayuda de una pinza estril extraer el catter de su envase.
Si mide 2 cm, aproximadamente y cortarlo con un bistur hasta esa longitud.
Depositarlo en una placa de agar sangre y rodar desde un extremo al otro de la placa 3-4 veces.
Nota: Este mtodo est en desuso.
Cultivos cuantitativos (orina, bronco aspirados, secreciones traqueales, lavados
broncoalveolares)
En el caso orina, usar un asa estril calibrada de 1 l, 5 l o 10 l, sembrar por estra, en un
cuadrante de la placa. Incinerar el asa despus del sembrado. El recuento de colonias se
multiplica por un factor de acuerdo al tipo de asa usada. Ver tabla N 3
En caso de muestras respiratorias fluidas, agitar en vrtex durante unos segundos. Si no se
consigue una buena homogeneizacin, aadir suero salino y agitar en vrtex de nuevo. Puede
usarse una dilucin 1/2, es decir un volumen de la muestra con otro volumen igual de solucin
salina fisiolgica, o una dilucin 1/5, es decir un volumen de la muestra con 4 volmenes de
solucin salina fisiolgica. Luego sembrar con un asa calibrada, similar al de orina, y el recuento

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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de multiplica por el factor de acuerdo al tipo de asa usada por la dilucin realizada. Ej., dilucin
1 en dos (al medio), con 400 colonias y asa de 5 l sera: 2 x 400 x 200=16,0000 UFC/ml.

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

La manipulacin de muestras y residuos biolgicos, conlleva a riesgo potencial de infeccin en el
personal que realiza los procesos de coloracin, aislamiento, identificacin y estudio de resistencia
bacteriana, a travs de exposiciones accidentales causadas por salpicaduras, cortes y araazos.
Adems, algunos procedimientos de laboratorio (por ejemplo, agitacin en vrtex, mezcla y
centrifugacin) pueden generar aerosoles que aumentan el riesgo de que los trabajadores que realizan
estas operaciones contraigan infecciones.
Por s mismos, el vertido y la fuga de sustancias no generan aerosoles, por lo que en general, durante
su transporte, los microorganismos no suponen un riesgo de la misma magnitud que en las
situaciones que tienen lugar en el laboratorio.

Las precauciones habituales, se destinan a reducir el riesgo de transmisin de microorganismos, a
partir de fuentes de infeccin reconocidas y no reconocidas, mediante el uso de barreras de
proteccin. Las precauciones habituales se aplican a la sangre, a todos los lquidos corporales,
secreciones, excreciones (excepto el sudor), piel no intacta y membranas mucosas. Por lo que se
recomienda a los trabajadores, que se protejan de las infecciones a s mismos, a los pacientes, los
materiales y el entorno.

Las personas pueden producir aerosoles de forma muy eficaz durante la tos, los estornudos o el
simple hecho de hablar; en un estornudo se pueden liberar 2 x 10
6
partculas viables. Si la persona
padece tuberculosis, cualquiera que est cerca de ella (a una distancia de hasta 1,5 m) puede inhalar
las partculas e infectarse. No obstante, slo se producen infecciones pulmonares cuando se inhalan
partculas aerosolizadas de tamao < 5 micrmetros, que no son atrapadas por los mecanismos de
defensa de las vas respiratorias superiores y consiguen alcanzar los pulmones.
Otros agentes son transmitidos por la sangre, como el virus de la hepatitis B y C, el virus de la
inmunodeficiencia humana, penetrando en un husped mediante inyeccin, a travs del contacto de
la piel no intacta con sangre o lquidos corporales infectados, y por relaciones sexuales (va genital).

Procedimiento de limpieza en caso de vertido de sustancias infecciosas o sangre:
1. Utilizar guantes, ropa de proteccin y proteccin facial y ocular.
2. Cubrir el vertido con un pao o toallas de papel.
3. Echar un desinfectante apropiado sobre las toallas de papel y la zona circundante (generalmente
son apropiadas las soluciones de leja al 5%.
4. Limpiar los materiales pasados 30 minutos. Si hay cristales rotos u otros materiales punzantes,
utilizar una pala o un cartn duro para recogerlos, y depositarlos en un contenedor resistente a los
pinchazos.
5. Limpiar y desinfectar la zona donde se haya producido el vertido (repetir los pasos 2 a 4).
6. Tirar los materiales contaminados en una bolsa de basura.

Con el fin de evitar que el personal se infecte durante los diferentes procesos, se debe aplicar las
medidas de Bioseguridad establecidas en las normas del laboratorio, siendo indispensable que las
personas que laboran en Microbiologa usen su equipo de proteccin personal, tales como Guantes,
mascarilla, y mandil, as como el lavado de manos en forma rutinaria, despus de cada
procedimiento. Con estas medidas se disminuye la incidencia de infecciones intrahospitalarias.

Residuos slidos

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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El desecho de residuos debe realizarse de acuerdo con lo establecido en el documento "Gestin de
residuos" de la institucin.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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24

COLORACIONES

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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OBJETIVOS
Identificar las bacterias segn sus caractersticas tintoriales.
Dar un avance en el diagnstico microbiolgico, el cual es til para la seleccin del medio de
cultivo y para dar inicio al tratamiento antibitico.

INTRODUCCIN
En fresco las bacterias son transparentes, lo que dificulta su estudio, por lo que es necesario, usar
colorantes para distinguirlas. Para ello se pueden usar coloraciones simples (un solo colorante) o
coloraciones compuestas (se usan varios colorantes).

a.- Coloraciones Simples
Se usa una sola solucin colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.
Coloracin positiva es la tincin de los microorganismos, efectuada con colorantes bsico, que
poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan qumicamente con el citoplasma
microbiano.
Tcnica: La coloracin consiste en cubrir el frotis, despus de fijado, con la solucin colorante y
se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar. Los ms usados son:
Fucsina bsica: se diluye 1/10 la solucin de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se deja actuar
30 a 60 segundos.
Violeta de genciana 1%: se diluye al 1/10 la solucin de uso y se deja actuar 30 a 60 segundos.
Azul de metileno 3%: se usa sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.
Coloracin negativa los microorganismos quedan sin teir y se colorea el medio que los rodea.
Se usa un colorante opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y simplemente
rodea a las clulas.
Tcnica: Mtodo de Burri. Se coloca en un extremo del portaobjetos una gota de tinta china o
nigrosina y otra de la suspensin microbiana y se mezclan con el asa. Luego, con otro porta se
apoya sobre la mezcla y se hace un extendido a lo largo del porta. Con este procedimiento el
espesor del frotis va disminuyendo a medida que se extiende, con lo cual se conseguir una zona
donde el contraste sea el adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersin.
Tinta china, es una suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado grandes que no
penetran en la bacteria u hongo.
Nigrosina Colorantes cidos que no poseen afinidad por los constituyentes celulares.
La mxima utilidad est en revelar cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se
observan como cuerpos refringentes y espiroquetas que, por su pequeo dimetro transversal,

b.- Coloraciones compuestas o diferenciales: las ms usadas son, la coloracin Gram y la de Ziehl
Neelsen

COLORACION DE GRAM

1. OBJETIVO: Identificacin y clasificacin de grmenes de acuerdo a la captacin de colorantes,
en Gram positivas (G +) y. Gram negativas (G -) (ver grfico 1)

2. PRINCIPIO: Las bacterias Gram positivas tienen pared celular gruesa y capta la violeta de
genciana, usando como mordiente el lugol. Las bacterias Gram negativas tienen pared celular
delgada y pierden el color al agregrsele el decolorante, tindose con la safranina como
contraste. Existen algunas dificultades para su interpretacin (ver Tabla 5)

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
Asa de platino de 4 mm de dimetro.

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Porta objeto de vidrio.
Mechero de Bunsen
Reactivos: Violeta de Genciana, lugol, alcohol acetona y safranina.

4. PREPARACION DEL FROTIS:
a) Use lminas preferiblemente nuevas para evitar errores de interpretacin.
b) Numere la lmina portaobjetos donde va a realizar el frotis, con lpiz de cera.
c) Flamee el asa de platino hasta que se ponga al rojo vivo y deje enfriar
d) Seleccione la zona donde va a tomar la muestra (presencia de pus o sangre).
e) Trabaje siempre cerca al mechero, colocando el portaobjetos detrs de la llama y realice
movimientos en zigzag casi paralelos tratando de abarcar los dos tercios de la lmina.
f) Realice frotis delgado, en caso de lquidos corporales turbios, use muestra sin centrifugar.
a) Evite sobrecalentar la lmina, para evitar aerosoles, es preferible dejar secar a temperatura
ambiente en un rea donde haya poca ventilacin, sobre todo en caso de LCR u orina, estos de
preferencia deben ser secados en estufa (37 C), luego se flamea ligeramente 3 veces para fijar.
g) Realizado el frotis, flamee de nuevo el asa de platino al rojo vivo y poner en la gradilla.

5. COLORACION:
a) Cubra el portaobjeto con cristal violeta al 1% y deje reposar un 1minuto.
b) Enjuague la lmina dentro de un vaso de agua, por el que discurre agua del cao.
c) Cubra el portaobjeto con solucin yodada de Gram y deje reposar un 1minuuto.
d) Enjuague la lmina dentro de un vaso de agua, por el que discurre agua del cao.
e) Cubra el portaobjeto con alcohol-acetona por 30 segundos. Si el frotis es grueso decolore ms.
f) Enjuague la lmina dentro de un vaso de agua, por el que discurre agua del cao.
g) Cubra el portaobjeto con solucin acuosa de safranina por 30 segundos.
h) Enjuague la lmina dentro de un vaso de agua, por el que discurre agua del cao.
i) Deje la lmina en forma inclinada para que seque y leer a 100x usando aceite de inmersin.

6.- RESULTADOS:
Las bacterias Gram positivas se tien de color azul oscuro a violeta.
Las bacterias Gram negativas se tienen de color rosado a rojo.
La coloracin Gram no es recomendable para muestra de heces, ni esputo por su alta contaminacin
poli microbiana.

7.- CONTROL DE CALIDAD: Se debe usar una cepa de estafilococos (Gram positivas) y una cepa
de Escherichia coli (Gram negativas) para el control de calidad de los reactivos.

Tabla 5. Dificultades en la interpretacin de la coloracin Gram
Microorganismo Presentacin clnica Variante de presentacin Comentarios
St. pneumoniae Diplococos GP, forma de
punta de lanza
Cocos alargados semeja
bacilos cortos
Puede ser mal interpretado como bacilos
Acinetobacter Cocobacilos GN Cocos Gram negativos,
aislados o en pares
Cocos Gram positivos
Semejantes a Neisseria. Buscar formas
alargadas, Neisseria nunca es alargada.
Puede confundirse con streptococcus.
Levaduras,
criptococos
Clulas GP redondas u
ovales con gemacin
Clulas con tincin variable Pueden confundirse con residuos de
colorante, ver uniformidad de tamao.
Clostridium
perfringens
Bacilos Gram positivos
en tndem
Bacilos GN o con tincin
Gram variable
Puede confundirse con bacilos GN, la
forma en tren hace pensar en clostridium.
Staphylococcus Cocos GP en racimos Pueden observarse en pares Puede confundirse con estreptococos
GN: Gram negativos GP: Gram positivos

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Grfico 1. Clasificacin bacteriana segn coloracin Gram

EVALUACION DE SECRECION TRAQUEOBRONQUIAL POR FROTIS PARA GRAM
til para muestras de esputo y secrecin endotraqueal.
Utilice objetivo de 10x para escoger el campo de estudio.
Concntrese en al rea con leucocitos.
Evite zonas de contaminacin oro farngea.
Haga conteo semicuantitativo de las clulas (Leucocitos, clulas epiteliales y grmenes), en
cruces: (+, escasas), (++, regular cantidad), o (+++, abundantes).
Si un organismo predomina en reas de inflamacin, haga conteo semicuantitativo y reporte:
Predomino de bacilos, cocos, cocobacilos, etc., Gram positivos o Gram negativos.
Si otros tipos de bacterias estn presente, haga conteo semicuantitativo del predominante y
reporte: (+, escasas), (++, regular cantidad), o (+++, abundantes) o en porcentaje si es posible.
Si hay diversidad de organismos y no hay organismos predominantes: Haga conteo
semicuantitativo y reporte: " Mezcla de flora poli microbiana".
Si no hay microorganismos: Reportar " No se observ microorganismos".

Protocolo Q-Score System para evaluacin de muestra traqueobronquial:

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La evaluacin consiste en la lectura previa de un frotis por Gram (en campo de bajo poder 40x), en el que se
valora el nmero de clulas epiteliales y de leucocitos polimorfonucleares, en base a la tabla 5, se cultivan
solamente las muestras que tengan Q score +, de lo contrario se solicita otra muestra.
Tabla N 6: Evaluacin de secrecin traqueobronquial segn el sistema Q-Score

Ref: Raymond Bartlett, M.D - Medical Microbiology : Quality Cost and Clinical Relevance. 1974, Edit. John Wiley & Son, New York.

COLORACION ALCOHOL-ACIDO RESISTENTE (TINCION ZIEHL NEELSEN)

1. OBJETIVO: Identificar la presencia de bacilos alcohol cido resistentes, en lquidos y
secreciones, primordialmente el micobacterium tuberculoso, aunque pueden hallarse bacterias
cido-alcohol resistentes no pertenecientes al gnero micobacterium tuberculoso.
2. PRINCIPIO: La cpsula lipdica de los microorganismos acido resistentes captan la carbol
fucsina y resisten a la decoloracin con alcohol cido, permaneciendo teidos, y para resaltar la
coloracin se usa como colorante de contraste al azul de metileno o al cido pcrico.
3. CONDICIONES:
Para una mejor deteccin del bacilo tuberculoso, se recomienda tomar tres muestras. Por lo
menos dos deben ser la primera muestra de la maana.
Instruir adecuadamente al paciente para que la muestra sea de esputo y no de saliva, ya que la
recoleccin de saliva es de baja calidad para deteccin de BK.
La saliva no es considerada como una muestra apropiada para TBC, sin embargo de no poder
contar con otra muestra ms adecuada, debe ser procesada.
Una buena muestra de esputo debe contener una cantidad de 3 a 5ml. Frecuentemente es
espesa y mucoide, pero puede ser fluida con pedazos de tejido muerto. El color es variable y
las muestras sanguinolentas son de color rojizo o caf.
Registre la apariencia visual de la muestra de esputo en la solicitud del laboratorio.
Descarte cualquier recipiente con derrames y solicite otra muestra.
La solicitud de baciloscopia debe estar debidamente llenada y los datos deben coincidir con
los datos de la muestra. Una vez verificado esto, anote la informacin en el registro del
laboratorio.
No se aceptarn muestras con derrames, ni hojas de solicitud mal llenadas.

4. PRECAUCIONES:
La mayora de casos de tuberculosis es de forma pulmonar y se trasmite por va area, por lo
que se debe usar mascarillas N95 al atender a pacientes o manipular sus muestras.

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Nunca permita que las muestras de esputo sean recolectadas dentro del laboratorio.
Evite crear aerosoles al manipular las muestras: Tapar los tubos si son centrifugados y evitar
calentar los frotices para reducir al mnimo la produccin de aerosoles.
Las muestras de esputo deben estar alejadas de zonas donde corre el aire, para evitar el
arrastre de partculas infecciosas, por lo tanto use cabina de bioseguridad tipo IIA, o coloque
las muestras en un sitio no ventilado.
Rotule adecuadamente con el N de registro del laboratorio tanto en la tapa como en el envase
y coloque ese nmero en la hoja de solicitud de baciloscopia.

5. MATERIALES Y REACTIVOS:
Pinzas,
Un lpiz con punta de diamante o lpiz de grafito,
Aplicadores de madera o un asa, o gotero descartable.
Un recipiente con desinfectante para desechables,
Un mechero Bunsen o lmpara de alcohol,
Frascos con las muestras.
Portaobjetos de vidrio (nuevas)
Cabina de bioseguridad
Reactivos: Fucsina fenicada, Alcohol cido, Azul de metileno.

6. PREPARACION DEL FROTIS DEL ESPUTO.
Cuando prepare los extendidos de BAAR siempre utilice portaobjetos nuevos, pero primero
deben limpiarse frotndose con alcohol hasta secarse o pasarse rpidamente sobre una llama,
Esto eliminar cualquier residuo de aceite que pudiera interferir con la tincin.
Abra despacio el recipiente, esto evita la produccin de aerosoles.
Los frotices se realizan por duplicado, para ello use 2 lminas portaobjetos nuevos y
numrelos de acuerdo a la identificacin de la muestra. Nunca reutilice portaobjetos de
extendido de esputo para trabajo de TBC.
Si el portaobjetos es de vidrio no esmerilado, escriba con lpiz de diamante los nmeros
correspondientes del laboratorio. Nunca use un lpiz graso, ya que las marcas pueden
desaparecer durante el proceso de tincin.
Usando un aplicador de madera o un asa, tome porciones de esputo para examinarlos. Las
partculas caseosas slidas, a menudo producen el mayor nmero de bacilos.
Usar movimientos suave en zigzag sobre el portaobjetos, para evitar la produccin de
aerosoles, y cubra un rea oval de aproximadamente 2 cm de largo. Coloque un solo frotis en
cada portaobjetos.
Evite realizar el frotis sobre la llama, para evitar la generacin de aerosoles. Es
preferible realizarlo detrs de la llama (es decir el mechero debe estar entre el operador y la
muestra) y luego dejar secar a temperatura ambiente donde no haya corriente de aire,
pudindose dejar dentro de la estufa a 37C. o dentro de la cabina de bioseguridad. Una vez
secada la muestra se puede flamear ligeramente en el mechero.
En caso de muestras lquidas es preferible usar un gotero plstico (100 l aprox.) y se toma la
muestra de la porcin purulenta, realizando el frotis con el mismo gotero.
Para evaluar si el grosor del frotis es el adecuado, dejar secar y colocar sobre un impreso, las
letras deben leerse con claridad. Si es muy delgado, la muestra puede dar resultado falso
negativo. Si es muy grueso, el extendido puede barrerse durante el proceso de tincin.
Ya secos, fije los portaobjetos usando la llama azul de un mechero Bunsen. Con pinzas, y con
el extendido hacia arriba, pase brevemente el portaobjetos a travs de la llama 3 veces.

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La fijacin por calor asegura que el esputo se pegar al portaobjetos de vidrio. Un
calentamiento excesivo puede daar los bacilos. Si no se fijan lo suficiente por medio del
calor, los bacilos cido-resistentes pueden barrerse durante la tincin.

7. COLORACION DEL FROTIS

Tcnica de coloracin:
Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tincin con los extendidos
hacia arriba y orientados uniformemente, los portaobjetos no deben tocarse, para evita una
contaminacin cruzada. Como control de calidad, incluya diariamente un portaobjetos de
control positivo y otro portaobjetos de control negativo.
1. Coloree cubriendo con Fucsina fenicada cada portaobjetos, flamee las lminas por debajo
hasta ver que humee, durante 15 seg. aprox., dejar que enfriar dos minutos y nuevamente
repetir el flameado dos veces ms, dejarlos enfriar. Si los portaobjetos an tienen residuos de
fucsina o estn color rosa, aplique una cantidad adicional de la solucin decolorante de 1 a 3
minutos ms. Lave suavemente cada portaobjetos con agua corriente fra hasta que el
portaobjetos quede libre de colorante.
2. Cubra cada portaobjetos con alcohol cido como decolorante y mantngalo durante 3
minutos. Cuidadosamente, enjuague con agua una vez ms los portaobjetos e inclnelos para
quitar el exceso de agua.
3. Despus aplique la solucin de contraste, azul de metileno, durante 3 a 5 minutos.
Dependiendo de la calidad de azul de metileno que est usando. Vuelva a enjuagar con un
leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua.
Ya con los extendidos teidos, limpie la parte posterior de cada portaobjetos con un algodn
o toalla de papel impregnada de alcohol.
Finalmente, coloque cada portaobjetos en forma inclinada, sobre una gradilla para que
sequen al aire (30 minutos), o en la estufa (10 minutos). NO deben secarse con papel secante.

Precauciones de la coloracin Ziehl Neelsen
Todos los reactivos deben tener fecha de vencimiento, descarte los reactivos caducados.
Filtre la fucsina fenicada antes de usarla. Si despus del filtrado se detecta un precipitado,
descarte el reactivo.
Para evitar una contaminacin cruzada, nunca use una caja de tincin.
Nunca tia ms de 12 portaobjetos a la vez.
Para el flameado de la fucsina, use una llama de mechero de alcohol o de Bunsen, caliente
suavemente los portaobjetos hasta vaporizar. Deje que el colorante permanezca sobre los
portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este perodo.
Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tia la pared celular de
la bacteria, La fucsina debe permanecer 5 minutos aprox.
Siempre lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Incline
individualmente cada portaobjetos para drenar todo el exceso de agua. Esto evita que quede
agua remanente sobre el portaobjetos que pueda diluir el prximo reactivo.
Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede
permanecer teido. Esto nos puede dar un resultado falso positivo.
Proteja los portaobjetos de la luz solar directa ya que sta puede aclarar el color del bacilo
cido-resistente.

8. EXAMEN MICROSCPICO E INFORME DE LOS RESULTADOS.

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Utilice un objetivo de 40X para enfocar y determinar un rea adecuada para leer los
portaobjetos.
Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el extendido teido. Deje que la gota caiga
libremente sobre el portaobjetos.
Nunca toque el portaobjetos con el aplicador de aceite, esto puede ocasionar un
escurrimiento de BAAR en el aceite de inmersin y contaminar al siguiente portaobjetos.
No examine los portaobjetos hmedos, estos deben estar completamente secos, de lo
contrario el aceite al mezclarse con el agua se pondr lechoso y producir artefactos que
dificultarn la visin
Gire el revlver y coloque el objetivo 100X en su sitio. Ahora baje suavemente el objetivo
100X, apenas debe tocar el aceite.
Nunca deje que el lente toque el portaobjetos. Puede daar los lentes y posiblemente rompa
el portaobjetos.
Mientras observa a travs del ocular, eleve lentamente el lente de inmersin, ajuste y
enfoque hasta que aparezca la imagen del extendido. Para enfocar, gire cuidadosamente el
tornillo micromtrico.
Se debe seguir una pauta sistemtica para la observacin yendo de izquierda a derecha del
extendido.
Los bacilos del micobacterium, pueden ser un poco encorvados granulados y presentarse
individualmente, en pares o en grupos.
Despus de terminar cada lectura, limpie el objetivo con alcohol isopropilco o alcohol
acetona. Nunca use xylol, para evitar daar los lentes.
Nunca eliminar los portaobjetos teidos, ya que deben ser enviados al laboratorio referencial
para el control de calidad.
Guarde todas las muestras hasta que los extendidos sean examinados y registrados. Luego
esterilcelas y deschelas.
Si se encontraron bacilos cido resistente, reporte la observacin como extendido positivo
para BAAR. Estos pacientes son infecciosos y deben registrarse para tratamiento con un
rgimen efectivo. El nmero de BAAR encontrados es un indicador del grado de infeccin
del paciente y de la severidad de la enfermedad.
Las pruebas y reportes deben efectuarse lo ms rpido posible, preferentemente dentro de las
primeras 24 horas.
Los resultados deben cuantificarse, de acuerdo al resultado de la baciloscopia.

Informe de la Baciloscopia

Negativo (-): No se encuentra bacilos cido alcohol resistente (BAAR) en 100 campos
microscpicos.
Positivo (+): Menos de 1 BAAR promedio por campo en 100 campos observados (10-99
bacilos en 100 campos).
Positivo (++): De 1 a 10 BAAR promedio por campo en 50 campos Observados.
Positivo (+++): Ms de 10 BAAR promedio por campo en 20 campos observados.
Si se observa de 1 a 9 BAAR en 100 campos microscpicos, se adoptar la siguiente
conducta:

- Leer 100 campos microscpicos ms. Si persiste el resultado, realizar otro extendido de
una porcin ms representativa de la misma muestra.

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- Si persiste la observacin o no se encuentra ms BAAR, en el rubro Observaciones de la
solicitud bacteriolgica se informar el hallazgo (Ej. 5 BAAR) y se solicitar nuevas
muestras del paciente.
- Si persiste el resultado se anotar el hallazgo en el registro y la muestra se enviar para
cultivo.

Antes de reportar un extendido como negativo, se debe examinar por lo menos 100 campos
microscpicos. Si se examina menos de 100 campos microscpicos, puede dar un reporte falso
negativo. Se pueden leer menos de 100 campos, solamente si la muestra es BAAR positiva ++,
+++.

Control de Calidad en el Laboratorio de TBC

Realice el Control de Calidad en cada nuevo lote de reactivos.
Considere estos resultados antes de leer las baciloscopas, este importante paso verificar
que tanto el procedimiento de coloracin como la funcin microscpica fueron correctos.
Si despus del procedimiento de tincin un control negativo aparece rojo, es resultado de una
decoloracin incompleta.
Si el portaobjetos de control positivo no muestra BAAR, puede ser que los reactivos de
coloracin estn defectuosos, o el procedimiento se hizo incorrectamente.
Cada fase de la Baciloscopa debe hacerse cuidadosamente.
Los errores efectuados durante cualquier paso, pueden darnos resultados incorrectos. Un
resultado falso positivo conduce a un tratamiento innecesario y un falso negativo ocasiona
un mayor contagio en la familia y la poblacin.
Cuando los controles no demuestran la coloracin correcta, determine la causa y corrjala.
Cuando haya identificado y corregido el problema, repita el procedimiento de tincin con
nuevos extendidos y controles.

Algunas razones que causan resultados falsos positivos son:
Error al manejar la muestra o al registrar la informacin
Volver a usar recipientes o portaobjetos positivos
Fucsina Fenicada sin filtrar
Aceite de inmersin contaminado
Decoloracin incorrecta.

Algunas razones que causan resultados falsos negativos son:
Errores al manejar la muestra o al registrar informacin
Mala calidad del esputo
Decoloracin excesiva
Lectura de menos de 100 campos microscpicos.

Figura 2: Pasos para la coloracin Ziehl Neelsen

1.- Calentamiento con Fucsina fenicada 2.- Lavado con agua 3.- Aplicacin de alcohol cido

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4.- Aplicacin de azul de metileno 5.- Lavado con agua 6.- Bacilos de Koch al microscopio
Responsabilidades:
Recibir las muestras para baciloscopas durante todo el horario de trabajo.
Efectuar las baciloscopas solicitadas en el mbito de su jurisdiccin.
Enviar muestras para cultivos segn las indicaciones implcitas de cultivo.
Entregar los resultados de las baciloscopas en forma oportuna.
Ser referencia para las Unidades Tomadoras de Muestras (UTM).
Coordinar con el laboratorio intermedio y/o Regional para la derivacin de muestras que
requieran tcnicas de mayor complejidad y calificar las muestras para ser derivadas a cultivo,
prueba de sensibilidad y otras de acuerdo a las indicaciones respectivas.
Remitir la informacin mensual al laboratorio intermedio y ESN-PCT del establecimiento de
salud.
Cumplir con las disposiciones para la conservacin, registro y envo de lminas para control
de calidad.
Cumplir con las normas de bioseguridad en su laboratorio.

BIOSEGURIDAD EN BACILOSCOPIAS

Descontaminacin de derrames de muestras de esputo

Se recomienda los siguientes procedimientos para la descontaminacin de derrames:

Evacuar al personal de laboratorio y aislar el rea para prevenir el ingreso de personas
ajenas.
Usar guantes, bata, zapatos con protector y respirador para actuar frente al accidente.
Saturar el papel o toalla absorbente con solucin acuosa de fenol al 5%.
Colocar las toallas empapadas en desinfectante sobre el rea donde se produjo el derrame y
dejar actuar por lo menos 30 minutos antes de sacar y eliminar.
Limpiar el rea con desinfectante y dejar secar
Poner todos los materiales desechables utilizados para la descontaminacin del derrame
dentro de un recipiente para riesgos biolgicos.
Manipular el material de la misma forma que otros desperdicios infecciosos.
Cuando se producen heridas por cortes o pinchazos con agujas o cristales rotos y existe la
posibilidad de que stos estn contaminados se deber lavar rpidamente el rea afectada con
jabn desinfectante y agua durante 15 minutos.
En caso de un accidente en una centrfuga en el cual no se hayan utilizado medidas de
seguridad (tubos sin proteccin con parafilm, para evitar aerosoles), se debe avisar
inmediatamente al resto del personal del rea para evacuar y sta deber aislarse para evitar
ingreso de otras personas.

Todos los accidentes o incidentes raros debern notificarse inmediatamente al jefe del laboratorio. Se
har el informe por escrito y se deber realizar una evaluacin de la ocurrencia a fin de evitar que se

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vuelva a repetir. Se deber informar a la Oficina de Epidemiologa, para el seguimiento del caso y de
instaurar tratamiento de ser necesario.

AISLAMIENTO
BACTERIANO

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CULTIVO BACTERIANO

La mayora de bacterias necesitan requerimientos nutricionales mnimos para poder desarrollarse,
otras son ms exigentes y requieren suplementos adicionales, as como condiciones atmosfricas
adecuadas (aerobiosis, anaerobiosis, microaerofilia), pH y temperatura ptima para su crecimiento.
Los medios se seleccionan de acuerdo al tipo de muestra, a la sospecha diagnstica., a la localizacin
de la infeccin o al tipo de bacteria a investigar (ver tabla N 2), la falta de estos datos puede llevar a
cometer errores durante el aislamiento bacteriano, invalidando la lectura, el estudio de antibiticos y
la interpretacin de los resultados.

Por lo tanto el cultivo bacteriano tiene tres propsitos:
1. Facilitar el desarrollo de grmenes, en la muestra a estudiar.
2. Aislar e identificar los grmenes causantes de infeccin y discriminar las contaminantes.
3. Realizar el estudio de sensibilidad y resistencia antibitica en los patgenos aislados.

SIEMBRA PRIMARIA:
La siembra primaria consiste en la inoculacin de una muestra a un medio de cultivo, que puede ser
slido como el agar (orinas, secreciones y otros), o bifsico (hemocultivo, mielocultivo, LCR).
Los medios que usamos de rutina son: Mac Conkey, Manitol salado y Agar sangre.
En caso de Hemocultivos o mielocultivos, usamos medio bifsico.
En caso de heces lquidas, usamos como medio selectivo para la siembra primaria el Agar S-S
cuando se solicita investigar salmonella o shigella, Agar TCBS para el vibrio cholerae, Agar Skirrow
para campylobacter (este ltimo requiere incubacin a 42C). Las heces slidas no se deben cultivar,
salvo que se desee estudiar algn brote epidmico, en este caso, se coloca 1gr., de heces, en caldo
selenito por 6-18 horas, como medio de enriquecimiento, antes de realizar la siembra en agar S-S.
Algunas secreciones o punta de catter deben ser colocadas en caldo thioglicolato como medio de
transporte y enriquecimiento, en el cual se favorecer el desarrollo de anaerobios, aerobios y
grmenes facultativos, teniendo cuidado de repicar en placa de agar, antes de las dos horas de
incubacin, para evitar el sobrecrecimiento bacteriano, ya que un mayor tiempo puede ocasionar que
un germen contaminante aparezca como causante de infeccin.
Los medios semislido se usan como medios de transporte (Cary Blair, Ammies) de algunas
muestras.

Materiales y equipos para siembra primaria o aislamiento bacteriano
a) Asa calibrada de platino o descartable de 0,001 mL (1 L), 0.005 mL (5L), 0,01 mL (10 L).
b) Estufa de 35 37 C.
c) Mechero Bunsen o cabina de flujo laminar.
d) Guantes de ltex.
e) Contenedor de material contaminado.
g) Placas de cultivo: Agar Sangre de carnero (AS), Agar Mc Conkey (MC), Agar manitol salado
(MS) o Agar Sabouraud (ASab) en caso se requiera aislar hongos.

Procedimiento
a. Mantener las muestras en refrigeracin (2-8 C) hasta su procesamiento por cultivo, a excepcin
del aislamiento de Neisseria spp., en la cual la refrigeracin las destruye, motivo por el cual el
cultivo debe realizarse antes de la hora de tomada la muestra.
b. Los cultivos deben realizarse en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero Bunsen.
c. Las placas para siembra deben estar a temperatura ambiente, sin humedad y deben rotularse.
d. Si el asa calibrada no es descartable, esterilizar el asa de siembra flamendola en el mechero
Bunsen hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa. No use asa caliente.

PRIMERA EDICION
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e. Tomar el frasco con la muestra de orina, abrir la tapa y flamear la boca del frasco en el mechero
Bunsen.
f. Tomar la muestra de orina con el asa de siembra estril introducindola y sacndola del frasco en
forma vertical (Figura 2a). Tapar el frasco con la muestra.
g. Inocular en el centro de la placa con AS a partir del cual se extiende la muestra, hacia delante y
hacia atrs (Figura 2b).
h. Luego, sin quemar el asa, el inculo se disemina uniformemente con trazos perpendiculares a la
siembra inicial en toda la placa (Figura 2c).
i. Proceder de la misma forma para el agar Mc Conkey.
j. Esterilizar el asa de siembra en el mechero.
k. Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia
arriba. Incubar la placa de AS y Mc Conkey a 35 37 C en condiciones aerbicas por 24 horas.

Tabla N 7: Medios de cultivo para siembra primaria

* No debe permanecer por ms de dos horas, para evitar posible contaminacin.
**Cuando se sospecha Salmonella o Shigella
***Cuando se sospecha infeccin por Vibrio cholerae
Leyenda: AS: Agar sangre, ACH: Agar chocolate, MC: Agar Mac Conkey, MS: Manitol salado,
SS: Salmonella-Shigella; TCBS: Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa, Sab: Agar Sabouraud, Selen: Caldo selenito, Thio/BHI:
Caldo thioglicolato infusin cerebro-corazn de buey.

AS ACh MC MS S-S TCBS Sab Selen Thio/BHI*
Aspi rado seno nasal X X X X
Bi opsi a X X X X X
Catter EV X X
Cepi l l ado bronqui al X X X X
Heces X X X** X*** X
Heri das, mordeduras X X X X
Lqui dos corporal es X X X X
Ori na X X X
Secreci n odo, ojos X X X X
Secreci n traqueo bronqui al X X X X
Secreci n gangl i onar X X X
Secreci n Farngea X X
Secreci n prostti ca X X X X
Secreci n Rectal X
Secreci n Uretral X
Secreci nVagi nal X X
Ul ceras, Abscesos X X X X
Agar Caldo
Tipo de muestra

PRIMERA EDICION
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Figura 3. Mtodo para introducir el asa calibrada en la muestra de orina para asegurar que se retire una
cantidad apropiada.

Figura 4. Siembra por estras en cuadrantes. Cada cuadrante representa una muestra diferente. Realizar un implante
transversal en el centro de la placa, de la parte ms ancha a la ms angosta con el asa y luego estriar en zigzag de la parte
ms ancha a la ms angosta en sentido perpendicular a la primera estra. til para cultivo de orina o secreciones

Tomado de Kayser, Medical Microbiology 2005 Thieme. All rights reserved. Usage subject to terms and conditions of license.

Figura 5. Siembra en una sola placa en caso de investigacin de salmonella u hongos.

LECTURA.

Realizar la evaluacin a las 24 horas, si no hay crecimiento bacteriano dejar incubar hasta las 48
horas, debido a que existen bacterias de crecimiento lento como acinetobacter, o micoplasma.

Para calcular el nmero de UFC/ml, se multiplica el nmero de colonias contadas en la placa de
cultivo y se multiplica por el factor del asa utilizada (tabla 5).

Para evitar errores, primero se debe anotar la muestra en el cuaderno de registro, y el nmero
correspondiente se debe anotar en el cuadrante de la placa, antes de realizar la siembra.
Los medios se seleccionan de acuerdo al tipo de muestra y de acuerdo a la sospecha diagnstica.
(Ver tabla N 4).

PRIMERA EDICION
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En caso de los cultivos de orina y de secreciones traqueo bronquiales, el nmero de colonias aisladas
es importante para la interpretacin clnica diagnstica de infeccin, por lo que se debe usar asa de
platino calibrada.

RECUENTO DE COLONIAS

a. El recuento de colonias se debe realizar en forma rutinaria en caso de muestras de orina y
secreciones traqueo bronquiales (aspirado con sonda, lavado broncoalveolar o cepillado
bronquial), debido a que son muestras que frecuentemente presentan grmenes en cantidades
pequeas, en forma de colonizacin o como contaminantes. En el estudio de otros lquidos
corporales o secreciones el recuento no es crtico, ya que normalmente son muestras aspticas y
la presencia de grmenes ya es patolgica.
b. En orina, recuento de colonias mayor a 10
5
UFC/mL, de una sola especie bacteriana indica
infeccin. Recuentos entre 10
3
-10
4
UFC/mL, indican infeccin si el procedimiento de
recoleccin de orina fue realizado correctamente, de lo contrario se puede tratar de una
contaminacin y se debe solicitar una nueva muestra. Recuentos menores a 10
3
UFC/mL, son
considerados negativos, salvo que sea una orina tomada por aspiracin suprapbica, en donde la
presencia de escasas colonias indica infeccin teniendo en cuenta que la vejiga es completamente
estril. Estos valores son vlidos tambin para las secreciones traqueobronquiales, con excepcin
del esputo.
c. En pacientes con sonda vesical, cuentas bacterianas menores de 10
5
UFC/mL pueden tener
significado, as como tambin se pueden encontrar bacteriurias polimicrobianas hasta en casi
15% de enfermos., pero generalmente, el aislamiento de tres o ms especies bacterianas indica
que la muestra pudo haberse contaminado por recoleccin inadecuada o demora en la siembra,
por lo cual se debe solicitar nueva muestra indicando al paciente una cuidadosa higiene.
d. Slo en casos de urocultivos se debe trabajar con asa calibrada de 1 L 5 L. A excepcin de
aquellas procedentes de aspirados suprapbicos en nios o en caso de pacientes con tratamiento
antimicrobiano, cuyas muestras deben inocularn con asas de 0,01 mL (10 l) debido a que en
dichos pacientes pueden haber infecciones del tracto urinario asociados a recuentos menores de
10
5
UFC/mL.
e. En caso de otras muestras como secreciones, LCR, lquido sinovial, etc, se debe usar asa
calibrada de 10 L., con la finalidad de tener mayor posibilidad de hallar bacterias.
f. Cuando se desea investigar bacterias difciles de aislar, se debe usar medios enriquecidos o
medios selectivos.
g. De no contar con asa calibrada, se puede utilizar micropipeta calibrada de 1L, 5 L, 10 L.
h. En caso de orina y secreciones traqueobronquiales, lavados broncoalveolares, cepillados
bronquiales, es necesario realizar recuento de colonias para ello se usa el factor de multiplicacin
segn el tipo de asa calibrada usada, como se describe en la tabla 6.
i. En caso de secreciones traqueobronquiales es mejor manejar los criterios del protocolo Q score
para realizar el cultivo o rechazar la muestra o para validar el resultado del cultivo. Ver tabla N
6 (pgina 26) y las tcnicas de cultivo deben orientarse al aislamiento e identificacin de S.
pnumoniae, S. aureus, Ps. aeruginosa y enterobacterias. No se recomienda reportar la presencia
de levaduras, ya que estas siempre son contaminantes de las secreciones traqueobronquiales.

Tabla N 6: Asa calibrada y factor de multiplicacin, ejemplo de resultados.

Capacidad del asa Factor de multiplicacin N hallado UFC/mL
1 L 1000 102 102,000
5 L 200 550 110,000
10 L 100 1200 120,000

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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39
UFC= Unidades formadoras de colonias

IDENTIFICACION
BACTERIANA

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
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40
IDENTIFICACION BACTERIANA BASADA EN LA COLORACION GRAM:

En la identificacin bacteriana es necesario considerar las caractersticas macroscpicas de las
colonias teniendo en cuenta el medio de aislamiento original y sus caractersticas microscpicas para
poder elegir las pruebas diferenciales correspondientes. Para ello usamos la coloracin Gram.

GERMENES GRAM POSITIVOS

Grfico 2 .-

GERMENES GRAM NEGATIVOS

Grfico 3.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

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41
IDENTIFICACIN BACTERIANA BASADA EN LA MORFOLOGA DE LA COLONIA Y
LAS CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS

IDENTIFICACION BACTERIANA DE COCOS GRAM POSITIVOS:
Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus

Objetivo
Describir los procedimientos para la identificacin de Cocos Gram positivos: Staphylococcus,
streptococcus y Enterococcus, aisladas a partir de muestras clnicas.

Condiciones generales
a. La primera consideracin prctica a tomar en cuenta es determinar, si un aislamiento es
estafilococo, estreptococo o enterococo. Esta diferenciacin se realiza en base a la morfologa de
la colonia, tipo de hemlisis, forma de las bacterias por coloracin Gram a partir de un cultivo y
de la prueba de reaccin de la catalasa.
b. Las colonias de estafilococos son comnmente grandes (2 a 3mm a las 24 horas), convexas,
lisas, enteras, opacas y con frecuencia pigmentadas, a diferencia de las colonias de estreptococos
y enterococos que son ms pequeas (menos de 2 mm de dimetro), puntiformes, con aspecto
translcido a semiopaco.
c. Los estafilococos pueden ser fuertemente - hemolticos en agar sangre de carnero, pero las
zonas de hemlisis son menores en relacin al tamao de las colonias que las generadas por los
enterococos y estreptococos hemolticos.
d. Staphylococcus aureus se encuentran en furnculos, carbuncos, imptigo, heridas, sinusitis, otitis
media, mastitis, osteomielitis, neumona post influenza, sepsis, sndrome del shock txico,
intoxicacin alimenticia, dermatitis exfoliativa (sndrome de piel escaldada o enfermedad del
paal).
e. Staphylococcus epidermidis, se encuentra con frecuencia como infeccin oportunista en
pacientes inmunolgicamente disminuidos y en infecciones por cuerpo extrao (incluye: catter
endovenoso, catter de dilisis peritoneal continua ambulatoria, endoprotesis de metal, y
tornillos en osteosntesis, marcapasos cardacos, vlvula cardacas artificiales, shunt valvular.
f. Staphylococcus saprophyticus se halla en infecciones urinarias en mujeres jvenes y
ocasionalmente en uretritis no especfica en varones.

IDENTIFICACIN DE ESTAFILOCOCOS.

Lectura de Cultivos en Agar sangre, Manitol Salado o Agar Chapman Stone.

a) Morfologa de las colonias:
En manitol salado:
Las colonias de la mayora de Staphylococcus son lisas, enteras, algo elevadas, algunas
producen pigmento. Miden aproximadamente de 1-3 mm de dimetro a las 24 horas.

Las colonias de Staphylococcus aureus normalmente son grandes, stas siguen desarrollando
si se deja e incuban por tres das a 34 - 37 C, llegando a medir 3-8 mm. Son de borde
entero, de superficie lisa, la mayora de ellas viran la manita por lo que presentan un
pigmento que va desde el amarillo crema hasta el naranja.

Las colonias de Staphylococcus epidermidis son algo ms pequeas, No viran la manita, por
lo que las colonias son de color blanquecino.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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42
Las colonias de Staphylococcus saprophyticus son ms grandes que S. epidermidis, son
lustrosas y ms convexas que otras colonias de estafilococos. Al igual que el staphylococcus
aureus vira la manita por lo que las colonias son de color amarillento.

En agar sangre:
La presencia de colonias grandes, con evidente signo de hemlisis sugiere una especie
hemoltica de estafilococo, en cambio colonias pequeas puntiformes -hemolticas, sugiere
presencia de estreptococos. La presencia de colonias planas - hemolticas sugiere la
presencia de Streptococcus pneumoniae.

b) Coloracin Gram (ver mtodo de Coloracin Gram, pgina23)
Los estafilococos se observan como cocos Gram positivos formando racimos, aunque tambin se
pueden observar formando pares, sobre todo en secreciones, pudiendo confundirse con
Streptococcus o Enterococcus, que tambin se encuentran formando pares, para ello se debe
realizar la prueba de catalasa, siendo el estafilococo catalasa positivo, en cambio el
Streptococcus y Enterococcus son catalasa negativos.

c) Prueba de la catalasa
Esta enzima se encuentra en el gnero staphylococcus, y su funcin es descomponer el perxido
de hidrgeno en agua y oxgeno, formando burbujas o espuma.
Reactivo
Perxido de hidrgeno 3%
Procedimiento
Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas y colocar sobre
un portaobjetos limpio.
Agregar una gota de H
2
O
2
al 3% in situ, usando un gotero o pipeta Pasteur. No es necesario
mezclar el cultivo con el H
2
O
2.

Observar una inmediata efervescencia (formacin de burbujas) lo que indica una prueba
positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa.
Desechar el portaobjetos colocndolo en un desinfectante.
Realizar este procedimiento en forma paralela con cepas controles:
- Control positivo : Staphylococcus aureus
- Control negativo: Streptococcus spp.
Observaciones a la prueba catalasa:
Si se coge la colonia sospechosa, del agar sangre, evitar contaminarla con sangre, ya que los
glbulos rojos tienen la enzima catalasa y puede dar resultado falso positivo.
No invertir el orden del mtodo porque pueden producirse resultados falsos positivos.
A todas las cepas catalasa positivas, se les debe realizar la prueba de la coagulasa, para
determinar si el organismo es o no Staphylococcus aureus.

d) Prueba de la coagulasa

La coagulasa es una enzima que convierte el fibringeno en fibrina, es producida por el
Staphylococcus aureus, y se puede encontrar en forma fija (unida a la pared celular) o en forma
libre. Existen dos mtodos de deteccin:
Prueba en lmina o Factor de aglutinacin (Factor Clumping), se usa como prueba de
tamizaje. El staphyloccoccus ludgunensis y el schleiferi, dan positivo a esta prueba, y un 10-
15% de Staphylococcus aureus, dan resultado negativo, o reaccin retardada (mayor de 20
segundos). Si es negativa se debe repetir con la prueba en tubo.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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43
Procedimiento: Homogenizar bien, varias colonias de staphylococcus en 0.5 ml de solucin
salina fisiolgica, observar macroscopicamente que no existan grumos o precipitados. Una vez
homogenizado, tomar dos gotas y colocarlas separadas en una lmina portaobjeto, marcarlas
como M (muestra) y C (control), a la muestra se le agrega una gota de Plasma citratado o con
EDTA, al control se le agrega una gota se solucin salina fisiolgica. Mezclar por rotacin o en
vaivn, inclinando el portaobjetos hacia uno y otro lado observando la formacin inmediata de
un precipitado granular o de grumos blancos. Una reaccin positiva se detecta usualmente en 15
a 20 segundos por la aparicin del precipitado granular, la prueba se considera negativa si no de
observa aglutinacin al cabo de 2 a 3 minutos. El efecto de aglutinacin debe verse a contraluz o
al microscopio con lente 10x. La muestra control no debe presentar aglutinacin.
Prueba en tubo: detecta coagulasa libre y la fija. Es definitiva y confirmatoria.
Procedimiento:
- A la suspensin realizada en tubo para la prueba en lmina, se le agrega 0. 5 ml de
plasma citratado o con EDTA y se incuba a 35 C (en estufa o bao mara de
preferencia).
- Observar la formacin de cogulo inclinando lentamente el tubo (sin agitar) en intervalos
de una hora, 4 horas y 24 horas. Cualquier grado de coagulacin (fragmentos de fibrina)
es una prueba positiva. La mayora del S. aureus formarn cogulo dentro de una hora y
otras pueden requerir ms de cuatro horas para la formacin de cogulo. Considerar que
Staphylococcus produce fibrinolisina, la cual puede lisar el cogulo, por lo que la
observacin mayor de 24 horas puede dar resultado negativo.

Reactivo
Plasma humano anti coagulado con citrato de sodio al 3.2% (9 partes de sangre total + una
parte de citrato), libre de patgenos, con capacidad de coagulacin y que carezca de
inhibidores. Existen plasmas comerciales de conejo (en este caso seguir las instrucciones del
fabricante)

Observaciones a la prueba de la coagulasa:
Realizar el control de calidad del reactivo utilizando controles positivos y negativos. Si es
coagulasa positiva se identifica como Staphylococcus aureus.
Si son estafilococos coagulasa negativos, realizar las pruebas de resistencia a la polimixina B
(S. epidermidis) y resistencia a novobiocina (S. saprophyticus).
Controles:
Positivo: S. aureus
Negativo: S. epidermidis o S. saprophyticus

Tabla 9.- Principales caractersticas fenotpicas de las especies de Staphylococcus.

Pigmento
de colonia
Hemolisis
(*)
Coagulasa
Factor de
aglutinacin
Novobiocina Polimixina B
Ornitina
descarboxilasa
Acidez de
manitol
S. aureus
+ +
1
+ + S R - +
S. epidermidis
- (d)
4
- - S R d -
S. haemolyticus
d (+)
3
- - S S - d
S. lugdunensis
d (+)
3
- (+)
2
S d + -
S. saprophyticus
d -
5
- - R S - d
S. schleiferi
- (+)
3
- + S S - -
S. warneri
d (d)
4
- - S S - d

+, 90% o ms especies, o cepas positivas
-, 90% o ms especies, o cepas negativas
d, 11% - 89% de especies o cepas positivas

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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(*), En agar sangre de carnero
+
1
, Zona amplia de hemlisis dentro de 24 - 36 horas.
(+)
2
, Reaccin retardada
(+)
3
, Hemlisis retardada, de una zona moderada a amplia dentro de las 48 - 72 horas
(d)
4
, No hay hemlisis o es retardada
-
5
, No hay hemlisis o hay una zona muy angosta (1 mm) dentro de las 72 horas. Algunas de las cepas pueden
producir un ligero color verdusco o marrn en agar sangre de carnero.
S, sensible; R, resistente
Fuente: Kloos W, Bannerman T. Staphylococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clinical
Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 264 282.

e) Resistencia a la novobiocina

(5 g por disco)
[2)
y polimixina B (300 U por disco)
[2]

La resistencia a novobiocina es intrnseca en S. saprophyticus, por lo que es una prueba til para su
diagnstico. Un halo <16 mm es resistente a la novobiocina, un halo >16 mm, indica sensibilidad.

La resistencia a la Polimixina B vara de acuerdo a las diferentes cepas de Staphylococccus, siendo el
S. aureus y S. epidermidis resistentes a ella (ver tabla 7). Un halo <20 mm, indica resistencia a
Polimixina B y un halo >20 mm, indica sensibilidad.

Resultados:
Comparar los resultados con la tabla 7 que muestra las principales caractersticas de S. aureus y
Staphylococcus coagulasa negativos comnmente asociados con infecciones.

Nota: Las identificaciones de los estafilococos coagulasa negativos son presuntivas y deben ser
confirmadas en el Laboratorio Referencial.

Grfico 4.- Algoritmo diferencial para cocos Gram positivos

IDENTIFICACIN DE ESTREPTOCOCOS.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

45
45
La familia Streptococcaceae son grmenes Gram positivos, algunos presentan cpsula, se caracteriza
por la forma cocoide o cocobacilar, forman cadenas en medios lquidos y secreciones (a excepcin
de Aerococcus), y a veces tienen la forma de racimos en la coloracin Gram obtenida de medios de
cultivo slidos, semejando a Staphylococcus por lo que la prueba de catalasa es muy importante,
siendo el Staphylococcus, catalasa positivo y el Streptococcus catalasa negativo. (ver tabla 8).
Son aerobios y anaerobios facultativos, crecen en Agar sangre de carnero al 5% y mejor con CO
2
al
10% a 37C. Son de crecimiento lento por lo que requieren de 24 a 48 horas de incubacin, las
colonias son pequeas, apenas visibles a simple vista, planas, consistentes y algunas especies
presentar halo hemoltico alfa o beta, las colonias gamma no presentan hemlisis.
Las especies del gnero Enterococcus, son poco exigentes y crecen en medios carentes de sangre.
Para el aislamiento se puede usar caldos enriquecidos que disminuyen la flora acompaante (Todd
Hewitt, caldo SF, bio streptosel, etc.) o medios con inhibidores, que contienen antibiticos para
evitar el desarrollo de otros grmenes (Agar sangre CNA con base Columbia o TSA con cido
nalidxico y colistina). Otros medios usados son el SSA de B&D, que es selectivo para Streptococcus
-hemolticos de los grupos A y B, y el medio CPS de Biomerieux, que incluye un sustrato
susceptible de ser hidrolizado por la esculinasa (-glucosidasa) de los enterococcus

Clasificacin de los estreptococos

Existen 7 gneros: Aerococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, y
Streptococcus (tabla 8), que se clasifican segn el tipo de hemlisis (tabla 9)

Tabla 10.- Gneros de Streptococcus (cocos Gram positivos, catalasa negativos)

(1) La excepcin es Streptococcus pyogenes, que es PYR positivo.

Tabla 11.- Diferenciacin de Streptococcus, segn el tipo de hemlisis
Tipo de Hemlisis
Gnero Alfa Beta Gamma
Streptocccus pyogenes* No Siempre No
Streptococcus agalactiae* No Generalmente A veces
Streptococcus bovis* A veces A veces Generalmente
Streptococcus pneumoniae* Siempre No No
Streptococcus grupo viridans Generalmente No No
Enterococcus faecalis Rara vez A veces Generalmente

-hemolticos: Hemlisis parcial, color verdosa, son patgenos*
-hemolticos: Hemlisis total, zona incolora clara, bien definida, son patgenos*
-hemolticos, sin hemlisis, o no hemolticos, generalmente son saprfitos

El medio recomendado para investigar S. pneumoniae y otros Streptococcus spp. es el agar Mueller-
Hinton suplementado con 5% de sangre de cordero desfibrinada, el cual sirve para el aislamiento y
Genero Aerococcus Enterococcus Gemella Lactococcus Streptococcus Leuconostoc Pediococcus
Vancomicina Sensible Sensible Sensible Sensible Sensible Resistente Resistente
Agrupacin en
medio Lquido
Racimos Cadenas cadenas Cadenas cadenas Cadenas Racimos
PYR Positivo Positivo Negativo (1) Negativo
Crecimiento
ClNa 6.5%
Positivo Negativo
Crecimiento
a 10C
Positivo Negativo

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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46
para el estudio de antibiticos. Tambin sirve para estudio de sensibilidad de Corynebacterium. En
cepas de Neisseria y Haemophilus se debe seguir las recomendaciones del Clinical Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2007).
De las 65 especies de estreptococos, solo cuatro tienen importancia clnica: y son: Streptococcus
pyogenes, Streptococcus agalactia, Streptococcus bovis y Streptococcus pneumoniae.

Las especies menos significativas se agrupan con la denominacin de estreptococos del grupo
viridans.
Los enterococos ms importantes son: Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium

Tabla 12.- Identificacin bioqumica de Streptococcus
Identificacin
Hidrlisis Sensibilidad Otras pruebas
Hip Esc PyR Bac Opt SXT CAMP ClNa Hemlisis
S. pyogenes - - + + - - - - Beta
S. agalactiae + - - - - - + + Beta
Otros hemol (C,F,G) - - - - - + - - Beta
S. bovis - + - - - + - - No
Grupo viridans - - - - - + - - No
Grupo milleri - + - - - - - - Variable
S. pneumoniae - - - +* - - Alfa
Enterococcus - + + - - - - + No
*La prueba de la optoquina debe realizarse en atmosfera con CO2, y para considerarla sensible el halo de inhibicin debe
ser 14 mm, existiendo un 3-5% de S. pneumoniae resistentes a optoquina.

Tabla N13. Identificacin de Streptococcus Beta hemolticos

Tabla 14. Identificacin de estreptococos del grupo viridans.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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Clasificacin de los estreptococos segn sus antgenos especficos (grupos de Lancefield)
Los estreptococos poseen unos antgenos especficos de naturaleza hidrocarbonada, que pueden ser
puestos de manifiesto mediante diversas tcnicas inmunolgicas, como la aglutinacin.
Los antgenos se nombran con letras del alfabeto correlativas desde la A hasta la V. Adems existe
un grupo denominado de estreptococos no agrupables donde se incluyen aquellas especies en las que
no ha podido ser demostrado ninguno de estos antgenos.
Los grupos antignicos ms importantes son los grupos A, B y D, seguidos de C, F y G. Algunos
estreptococos, como S. pneumoniae no poseen antgenos de Lancefield demostrables. Los
estreptococos no agrupables y alfa hemolticos se conocen con el nombre de estreptococos viridans,
denominacin que no identifica a una especie sino a un conjunto de ellas. Los enterococos se
incluyen dentro del grupo D de los estreptococos.

Tabla 15.- Clasificacin combinada de estreptococos y enterococos

Grafico 5.- Diagrama de flujo para identificacin de Streptococcus pneumoniae

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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Interpretacin de la combinacin de las pruebas de optoquina y de solubilidad en bilis para la
identificacin del neumococo
Los siguientes resultados de las pruebas de optoquina y de solubilidad en bilis se usan comnmente
para hacer una identificacin exacta y conveniente de aislamientos de S. pneumoniae (neumococo).
Una cepa que exhiba una zona de inhibicin para optoquina 14 mm (con un disco de 6 mm
y 5 g) es un neumococo.
Una cepa que exhiba una zona de inhibicin pequea pero definida para optoquina (de 9 a 13
mm con un disco de 6 mm y 5 g) que tambin sea soluble en bilis es un neumococo.
Los siguientes resultados se deben interpretar como negativos para S. pneumoniae (y positivo para
estreptococo viridans).
Una cepa con una zona pequea de inhibicin para optoquina (8 mm con un disco de 6 mm
y 5 g) que no sea soluble en bilis no es un neumococo. (Las colonias pueden ser
identificadas como estreptococos viridans.)
Las cepas que no tienen zonas de inhibicin para la optoquina no son neumococos. (Las
colonias pueden ser identificadas como estreptococos viridans.)

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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49
IDENTIFICACIN DE ENTEROCOCCUS:

Los Enterococcus son grmenes Gram positivos, anaerobios facultativos y su crecimiento
ptimo es a 35 C. Muchas cepas crecen a 10 y 45 C. Se debe realizar la prueba de la
optoquina, para descartar infeccin a Estreptococcus pneumoniae.

Lectura de cultivos en Agar sangre de carnero y Agar Columbia CNA

a) Apariencia de las colonias
Usualmente son alfa hemolticas o no hemolticas en agar sangre de carnero 5% aunque
tambin puede haber especies beta hemolticas como algunas cepas de E. durans.

b) Coloracin Gram
En los frotices tomados del agar sangre o secreciones, se observan como cocos Gram
positivos en forma aislada, en pares, cadenas cortas, o cocobacilar. En los frotices realizados
Gram a partir de caldo thioglicolato se pueden ver en forma de cadenas o rosario.

Tabla 16.- Principales caractersticas fenotpicas de cocos Gram positivos en cadena, catalasa negativos

Bilis esculina ClNa 6.5%
Crecimiento
Hemlisis
10C 45C
Enterococcus + + + + , , n
Streptococcus -
a
-
b
- V , , n
Lactococcus + V + V , n
Vagococcus + + + V , n

a, de los estreptococos viridans 5% a 10% son bilis esculina positivas
b, algunos estreptococos b hemolticos crecen en ClNa al 6.5%
n, no hemoltico
+, 95% reacciones positivas
-, 5% reacciones positivas
V, reacciones variables

c) Prueba de la catalasa (pag 40)
Enterococcus es catalasa negativo. Algunas veces se produce una seudo catalasa y se puede
observar una dbil efervescencia, esto ocurre cuando E. faecalis se desarrolla en medios que
contienen sangre,

en este caso subcultivar la colonia en estudio en TSA o agar Mueller Hinton y
repetir la prueba.

d) Prueba de la esculina en medio con bilis
Para determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucsido esculina en
esculetina y glucosa, en presencia de bilis (Foto N 5).

Procedimiento
a) Inocular el cultivo en estudio haciendo estras sobre la superficie del pico de flauta o de la
placa de agar bilis esculina.
b) Incubar a 35 37 C hasta 72 horas.
c) Se puede controlar peridicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de informar como
negativo.
Lectura:
Positivo: En tubo: Ennegrecimiento difuso en el agar inclinado
En placa: Se observa un halo negro o marrn alrededor de las colonias en la placa.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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Negativo: No se produce ennegrecimiento del medio o ennegrecimiento de menos de la mitad
del tubo despus de 72 horas de incubacin.
Controles
Control negativo: Staphylococcus aureus
Control positivo: Enterococcus spp

e) Tolerancia al cloruro de sodio
Para determinar la facultad de un organismo de desarrollar en presencia de una
concentracin de 6.5 % de cloruro de sodio.

Procedimiento
a) Inocular en el caldo TSB con cloruro de sodio un cultivo de 18 - 24 horas de incubacin.
b) Incubar a 35 37 C por 24 horas.
c) Se puede controlar peridicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de informar como
negativo.

Lectura:
Positivo: Hay desarrollo bacteriano
Negativo: No se observa crecimiento en el caldo

Controles
Control negativo: Escherichia coli
Control positivo: Staphylococcus aureus

Observar el oscurecimiento del agar indicando si hubo hidrlisis de la esculina y el
crecimiento en el caldo con cloruro de sodio. Con estas pruebas tenemos dos identificaciones
presuntivas posibles:

Casi todos los enterococos (95%) son esculina positivos y crecen en medios con 6.5% de
cloruro de sodio produciendo acidez y 5% a 10% de Streptococcus del grupo viridans
son bilis esculina positivos.

NOTA: Una vez que se ha establecido que el microorganismo en estudio es
presuntivamente un Enterococcus o un gnero cercano a l (Lactococcus o Vagococcus)
se puede hacer la identificacin de las especies de acuerdo a la Tabla N 8.

f) Crecimiento en telurito de potasio

Es til para la identificacin presuntiva de E. faecalis (Foto N 6).
Procedimiento:
a) Sembrar la cepa en estudio en TSA con 0.04% de telurito de potasio.
b) Incubar a 35 37 C. Si hay desarrollo de colonias negras se identifica
presuntivamente como E. faecalis.

g) Metabolismo de carbohidratos
Sembrar en caldo para fermentacin de carbohidratos con manitol, sorbosa, rafinosa, sorbitol y
arabinosa, y en caldo base descarboxilasa con arginina.

Procedimiento:

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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51
a) A partir de un cultivo puro de 24 horas inocular los caldos conteniendo los diferentes
carbohidratos con las colonias sospechosas cultivos puros.
b) Incubar a 35 37 C hasta por 4 das.

Lectura
a) Positivo: Viraje de color hacia el amarillo (indicador prpura de bromocresol), indica
produccin de acidez .
b) Negativo: No hay viraje de color.

b) Descarboxilacin de la arginina
Se usa el medio diferencial LIA.

Tabla 17. Principales caractersticas fenotpicas usadas para la identificacin de Enterococcus de mayor importancia clnica
y gneros relacionado
Telurito Manitol Sorbosa Arginina Arabinosa Rafinosa Sorbitol
E. avium - + + - + - +
E. raffinosus - + + - + + +
E. saccharolyticus - + + - - + +
E. faecalis + + * - + * - - +
E. faecium - + * - + + v v
E. durans - - - + - - -
E. hirae - - - + - v -
E. gallinarum - + * - + * + + -
E. mundtii - + - + + + v
Lactococcus - + - + - - +

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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52
IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES

Objetivo
Describir los procedimientos de cultivos e identificacin de bacilos Gram negativos
fermentadores: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter, Proteus, Salmonella,
etc., y bacilos no fermentadores: Pseudomona, Acinetobacter, Bukholdiera, etc.

Condiciones Generales
Las bacterias Gram negativas fermentadoras y no fermentadoras se desarrollan en agar
sangre de carnero y agar Mc Conkey, pero en agar sangre de carnero no podemos hacer
mayor diferenciacin entre las colonias, sin embargo, en el agar Mc Conkey podemos
diferenciar las colonias lactosa positivas (color fucsia) y lactosa negativas (colonias rosadas).

Aspecto de las colonias en los diferentes medios
Agar Mc Conkey
La mayora de cepas de Escherichia coli, son lactosa positiva (color fucsia), de borde entero,
opaco, de 2-3 mm de dimetro, usualmente rodeadas de una zona opaca alrededor de la
colonia (bilis precipitada). Existen cepas de E. coli que son lactosa negativas, por lo que las
colonias son incoloras y miden de 3-4 mm de dimetro.
Las cepas de Klebsiella pneumoniae son colonias de borde entero, de color rosado a rosado
oscuro, de 3 mm de dimetro y mucoides.
Las cepas de Enterobacter spp., dan colonias de borde entero, color rosado de 2-4 mm de
dimetro, no tan mucoides como K. pneumoniae.
Todas las colonias deben ser subcultivadas en medios diferenciales.

Aspecto de las colonias
Salmonella, Shigella Incoloras, medio amarillo
Enterobacter, Klebsiella Grandes, rosadas a rojo, mucosas
Escherichia Rojas, halo turbio
Proteus Incoloras

Agar SS
Es un medio selectivo para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de materia fecal,
alimentos y animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve tambin para
Y. enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La
presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentracin de tiosulfato y el citrato inhiben la
flora acompaante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formacin de sulfuro de
hierro. La degradacin de la lactosa a cido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo.

Salmonella Inncoloras, transparentes, centro negro
Shigella Incoloras, transparentes, medio amarillo
Proteus Transparentes, centro rojo, medio amarillo
Escherichia coli Rosadas a rojo, medio rojo
Enterobacter aerogenes Rosadas a crema, opacas, mucosas
Bacterias lactosa + Rojizas, mucoides, centro negro

Agar XLD
Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella.
La degradacin de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al
amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la produccin de sulfdrico. La
decarboxilacin de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo prpura

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciacin de Salmonella/Shigella
de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentacin de xilosa, decarboxilacin de
lisina y produccin de sulfdrico. La xilosa diferencia Shigella de Providencia que no fermenta
xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella de los fermentadores de xilosa
no patgenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los coliformes lisina positiva
reviertan la condicin alcalina de los microorganismos consumidores rpidos de xilosa/lisina. La
produccin de sulfdrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en
condiciones cidas la precipitacin negra se inhibe.
El medio contiene: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato,
tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, rojo fenol, sales.
El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede
eliminarse por filtracin.

E. coli, Enterobacter Amarilla, opacas, con precipitado
Aeromonas Amarilla, opacas, con precipitado
Klebsiella Amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado
Citrobacter Amarilla, opacas, centro negro
Serrati, Hafnia Amarilla, opacas
P. vulgaris, P. mirabilis Amarilla, translcidas, centro negro
Salmonella Iigual color del medio, centro negro
Shigella, Providencia Igual color del medio, translcidas
S. Typhi Amarilla, ligeramente opacas

Agar Sangre.
En agar sangre la apariencia de colonias opacas, convexas, color amarillo grisceo, sugiere la
presencia de enterobacterias. Colonias lisas diseminadas con pigmento color verdoso sugiere
la presencia de pseudomona aeruginosa, en cambio un desarrollo bacteriano profuso a
manera de olas, sugiere la presencia de proteus mirabilis o vulgaris.
La presencia de colonias grandes mucoides sugiere la presencia de klebsiella.

Pruebas bioqumicas
a) Utilizacin de lactosa.
b) Utilizacin de glucosa.
c) Produccin de gas de glucosa.
d) Descarboxilacin de lisina.
e) Produccin de cido sulfhdrico.
f) Utilizacin del citrato.
g) Produccin de ureasa.
h) Prueba MR.
i) Prueba VP.
j) Motilidad.
k) Produccin de indol.

Procedimiento
a) Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mc Conkey.
b) Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero de Bunsen.
c) Enfriar el asa
d) Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del medio de
cultivo ni otra colonia vecina.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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e) Sembrar por estra en los medios diferenciales empezando por el agar citrato, urea (en la
superficie), TSI, LIA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo, retirar por
el mismo trazo y sembrar en estra la parte inclinada).
f) Sembrar en caldo para la prueba de Indol, MRVP.
g) Sembrar en medio MIO, por puntura en el centro del agar hasta una profundidad aproximada de
1.5 cm.
h) Incubar a 35 37 C de 18 a 24 horas.

INTERPRETACION

a) Agar TSI (triple azcar y hierro)
Es importante hacer la lectura entre las 18 24 horas para no obtener resultados errneos.
La lectura se hace sobre la base de tres caractersticas:
a) Utilizacin de hidratos de carbono
Utilizacin de lactosa: Reaccin cida en el pico de flauta de color amarillo (A).
Utilizacin de glucosa: Reaccin cida en la columna del medio de color amarillo (A).
No hay utilizacin del carbohidrato: Se puede observar una reaccin alcalina de (K), o que
no hay cambio de color, permanece del mismo color que el medio no inoculado (N).
b) Produccin de gas de glucosa:
Se considera positivo la presencia de una sola o mltiples burbujas de gas, divisin del
medio, desplazamiento completo del medio del fondo del tubo dejando un rea clara o una
ligera muesca del medio en el costado del tubo, observndose como partido o abierto.
Se registra la lectura por medio de cruces: (+, ++, +++).
c) Produccin de cido sulfhdrico:
Se manifiesta por un color negro distribuido por toda la columna del medio de cultivo o
slo en la parte superior.
Se registra la lectura por medio de cruces (+, ++, +++) y cuando la produccin de H
2
S es
abundante, puede ocultar la acidez.

Resultados:
A/A + +: Indica Acidez en la inclinacin (fermentacin de lactosa) y acidez en el fondo
(fermentacin de glucosa), gas positivo, H
2
S positivo.
K/A - +: Indica alcalinidad en la inclinacin y acidez en el fondo, gas negativo y H2S
positivo.
N/N - - : Significa que no hay utilizacin de la lactosa y glucosa, gas e H
2
S negativos.

Tabla 18.- Caractersticas bioqumicas de algunas bacterias Gram negativas
Controles Columna vertical (fondo) Superficie inclinada
(pico de flauta)
Lectura
E. coli (lactosa +) Amarillo /gas/sin H
2
S amarillo A/A +, -
Shigella Amarillo /sin gas/sin H
2
S rojo A/N -, -
Salmonella paratyphi B Amarillo /con gas/ con H
2
S rojo A/N, +, +
Pseudomona aeruginosa Sin cambio Sin cambio N/N-- , K/K - -

Recomendaciones
Si se observa que no hay cambio de color en el tubo hasta las 24 horas seguir incubando
hasta las 48 horas. Si no se observa viraje de color y hay desarrollo, se trata de una bacteria
no fermentadora.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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55
Especie
Superficie
inclinada
Fondo Gas H
2
S
Enterobacter A K ++ -
Hafnia K A + -
Klebsiella A A ++ -
E. coli A A + -
Shigella K A - -
Salmonella Typhi K A - +
Salmonella Paratyphi K A + -
S choleraesuis K A + -
Otras salmonellas K A + +++
Citrobacter K A + +++
Edwarsiella K A + +++
Serratia K A - -
Proteus vulgaris K A + +++
Proteus mirabilis K A + +++
Proteus morganii K A - -
Proteus rettgeri K A - -
Providence K A + o - -
TSI PRUEBAS BIOQUMICAS

Tabla 19.-Caractersticas bioqumicas de enterobacterias en TSI

Fig 6.- Imgenes de medio diferencial en TSI, A/A: acidez en la parte inclinada y en el fondo, K/A, alcalinidad en en la
parte inclinada y acidez en el fondo, N/N, no fermentacin. El color negro indica presencia de hidrgeno sulfurado y la
presencia de gas se manifiesta por el espacio en el fondo..

b) Agar Lisina Hierro

En este medio se determina simultneamente la produccin de lisina descarboxilasa y la
formacin de cido sulfhdrico (H
2
S).
Lectura
Es importante hacer la lectura entre las 18 24 horas; si la lectura se realiza antes podemos
obtener resultados falsos negativos, si se lee despus de las 24 horas puede haber falsos
positivos, ya que puede haber alcalinizacin en la superficie del medio y por lo tanto
producir un viraje hacia el color prpura o violeta.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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56

Realizar la lectura en la columna y en la superficie inclinada y observar la formacin de
cido sulfhdrico el cual se evidencia por una coloracin negra.

NOTA: Generalmente las cepas del grupo Proteus y Providencia, desaminan la lisina a cido
cetocarbnico. Este ltimo forma compuestos pardo rojizos en la regin superficial del medio de
cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia del oxigeno.

Tabla 20.- Reaccin bioqumica en LIA
Prueba Reaccin positiva Reaccin negativa
Produccin de H2S
Produccin de H2S Formacin de un
precipitado negro en la superficie
No hay formacin de
precipitado negro
Descarboxilacin de la Lisina
Fondo y superficie del medio
de color prpura (alcalino) K/K
Superficie prpura (alcalina),
Fondo amarillo (cido) K/A
Desaminacin de la Lisina Superficie roja* Superficie prpura
* Proteus y Providence producen cultivos con superficie roja sobre fondo amarillo

Tabla 21.- Caractersticas bioqumicas en LIA

Fig. 8.- Caractersticas en LIA

c) Agar citrato de Simmons
Para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de
carbono para su metabolismo.
Lectura: Leer entre 24 a 48 horas, algunos casos es necesaria incubar hasta por 4 das.
Resultado
Especie
Superficie
inclinada
Fondo Gas H
2
S
E. coli K K o N - o + -
Shigella K A - -
Salmonella Typhi K K -
Salmonella Paratyphi K A + o -
Otras salmonellas K K o N - +
Arizona K K o N - +
Citrobacter K A - o +
Edwarsiella K K - o + +
Klebsiella K K o N + o - -
Enterobacter cloacae K A + o - -
Enterobacter aerogenes K K o N + -
Enterobacter hafnia K K o N - o + -
Proteus vulgaris R A - -
Proteus mirabilis R A - -
Proteus morganii K o R A - -
Proteus rettgeri R A - -
Providence R A - -
LIA PRUEBAS BIOQUMICAS

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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57
a) Prueba positiva: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta, o presencia
de colonias en ausencia del color azul.
b) Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color (verde)
Controles
Positivo: Enterobacter clocae.
Negativo: Escherichia coli.
d) Hidrlisis de la urea (produccin de ureasa)
Es til para determinar la capacidad de un organismo de degradar la urea, formando dos
molculas de amoniaco por accin de la enzima ureasa.
Lectura: Leer entre 18 horas- 24 horas de incubacin observando el viraje de color.
Resultados
a) Prueba positiva: Color rojo intenso en el pico de flauta o todo el agar. Puede haber una
reaccin positiva retardada despus de 24 horas y hasta 6 das de incubacin (algunas
cepas de Klebsiella por ejemplo).
b) Prueba negativa: No se produce cambio de color.
Controles
Negativo: Escherichia coli.
Positivo: Klebsiella pneumoniae
e) Rojo de metilo
Permite comprobar la capacidad del microorganismo para producir y mantener estables los
productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa determinando cualitativamente
el pH del medio.
Procedimiento
El caldo debe ser incubado a 35-37 C durante 48 a 72 horas.
Aspticamente retirar 2,5 ml de caldo a un tubo estril.
Aadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo rojo de metilo (indicador pH)
Interpretar el resultado del viraje de color inmediatamente.
Si la lectura fuera negativa continuar la incubacin para repetir la prueba.
NOTA: No debe realizarse la lectura antes de las 48 horas de incubacin para evitar
resultados errneos.
El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la produccin de
cido es suficiente como para bajar el pH a 4,4 y es una prueba positiva. Un color naranja
(pH 5 a 5,8) indica una prueba negativa.
Resultados
Prueba positiva: Color rojo.
Prueba negativa: Color amarillo o naranja.
Controles
Control positivo: Escherichia coli
Control negativo: Klebsiella pneumoniae

f) Voges Proskauer

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

58
58
Es til para determinar la capacidad de algunos microorganismos de degradar la glucosa
hasta acetilmetilcarbinol (acetona) a travs de un proceso de fermentacin.
Medios y reactivos: Medio MP VP, naftol al 5%, KOH al 40%
Procedimiento
Incubar por 24 48 horas a 35 37 C.
Transferir 1 ml de caldo a un tubo de ensayo limpio. Aadir con una pipeta Pasteur 0,6 ml de
naftol al 5% y o,2 ml de KOH al 40%.
Agitar el tubo cuidadosamente (para exponerlo al oxgeno atmosfrico) y dejarlo reposar
durante 10 a 15 minutos.
Resultados
Prueba positiva: Desarrollo de un color rojo rosado en la superficie del medio.
Prueba negativa: Mantiene su color.
Controles
Control positivo: Klebsiella pneumoniae
Control negativo: Escherichia coli

g) Motilidad (Medios SIM, MIO o agar movilidad)
Para determinar si un organismo es mvil o inmvil.
Procedimiento: Incubar a 35 37 C durante 24 a 48 horas.
Resultados
Positivo: Los microorganismos migran de la lnea de siembra y se difunden en el
medio provocando turbidez. Tambin puede manifestarse semejando vellosidades
a lo largo del trazo de siembra.
Negativo: Se observa un crecimiento bacteriano acentuado siguiendo el trazo de
siembra y el medio circundante se mantiene claro.
Controles
Control positivo: Escherichia coli.
Control negativo: Klebsiella pneumoniae.
h) Prueba indol
Es til para determinar la capacidad de un microorganismo de producir indol a partir del
aminocido triptfano.
Medios y Reactivos: Se utilizar el medio SIM, el mismo medio para la prueba de
motilidad.
Reactivo de indol de Kovacs.
Procedimiento
En el tubo donde se realiz la prueba de motilidad.
Agregar de 2 a 5 gotas de reactivo de Kovacs.
Mover suavemente el tubo y realizar la lectura.
Evaluar el cultivo, si la lectura es negativa, deber incubarse otras 24 horas.
Resultados
Prueba positiva: Formacin de un anillo rojo en la superficie del medio (la capa alcohlica)
Prueba negativa: No se produce cambio y toma el color del reactivo.
Controles
Control positivo: Escherichia coli.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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Control negativo: Klebsiella pneumoniae.
NOTA
Todas las Escherichia coli producen acidez de glucosa en el TSI o KIA (5 % no producen
gas) y un 98 % son indol positivo, VP -, MR+ (99 %), mviles (95 %).
Todas las Klebsiella pneumoniae son indol negativo, no mviles. VP + (98 %), citrato + (98
%), urea + (95 %), lisina descarboxilasa (98 %), gas de glucosa (97 %).

Tabla 22.- Reacciones Bioqumicas de Enterobacterias en TSI LIA

VP=Vogues Proskauer RM: Rojo de Metilo v variable (10 a 90% + a las 48 horas) + Positivo - Negativo
Grupo I Hidrgeno sulfurado (H
2
S) POSITIVOS
ANAEROGENICOS ( GAS NEGATIVO )
Citrato VP RM

TSI GAS H
2
S LIA INDOL Enterobacteria
K/A - - o + K/K - - - + Salmonella typhi
AEROGENICOS ( GAS POSITIVO )

TSI GAS H
2
S LIA INDOL Citrato VP RM Enterobacteria
K/A 2+ - 4+ K/K - V - + Salmonella spp.
K/A o A/A 2+ - 4+ K/K - + - + Arizona
K/A o A/A 2+ - 4+ K/K - + - + Citrobacter freundi
K/A o A/A 2+ - 4+ K/K + + - + Citrobacter spp.
K/A o A/A 2+ 4+ R/A - v (v) + Proteus mirabilis
K/A o A/A 2+ 4+ R/A + v - + Proteus vulgaris
K/A 2+ 4+ K/K + - - + Edwarsiella tarda
Grupo II Hidrgeno sulfurado (H
2
S) NEGATIVOS
ANAEROGENICOS ( GAS NEGATIVO )
Citrato VP RM

TSI GAS H
2
S LIA INDOL Enterobacteria
K/A - - K/A - o + - - + Shigella
A/A o K/A - - K/K K/N + - - + E. coli
A/A K/A - - K/A - + - - Enterobacter cloacae
A/A K/A - - K/A - + + - Enterobacter aerogenes
A/A K/A - - K/A v v v v Enterobacter aglomerans
A/A - - K/K - + v v Serratia**
K/A - - R/A + v (v) + Proteus mirabilis
K/A - - R/A + v - + Proteus vulgaris
K/A - - R/A + + - + Providencia
A/A - - A/A o K/A - o + - - o+ + Yersinia
AEROGENICOS ( GAS POSITIVO )

TSI GAS H
2
S LIA INDOL Citrato VP RM Enterobacteria
A/A K/A 2+ - K/K o K/A + - - + E. coli
A/A 4+ - K/K - o + + + - Klebsiella
A/A K/A 3+ - K/A A/A - + + -o+ Enterobacter spp.
K/A A/A 2+ - K/K - + v v Serratia
K/A o A/A 1+ - R/A - v (v) + Proteus mirabilis
K/A 1+ - K/K o R/A - v - + Proteus vulgaris
K/A 1+ - K/A o A/A - - - + Paratyphi A
K/K o N/N - - K/K o N/N - + - - No fermentador

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

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60
(v) Ms del 50% + a las 48 horas y ms del 90% + entre 3 a 7 das.
**Serratia liquefaciens es VP variable

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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61
Pruebas bioqumicas diferenciales entre Salmonella Typhi,
Salmonella Paratyphi A y Salmonella spp.
P. bioqumicas S. Typhi S. Paratyphi A Salmonella spp.
SH2 (TSI) Trazas - +
Lisina decarboxilasa + - +
Ornitina decarboxilasa - + +
Arginina dehidrolasa - - +
Glucosa (gas) - + +
Citrato Simmons - - +
+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos

Algunas cepas de Salmonella spp. se pueden confundir con otras enterobacterias
productoras de SH2 como Proteus mirabilis y Citrobacter freundii que son comensales del
aparato digestivo del hombre y de los animales de sangre caliente, pero que no son
enteropatgenos.

IDENTIFICACION DE BACILO GRAM NEGATIVO NO FERMENTADORES:

Pseudomona aeruginosa

Objetivo
Describir los procedimientos de identificacin de Pseudomonas aeruginosa por medio de
pruebas bioqumicas.

Condiciones generales
Pseudomona aeruginosa es fcilmente reconocida en medios de aislamiento primario por sus
caractersticas:
Morfologa de la colonia.
Produccin de pigmentos difusibles si estn presentes.
Olor caracterstico.

Identificacin

Morfologa de las colonias
Las colonias en agar Mc Conkey, generalmente son planas, algo extendidas, bordes
aserrados y tienen un brillo metlico. La pseudomona aeruginosa da un color verdoso y un
olor caracterstico acetonado. Algunas cepas de P. aeruginosa pueden no producir pigmento,
frecuentemente estas cepas son bastante mucoides y se aslan a partir de muestras de
secreciones respiratorias de pacientes con fibrosis qustica.
Las caractersticas de las colonias en Agar sangre se muestran en la tabla 22.

Tabla 23.- Apariencia y caractersticas de colonias de grmenes no fermentadores en Agar sangre

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

62
62

Determinacin de las caractersticas bioqumicas
Identificada la colonia sospechosa. Realizar las siguientes pruebas:
a) Utilizacin de lactosa.
b) Utilizacin de glucosa.
c) Prueba de oxidasa.
d) Crecimiento a 42 C.
e) Utilizacin de citrato.
f) Reduccin de nitrato.
g) Hidrlisis de la gelatina.

Procedimiento
a) Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mc Conkey
b) Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero de Bunsen.
c) Enfriar el asa.
d) Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del medio
de cultivo ni otra colonia vecina.
e) Sembrar por estra en los medios diferenciales empezando por el agar citrato (en la
superficie), TSI, LIA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo,
retirar por el mismo trazo y sembrar en estra la parte inclinada), caldo para la prueba de
indol y caldo nitrato.
f) Sembrar por puntura en el centro del agar gelatina (hasta una profundidad de 1,5 cm
2,5 cm) y agar movilidad hasta una profundidad aproximada de 1.5 cm.
g) Quemar el asa y dejar enfriar.
h) Con el asa recta obtener la misma colonia trabajada y cogerla tratando de no tocar el
fondo del medio de cultivo ni otra colonia vecina y sembrar haciendo pequeos trazos en
el extremo de dos placas de TSA o Meller Hinton (sembrar solo una placa de TSA o
Meller Hinton si no se dispone de incubadora a 42 C).
i) Utilizando un asa de siembra en aro estril y tomando como referencia central el inculo
de la colonia, realizar la siembra por dispersin agotamiento en los cuadrantes de la
placa.
j) Incubar a 35 37 C de 18 24 horas a excepcin de una placa de TSA que debe ser
incubada a 42 C.
NOTA: De no disponer de estufa de 42 C, una alternativa es utilizar un bao mara
graduado a 42 C y sembrar el cultivo en estudio en TSB o BHI e incubarlo de 18 a 24
horas.
Organismo Apariencia
Stenotrophomona malthophilia Colonias grandes, lisas, brillantes, con prominencias elevadas, con
pigmento verde lavanda a ligeramente prpura, descoloracin
verdosa undermelth crecimiento, olor a amonaco.
Acinetobacter spp. Lisas, opacas, elevadas, cremosas, y ms pequeas que
las enterobacterias, algunas son -hemolticos
Burkholderia gladioli Amarillas
Bordetella parapertrussis Lisas, opacas, -hemolticos
Bordetella hotmesli Puntiformes, semiopacas, convexas, redondas, color
verdoso, acompaado de lisis
Bordetella trematum Convexas, circulares, gris cremosas a blanca.
Pseudomona oryzihabitans Amplias y lisas, transparentes y amarillas
Pseudomona luteola Lisas, opacas, amarillas
CDC grupo N 1 Pequeas, pueden ser transferidas intactas con una aguja de inoculacin.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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63

Lecturas:
a) Agar TSI
Seguir los pasos descritos en el Procedimiento IDENTIFICACION DE BACILOS
GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES: Escherichia coli, Enterobacter y K.
Pneumoniae, P. aeruginosa da una reaccin: K/K o N/N y no hay produccin de sulfuro
de hidrgeno.
b) Prueba de utilizacin de citrato
Procedimiento
Seguir los pasos descritos en el Procedimiento IDENTIFICACION DE BACILOS
GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES: Escherichia coli, Enterobacter spp y K.
Pneumoniae.
NOTA: 95 % de cepas de P. aeruginosa son positivos.
c) Prueba de hidrlisis de la gelatina
Determina la capacidad de un microorganismo de producir gelatinasas (enzimas de tipo
proteoltico) que lican la gelatina.
Medio
Gelatina nutritiva pH 6,8
Procedimiento
Utilizando una asa de siembra en punta y a partir de un cultivo puro de 18 a 24 horas
coger un inculo abundante y hacer una puncin en el centro y en forma vertical en el
medio de gelatina hasta una profundidad de 1.5 a 2.5 cm.
Utilizar un tubo con medio de gelatina sin inocular como control de la prueba.
Incubar los cultivos en estudio y de control a 22 25 C por 24 48 horas y hacer la
lectura.
Evaluar diariamente el cultivo durante 14 das.
Al trmino de cada perodo de 24 horas colocar el tubo control y el estudio en el
refrigerador o en un recipiente con hielo durante 2 horas aproximadamente para
determinar se se ha producido o no la digestin de la gelatina (licuefaccin)
Realizar las lecturas observando si hay crecimiento (turbidez) y licuefaccin.

Controles
Positivo: Serratia marcescens.
Negativo: E. coli
Resultados
Positivo: medio de cultivo semilquido.
Negativo: medio de cultivo slido.
Recomendaciones
En todos los ensayos debe prepararse un tubo control (sin inoculacin del
microorganismo).
Pasar los tubos de la incubadora al refrigerador sin agitarlos para evitar resultados falsos
negativos.

d) Produccin de pigmentos

Despus del perodo de incubacin, realizar la lectura verificando la produccin de algn
pigmento en el TSA o agar Meller Hinton.
P. aeruginosa produce pigmentos: verdoso o azul verdoso brillante, rojo o marrn.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

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Ocasionalmente algunas cepas de P. aeruginosa solo producen pioverdina siendo difcil su
diferenciacin de otras Pseudomonas como P. fluorescens o P. putida, sin embargo se puede
diferenciar de las otras especies por la temperatura de crecimiento (42 C)

Lectura:
Si no se observa pigmento dejar la placa incubando a temperatura ambiente y realizar la
lectura a las 48 horas

NOTA: Si se dispone de estufa a 42 C o bao mara graduado a 42 C para la identificacin
de P. aeruginosa, es suficiente realizar las pruebas de: oxidasa, cultivo en TSI, crecimiento a
42 C y demostracin de produccin de pigmento verde-azulado, rojo o marrn en el agar
TSA o Meller Hinton.

Tabla 23.- Caractersticas de P. aeruginosa y otras Pseudomonas que producen pigmento encontradas en muestras clnicas.

Prueba P. aeruginosa P. fluorescens P. putida
Oxidasa 99 97 100
Crecimiento
Agar Mc Conkey 100 100 100
A 42C 100 - -
Reduccin de nitrato 98 18 0
Pioverdina 65 96 93
Indol 0 0 0
Hidrlisis de la Gelatina 82 100 0
Citrato de Simmons 95 93 94 (6)
Porcentaje de cepas positivas, en parntesis representan porcentaje de cepas con reacciones retrasadas.
Fuente: Kiska D, Gilligan P. Pseudomonas. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clinical
Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 517 25.

PRUEBA DE LA CITOCROMO-OXIDASA (Identificacin de no fermentadores)

Mtodo Indirecto: Para esto se usa tiras reactivas de Bactident oxidase de Merck, que contienen
dicloruro de N,N-dimetil-1,4-fenilendiamonio 0.1 mol; 1 naftol 1,0 mol.
Fundamento:
La citocromooxidasa es un enzima que oxida el citocromo c, reducindola y hacindola inactiva.
En presencia de oxgeno molecular el sistema citocromo oxidasa/citocromo c, la enzima se
activa nuevamente y puede reducir una serie de sustancias orgnicas y entre ellas al reactivo
NaDi (1-naftol+ dimetilparafenil endiamina) dando una molcula de condensacin de color
azul, la cual sirve para la identificacin de esta enzima.

Nota: Para evitar falsos positivos se debe exclusivamente asa de platino, o palo de madera.

La interpretacin de resultados es la siguiente:

Cuando de utiliza el reactivo dimetil-p-fenilendiamina: se considera un resultado positivo cuando se
desarrolla un color Rosado a fucsia en un tiempo de aproximadamente 2 minutos.

Otro mtodo, es el directo en el cual se aplican dos a tres gotas sobre la placa de cultivo que contiene
la bacteria a estudiar, pero esta prueba llamada directa o en placa es menos sensible que en mtodo
indirecto o en papel.

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Tambin se puede usar el reactivo trimetilp- fenilendiamina, el cual es el ms sensible a la
deteccin del citocromo oxidasa.

GERMENES OXIDASA POSITIVOS GERMENES OXIDASA NEGATIVOS
Actinobacillus lignieresii/equuli. Acinetobacter spp.
Aeromonas spp. Actinobacillus actinomicetim comitans
Alcaligenes spp. Acholeplasma spp.
Bacillus anthracis Anaerobios (todos)
Bacillus subtilis Bordetella parapertrussis
Bordetella pertrusis Corynebacterium Bacillus spp
Branhamella catarrhalis Enterobacterias (todas las especies)
Brucella spp. Haemophylus spp
Campylobacter spp. Lactobacillus spp.
Cordiobacterium hominis Listeria spp.
Chromobacterium spp. Mycoplasma spp.
Eickenella corrodens Pasteurella haemolytica Typ T
Moraxella spp. Peptococcus spp.
Micrococcus spp. Pseudomona mallei
Neisserias spp. Pseudomona maltophilia
Pasteurella spp. Streptobacillus
Plesiomonas spp. Staphylococcus spp.
Pseudomonas spp Streptococcus spp.
Vibrio spp.

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ANTIBIOGRAMA

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REALIZACION DEL ANTIBIOGRAMA POR EL METODO DE DISCO DIFUSION

Objetivo:
Estudiar la sensibilidad o resistencia de la cepa bacteriana aislada, cuya informacin es muy til para
el tratamiento mdico.

DISCO DIFUSION POR EL METODO DE KIRBY BAHUER.

El mtodo se basa en el principio de que las molculas de los antibiticos colocados en un disco
difunden a travs del agar creando una gradiente dinmica de la concentracin del antibitico,
desde donde se inicia la divisin bacteriana y en forma progresiva hasta la masa crtica de
desarrollo.[19].
El inculo debe ser preparado por suspensin de colonias aisladas (tomadas de una placa de agar
de 18 a 24 horas de desarrollo) en caldo TSA o solucin salina, que alcance una turbidez de 0.5
en la escala estndar de Mc Farland (1 x 108 Unidades formadoras de colonias/ml). Este estndar
es usado para medir la turbidez de la bacteria y asegurar un cierto nmero de unidades
formadoras de colonias en el inculo.[12] La concentracin de la solucin del inculo es
importante debido a que un inoculo que tiene una alta concentracin de unidades formadoras de
colonia puede dar zonas de inhibicin ms pequeas (i.e., falsa resistencia), por otro lado un
inoculo bajo puede dar zonas de inhibicin falsamente grandes (i.e., falsa sensibilidad).[21, 22].
Las diferentes especies y cepas de un microorganismo tienen grados variables de susceptibilidad
a los antimicrobianos, la cual adems puede cambiar, especialmente durante el tratamiento. Para
determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de las diferentes especies y cepas de un
microorganismo se aplica el mtodo de disco difusin en Agar Mueller Hinton, el cual no debe
tener un espesor estndar de 4 mm. Un espesor mayor del medio puede dar como resultado halos
de inhibicin ms pequeos y un espesor menor puede ocasionar halos de inhibicin ms
grandes, lo cual causara error en la sensibilidad antibitica. Por otro lado es importante
investigar la presencia de cationes divalentes en este medio, ya que algunos antibiticos como
los aminoglicsidos pueden dar lecturas falsamente negativas cuando el nivel de calcio y
magnesio son muy altos. La presencia de excesiva cantidad de timina o timidina produce zonas
de inhibicin pequeas a los discos de sulfonamidas y trimetoprim, no tan ntidas o sin halo
dando una falsa resistencia en la lectura. Se debe evaluar cada lote de Mueller Hinton en su
contenido de timidina utilizando la cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 o ATCC 33186
y probndola con discos de cotrimoxazol. Se debe obtener un halo de inhibicin claro y definido
de 20 mm o ms. La variacin en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarn los
resultados con tetraciclina y aminoglucsidos frente a P. aeruginosa. Un exceso de dichos
cationes reducirn las zonas de inhibicin, y bajas concentraciones aumentarn las zonas de
inhibicin. El exceso de zinc podra reducir las zonas de inhibicin de los carbapenems.
Antes de realizar el antibiograma, se debe dejar las placas de Mueller Hinton durante 30 minutos
a temperatura ambiente y no debe haber humedad en la superficie.
Se debe realizar una suspensin de la cepa a una concentracin de 0.5 segn la escala de Mc
Farland. La suspensin bacteriana debe sembrarse en el Mueller Hinton antes de los 15 minutos
de preparada. Esto es particularmente importante para organismos difciles (como las especies de
Neisseria, Haemophilus influenzae, y streptococcus -hemolyticus) que tienen una viabilidad
muy corta, resultando en disminucin del inculo.
Para la siembra se usa un hisopo estril, el cual es introducido hacia la suspensin y debe
presionarse firmemente en la pared del tubo, para escurrir o remover el exceso de lquido.

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La superficie completa de la placa de agar es inoculada por estriamiento, sembrando la superficie
en tres direcciones. Despus de cada estriado la placa es rotada 60 grados para obtener una
distribucin uniforme del inoculo.
Despus del estriado completo, la placa debe ser dejada a secar por no ms de 15 minutos.
Una vez que la placa agar est completamente seca, los discos antibiticos son aplicados
manualmente o con un aparato dispensador. Para la mayora de organismos, no ms de 12 discos
deben ser colocados en una placa de agar de 150 mm o 5 discos sobre una placa de 90mm. Es
mejor colocar los discos que tienen zonas pequeas predecibles (gentamicina) cerca de discos
con zonas grandes de inhibicin (cefalosporinas) para evitar zonas de sobrelapamiento.
[23]

ptimamente los discos no deben ser posicionados a una distancia mayor de 30 mm, ni menor
de 24 mm, medidos de centro a centro, para minimizar el sobrelapamiento de las zonas de
inhibicin.
[23]
Existen dispensadores de discos en forma automtica, pero siempre los discos
deben ser presionados manualmente en forma inmediata, para realizar un mejor contacto con la
superficie del agar.
Una vez que el disco entra en contacto con el agar no debe ser movido, debido a que el
antibitico difunde rpidamente en el agar. La tcnica microbiolgica es importante debido a que
el movimiento puede alterar el proceso de integridad y llevar a resultados inexactos.
Las placas de agar son incubadas en posicin invertida (El agar hacia arriba) bajo condiciones
apropiadas para el microorganismo. El periodo de incubacin es de 16-18 horas para bacterias
aerobias de rpido crecimiento y hasta 48 horas para bacterias exigentes de difcil crecimiento o
de condiciones especiales de resistencia, como el acinetobacter spp., o streptococcus
Cuando se detecta Staphylococcus aureus resistente a vancomicina u oxacilina, las placas deben
ser mantenidas por un mnimo de 24 horas, segn los procedimientos del CLSI.
[23]
.
Despus de la incubacin la placa de agar es examinada para determinar si hay semiconfluencia
and even "lawn" de crecimiento ha sido obtenido antes de la lectura de la placa.
Si existen pocas colonias o estn dispersas, significa que el inoculo ha sido muy pobre y debe
repetirse la prueba, ya que las zonas de inhibicin son inexactas. Lo mismo debe hacerse si el
inculo es muy denso, lo que causa zonas pequeas de inhibicin con bordes pronunciados.
Ambos casos da lecturas falsas
[22]
.
Si el borde de crecimiento es satisfactorio, la zona de dimetro es leda usando una regla
milimetrada o un pie de rey. El margen o borde de inhibicin es el rea donde obviamente no se
observa crecimiento bacteriano a simple vista.
El dimetro de inhibicin del Mueller-Hinton (sin suplemento de sangre) son ledos por la parte
posterior de la placa, en caso de agar sangre, son ledos por la superficie, para asegurar que la
zona de inhibicin sea leda correctamente. La lnea de demarcacin de la zona de inhibicin
debe ser clara; la presencia de crecimiento de micro colonias detectable solamente con una lupa,
debe ser ignorado.
La ventaja de mtodo de disco difusin, es su simplicidad, requiere poco equipo, menor costo y
la facilidad de elegir el antibitico para la prueba. La ventaja es la incapacidad de obtener una
concentracin inhibitoria mnima y el tiempo adicional requerido para la preparacin de la
prueba, as como el uso de medidores manuales para determinar la zona de inhibicin.
Ciertos antibiticos pueden ser un problema para el mtodo de disco difusin, debido a las
propiedades fsico qumicas de las molculas. La vancomicina, colistina, y macrlidos tienen
alto peso molecular y difunden lentamente en el agar.
[22]

La difusin limitada y el gradiente de concentracin pobre alrededor del disco da como resultado
que exista poca diferencia entre los grmenes susceptibles y los resistentes, con la consiguiente
lectura potencial ambigua. Los resultados tambin pueden ser influidos por la posicin de la
fuente de luz sobre la placa.

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La mayora de placas son ledas usando luz reflejada, con la excepcin de linezolid, oxacilina, y
vancomicina tanto para el S. aureus y Enterococcus. En estos casos la zona de inhibicin debe
ser leda usando luz transmitida para asegurar una medida adecuada del halo de inhibicin. Si los
resultados son inesperados o estn en el borderline, otro mtodo de prueba debe ser requerido
para la confirmacin.

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Medios a utilizar para las pruebas de sensibilidad.
Agar Meller Hinton (MH) o Tripticase Soya Agar (TSA): Para la gran mayora de bacterias
Gram positivas y Gram negativas el medio ms usado es el de Mueller Hinton, al cual
previamente debe haberse realizado el control de calidad. Ver control de calidad.
Agar Sangre: En caso de grmenes que slo crecen en Agar sangre, como los estreptococos, los
micoplasmas y corynebacterium diphterae, usar Mueller Hinton con sangre de carnero 5%.
Agar Chocolate: Para su empleo en la prueba de Neiseria, Hemophilus y de otros patgenos
excepcionalmente difciles. Las placas se incuban rutinariamente en atmsfera reforzada con
bixido de carbono. Se recomienda en los cultivos de LCR.

Algunos criterios que deben observarse.
Inoculacin; Los cultivos deben ser puros, a veces es necesario volver a repicar el sembrado hasta
conseguir colonias bien aisladas, a partir del cual se debe hacer el estudio diferencial para identificar
la cepa bacteriana, as como para realizar el estudio del antibiograma. Si los aislados no son puros
daran como resultado una identificacin bacteriana errnea con un estudio de sensibilidad
equivocado.
Seleccin de discos; Debe hacerse en general por la reaccin del Gram, el tipo de microorganismo a
prueba y por la solicitud de los mdicos. Por regla, siempre debe incluirse el antimicrobiano que el
paciente est utilizando.
Colocacin de Discos: Para la colocacin de discos se puede usar un dispensador automtico, o
manualmente, por medio de una aguja estril, se puede usar tambin pinzas que se esterilizan al calor
en cada aplicacin de disco, pero un sobrecalentamiento de la pinza, puede ocasionar sequedad del
disco y puede disminuir el halo de sensibilidad. Los discos se colocan con una separacin de 20 mm.
Empleando no ms de 9 discos en una placa de 100 mm.
Incubacin; Las placas se incubarn a 35 C. durante 16 a 24 horas para su lectura.
La sensibilidad antimicrobiana; debe realizarse por cada germen aislado en placas separadas y de
acuerdo a los requerimientos del espcimen aislado.

CONTROL DE CALIDAD

Control interno de la calidad

Los colorantes y reactivos usados para la identificacin bacteriana deben probarse inmediatamente
despus de la preparacin y peridicamente para evaluar las caractersticas de tincin esperadas y la
correcta reactividad de los medios apropiados con cepas referenciales o de reactividad conocida.
Debe llevarse un registro de control de calidad de los medios de cultivo, colorantes y reactivos en el
que se incluya: fecha, nmero de control o lote, control positivo y negativo utilizado, resultados de la
prueba y nombre de la persona que realiz la prueba. Los registros deben estar a disposicin de todo
el personal del laboratorio.
Es necesario llevar registros de temperatura y de mantenimiento de los equipos para documentar el
correcto funcionamiento de los mismos y demostrar que los hallazgos de laboratorio constituyeron
realmente determinaciones vlidas.
Para asegurar la confiabilidad del diagnstico microbiolgico de las infecciones intrahospitalarias se
realiza la verificacin del cumplimiento de las especificaciones contenidas en el presente Manual de
Procedimientos.
Se verifica el cumplimiento de la frecuencia programada para controlar el estado de calibracin de
los equipos y los medios de medicin.
En caso de identificarse disconformidades en la aplicacin de las especificaciones, se informa al
personal responsable del laboratorio, quien decide la adopcin de medidas correctivas necesarias y la
identificacin de las causas.

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ANTIBIOGRAMA PARA STAPHYLOCOCCUS
El Antibiograma para staphylococcus debe realizarse en Mueller Hinton suplementado con ClNa al
2%, para que los halos de sensibilidad sean fiables, sobre todo en cepas meticilinoresistentes
Tabla 24.- Discos de antibiticos a incluir en el antibiograma.
Grupo I: Grupo II:
Oxacilina
Penicilina
Eritromicina
Clindamicina
Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol)
Vancomicina
Gentamicina
Ciprofloxacina
Cloramfenicol.
Rifampicina.
Tetraciclina.
Teicoplanina
Nitrofurantona(1)
Norfloxacina(1)

(1) Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias

Lectura: Entre 16 18 h. A las 24 h para el disco de Oxacilina

Resistencias Naturales
Los estafilococos son resistentes a cido Nalidxico, cido Pipemdico y Aztreonam
Staphylococcus saprophyticus es resistente a Fosfomicina y Novobiocina
Staphylococcus cohnii y Staphylococcus xylosus son resistentes a Novobiocina y a
Lincomicina

Tabla 25.- Antibiticos y Dimetros Crticos para Staphylococcus spp.
Antimicrobiano Interpretacin (mm de halo)
Resistente Intermedio Sensible
Penicilina 10 U <28 - >29
Oxacilina (S. aureus) 1g <10 - >24
Oxacilina (S. coagulasa negativos) 1g <17 - >18
Vancomicina 30 g - - >15
Teicoplamina 30 g <10 11-13 >14
Gentamicina 10 g <12 13-14 >15
Norfloxacino 10 g <12 13-16 >17
Ciprofloxacino 5 g <15 16-20 >21
Tetraciclina 30 <14 15-18 >19
Eritromicina 15 g <13 14-22 >23
Clindamicina 2 g <14 15-20 >21
Cloramfenicol 30 g <12 13-17 >18
Rifampicina 5 g <16 17-19 >20
Nitrofurantona 300 g <14 15-16 >17
Trimetoprim/sulfametoxazol 1.25/23.75 g <10 11-15 >16

Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma
Disco de Penicilina:
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Penicilina es vlido tambin para
Ampicilina y Amoxicilina.
Disco de Oxacilina:
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Oxacilina es vlido tambin para
Dicloxacilina y Cloxacilina.
La resistencia a Oxacilina seala una resistencia cruzada a todas las penicilinas (asociadas o
no a inhibidores de betalactamasas), cefalosporinas de todas las generaciones y carbapenems,
sin excepcin.

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Las cepas resistentes a Penicilina y sensibles a Oxacilina son sensibles a las penicilinas
asociadas a los inhibidores de betalactamasas, a las cefalosporinas y a los carbapenems.
El disco de Oxacilina no debe incluirse en el antibiograma de Staphylococcus saprophyticus
pues con frecuencia al utilizar los dimetros crticos vlidos para los otros estafilococos
coagulasa negativos, se le clasifica incorrectamente como resistente a este antibitico.
Disco de Tetraciclina:
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para
Doxiciclina y Minociclina.
Disco de Eritromicina:
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es vlido tambin para
la Azitromicina, Claritromicina y Roxitromicina.
Disco de Ciprofloxacina:
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ciprofloxacina es vlido tambin
para la Ofloxacina y Levofloxacina.
Disco de Vancomicina:
Si se tiene una zona de inhibicin de 14 mm o menos, se recomienda la medicin de la CIM
de este antibitico para descartar una posible sensibilidad disminuida (Ver Anexo E).

ANTIBIOGRAMA PARA STREPTOCOCCUS SPP.
Tabla 26.- Discos de antibiticos a incluir en el antibiograma a Streptococcus spp.
Grupo I: Grupo II:
Ampicilina o Penicilina G
(solo para Estreptococos -hemolticos)
Eritromicina
Clindamicina
Cefotaxima o Ceftriaxona
Cloramfenicol

Levofloxacina
(solo para estreptococos -hemolticos)
Ofloxacina
(solo para estreptococos -hemolticos)
Cefepime
Vancomicina
Teicoplanina

Resistencias Naturales:
Los Estreptococos spp., son resistentes a Aztreonam y Pefloxacina y presentan una resistencia de
bajo nivel a los Aminoglucsidos.

Tabla 27.- Antibiticos y Dimetros Crticos para Streptococcus spp (excepto Neumococo)
Penicilina 10 U >24
Ampicilina 10 g >24
Cefotaxima 30 g (-hemolticos) >24
Cefotaxima 30 g (viridans) <25 26-27 >28
Ceftriaxone 30 g (-hemolticos) >24
Ceftriaxone 30 g (viridans) <24 25-26 >27
Cefepime 30 g (-hemolticos) >24
Cefepime 30 g (viridans) <21 22-23 >24
Vancomicina 30 g >17
Teicoplamina 30 g >17
Clindamicina 2 g <15 16-18 >19
Levofloxacino 5 g <13 14-16 >17
* Dimetros crticos adaptados del CFA SFM 2000 20001.


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Discos de Penicilina - Ampicilina:
La interpretacin del resultado de estos discos es solo vlida para los Streptococcus beta -
hemolticos.
Para el estudio de la sensibilidad a Penicilina del Streptococcus viridans aislado de lquidos
normalmente estriles debe determinarse la CIM.
Las cepas sensibles a Penicilina deben ser consideradas sensibles igualmente a: Amoxicilina,
Amoxicilina/cido Clavulnico, Ampicilina/Sulbactam, Cefalotina, Cefaclor, Cefazolina,
Cefradina, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Loracarbef, Cefepime, Imipenem y
Meropenem.
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es tambin vlido para
Azitromicina, Roxitromicina y Claritromicina.
Discos de Ofloxacina y Levofloxacina:
La interpretacin del resultado de estos discos es solo vlida para los Streptococcus beta -
hemolticos.

ANTIBIOGRAMA PARA STREPTOCOCCUS PNEUMONI AE (NEUMOCOCO)

Tabla 28.- Discos de antibiticos a incluir en el antibiograma de Streptococcus pneumoniae
Grupo I: Grupo II:
Oxacilina
Eritromicina
Cotrimoxazol (trimetoprim/sulfametoxazol)*
Cloramfenicol
Vancomicina
Tetraciclina
Rifampicina
Teicoplanina
Levofloxacina o Esparfloxacina o Moxifloxacina.

* El agar Mueller-Hinton usado para esta prueba no debe contener timidina para poder obtener resultados exactos con
cotrimoxazol.

El Neumococo es resistente a Aztreonam y Pefloxacina y presenta una resistencia de bajo nivel a los
aminoglucsidos.

Tabla 29.- Antibiticos y Dimetros Crticos para Streptococcus pneumoniae
Antimicrobiano Interpretacin (mm de halo)*
Oxacilina 1 g >20
Vancomicina 30 g >17
Teicoplamina 30 g >17
Moxifloxacina 5 g <14 15-17 >18
Tetraciclina 30 g <18 19-22 >23
Cloramfenicol 30 g <20 >21
* Dimetros crticos adaptados del CFA SFM 2000 20001.

Disco de Oxacilina:
Cuando el halo de inhibicin del disco de Oxacilina es igual o superior a 20 mm, la cepa de
Neumococo es sensible a Penicilina y a los siguientes antibiticos: Ampicilina, Amoxicilina,
Amoxicilina/cido Clavulnico, Ampicilina/Sulbactam, Cefaclor, Cefuroxima, Cefotaxima,
Ceftriaxona, Cefixima, Cefepime, Loracarbef, Imipenem y Meropenem.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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Cuando el halo de inhibicin del disco de Oxacilina es igual o inferior a 19 mm puede
tratarse de una cepa de Neumococo sensible, de bajo nivel de resistencia o de alto nivel de
resistencia a Penicilina. En estas cepas debe determinarse la CIM de la Penicilina pues no es
posible categorizar al Neumococo como resistente a este antibitico basado nicamente en el
resultado del disco de Oxacilina.
Tampoco es posible determinar el grado de resistencia a los otros betalactmicos basado
nicamente en los resultados del disco de Oxacilina, por lo que se recomienda determinar la
CIM de ciertos antibiticos que pueden ser eficaces en el tratamiento de infecciones debidas
a Neumococo resistente a Penicilina (Amoxicilina, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona,
Imipenem y Meropenem).
En infecciones severas debidas a Neumococo (meningitis, bacteriemia) se recomienda
determinar la CIM de la cepa para Penicilina, Cefotaxima (o Ceftriaxona) y Meropenem. La
Vancomicina debe tambin estudiarse en estos casos, sea incluyendo el disco de este
antibitico en el antibiograma o por determinacin de la CIM.
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es tambin vlido para
Azitromicina, Roxitromicina y Claritromicina.

ANTIBIOGRAMA PARA ENTEROCOCCUS SPP.
Tabla 30.- Discos de antibiticos a incluir en el antibiograma.
Grupo I: Grupo II:
Ampicilina
Gentamicina (disco con contenido de 120 g)
Estreptomicina (disco con contenido de 300 g)
Vancomicina

Teicoplanina Nitrofurantona(1)
Rifampicina Norfloxacina(1)
Cloramfenicol Ciprofloxacina(1)
Tetraciclina Levofloxacina(1)
Eritromicina
(1) Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias

Resistencias Naturales
Los enterococos son resistentes a oxacilina, cefalosporinas, Clindamicina, y Cotrimoxazol y
presentan una resistencia de bajo nivel a los aminoglucsidos, lo cual no suprime la sinergia
con los betalactmicos, por tanto deben utilizarse discos con mayores concentraciones de
antibitico que las habituales buscando detectar una resistencia de alto nivel que si elimina
el efecto sinrgico.
Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus son resistentes a los glicopptidos.

Incubacin: 35C
Lectura: A las 16 18 h. A las 24 h para el disco de Vancomicina

Tabla 31.- Antibiticos y Dimetros Crticos para Enterococcus
Ampicilina 10 g <16 >17
Vancomicina 30 g <14 15-16 >17
Teicoplamina 30 g <10 11-13 >14
Estreptomicina 300 g <5 7-9 >10

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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Nitrofurantona 300 g <14 15 16 >17

Disco de Ampicilina:
Si la cepa es sensible a Ampicilina lo es tambin a Penicilina, la Amoxicilina, asociaciones de
penicilinas e inhibidores de betalactamasas, e Imipenem.
En caso de resistencia a Ampicilina, se recomienda la realizacin del test de la nitrocefina para la
deteccin de una penicilinasa. Esta resistencia enzimtica a Ampicilina (test de la nitrocefina positivo)
es cruzada con Penicilina y Amoxicilina.
Discos de Vancomicina y Teicoplanina:
Si la cepa es intermedia a Vancomicina y/o Teicoplanina, se recomienda la medicin de la CIM de
estos antibiticos para descartar una posible resistencia (Ver anexo E)
Discos de Gentamicina y Estreptomicina:
Si la cepa es intermedia a Gentamicina y/o Estreptomicina, se recomienda la medicin de la CIM de
estos antibiticos para descartar una posible resistencia de alto nivel (Ver anexo E).
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es vlido tambin para
Azitromicina, Claritromicina y Roxitromicina.

ANTIBIOGRAMA PARA PSEUDOMONAS SPP.

Tabla 32.- Discos de antibiticos a incluir en el antibiograma para Pseudomona spp.
Grupo I: Grupo II:
Ceftazidima
Imipenem y/o Meropenem
Gentamicina
Amikacina
Ciprofloxacina
Aztreonam
Cefoperazona/sulbactam
Cefepime
Norfloxacina (1)
Ofloxacina (1)
(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias

Pseudomonas aeruginosa es resistente a Penicilina, Ampicilina, Amoxicilina, cefalosporinas
de primera y segunda generacin, Cefotaxima, Ceftriaxona, Kanamicina, Tetraciclina,
Cloramfenicol, cido Nalidxico y cido Pipemdico.

INCUBACIN: 35C
LECTURA: A las 16 18 h.

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS
Tabla 33.- Antibiticos y Dimetros Crticos para pseudomona
Cefotazidima 30 g <14 15-17 >18
Cefepime 30 g <14 15-17 >18
Cefoperazona/sulbactam 75/30 g <15 16-20 >21
Imipenem 10 g <13 14-15 >16
Meropenem 10 g <13 14-15 >16
Aztreonam 30 g <15 16-21 >22

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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76
Amikacina 10 g <14 14-16 >17
Ofloxacino 5 g <12 13-15 >16
* Adaptado a partir de los dimetros crticos de la Cefoperazona segn el NCCLS 2001
Disco de Ceftazidima:
Si la cepa tiene susceptibilidad intermedia (I) o resistente (R) a Ceftazidima debe informarse
tambin como intermedia (I) o resistente (R) al Aztreonam an cuando el resultado del disco
indique sensibilidad (resistencia cruzada).

Disco de Aztreonam:
Una resistencia aislada del Aztreonam en relacin con una sensibilidad conservada para los
otros betalactmicos (cefalosporinas y carbapenems) es posible y debe informarse como tal.

Discos de carbapenems:
Si una resistencia disociada entre Meropenem e Imipenem (sensible a uno y resistente al
otro) es detectada deber verificarse la tcnica y repetirse la prueba. Si la resistencia
disociada se confirma, la cepa deber ser enviada al INS.
Una resistencia aislada a Imipenem y/o Meropenem en relacin con una sensibilidad
conservada para otros betalactmicos (cefalosporinas, monobactams y combinaciones
cefalosporina / inhibidor de betalactamasas) es posible y debe informarse como tal.

ANTIBIOGRAMA PARA ACI NETOBACTER SPP

Tabla 34.- Discos de antibiticos a incluir en el antibiograma para Acinetobacter spp.
Grupo I: Grupo II:
Ceftazidima
Imipenem o Meropenem
Gentamicina
Amikacina
Ciprofloxacina.
Ampicilina/Sulbactam Aztreonam
Cefotaxima o Ceftriaxona Cefepime
Norfloxacina
1
Ofloxacina
1

Tetraciclina
1
Cloramfenicol
1

(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias

Acinetobacter baumannii y Acinetobacter calcoaceticus son resistentes a Penicilina,
Ampicilina, Amoxicilina, cefalosporinas de primera y segunda generacin y a furanos.
Acinetobacter haemolyticus es resistente a Gentamicina y Amikacina.
INCUBACIN: 35C
LECTURA:16 18 h

Tabla 35.- Antibiticos y Dimetros Crticos para Acinetobacter spp.
Ampicilina/sulbactam 10/10 g <11 12-14 >15
Cefotazidima 30 g <14 15-17 >18
Ceftriaxone 30 g <13 14-20 >21
Cefotaxima 30 g <14 15-22 >23
Cefepime30 g <14 15-17 >18
Imipenem 10 g <13 14-15 >16
Meropenem 10 g <13 14-15 >16
Aztreonam 30 g <15 16-21 >22

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

77
77
Amikacina 10 g <14 14-16 >17
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina no es necesariamente
vlido para Doxiciclina y Minociclina.
Disco de Sulbactam:
El Sulbactam, un inhibidor de betalactamasas, posee actividad intrnseca sobre el
Acinetobacter spp.
La Ampicilina/Sulbactam mide la actividad sobre Acinetobacter spp. Por lo que se debe
incluir en el antibiograma de esta especie.
Disco de Rifampicina:
La Rifampicina es utilizada en algunos pases para el tratamiento en asociacin de
infecciones ocasionadas por Acinetobacter spp multirresistente.
Sin embargo debido a la inexistencia de dimetros crticos en el sistema norteamericano
(NCCLS) para medir la actividad de Rifampicina sobre Acinetobacter spp no hemos incluido
este antibitico en ninguno de los dos grupos de antibiticos para esta especie.

ANTIBIOGRAMA PARA ENTEROBACTERI ACEAE

Tabla 36.- Discos de antibiticos a incluir en el antibiograma para Enterobactericeae
Grupo I: Grupo II:
Ampicilina
Cefalotina
Ampicilina / Sulbactam o Amoxicilina / cido
Clavulnico.
Cefuroxima
Cefotaxima o Ceftriaxona
Gentamicina
Amikacina
cido Nalidxico
1

Norfloxacina
1

Ciprofloxacina
Nitrofurantona
1

Cefoxitina
Aztreonam
Ceftazidima
Cefixima
Cefoperazona/Sulbactam
Cefepime o Cefpirome
Imipenem o Meropenem
Cloramfenicol
Ofloxacina
1

(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias.

Tabla 37.-Antibiticos a utilizar en el antibiograma de Salmonella spp y Shigella spp aisladas de coprocultivos:
Ampicilina
Cloramfenicol
Ciprofloxacina
Cefotaxima

Las enterobacterias son resistentes a Penicilina, Oxacilina, Macrlidos, Clindamicina y
Glicopptidos.
Klebsiella spp es resistente a las Aminopenicilinas.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

78
78
Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes son resistentes a las
Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera
generacin y Cefuroxima.
Serratia marcescens es resistente a las Aminopenicilinas, aminopenicilinas/Inhibidores de
betalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin y Cefoxitina.
Proteus mirabilis es resistente a Nitrofurantona.
Proteus vulgaris es resistente a las Aminopenicilinas, Cefalosporinas de primera generacin,
Cefuroxima y Nitrofurantona.
Morganella morganii es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de
betalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin, Cefuroxima y Nitrofurantona.
Providentia stuartii es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de
betalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin, Gentamicina (bajo nivel) y
Nitrofurantona.
Tabla 38.- Antibiticos y Dimetros Crticos para enterobacterias
Ampicilina 10 g <13 14-16 >17
Cefalotina 30 g <14 15-17 >18
Cefuroxima axetil (oral) 30 g <14 15-22 >23
Cefuroxima sodio (parenteral) 30 g <14 15-17 >18
Cefoxitina 30 g <14 15-17 >18
Cefotaxima 30 g <14 15-22 >23
Ceftriaxone 30 g <13 14-20 >21
Ceftazidima 30 g <14 15-17 >18
Cefixima 5 g <15 16-18 >19
Cefpirome 30* g <14 15-17 >18
Cefepime 30 g <14 15-17 >18
Ampicilina/Sulbactam 10/10 g <11 12-14 >15
Amoxicilina/clavulnico 20/10 g <13 14-17 >18
Cefoperazona/sulbactam 75/30** g <15 16-20 >21
Imipenem 10 g <13 14-15 >16
Meropenem 10 g <13 14-15 >16
Aztreonam 30 g <15 16-21 >22
Amikacina 10 g <14 14-16 >17
Acido nalidxico 10 g <13 14-18 >19
Ofloxacino 5 g <12 13-15 >16
* Dimetros crticos adaptados del CFA SFM, 2000 2001.
** Adaptado a partir de los dimetros crticos de la Cefoperazona segn el NCCLS 2001

El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ampicilina es tambin vlido para
Amoxicilina.
Tomar en cuenta las resistencias naturales de las enterobacterias para el reporte.
Disco de Ampicilina/Sulbactam y Amoxicilina/cido Clavulnico:
En enterobacterias no existe una disociacin de resultados para estos discos por lo que debe
utilizarse uno solo de ellos en el antibiograma.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

79
79
Disco de Cefalotina:
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Cefalotina es generalmente vlido
para la Cefazolina. Tambin es vlido para Cefadroxilo, Cefradina, Cefalexina, Cefaclor y
Loracarbef pero nicamente de las cepas aisladas de infecciones urinarias.
En el caso de Salmonella spp y Shigella spp las Cefalosporinas de primera y segunda
generacin no son eficaces clnicamente por lo que deben ser reportadas como resistentes a
estos antibiticos an cuando se observe actividad in vitro.

Discos de Aminoglucsidos:
En el caso de Salmonella spp. y Shigella spp los Aminoglucsidos no son eficaces
clnicamente por lo que deben ser reportadas como resistentes a estos antibiticos an
cuando se observe actividad in vitro.
El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para la
Discos de Cefalosporinas de tercera generacin y Aztreonam:
Para Enterobacter spp., Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris,
Morganella morganii y Providentia stuartii un resultado intermedio o resistente a
Cefotaxima, Ceftriaxona, Ceftazidima o Aztreonam obliga a reportar como intermedio o
resistente a todo este grupo de antibiticos.
El disco de Cefixima no debe utilizarse en el antibiograma de Morganella morganii.
Algunas cepas de enterobacterias, principalmente de Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae, son clnicamente resistentes a las Cefalosporinas de tercera generacin y al
Aztreonam debido a la produccin de betalactamasas de espectro extendido. Este tipo de
resistencia puede ser difcil de detectar en el antibiograma estndar.

ANTIBIOGRAMA DE HAEMOPHI LUS SPP.

MEDIO DE CULTIVO
Haemophilus test medium (HTM). Ver Anexo C para su preparacin.

INOCULO
Suspensin directa de la colonia en caldo Mueller Hinton o solucin salina al 0,9 % a partir de un
cultivo en agar chocolate de 20 24 h de incubacin. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar
0,5 de la escala de Mc. Farland.
NOTA: No preparar inculos densos superiores a 0,5 de la escala de Mc. Farland, especialmente con
H. influenzae productores de betalactamasas, que pueden conducir a resultados falsamente resistentes
a las cefalosporinas.

Tabla 39.- Antibiticos a utilizar en el antibiograma de Haempphylus.
Grupo I: Grupo II:
Ampicilina
Ampicilina/Sulbactam o
Amoxicilina/cido Clavulnico
Cefaclor
Cefuroxima
Ceftriaxona o Cefotaxima
Cloramfenicol

Cefixima.
Cefepime
Aztreonam
Azitromicina o Claritromicina
Levofloxacina o Ciprofloxacina o
Moxifloxacina u Ofloxacina
Rifampicina
Tetraciclina
Meropenem

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

80
80

Los Haemophilus son resistentes a Clindamicina y Lincomicina.

INCUBACIN: 35C en atmsfera de 5% de CO2
LECTURA: 16 18 h
Al realizar la medicin del halo de inhibicin no considerar la zona de desarrollo dbil o de
pequeas colonias que pueden encontrarse cercanas al borde neto del halo.

Tabla 40.- Antibiticos y Dimetros Crticos para Haemophylus spp.
Ampicilina 30 g <18 19-21 >22
Ampicilina/Sulbactam 10/10 g <19 >20
Amoxicilina/clavulnico 20/10 g <19 >20
Cefaclor 30 g <16 17-19 >20
Cefuroxima 30 g <16 17-19 >20
Cefoxitina 30 g <14 15-17 >18
Cefotaxima 30 g >26
Ceftriaxone 30 g >26
Ceftazidima 30 g <14 15-17 >18
Cefixima 5 g >21
Cefepime30 g >26
Meropenem 10 g >20
Aztreonam 30 g >26
Azitromicina 15 g >12
Claritromicina 15 g <10 11-12 >13
Ciprofloxacino 5 g >21
Levofloxacino 5 g >17
Moxifloxacino 5 g >18
Ofloxacino 5 g >16
Cloramfenicol g <25 26-28 >29


El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ampicilina es tambin vlido para
Amoxicilina.
Para detectar una posible resistencia a Ampicilina y Amoxicilina por produccin de una
betalactamasa recomendamos la realizacin del test de la nitrocefina.
Una resistencia a Ampicilina con un test de nitrocefina negativo obliga a informar la cepa
como resistente a Amoxicilina, Ampicilina/Sulbactam, Amoxicilina/cido Clavulnico,
Cefaclor y Cefuroxima, a pesar de una aparente actividad in vitro.

ANTIBIOGRAMA DE VI BRI O CHOLERAE

MEDIO DE CULTIVO: Agar Mueller Hinton
INOCULO: Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez
equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

81
81
Tabla 41.- Antibiticos a utilizar en el antibiograma de Vibrio cholerae
Ampicilina
Cloramfenicol
Tetraciclina
Ciprofloxacino

Se pueden incluir otros antibiticos segn vigilancia de resistencia antimicrobiana.

Son resistentes a Penicilina, Oxacilina, Macrlidos, Clindamicina y Glicopptidos.

INCUBACIN: 35C
LECTURA: 16 18 h

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS

Tabla 42.- Antibiticos y Dimetros Crticos para V. cholerae
Ampicilina 10 g <13 14-16 >17
Tetraciclina 30 <14 15- 18 >19
Cloramfenicol 30 <12 13-17 >18
Trimetoprim/sulfametoxazol 1.25/23.75 <10 11-15 >16

Es la clase representativa de la Ampicilina y Amoxicilina.
Los resultados con discos de Tetraciclina pueden ser usados para predecir la sensibilidad a la
Doxiciclina.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

82
82

ESTUDIO DE RESISTENCIA BACTERIANA

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

83
83
Introduccin

El estudio de resistencia antibitica utiliza las mismas condiciones que se usan para el antibiograma,
es decir placas de Mueller Hinton que hayan pasado el control de calidad, concentracin bacteriana
de 0.5 Mc Farland, incubacin a 37C durante 18 a 24 horas.
Algunas Infecciones causadas por grmenes susceptibles responden apropiadamente al tratamiento
en un 90% de veces aproximadamente. A su vez, las infecciones causadas por grmenes resistentes
responden a la terapia antibitica inapropiada en un 60% de veces,
8
Esto crea cierta discrepancia
entre el examen de laboratorio y la respuesta clnica, la cual est dada por otros factores especficos
del paciente como son: estado de la funcin renal, sitio de la infeccin, volumen de distribucin, etc.
existiendo algunas infecciones leves que ceden espontneamente sin ningn tratamiento.
Para iniciar una terapia emprica antes que se conozcan los resultados de laboratorio, se debe conocer
la susceptibilidad propia del hospital, esto podra asegurar una pronta buena respuesta clnica. Para
ello el laboratorio debe realizar un buen estudio de susceptibilidad antibitica y un informe adecuado
(ver tabla ), ya que un error en laboratorio podra generar una inadecuada terapia y por ende una
mala respuesta clnica, tal como sucede con algunos grmenes que por naturaleza son resistentes a
algunos antibiticos y que sin embargo basndose en la susceptibilidad in vitro se informa como
sensible, o en el caso de la resistencia bacteriana por mecanismos enzimticos, tal como ocurre con
las betalactamasas, en las cuales podra salir susceptible un antibitico, en un germen que presenta
beta lactamasa de expectro extendido y que afecta a todo el grupo de antibiticos betalactamicos y
que por error de laboratorio se informa como susceptible. Otro de los errores se debe al desarrollo
del germen, crecimiento lento, requerimientos, etc.
Existen ms de 150 tipos de betalactamasas y en esta seccin describiremos aquellas que son
posibles realizar, sin usar mtodos complejos, por lo tanto se incluyen en el test de rutina, como
complemento del informe de susceptibilidad.
Tabla 43 Grado de error de acuerdo a las categoras del resultado contra los resultados del mtodo.
Resultado de lectura Resultado del informe Valoracin del informe
Resistente
Resistente Aceptable
Intermedio Error menor
Susceptible Error grave
Intermedio
Resistente Error menor
Intermedio Aceptable
Susceptible Error menor
Susceptible
Resistente Error grave
Intermedio Error menor
Susceptible Aceptable
Los microorganismos grampositivos de mayor trascendencia clnica son el Staphylococcus
aureus, estafilococos coagulasa negativa (ECN), Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium y varias especies de Streptococcus, entre las que destaca Streptococcus pneumoniae.
Las betalactamasas son detectadas usando un disco impregnado de una cefalosporina
cromognica, llamada nitrocefin, la cual por accin de la betalactamasa experimenta un
cambio en su estructura, lo que resulta en un producto coloreado (naranja-rojo).

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

84
84

RESULTADOS ERRNEOS

Se pueden obtener resultados errneos cuando se realizan pruebas de sensibilidad de algunas drogas
y se informan como sensibles frente a microorganismos especficos. Estas combinaciones incluyen
como algunos ejemplos las siguientes:
(1) Cefalosporinas de 1 y 2 generacin y aminoglicsidos frente a Salmonella spp. y Shigella spp.
(2) Todos los antibiticos betalactmicos, (excepto oxacilina, meticilina y nafcilina) frente a
Staphylococcus spp. meticilino resistentes.
(3) Cefalosporinas, aminoglicsidos, (excepto para deteccin de alto nivel de resistencia),
clindamicina y trimetoprim/sulfametoxazole frente a Enterococcus.
(4) Cefalosporinas frente a Listeria spp.

RESISTENCIA ANTIMICROBIANA EN GERMENES GRAM POSITIVOS

RESISTENCIA A LA PENICILINA POR STAFILOCOCCUS AUREUS Y ENTEROCOCCUS

PROPSITO Y ALCANCE
Describir el procedimiento de deteccin rpida de la produccin de betalactamasa (penicilinasa) por
microorganismos de los gneros Staphylococcus y Enterococcus a partir de colonias en cultivo puro.

FUNDAMENTO
La Penicilinasa es una betalactamasa que modifica e inactiva las penicilinas. Si un microorganismo
la produce, indica que ste es resistente a todas las penicilinas (penicilina, ampicilina, amoxicilina,
carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina). Para su deteccin se utilizan discos
impregnados con una cefalosporina cromognica (nitrocefin) la cual en presencia de betalactamasa
se hidroliza y vira a color rojo (fig. 1).

PROCEDIMIENTO
Con la ayuda de las pinzas previamente flameadas y fras depositar un disco de nitrocefin sobre
un portaobjetos.
Humedecer el disco con agua estril utilizando la pipeta Pasteur.
Recoger con un asa de cultivo varias colonias del borde del halo de inhibicin de la penicilina
(induccin de betalactamasas), depositarlas sobre el disco de nitrocefin y dejar a temperatura
ambiente durante 5 minutos. En el caso de Enterococcus no es necesario inducir previamente con
penicilina por lo que se pueden tomar colonias crecidas en medio de agar sangre o chocolate.
Observar hasta 15 minutos el cambio de color, si vira de blanco a rojo, indica un resultado
positivo, es decir el micoorganismo producce betalactamasa y por tanto, es resistente a todas las
penicilinas incluyendo a ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, azlocilina,
mezlocilina y piperacilina (Figura 1).

Figura 4. Prueba de deteccin de beta-lactamasa. Resultado: Izquierda: negativo; derecha: positivo.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
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Observaciones
Los microorganismos del gnero Staphylococcus producen pequeas cantidades de betalactamasa
que en ocasiones pueden no detectarse con este mtodo si no se ha realizado una induccin previa,
por lo que siempre se debe tomar colonias del borde del halo de inhibicin de penicilina. Es
conveniente que el inculo bacteriano que se deposita en el disco sea grande ya que puede haber
falsos negativos con inculos bajos.
En el caso del gnero Enterococcus, se debe realizar la prueba de betalactamasa a todas las cepas,
incluso a las sensibles a la ampicilina.

CONSIDERACIONES
Usando el disco de Penicilina de 10 U, se considera Staphylococcus resistente, cuando el halo de
inhibicin es < 29 mm.

Tabla 44.- Resistencia bacteriana a staphylococcus aureus
Organismo
Penicilina 10 U
Dimetro del halo en mm
Comentarios

Resistente Sensible
Staphylococcus 29 > 29
Los resultados son vlidos para ampicilina, amoxicilina,
carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina.

DETECCIN DE RESISTENCIA A LA METICILINA EN STAPHYLOCOCCUS
PROPSITO Y ALCANCE
Definir los mtodos utilizados para realizar el estudio de la sensibilidad a meticilina en cepas del
gnero Staphylococcus.
FUNDAMENTO
En los estafilococos, la resistencia a la meticilina se debe a la adquisicin del gen mecA que codifica
la protena fijadora de penicilina (PBP), que posee baja afinidad por los betalactmicos. La expresin
de esta resistencia en los estafilococos puede ser homognea o heterognea. Para detectar la
resistencia heterognea, se requiere el uso de un marcador de esta resistencia (cefoxitina).
DETECCIN DE RESISTENCIA A LA METICILINA
Procedimiento operativo.
Una vez preparado el inculo, depositar un disco de oxacilina de 1 g y otro de cefoxitina de 30 g,
separados, sobre la superficie inoculada y dejar unos minutos a temperatura ambiente para permitir la
difusin del antimicrobiano.
Incubar: en estufa a temperatura no superior a 35C en atmsfera aerobia.
Lectura: de los resultados a las 24 horas.
Para el estudio de resistencia a meticilina se usa discos de oxacilina (1g) o cefoxitina (30 g), la
cefoxitina es mejor inductor de la betalactamasa regulado por el gen MecA, e indica resistencia a

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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todas las penicilinas semisintticas (oxacilina, meticilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina),
cefalosporinas y carbapenems e incluye a todas las penicilinas naturales. (ver tablas N 45 y 46 )
Tabla 45.- Resistencia de Staphylococcus a oxacilina
Organismo
Oxacilina 1 g
Dimetro del halo en mm
Comentarios

Resistente Sensible
S. aureus
< 10 > 24
Los resultados son vlidos para todos
los betalactmicos y se consideran
Meticilino resistentes
Staphylococcus coagulasa
negativa
< 17

> 18

Tabla 46.-. Prueba de tamizaje para prediccin de meticilino resistencia en Staphylococcus spp. mediada por
gen mec-A, usando disco de Cefoxitina 30 ug
Organismo
Cefoxitina 30 g
Dimetro del halo en mm Comentarios

Resistente Sensible
S. aureus < 19 > 20
Los resultados son vlidos para
Oxacilina y todos los
betalactmicos y se consideran
Meticilino resistentes
S. coagulasa Negativa
< 24

> 25

Resistencia a la meticilina. En las cepas con resistencia homognea a la meticilina se observa
resistencia a la oxacilina y a la cefoxitina. Si la resistencia es heterognea se puede observar
sensibilidad a la oxacilina y resistencia a la cefoxitina (ver figura 6). Si se trata de resistencia de tipo
BORSA (Borderline o lmite de resistencia a la oxacilina) se observar resistencia a la oxacilina y
sensibilidad a la cefoxitina. En este caso, la resistencia a oxacilina se debe informar como tal, pero
no implica resistencia al resto de los beta-lactmicos, la resistencia a la cefoxitina es un marcador de
la resistencia mediada por el gen mecA y por tanto, en Staphylococcus, esto implica resistencia a
todos los betalactmicos y los microorganismos deben ser informados como resistentes.
El fenotipo de resistencia a la meticilina (y a la oxacilina) es mucho ms frecuente entre las
diferentes especies de ECN con la excepcin de Staphylococcus lugdunensis y Staphylococcus
saprophyticus.
En el caso de S. aureus y S. lugdunensis, tanto la resistencia a la oxacilina, a la cefoxitina o a las dos
simultneamente debe interpretarse como resistencia a la meticilina.

Figura 6. Deteccin de resistencia en Staphylococcus mediante difusin con discos de oxacilina y cefoxitina. Imagen
izquierda: cepa con resistencia homognea. Imagen derecha: cepa con resistencia heterognea.

Las cepas con resistencia intermedia a la oxacilina pero sensibles a la cefoxitina se deben informar
como sensibles a la cefoxitina y nunca se debe informar una sensibilidad intermedia a la oxacilina.
Del mismo modo, si se realiza la deteccin del gen mecA y/o de la PBP2a y los resultados son
negativos, el aislamiento debe informarse como sensible a la oxacilina. Estas cepas borderline mecA
negativas son sensibles a todos los betalactmicos, incluyendo cefalosporinas y carbapenems

Tabla 47.- Estudio de resistencia a la meticilina en staphylococcus

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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Tipo de
resistencia
Oxacilina
1 ug
Cefoxitina
30 ug
Comentarios
Homognea Resistente Resistente La cefoxitina es un marcador del gen mecA, lo que implica
resistencia a todos los betalactmicos. La oxacilina se informa
tambin como resistente Heterognea Sensible Resistente
Borderline Intermedia Sensible
La sensibilidad a oxacilina se informa como sensible y por lo
tanto son sensibles a todos los betalactmicos.
Borderline Intermedia Resistente
La sensibilidad a oxacilina se informa como borderline y por lo
tanto implica resistencia a todos los betalactmicos.
DETECCIN DE RESISTENCIA INDUCIBLE A LA CLINDAMICINA

PROPOSITO Y ALCANCE
Identificar la resistencia a los macrlidos y lincosamidas, en cepas de Staphylococcus.
FUNDAMENTO
En el caso de la resistencia a macrlidos y lincosamidas, el staphylococcus puede expresar
resistencia constitutiva a todos los antimicrobianos del grupo MLS (macrlidos, lincosaminas y
aminoglicsidos) o resistencia inducible y solamente manifestarse ante la presencia de un inductor,
para este ltimo es necesario usar en el antibiograma, un disco de clindamicina en presencia de un
inductor (eritromicina). La resistencia a los macrlidos y a la clindamicina es ms frecuente en cepas
de S. coagulasa negativo, que en S. aureus.

DETECCION DE RESISTENCIA
Si bien los macrlidos y lincosamidas tienen estructuras qumicas diferentes, los mecanismos de
accin son similares. En los estafilococos, la resistencia a los macrlidos (eritromicina,
claritromicina, azitromicina) puede asociarse a diferentes fenotipos de sensibilidad o de resistencia a
las lincosamidas (clindamicina). Los fenotipos que se observan mediante difusin con discos son: 1)
resistencia a la eritromicina y a la clindamicina; 2) resistencia a la eritromicina y sensibilidad a la
clindamicina pero con un achatamiento del halo de la clindamicina en la proximidad de la
eritromicina (D-test positivo); 3) resistencia a la eritromicina y sensibilidad a la clindamicina sin
achatamiento del halo (D-test negativo). En el primer caso se trata de resistencia constitutiva a la
eritromicina y a la clindamicina (fenotipo cMLS), en el segundo de resistencia constitutiva de
expresin inducible (fenotipo iMLS
B
) y en el tercero de resistencia a la eritromicina mediada por una
bomba de expulsin activa (fenotipo MS). Se puede identificar tambin un cuarto fenotipo de
resistencia a la clindamicina y sensibilidad a la eritromicina debido a la accin de enzimas que
inactivan las lincosamidas (codificadas por los genes lnu) aunque es poco frecuente.

Procedimiento operativo.
Una vez preparado el inculo, depositar un disco de eritromicina de 15 g y otro de clindamicina de
2 g, colocarlos a una distancia de 15 o 20 mm entre ambos sobre la superficie inoculada.

Incubar en estufa a temperatura de 35C durante 18-24 horas en atmsfera aerobia.

Lectura de los resultados: Observar si se produce un achatamiento del halo de la clindamicina en el
borde en prximo a la eritromicina. La presencia de este achatamiento indica resistencia inducible
(D-test positivo).

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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88
INTERPRETACIN Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS
Resistencia inducible a la clindamicina. Si se produce un achatamiento del halo de la clindamicina
en el borde en que est enfrentada a la eritromicina se tratar de una resistencia inducible (D-test
positivo) que indica la presencia de genes erm. Cuando la resistencia es inducible existe riesgo de
mutacin hacia la resistencia constitutiva durante el tratamiento con clindamicina. Esta posibilidad,
se debe indicar en el informe o bien se debe interpretar este resultado como resistente a la
eritromicina y a la clindamicina. Si, por el contrario, no se observa un achatamiento del halo (D-test
negativo) el mecanismo de resistencia implicado es una bomba de expulsin activa y el
microorganismo se debe informar como sensible a la clindamicina.

Tabla 48.- Estudio de resistencia inducida a la clindamicina en staphylococcus
Variantes
Eritromicina
15 ug
Clindamicina
2 ug
Comentarios
1 Resistente Resistente Resistencia constitutiva (cMLS)
2 Resistente Sensible
Resistencia inducible con achatamiento (iMLS), se informa
resiste ambos
3 Resistente Sensible
No existe achatamiento, bomba de expulsin activa (fenotipo
MS). Se informan como tales.
4 Sensible Resistente
enzimas que inactivan las lincosamidas (codificadas por los
genes lnu. Se informan como tales.
5 Sensible Sensible No existe resistencia.

Figura 7.- Test de induccin a la resistencia de clindamicina (D. test) Izquierda: cepa de Staphylococcus epidermidis con
resistencia a la eritromicina mediada por bomba de expulsin activa (D-test negativo). Derecha: cepa de S. aureus con
fenotipo MLS
B
inducible (D-test positivo).

SENSIBILIDAD DISMINUIDA A LOS GLUCOPPTIDOS
Los estafilococos mantienen una alta sensibilidad a los glucopptidos, de manera que lo ms
frecuente es que sean sensibles a la vancomicina y a la teicoplanina. Usando MIC por mtodo de
dilucin se observan cepas de Staphylococcus aureus vancomycin intermediae (VISA) que pueden
presentar sensibilidad disminuida o resistencia a la teicoplanina, por lo que hoy en da suele
utilizarse el trmino GISA (glycopeptide-intermediate S. aureus) para definirlas.
El mtodo de disco difusin no sirve para determinar la sensibilidad de los estafilococos a la
vancomicina porque no permite diferenciar las cepas de S. aureus o ECN sensibles de aquellas con
sensibilidad intermedia ni tampoco aquellas heterorresistentes, por lo que se recomienda realizar
estudio de MIC o e-test.
Las cepas VISA y hVISA (VISA heteroresistentes) se aslan con una frecuencia muy baja y
generalmente despus de un tratamiento prolongado con glucopptidos.
Tabla 49.- Puntos de corte (CMI, mg/L) definidos por el CLSI y por el EUCAST para vancomicina y
teicoplanina frente a Staphylococcus
Vancomicina
30 g
Teicoplamina
30 g
Comentario

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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89
Intermedia Sensible Cepas VISA o GISA
Intermedia Resistente Cepas VISA o GISA
Intermedia Intermedia Cepas VISA o GISA
Resistente Resistente Cepas raras

Figura 8.- Staphylococcus aureus con resistencia intermedia a la vancomicina. CMI de
vancomicina por e-test: 8 mg/L (la CMI por microdilucin es 4 mg/L). Como se ha
indicado anteriormente, el empleo del disco de vancomicina est desaconsejado
(aparentemente la cepa podra parecer sensible).

La deteccin fenotpica de las cepas de estafilococos con resistencia intermedia
o con heterorresistencia a los glucopptidos es difcil, sus caractersticas
morfolgicas son diferentes a las de las cepas sensibles, con apariencia de
cultivos mixtos de colonias grandes y pequeas de pigmentacin variable. Se debe determinar la
sensibilidad a la vancomicina en cada uno de los diferentes morfotipos, principalmente en el caso de
S. aureus.

RESISTENCIA A LA MUPIROCINA
La mupirocina o cido pseudomnico es un antimicrobiano de uso exclusivamente tpico que se
utiliza ampliamente para la descolonizacin de portadores nasales de S. aureus. El porcentaje de
cepas resistentes a la mupirocina es superior en cepas de ECN que en S. aureus.
Se pueden observar dos fenotipos de resistencia a la mupirocina: el de resistencia de bajo nivel
(CMIs entre 8 y 256 mg/L) y el de alto nivel (CMI > 512 mg/L). La mupirocina detiene la sntesis
proteica.
El CLSI establece las tcnicas para la deteccin de cepas con resistencia a este compuesto. Para ello
indica el uso del disco de 200 g en condiciones estndar de temperatura y tiempo de incubacin.
EUCAST plantea el uso del disco de 200 g y los puntos de corte > 30 mm (S) y < 18 mm (R) pero
exclusivamente para cepas implicadas en procesos de colonizacin nasal. Asimismo, diferentes
estudios recomiendan que se consideren cepas sensibles si el halo de inhibicin es > 14 mm
(utilizando discos de 5 g). En el caso de que mediante la tcnica de difusin con el disco de 5 g la
cepa sea resistente (halo <14 mm) ser necesario determinar siempre la CMI mediante el mtodo de
microdilucin o mediante Etest, ya que un valor de CMI de 8 o de 256 mg/L tiene diferentes
implicaciones clnicas. Si no se dispone de estas tcnicas se puede utilizar la combinacin de discos
de mupirocina de 5 g y de 200 g o bien utilizar solamente el de 200 g para determinar si la
resistencia es de bajo o de alto nivel como se indica en la tabla 2.
Si una cepa presenta resistencia de bajo nivel a la mupirocina, se puede usar este antimicrobiano en
la descolonizacin nasal con pomada de mupirocina al 2%, sin embargo existe mayor riesgo de
fracaso, que cuando la cepa es sensible a la mupirocina. En cepas con resistencia de alto nivel, el
antimicrobiano es ineficaz.

Tabla 50.- Fenotipos de resistencia a mupirocina obtenidos mediante el mtodo de difusin con discos. (Finlay JE et al.
Antimicrob Agents Chemother. 1997;41:1137-9) y su relacin con los valores de CMI (mg/L)
Sensible
(mm halo)
RBN
(mm halo)
RAN
(mm halo)
Un disco: (20 g) > 17 6-16 -
Dos discos: (5 g)
(200 g)
> 14
>6
<14
>6
<14
-

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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MIC mg/L < 4 8-256 > 512
RBN: Resistencia de bajo nivel
RAN: Resistencia de alto nivel

RESISTENCIA AL LINEZOLID
La resistencia al linezolid es poco frecuente y generalmente se produce en pacientes con tratamientos
prolongados con este antimicrobiano, por diseminacin de transposones o plsmidos.
En el laboratorio se pueden observar tres fenotipos de resistencia al linezolid en estafilococos: a)
resistencia cruzada al linezolid y a las pleuromutilinas; b) resistencia cruzada al linezolid, los
fenicoles, las pleuromutilinas, las lincosamidas y la estreptogramina A; c) resistencia cruzada al
linezolid, los macrlidos y el cloranfenicol, al tratarse de un mecanismo de resistencia transferible, si
no se detecta precozmente hay riesgo de transmisin a otras cepas si no se implantan las medidas
adecuadas.
En el caso de las cepas resistentes al linezolid es caracterstica la resistencia simultnea a la
clindamicina y al cloranfenicol, con sensibilidad a macrlidos. Sin embargo, la relativa frecuencia de
cepas que presentan dos o tres mecanismos de resistencia diferentes (resistencia al cloranfenicol,
resistencia de tipo MLS
B
, etc.) dificulta la adecuada deteccin de resistencia al linezolid.

RESISTENCIA A LOS AMINOGLUCOSIDOS
La resistencia de los estafilococos a los aminoglucsidos es ms frecuente en los ECN que en S.
aureus
Los dos fenotipos ms frecuentes son el de resistencia a la gentamicina y a la tobramicina pero
sensibilidad aparente a la amicacina y el de sensibilidad a la gentamicina y resistencia a la
tobramicina y a la amicacina. En ambos casos la resistencia se debe a la produccin de enzimas
modificadoras de aminoglucsidos.
La tobramicina es el mejor marcador de este mecanismo de resistencia, de modo que aquellas cepas
que aparezcan como sensibles a la gentamicina y resistentes a la tobramicina deben informarse como
resistentes a la amicacina.
Para detectar este mecanismo de resistencia del estafilococo, se debe usar los discos de gentamicina
y tobramicina. No se debe asumir que la sensibilidad a la gentamicina implica tambin sensibilidad
al resto de los aminoglucsidos.
Tabla 51.- Estudio de resistencia a los aminoglucsidos en staphylococcus
Tipo de resistencia
Gentamicina
10 g
Tobramicina
10 g
Amikacina
10 g
Comentarios
Produccin de la
enzima bifuncional
AAC(6)-APH(2").
Resistente Resistente Sensible
Indica resistencia a todos los aminoglicsidos con
excepcin de estreptomicina, as sean sensibles in
vitro. Se informa amicacina resistente
Produccin de la
enzima ANT(4)(4")
Sensible Resistente
Sensible a
Resistente
Indica resistencia a todos los aminoglicsidos as
sean sensibles in vitro. Se informa gentamicina y
amicacina resistente.

DETECCIN DE RESISTENCIA DE ALTO NIVEL A LOS AMINOGLUCSIDOS EN
ENTEROCOCOS (RAN)
PROPSITO Y ALCANCE
El propsito de este documento es la descripcin del procedimiento de deteccin de resistencia de
alto nivel a los aminoglucsidos (gentamicina y estreptomicina) en cepas del gnero Enterococcus.
FUNDAMENTO

PRIMERA EDICION
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Los enterococos presentan resistencia intrnseca de bajo nivel a los aminoglucsidos pero cuando
stos se usan en combinacin con antimicrobianos activos a nivel de la pared celular (betalactmicos
y glucopptidos) se produce un efecto bactericida sinrgico, necesario para el tratamiento de
infecciones graves en las que estn implicados estos microorganismos. La adquisicin de
mecanismos de resistencia, fundamentalmente por produccin de enzimas modificadoras de
aminoglucsidos, da lugar a resistencia de alto nivel (RAN) lo que impide el efecto sinrgico de
estos antimicrobianos con betalactmicos o glucopptidos. No existe resistencia cruzada entre la
gentamicina y la estreptomicina ya que las enzimas modificadoras de aminoglucsidos afectan de
forma diferente a ambos compuestos por lo que es importante estudiar la sensibilidad a ambos. La
RAN a la estreptomicina implica solamente resistencia a este antimicrobiano, mientras que la RAN a
la gentamicina implica generalmente RAN al resto de los aminoglucsidos de uso clnico, con la
excepcin de la estreptomicina. Se presentan los mtodos de deteccin fenotpica de la esta RAN
mediante la prueba de difusin en agar con discos de alta carga de antimicrobiano y mediante la
determinacin de la CMI por microdilucin en caldo y por dilucin en agar.

PROCEDIMIENTO
MTODO DE DIFUSIN CON DISCO
Una vez preparado el inculo, colocar un disco de gentamicina (120 g y 30 g) y de estreptomicina
(300 g) en la superficie del agar con la ayuda de unas pinzas.
Incubar las placas durante 18-24 horas en estufa en ambiente aerobio a 35C.
Leer el halo de inhibicin de los discos. Ver tabla N

Tabla 52.- Resistencia de alto nivel (RAN) en Enterococcus.
Gentamicina
30 g
Gentamicina
120 g
Estreptomicina
300 g
Comentarios
- >10 mm >10 mm Indica ausencia de RAN
- 7 9 mm 7 9 mm Resultado dudoso confirmar por MIC
- 6 mm 6 mm Indica presencia de RAN
< 8 mm - - Indica presencia de RAN
RAN = Resistencia de alto nivel
MIC= Concentracin inhibitoria mnima, por microdilucin.

EXPRESIN DE RESULTADOS
Si se detecta resistencia a alguno de los aminoglucsidos estudiados por alguna de las tcnicas
anteriormente indicadas, se expresar el resultado como RAN a dicho antimicrobiano y ausencia de
posible sinergia de dicho compuesto con agentes activos a nivel de la pared celular (betalactmicos o
glucopptidos).
ANOTACIONES Y LIMITACIONES AL PROCEDIMIENTO
En general solamente se utilizan los discos de 120 g para la deteccin de la RAN a gentamicina. Sin
embargo, existen enzimas modificadoras de gentamicina que dan lugar a moderados niveles de
resistencia a este antimicrobiano que no se detectan con el disco de 120 g ni con los mtodos de
microdilucin o de dilucin en agar indicados. Aunque este mecanismo es muy infrecuente, la
utilizacin adicional del disco de 30 g de gentamicina permite detectarlo.

DETECCIN DE RESISTENCIA A LOS GLUCOPPTIDOS EN ENTEROCOCOS

PRIMERA EDICION
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PROPSITO Y ALCANCE
El propsito de este documento es la descripcin del procedimiento de deteccin de resistencia a los
glucopptidos en cepas del gnero Enterococcus.

FUNDAMENTO
Los glucopptidos actan mediante su unin al precursor del peptidoglicano D-alanina-D-alanina, lo
cual afecta a la sntesis de la pared celular. Enterococcus puede ser resistente a estos antimicrobianos
debido a la adquisicin de genes que dan lugar a un precursor modificado del peptidoglicano por el
cual estos compuestos pierden su afinidad. Existiendo dos tipos de resistencia: 1) intrnseca, ligada a
las especies E. gallinarum, E. casseliflavus y E. flavescens, que se caracteriza por conferir bajos
niveles de resistencia a la vancomicina (CMI 2-32 mg/L) y sensibilidad a la teicoplanina (CMI 0,5-2
mg/L). Esta resistencia es de carcter cromosmico y no transferible y por tanto con poca
trascendencia epidemiolgica; 2) adquirida, se han descrito 6 tipos diferentes aunque los tipos VanA
y VanB son los ms frecuentes. VanA confiere altos niveles de resistencia a la vancomicina y a la
teicoplanina y VanB confiere moderados niveles de resistencia a la vancomicina y sensibilidad a la
teicoplanina. Es muy importante detectar estos fenotipos de resistencia ya que son potencialmente
transferibles, tienen importante trascendencia clnica y epidemiolgica y se tienen que considerar en
los programas de control de la infeccin.
PROCEDIMIENTO
MTODO DE DIFUSIN CON DISCOS
Una vez preparado el inculo, en Mueller Hinton, colocar los discos de vancomicina y teicoplanina
(30 g) en la superficie del agar.
Incubar las placas durante 24 horas en estufa en ambiente aerobio a 35C.
Leer el halo de inhibicin de los discos. Ver tabla N 53.
Tras la incubacin, los halos de inhibicin deben ser ledos con luz transmitida. La presencia de velo
en la zona de inhibicin o de cualquier tipo de crecimiento indica resistencia. Los microorganismos
con halos de inhibicin en el rango intermedio, 15-16 mm (CLSI) deberan ser estudiados mediante
tcnicas de microdilucin o con Etest mediante la prueba de cribado en placa suplementada con 6
mg/L de vancomicina. Las especies con resistencia intrnseca a la vancomicina son mviles.

EXPRESIN DE RESULTADOS
Si se detecta resistencia a la vancomicina (con o sin resistencia a la teicoplanina) en cepas de
enterococo de especies diferentes a E. gallinarum/E.casseliflavus/ E.flavescens, debe informarse
como tal y adoptar las medidas de control pertinentes en cada caso. Si la cepa presenta resistencia
adquirida tanto a la vancomicina como a la teicoplanina, probablemente se trate del mecanismo
vanA, que generalmente est localizado en plsmidos transferibles por conjugacin lo que tiene una
gran importancia epidemiolgica. Si la cepa presenta moderada resistencia a la vancomicina y es
sensible a la teicoplanina, probablemente se trate del mecanismo vanB2, emergente en muchos
hospitales y que tambin puede ser transferible por conjugacin y de importancia epidemiolgica. La
presencia de este tipo de resistencia en Enterococcus invalida el efecto sinrgico de estos
antimicrobianos con los aminoglucsidos, requerido en el tratamiento de infecciones enteroccicas
graves en pacientes alrgicos a betalactmicos.
ANOTACIONES Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
La alta resistencia a la vancomicina y a la teicoplanina, se detecta con facilidad. Por ello es
importante realizar la incubacin de los cultivos 24 horas completas, leer los antibiogramas con luz
transmitida y en caso de que los halos de inhibicin estn en el rango intermedio o se sospeche
resistencia a la vancomicina por crecimiento de colonias o velo en el interior del halo, se proceder al
estudio de sensibilidad por otro mtodo como es el estudio de la CMI o bien la determinacin de

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crecimiento en placas selectivas suplementadas con vancomicina.
Es recomendable siempre realizar las pruebas de deteccin de movilidad y de pigmentos ante la
sospecha de resistencia a la vancomicina en enterococos para descartar la presencia de las especies
con resistencia intrnseca (E. gallinarum/E.casseliflavus/E.flavescens). E. gallinarum es una especie
mvil y no produce pigmentos mientras que las otras dos son mviles y producen pigmentacin
amarilla.

Tabla 53.- Resistencia a glicopptidos en Enterococcus.
Vancomicina
30 g
Teicoplamina
30 g
Tipo de resistencia Comentarios
Resistente >10 mm Resistencia intrnseca La presencia de velo en la zona
de inhibicin o de cualquier
tipo de crecimiento indica
resistencia
Resistente 7 9 mm Resistencia extrnseca
Resistente 6 mm Indica presencia de RAN
< 8 mm - Indica presencia de RAN
RAN = Resistencia de alto nivel
MIC= Concentracin inhibitoria mnima, por microdilucin.

DETECCIN DE RESISTENCIA A LOS BETALACTMICOS EN Streptococcus
pneumoniae
PROPSITO Y ALCANCE
El propsito de este documento es la descripcin del procedimiento de deteccin de resistencia a los
betalactmicos en Streptococcus pneumoniae.

FUNDAMENTO
Los betalactmicos son antimicrobianos de amplio espectro utilizados en el tratamiento de las
infecciones neumoccicas y actan sobre las protenas fijadoras de penicilina (PBP) y las
alteraciones de las mismas confieren resistencia a estos antimicrobianos.
La deteccin de cepas de neumococo con resistencia a los betalactmicos es importante para prevenir
fallos teraputicos, especialmente en las infecciones menngeas. El antibiograma de difusin con
discos impregnados con oxacilina se utiliza como mtodo de cribado para la deteccin de cepas
resistentes a estos compuestos.

PROCEDIMIENTO
Prepara el inculo a partir de 3-4 colonias aisladas, con una turbidez de 0,5 de la escala McFarland.
Inocular la placa de Mueller Hinton con sangre (MH-S) utilizando las torundas estriles.
Colocar el disco de oxacilina en la superficie del agar (MH-S) con la ayuda de unas pinzas.
Incubar las placas durante 18-24 horas en la estufa de CO
2
a una temperatura de 35C. En su defecto,
pueden utilizarse jarras de incubacin con atmsfera de 5% de CO
2
e incubar en estufa convencional.
Tras la incubacin de 18-24 h se leer el dimetro del halo de inhibicin del disco de oxacilina.
Halo de inhibicin de oxacilina > 20 mm. Resultado definitivo: cepa sensible a la penicilina y a la
cefotaxima/ceftriaxona.
Halo de inhibicin de oxacilina <20 mm: cepa con posibles alteraciones en las PBPs. Se recomienda
determinar la CMI a la penicilina y a la cefotaxima mediante Etest o microdilucin.

DETECCIN DE RESISTENCIA A FLUOROQUINOLONAS EN Streptococcus pneumoniae

PRIMERA EDICION
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PROPSITO Y ALCANCE
El propsito de este documento es la descripcin del procedimiento de deteccin fenotpica de
resistencia a las fluoroquinolonas en S. pneumoniae.
2. FUNDAMENTO
Las quinolonas son antimicrobianos de amplio espectro que actan sobre la ADN girasa y la
topoisomerasa IV. El principal mecanismo de resistencia bacteriana a las quinolonas es debido a
mutaciones en una o en los dos puntos de accin.
La deteccin de cepas con mutaciones de primer nivel es importante para prevenir el desarrollo de
alta resistencia durante el tratamiento. Se utilizar el antibiograma por difusin con discos de
norfloxacino y de ciprofloxacino como mtodo de cribado para la deteccin de cepas con mutaciones
que confieren bajo nivel de resistencia a las fluoroquinolonas.

MUESTRAS
Aislamientos de S. pneumoniae en cultivo puro en medios de agar sangre o de agar chocolate en los
que se requiera la determinacin de la sensibilidad a las fluoroquinolonas.

PROCEDIMIENTO
Preparar el inculo a partir de 3-4 colonias aisladas, con una turbidez de 0,5 de la escala McFarland.
Inocular la placa de Mueller Hinton con sangre de carnero al 5%.
Colocar los discos de norfloxacino y ciprofloxacino en la superficie del agar (MH-S).
Incubar las placas durante 18-24 horas en la estufa con 5% de CO
2
a una temperatura de 35C. En su
defecto, pueden utilizarse jarras de incubacin con atmsfera de 5% de CO
2
e incubar en estufa
convencional.
Tras la incubacin de 18-24 h leer los halos de inhibicin de norfloxacino y ciprofloxacino.
La interpretacin de los halos se puede ver en la tabla N54.
Se recomienda determinar la CMI de ciprofloxacino mediante Etest o por microdilucin.

Tabla 54.- Resistencia a fluorquinolonas en Streptococcus.
Norfloxacino
5 g
Ciprofloxacino
5 g
Tipo de resistencia Comentarios
> 10 mm > 30 mm Cepa sensible
< 10 mm < 19 mm
Cepa resistente con posible
mutacin de primer nivel
El uso de quinolonas puede
llevar a resistencia de alto nivel
a todas.

ANOTACIONES Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
EUCAST recomienda utilizar para el cribado de resistencia de primer nivel a las fluoroquinolonas un
disco de norfloxacino de 10 g y considerar resistencia si el halo de inhibicin es <12 mm.
Algunos aislamientos de S. pneumoniae, especialmente los que tienen un fenotipo mucoso (serotipo
3) pueden dar halos de inhibicin inferiores a 10 mm para norfloxacino aunque no tengan
mutaciones en las topoisomerasas.

DETECCIN DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) EN
ENTEROBACTERIAS
Algunas cepas productoras de estas enzimas pueden presentar halos de inhibicin lo suficientemente
grandes como para ser clasificadas errneamente como sensibles a las Cefalosporinas de tercera
generacin y a Aztreonam. Con el objeto de superar esta dificultad, la tabla 7 seala los dimetros
para Ceftazidima, Cefotaxima, Ceftriaxona y Aztreonam que sern utilizados como test de tamizaje y

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que permiten sospechar la presencia de estas enzimas: Si la cepa estudiada presenta halos de
inhibicin, para al menos uno de estos antibiticos, iguales o inferiores a los dimetros referidos en
tabla 7 deber realizarse un test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro
extendido.

PROPSITO Y ALCANCE
Describir la metodologa para la deteccin fenotpica de betalactamasas de espectro extendido
(BLEE) mediante las tcnica de sinergia de doble disco. Este procedimiento es aplicables a aislados
clnicos de la familia Enterobacteriaceae y a Pseudomonas aeruginosa que presenten un patrn
fenotpico sugestivo de produccin de BLEE (sensibilidad disminuida o resistencia a cefalosporinas
de tercera generacin, aztreonam y cefepime).
FUNDAMENTO
Las tcnicas para la deteccin fenotpica de BLEE se basan en la propiedad que presentan la mayor
parte de estas enzimas de ser inhibidas por cido clavulnico y en la utilizacin de cefalosporinas de
tercera y cuarta generacin y aztreonam como indicadores.
La prueba de sinergia de doble disco consiste en situar un disco con amoxicilina-cido clavulnico
prximo a discos de betalactmicos indicadores. La produccin de BLEE se demuestra por la
ampliacin del halo de inhibicin de cualquiera de los indicadores por la accin del cido
clavulnico.
Para mejorar la deteccin de BLEE en cepas que producen simultneamente una betalactamasa de
tipo AmpC cromosmica o plasmdica, estos mtodos pueden modificarse con la adicin de
cloxacilina, al medio de cultivo o a los discos, que es un inhibidor de enzimas AmpC.

MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS
Agar Mueller-Hinton
- Agar Mueller-Hinton suplementado con cloxacilina (250 g/ml)
- Discos/tabletas: ceftazidima (30 g), cefotaxima (30 g), cefepime (30 g), aztreonam (30 g),
amoxicilina-cido clavulnico (20/10 g).
- Cloxacilina
- Agua destilada estril
- Estndar de turbidez equivalente a un 0,5 de la escala de McFarland

MUESTRAS
Estas tcnicas se pueden realizar a partir del crecimiento de la enterobacteria obtenida en un cultivo.

Tabla 55.- Dimetros crticos de tamizaje para la deteccin de Bectalactamasas de espectro extendido
ANTIBIOTICO CONCENTRACION HALO DE INHIBICION
Aztreonam 30 g <27
Ceftazidima 30 g <22
Cefotaxima 30 g <27
Ceftriaxona 30 g <25

Figura 8.- Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido, segn NCCLS

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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A) B)
CAZ, ceftazidima; CTX, cefotaxima; CAZ+C, ceftazidima + cido clavulnico; CTX+C, cefotaxima + cido clavulnico
CTXCX, cefotaxima + cloxacilina; CTXCC, cefotaxima + cido clavulnico + cloxacilina. En las placas se observa una
diferencia mayor a 5 mm, lo que indica presencia de BLEE.

Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido (segn el Comit
de Antibiograma de la Sociedad Francesa de Microbiologa):
Este test requiere el uso de discos habituales de Amoxicilina/Acido Clavulnico (20/10 mg),
Ceftazidima (30 mg) y/o Cefotaxima (30 mg) y/o Aztreonam (30 mg) y/o Ceftriaxona, con los que se
realiza un test de disco difusin sin ninguna variante.
Los discos de Ceftazidima, Aztreonam, Cefotaxima y Ceftriaxona se disponen de 20 a 25 mm del
disco de Amoxicilina/cido Clavulnico (distancia de centro a centro de los discos), dependiendo
del halo de sensibilidad estipulado para el micoorganismo, en el caso de Proteus mirabilis se
recomienda una distancia de 40-45 mm.
Si se observa una imagen como llave de cerradura antigua o la aparicin de un espacio intermedio
sin crecimiento bacteriano (rea fantasma), entre el disco Amoxicilina/cido Clavulnico y los
discos de Ceftazidima y/o Aztreonam y/o Cefotaxima y/o Ceftriaxona, se considera la prueba
positiva para la presencia de betalactamasas. Fig. 9 A y B.
Figura 9.-. Cepa de Escherichia coli productora de CTX-M-15 (A) y cepa de Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
productora de SHV-18 (B). Se observa la sinergia positiva entre las cefalosporinas y cido clavulnico.
A) B)
ATM/AZT, aztreonam; CAZ, ceftazidima; CTX, cefotaxima; CRO, ceftriaxona; FEP, cefepime; AMC, amoxicilina -cido
clavulnico.

Reporte de antibiograma de las enterobacterias productoras de betalactamasas de espectro
extendido:
Una vez detectadas las cepas productoras de estas betalactamasas de espectro extendido deben ser
reportadas como resistentes a todas las penicilinas, las cefalosporinas de todas las generaciones
(incluyendo los de cuarta generacin) y al Aztreonam, cualquiera que sea el dimetro de los discos
de estos antibiticos.

PRIMERA EDICION
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Consideraciones:
En aislados productores de AmpC seguir el mismo procedimiento utilizando agar Mueller-Hinton
suplementado con cloxacilina en lugar de agar Mueller-Hinton.
OBSERVACIONES AL PROCEDIMIENTO
La eleccin de cualquiera de las tcnicas descritas depender de las preferencias de cada laboratorio.
La prueba de sinergia de doble disco requiere que la distancia de separacin de los discos sea ptima
para evitar resultados falsos negativos o no concluyentes y la repeticin de la prueba.
La interpretacin de la tcnica de discos combinados con inhibidor es ms objetiva que la prueba de
sinergia de doble disco ya que los resultados obtenidos son cuantificables.
Para no perder sensibilidad en cualquiera de las pruebas es necesario estudiar como mnimo
cefotaxima y ceftazidima.
En el caso de cepas que produzcan simultneamente betalactamasas de tipo AmpC, la resistencia a
cido clavulnico puede enmascarar el efecto sinrgico de la BLEE, por lo que es recomendable
incluir cefepime como indicador.
Puede ser necesario confirmar y caracterizar el mecanismo de resistencia involucrado mediante
tcnicas de biologa molecular.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
La deteccin de BLEE utilizando estos procedimientos puede ser alterado por la presencia de otros
mecanismos de resistencia en el mismo microorganismo, como pueden ser alteraciones en la
permeabilidad o produccin simultnea de otras betalactamasas.
En las Enterobacteriaceae se pueden observar fenotipos compatibles con BLEE con presencia de
sinergia entre alguna cefalosporina de tercera o cuarta generacin o aztreonam y amoxicilina-cido
clavulnico en diversas situaciones:
Hiperproduccin de betalactamasa cromosmica K1 de Klebsiella oxytoca (ceftazidima se
mantiene sensible y no se produce sinergia entre sta y amoxicilina-cido clavulnico pero si con
otras cefalosporinas de tercera generacin, aztreonam y cefepime).
Hiperproduccin de la enzima SHV-1 natural en K. pneumoniae y adquirida en otras especies
(sinergia entre ceftazidima y amoxicilina-cido clavulnico).
hiperproduccin de betalactamasas cromosmicas inducibles de Proteus vulgaris, Proteus
penneri y Citrobacter koseri (sinergia entre cefotaxima y amoxicilina-cido clavulnico).
Hiperproduccin de enzimas tipo OXA no BLEE como OXA-1 (sinergia entre cefepima y
amoxicilina-cido clavulnico). Adems, las BLEE tipo OXA (OXA -11, -14, -18, -28, etc.)
pueden no ser detectadas con estos mtodos debido a que son dbilmente inhibidas por cido
clavulnico.

DETECCIN FENOTPICA DE BETALACTAMASAS PLASMDICAS TIPO AmpC
PROPSITO Y ALCANCE
Describir la metodologa para realizar la deteccin de betalactamasas de tipo AmpC plasmdicas
(AmpCp) mediante las tcnicas de sinergia de doble disco y aproximacin de discos, es til en
Klebsiella, Proteus, Citrobacter koseri y Salmonella que producen AmpCp (sensibilidad disminuida
o resistencia a amoxicilina-cido clavulnico y cefalosporinas de tercera generacin).
La prueba de aproximacin de discos tambin es aplicable a aislados que producen una
betalactamasa AmpC cromosmica no inducible tales como Escherichia coli.

FUNDAMENTO

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

98
98
La deteccin de betalactamasas AmpCp se basa en la propiedad que presentan estas enzimas de ser
inhibidas por cloxacilina o cido bornico y en la utilizacin de cefalosporinas de tercera generacin
(cefotaxima, ceftazidima) como indicadores. La produccin de AmpCp se demuestra por la
ampliacin del halo de inhibicin de cualquiera de los indicadores por la accin del inhibidor.
La prueba de aproximacin de discos permite evidenciar el carcter inducible de la betalactamasa
AmpCp. Consiste en situar un disco con un betalactmico inductor dbil (cefotaxima, ceftazidima,
aztreonam) cercano a un betalactmico inductor fuerte (imipenem, cefoxitina). El achatamiento del
halo del betalactmico inductor dbil en la zona adyacente al del inductor fuerte demuestra la
expresin inducible de la betalactamasa.
Hay que tener en cuenta los dimetros de inhibicin con el fin de ajustar la distancia de separacin
entre los discos.

Agar Mueller-Hinton
Discos: ceftazidima (30 g), cefotaxima (30 g), ceftazidima-cloxacilina (30/500 g), cefotaxima-
cloxacilina (30/500 g), cido bornico (250-400 g), cloxacilina (500 g)

PROCEDIMIENTO

1.- PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO
Seguir el procedimiento estndar para la realizacin de un antibiograma por el mtodo de difusin e
inocular una placa de agar Mueller-Hinton a partir de una suspensin de la cepa problema en
solucin salina con una turbidez equivalente a un 0,5 de la escala de McFarland.
Situar un disco con cefotaxima y un disco con ceftazidima a una distancia de 20-25 mm (centro a
centro) de un disco con cloxacilina o cido bornico. La separacin ptima de los discos puede
variar en funcin de la cepa.
Incubar: a 352C durante 16-20 horas.
2.- PRUEBA DE APROXIMACIN DE DISCOS
Seguir el procedimiento estndar para la realizacin de un antibiograma por el mtodo de difusin
con discos e inocular una placa de agar Mueller-Hinton a partir de una suspensin de la cepa
problema en solucin salina con una turbidez equivalente a un 0,5 de la escala de McFarland.
Situar discos de betalactmicos inductores dbiles tales como cefotaxima, ceftazidima y aztreonam
cercanos a discos de betalactmicos inductores fuertes tales como cefoxitina y imipenem.
Incubar: a 352C durante 16-20 horas.

OBTENCIN Y EXPRESIN DE RESULTADOS
PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO.- Fig 9 A y B
Examinar visualmente la apariencia de las zonas de inhibicin. Los resultados se interpretan de la
siguiente manera:
a) Positivo. Ampliacin del halo de inhibicin de cefotaxima o ceftazidima en la zona prxima al
disco con cloxacilina o cido bornico (sinergia) o presencia de una "zona fantasma" (inhibicin del
crecimiento) entre las cefalosporinas y el inhibidor.
b) Negativo. No ampliacin de los halos de inhibicin de las cefalosporinas ni "zona fantasma".
El resultado positivo se informar como cepa portadora de AmpCp.
PRUEBA DE APROXIMACIN DE DISCOS. Fig. 10
siguiente manera:

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

99
99
a) Positivo. Achatamiento del halo de inhibicin (forma de D) de los betalactmicos inductores
dbiles (cefotaxima, ceftazidima, aztreonam) en la zona a prxima al disco con el betalactmico
inductor fuerte (cefoxitina, imipenem).
b) Negativo. No modificacin de los halos de inhibicin.
El resultado positivo se informar como cepa portadora de AmpCp Inducible. En caso de obtener un
resultado positivo en E. coli nos indica sin duda que se trata de una AmpCp y no de una
hiperproduccin de su betalactamasa cromosmica, dado que esta ltima no es inducible.

Figura 10. A) Sinergia de doble disco con cepa de K. pneumoniae productora de AmpCp, usando cido bornico. B) Cepa
de P. mirabilis productora de AmpCp, se observa sinergia positiva entre las cefalosporinas, la cloxacilina y cido bornico.
A) B)
CAZ, ceftazidima; CTX, cefotaxima; CL, cloxacilina; BORON, cido bornico.

Figura 11.-. CAproximacin de discos, cepa de K. pneumoniae productora betalactamasa
AmpCp inducible. Se observa el achatamiento de los halos de aztreonam (AZT) y
cefotaxima (CTX) en la zona cercana al disco de cefoxitina (CFO).

AZT, aztreonam; CAZ, ceftazidima; CFO, cefoxitina; CTX, cefotaxima
OBSERVACIONES
La presencia de colonias en el interior de los halos de cefalosporinas y aztreonam en la zona prxima
al margen de inhibicin constituye una caracterstica fenotpica altamente sugestiva de la presencia
de AmpCp. Este hecho puede ser especialmente til en E. coli para sospechar la presencia de una
AmpCp en lugar de una hiperproduccin de su betalactamasa cromosmica.

Estos mtodos slo son aplicables a determinadas especies bacterianas ya que no permite diferenciar
entre betalactamasas AmpC plasmdicas y cromosmicas. Adicionalmente, la utilizacin de cido
bornico reduce la especificidad en la deteccin ya que tambin puede dar resultados positivos en
cepas productoras de carbapenemasas de clase A como las KPC.

DETECCIN FENOTPICA DE CARBAPENEMASAS
PROPSITO Y ALCANCE
Describir la metodologa para la deteccin fenotpica de carbapenemasas mediante las tcnicas de
Hodge modificado, sinergia de doble disco y discos combinados con inhibidor.
Estos procedimientos son aplicables a aislados de la familia Enterobacteriaceae, Pseudomonas
aeruginosa y otros bacilos gramnegativos que presenten un patrn compatible con la produccin de
carbapenemasas (sensibilidad disminuida o resistencia a cefalosporinas de tercera generacin y
carbapenmicos).

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

100
100

FUNDAMENTO
Las carbapenemasas son un grupo heterogneo de betalactamasas distribuidas en las clases
moleculares A, B y D que presentan actividad hidroltica sobre los carbapenmicos y la totalidad de
antibiticos betalactmicos clnicamente relevantes.
El test de Hodge modificado es la tcnica que el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
recomienda para la deteccin fenotpica de carbapenemasas. La inactivacin de los carbapenmicos
por la cepa productora de carbapenemasa permite el crecimiento de un microorganismo indicador
sensible a los lados de una estra efectuada con la cepa productora, en una placa con un disco de
carbapenmico. Esta tcnica permite detectar la produccin de carbapenemasas pero no proporciona
informacin sobre la clase a la que pertenecen. Para ello se utilizan las tcnicas de sinergia de doble
disco, discos combinados con inhibidor y Etest MBL que se basan en la potenciacin de la actividad
de los carbapenmicos en presencia de inhibidores de carbapenemasas. Para la deteccin de
carbapenemasas de clase A, el inhibidor utilizado es el cido bornico. Para la deteccin de
carbapenemasas de clase B los inhibidores son el cido dipicolnico o EDTA.

Tubos con solucin salina estril 0,9%
Agar Mueller-Hinton
Agar Mueller-Hinton suplementado con cloxacilina (250 g/ml)
Discos/Tabletas: imipenem (10 g), meropenem (10 g), ertapenem (10 g), imipenem-cloxacilina
(10/500-750 g), meropenem-cloxacilina (10/500-750 g), imipenem-cido bornico (10/300-600
g), meropenem-cido bornico (10/300-600 g), imipenem-cido dipicolnico (10/250-1000 g),
meropenem-cido dipicolnico (10/250-1000 g), imipenem-EDTA (10/730-1500 g), meropenem-
EDTA (10/730-1500 g), cido bornico (300-600 g), cido dipicolnico (250-1000 g), EDTA
(750-1500 g), Etest MBL (bioMrieux).
Estndar de turbidez equivalente a un 0,5 de la escala de McFarland
Cepa Escherichia coli ATCC 25922

PROCEDIMIENTO
PREPARACIN DE LOS DISCOS CON INHIBIDOR
a) Preparar las soluciones madre de cido amino-fenil-bornico (disuelto en agua estril) o fenil-
bornico (disuelto en DMSO y agua estril), cloxacilina (disuelto en agua estril), cido dipicolnico
(disuelto en DMSO y agua estril) o EDTA (disuelto en agua estril).
b) Aadir el volumen adecuado de la solucin de inhibidor a los discos blancos (prueba de sinergia
de doble disco) o a los discos con carbapenmicos (prueba de discos combinados) segn la cantidad
final por disco que se desee.
c) Dejar absorber la solucin al menos 30 minutos y asegurarse que los discos estn suficientemente
secos antes de su aplicacin.

TEST DE HODGE MODIFICADO
a) Seguir el procedimiento estndar para la realizacin de un antibiograma por el mtodo de difusin
con discos e inocular una placa de agar Mueller-Hinton a partir de una suspensin de la cepa E. coli
ATCC 25922 en solucin salina con una turbidez equivalente a un 0,5 de la escala de McFarland
diluida al 1:10.
b) Colocar un disco con un un carbapenmico (imipenem, meropenem o ertapenem) en el centro de
la placa.
c) Inocular 3-5 colonias de la cepa problema formando una estra radial desde 2-3 mm del disco con
carbapenmico hacia el borde de la placa.
d) Incubar a 352C durante 16-20 horas.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

101
101

Consideraciones:
Se pueden estudiar hasta cuatro o cinco cepas por placa.
En las cepas que presenten un fenotipo de hiperproduccin de AmpC utilizar agar Mueller-Hinton
suplementado con cloxacilina (250 g/mL) o bien discos de carbapenmicos con cloxacilina puesto
que las enzimas AmpC presentan una cierta actividad hidroltica sobre carbapenmicos que dan lugar
a resultados falsamente positivos.
Cuando se evalan cepas del gnero Proteus, la presencia de swarming puede dificultar la lectura de
la pruebas. En este caso se recomienda realizar la prueba en medios cromognicos como el CPS ID,
o en agar MacConkey.
Si el resultado es ininterpretable (inhibicin del crecimiento de la cepa indicadora a los lados de la
estra) se recomienda repetir la prueba utilizando otra cepa indicadora como E. coli ATCC 35218.
No utilizar ertapenem en P. aeruginosa puesto que es intrnsecamente resistente.

PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO
Seguir el procedimiento estndar para la realizacin de un antibiograma por el mtodo de difusin
con discos e inocular una placa de agar Mueller-Hinton a partir de una suspensin de la cepa
problema en solucin salina con una turbidez equivalente a un 0,5 de la escala de McFarland.
Colocar discos con carbapenmicos (imipenem, meropenem) y un disco con inhibidor (cido
bornico para descartar carbapenemasas de clase A y EDTA para carbapenemasas de clase B) a 1-2
cm (margen a margen). La separacin ptima de los discos puede variar en funcin de la cepa.
c) Incubar a 352C durante 16-20 horas.
Consideraciones:
Hay que tener en cuenta los dimetros de inhibicin para ajustar la distancia ptima de separacin
entre los discos.

OBTENCIN Y EXPRESIN DE RESULTADOS
TEST DE HODGE MODIFICADO
Examinar visualmente el margen del halo de inhibicin en la zona adyacente a la estra. Los
resultados se interpretan de la siguiente manera:
a) Positivo. Presencia de una zona de inhibicin distorsionada a los lados de la estra debido de al
crecimiento de la cepa indicadora.
b) Negativo. Ausencia de una zona de inhibicin distorsionada a los lados de la estra.
c) Ininterpretable. Inhibicin del crecimiento de la cepa indicadora a los lados de la estra.
Los resultados positivos se deben confirmar con otros mtodos.

Figura 11-. Test modificado de Hodge donde se observan dos cepas positivas y una negativa.

PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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102
siguiente manera:
a) Positivo. Ampliacin del halo de inhibicin del carbapenmico en la zona cercana al disco de
inhibidor (sinergia) o presencia de una "zona fantasma" (inhibicin del crecimiento) entre el
carbapenmico y el inhibidor.
b) Negativo. No ampliacin de los halos de inhibicin del carbapenmico ni presencia de "zona
fantasma".
Figura 12. Prueba de sinergia de doble disco positiva en el caso de una cepa de A) Klebsiella pneumoniae portadora de la
betalactamasa KPC y B) Pseudomonas aeruginosa portadora de la betalactamasa VIM-2.

BORON, cido bornico; ETP, Ertapenem; IMI, imipenem; MRP, meropenem; D.P.A, cido dipicolnico. Los resultados
positivos se interpretan segn la tabla siguiente:

PRUEBA DE DISCOS COMBINADOS CON INHIBIDOR
Medir en milmetros los dimetros de las zonas de inhibicin completa (incluyendo el dimetro del
disco) con un pie de rey. Los resultados se interpretan de la siguiente manera:
a) Positivo. Incremento >5 mm del dimetro de inhibicin del carbapenmico con inhibidor respecto
al del carbapenmico.
b) Negativo. No diferencia o incremento <5 mm en el halo de inhibicin del carbapenmico con
inhibidor respecto al del carbapenmico.

Figura 13. Prueba de discos combinados con inhibidor positivas en el caso de una cepa de Klebsiella pneumoniae portadora
de la betalactamasa KPC, A) y de Pseudomonas aeruginosa portadora de la betalactamasa VIM-2, B).

MRP, meropenem; MR+DP, meropenem + cido dipicolnico; MR+CL, meropenem + cloxacilina; MR+BO, meropenem +
cido bornico.
Los resultados positivos se interpretan segn la tabla siguiente:

Tabla 56.- Relacin entre carbapenemasas y tipo de inhibidor
Resultado Tipo de Carbapenemasa/Mecanismo de resistencia
CAR+BOR > 5mm CAR y
CAR+CLO < 5mm CAR
Carbapenemasa de Clase A

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
Versin 01

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103
CAR+DPA > 5mm CAR
CAR+EDTA > 5mm CAR
Carbapenemasa de Clase B
CAR+BOR y CAR+CLO > 5mm CAR Hiperproduccin de AmpC o
Hiperproduccin de AmpC + Carbapenemasa de Clase A
CAR, carbapenmico; BOR, cido bornico; CLO, cloxacilina; DPA, cido dipicolnico.
La ausencia de inhibicin con cloxacilina descarta la hiperproduccin de betalactamasas AmpC.

Tabla 57.- Resumen de interpretacin de las tcnicas descritas:

Mecanismo de resistencia
Tcnica Carbapenemasa AmpC
+
reduccin permeabilidad
BLEE
+
reduccin permeabilidad
Clase A Clase B
THM

+ + +/- +/-
Sinergia doble disco CAR-BOR + - +/- -
CAR-DPA
CAR-EDTA
- + - -
Discos combinados CAR-BOR + - +/- -
CAR-CLO - - +/- -
CAR-DPA - + - -
THM, Test de Hodge modificado; CAR, carbapenmico; BOR, cido bornico; DPA, cido dipicolnico; CLO, cloxacilina;
BLEE, betalactamasa de espectro extendido.

El principal inconveniente del test de Hodge modficado es su baja especificidad, ya que puede
resultar positivo en cepas con hiperproduccin de betalactamasas AmpC o produccin de
betalactamasas de espectro extendido (BLEE) CTX-M, junto con alteraciones en las porinas.
Los mtodos basados en la utilizacin de cido bornico pueden presentar baja especificidad y
pueden producirse resultados falsos positivos debido a la hiperproduccin de enzimas de tipo AmpC
ya que tambin es un inhibidor de estas enzimas.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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104
ANEXOS

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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Anexo1: Formatos de Microbiologa, solicitudes y registros

Anexo 1a: Hoja de solicitud de anlisis microbiolgicos varios

Anexo 1b: Libro de Registro de anlisis microbiolgicos varios

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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106

Anexo 1c: Libro de Registro de Cultivos y antibiogramas

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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107

ANEXO 2.- PREPARACION DE COLORANTES: COLORACION GRAM
N 001 FECHA:..
SERVICIO DE MICROBIOLOGIA
Condicin: ( ) Ambulatorio: (V) (M) (TS) (P) ( ) Hospitalizado HC. N:.. N de Cama:.
Servicio: ( )Medicina ( ) UCI ( ) UCIN ( ) Ciruga ( ) Traumatologa ( ) Neurocirugia ( ) Pediatra
MUESTRA N:... (Anotar el cdigo del sistema) N Recibo:... (Pen) (Pag) (Exo)
PACIENTE:.. Edad:....
INDICACION Dr:
CULTIVO DE: ( )Orina ( )Sangre ( )Heces ( )Medula sea ( )Secreciones: ( )Traqueobronquial
EXAMEN MACROSCOPICO: Color:..Aspecto:....pH: ( ) Herida
EXAMEN MICROSCOPICO: Cel epit:...../c Leucocitos:..../c Hemates:....../c ( )Bilis
Piocitos:Cristales:...Grmenes:.Cilindros:.... ( )Absceso.
Eosinf:......% Monocitos:....% Linfocitos:...% Neutrfilos:......% ( )Peritoneal
Parsitos:.Levaduras: ( )Articular
COLORACION GRAM:. ( )Farngea
. ( )LCR
COLORACION BK: ( ) NO BAAR ( ) BAAR ( )+ ( )++ ( )+++ ( )Pleural
CULTIVO ( )Vaginal
Aislamiento primario ( )Uretral
CULTIVO 24 48 72 Lactosa ( )Higroma/Flictena
A. SANGRE ( )Otro:
A. CHOCOLATE
A. Mc CONKEY Uso de antibiticos:
A. MANITOL SALADO
A SS
A. SABORAUD
A. XLD
A. TCBS
CALDO SELENITO
CALDO THIOGLICOLATO
Pos Neg NR
RESULTADO: G1 ..
Germenes aislados G2 ..
G3 ..
ANTIBIOTICOS G 1 G 2 G 3 ANTIBIOTICOS G 1 G 2 G 3 G 1 G 2 G 3
Pencilina G
Ampicilina
Amoxicilina
Oxacilina
Ampicilina-Sulbactam
Amoxicilina-Clavulnico
Carbenicilina
Ticarcilina
Piperacilina/tazobactam
Cef alotina
Cef azolina
Cef radina
Cef alexina
Cedaf roxil
Cef aclor
Cef uroxima
Cef amandol
Cef otaxima
Cef triaxone
Cef tazidima
Cef operazona-sulbactam
Cef podoxima
*NO USAR EN NIOS NI EN EMBARAZADAS V: Varones D: Damas TS; Trauma Shock P: Particular
S: Sensible I: Intermedio R: Resistente BLEE: betalactamasa de espectro extendido
NR: No realizada RIC: Resistencia inducible a penicilina
EDTA: Identif ica metalobetalactamasas Ac. Bornico: Identif ica Carbapenemasas
MONOBACTAMS
CARBAPENEMS
CEFALOSPORINAS 1 Gen
Responsable de la siembra Responsable de la identif icacin
Estreptromicina
Gentamicina
Amikacina
Responsable de lectura de Antib
Medios diferenciales
Resistencia antibitica
Imipenem
Meropenem
MRSA
Sulf ometo-Trimetoprim
OTROS
Rif ampicina
PENICLINAS
Astreonam
Teicoplamina
Cef epime
Deteccin Antibitica
en orina
RIC
ANTIBIOGRAMA (colocar S, I o R en el nmero del grmen aislado)
GLICOPEPTIDOS
SULFONAMIDAS
Cef oxitina
Linezolid
Levof loxacina*
LINCOSAMINAS
Lincomicina
Cloramf enicol
Clindamicina
Tobramicina
Norf loxacina*
Ciprof loxacina*
Metodo Kirby Bauer, Sherris, Tarck
ANTIBIOTICOS
Vancomicina
QUINOLONAS
AMINOGLICOSIDOS
CEFAMICINAS
Cef pirome
RIFAMICINAS
OXAZOLIDINONA
ANFENICOLES
NITROFURANOS
Novobiocina
Nitrof urantoina
Furazolidona
Acido Nalidxico
Gram Positivos
Manitol
A. Bornico
Pencilinasa
Hemolisis beta
MR
VP
Coagulasa
Catalasa
EDTA
HORAS
TSI
LIA
Citrato
Urea
SIM/MIO
Gram Negativos
Bacitracina
Novobiocina
Optoquina
Desoxicolato
Hemolisis alf a
Ertapenem
Oxidasa
VRSA
BLEE
AmpC
Claritomicina
Azitromicina
POLIPEPTIDOS
MACROLIDOS
Oxitetraciclina*
TETRACICLINAS*
Doxyciclina*
Bacitracina
Colistina
Eritromicina

PRIMERA EDICION
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CODIGO:
Versin 01

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ANEXO 2a.- COLORACION GRAM DE HUCKER

Cristal violeta
a) Cristal violeta
- Violeta de Genciana 1 gr.
- Agua destilada 100 ml
Disolver y mezclar.
Almacenar en un frasco oscuro a temperatura ambiente (dura 1 ao).
Rotular con fecha e iniciales de la persona que preparo el reactivo.

b) Bicarbonato de soido (5%)
- Bicarbonato de sodio (grado reactivo) 5 gr.
Disolver y mezclar en un frasco oscuro.

c) Lugol de Gram
- Cristal de yodo 1 gr
- Yoduro de potasio 2 gr.
Mezclar los cristales de yodo con el yoduro de potasio en un mortero,
Agregar el agua destilada en pequeas cantidades.
Almacenar en un frasco oscuro a temperatura ambiente. (dura 6 meses)

Precaucin:
El yodo y yoduro de potasio son corrosivos. Evitar la inhalacin, ingestin o contacto con la piel.

d) Decolorante: alcohol acetona (1:1)
Etanol puro (100%) 500 ml
Acetona 500 ml
Mezclar el Etanol con la acetona.
Almacenar en un frasco a temperatura ambiente (dura 1 ao).

1. Colorante de contraste: Safranina
Safranina (certificada) 0.5 g
Agua destilada 100 ml
En un mortero disolver 0.5 g de la safranina (certificada) en 10 ml de agua destilada y completar a 100
ml con agua destilada

Precaucin general: Usar guantes descartables, para evitar teirse las manos.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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ANEXO 2b.- PREPARACION DE COLORANTES: COLORACION BK

COLORACION PARA BACILO DE KOCH (BK)
Reactivos para coloracin Ziehl Neelsen
Carbol-Fuchsin
Fucsina Bsica 2.5 g.
Agua destilada 250.0 ml
Etanol 95% 25.0 ml
Cristales de Fenol calentada 2.5 ml
Mezclar bien, filtrar en botella oscura
Marcar la botella con la fecha e iniciales de la persona que preparo el reactivo.
La solucin es estable por 1 ao.
Precaucin: Carcingeno, txico.

Alcohol Acido 1%:
Acido clorhdrico 3.0 ml
Etanol 100% 97.0 ml
Mezclar bien, marcar con fecha e iniciales de la persona que preparo el reactivo.
Precaucin: Corrosivo.

Azul de Metileno:
Azul de metileno 0.3 g.
Agua destilada 100.0 ml
Mezclar bien, filtrar en botella
Marcar la botella con la fecha e iniciales de la persona que preparo el reactivo.

Precaucin general: Usar guantes descartables, para evitar teirse las manos.

PRIMERA EDICION
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ANEXO 3.- DESCRIPCIN Y UTILIZACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO:
Los medios de cultivos deben ser preparados de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En este
anexo describiremos los medios ms utilizados en nuestro laboratorio.
Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de grmenes que no presentan
exigencias particulares. No es diferencial.
Agar Base Sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza adems para la investigacin de los
diversos tipos de hemlisis(, gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la
preparacin del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sdico o un
preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. Para la
preparacin debe utilizarse como aditivo la sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas
ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana). Cuando se usa
sangre humana, se debe tener cuidado de no usar sangre fresca, porque puede haber factores
inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero, por lo que se recomienda usar sangre de
banco de aproximadamente 30 das de extrada.
Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene agregando la sangre, al agar base sangre, a una
temperatura de 56C, Al destruirse los hemates se libera NAD y el factor X o hematina
termoestable, componentes que se encuentran en los glbulos rojos. El agar chocolate es un medio
destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos y meningococos) y Haemophilus
Influenzae, pero en l pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes, por lo que no se
recomienda para el aislamiento de grmenes comunes ni coprocultivos. El agar chocolate puede
convertirse quizs en uno de los medios ms enriquecidos si aadimos una mezcla de factores de
crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente segn las
casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen ms de una docena de compuestos que
confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adicin de uno o varios
antibiticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados
microorganismos. Un ejemplo clsico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del
gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha aadido una mezcla
de tres antibiticos especficos que impedirn el crecimiento del resto de la flora acompaante.
Agar Mac Conkey: Es un medio utilizado para el aislamiento e identificacin de enterobacterias,
debido a que contiene un inhibidor de grmenes Gram positivos, como el cristal violeta, siendo
selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composicin lleva un azcar
(lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los grmenes
que fermenten la lactosa producen una acidificacin del medio que hacen aparecer de color rojo
fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas sern incoloras, apareciendo del
mismo color que el medio subyacente (naranja).
Agar SS: El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a
partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el
crecimiento de coliformes y grmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos
permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen
(incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este
medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
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CODIGO:
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doblemente diferencial, porque adems de indicarnos el comportamiento de los grmenes con
relacin a la lactosa, nos muestra los grmenes que son capaces de producir cido sulfhdrico, que se
manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. As, una colonia incolora y
con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y ser exclusivamente a estas colonias a
quienes se hagan las pruebas bioqumicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio
muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre
todo de Shigella. Por esta razn debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como
el Hektoen.
Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realizacin de los
antibiogramas o pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Siempre debe hacerse control de
calidad del medio, el cual esta descrito en el captulo de antibiogramas (pgina 60).
Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de grmenes exigentes, como
Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial.
Caldo Thioglicolato: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de
aerobios, anaerobios y microaerfilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta
por un color rosa del medio. Por ese motivo no debe refrigerarse, ya que oxida al medio y pierde su
capacidad de anaerobiosis.
Agar Manitol salado: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado
contenido en cloruro sdico permite la inhibicin de la mayora de los otros grmenes. La presencia
de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: as se puede identificar
presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que este germen crece bien en medios salados y
fermenta el manitol (colonias amarillas). Dado a que el Staphylococcus saprophyticus tambin es
manitol positivo, es necesario realizar la prueba de coagulasa para identificarlo adecuadamente. El
Staphylococcus aureus es coagulasa positivo y novobiocina sensible, en cambio el Staphylococcus
saprophyticus, es coagulasa negativo y novobiocina resistente. El Staphylococcus epidermidis es
manitol negativo y novobiocina sensible. Ver tabla N 9: caractersticas fenotipicas de
Staphylococcus (pgina 41).
Agar Campylobacter: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42
C en microaerofilia. Al medio preparado se le agrega el suplemento selectivo CCDA, que viene en
ampollas y contiene desoxicolato sdico.
MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES

Agar Citrato de SIMMONS
Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante
Calentar suavemente hasta su disolucin.
Colocar aproximadamente 4 a 5 ml en cada tubo.
Autoclavar a 121 C, 15 libras/pulg
2
por 15 minutos.
Dejar que el medio solidifique en posicin inclinada, con poca profundidad en pico de flauta.
Refrigerar para su conservacin (4 10 C).

Agar TSI (HIERRO TRIPLE AZUCAR)
Preparar ambos medios de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Distribuir aproximadamente 5 ml en tubos de 13 x 100 preferentemente.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

112
112
2
por 15 minutos.
Enfriar en posicin inclinada (pico de flauta) con una capa basal profunda.

Agar LIA (LISINA HIERRO)
Preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
2
por 15 minutos.
Distribuir aproximadamente 5 ml en tubos de 13 x 100. Dejar enfriar en posicin inclinada,
para producir una columna de aproximadamente 3 cm de altura y sobre ella una superficie
inclinada de por lo menos la misma longitud.

CALDO MRVP (Se usa para realizar las pruebas de Rojo de Metilo y Vogues Proskauer)
Preparar el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Distribuir aproximadamente 5 ml en tubos (13 x 100 de preferencia).
2
, 15 minutos.
Conservar refrigerado a 4 C a 10 C.
Sembrar la cepa a identificar durante 24 horas en caldo MRVP.
Una vez observado el crecimiento, se reparte a partes iguales en otro tubo estril y se
identifica un tubo para Rojo de metilo (RM) y otro para Vogues Proskauer (VP).

Prueba de rojo de metilo (RM)
Indicador de pH de rojo de metilo:
Rojo de metilo 0,1 g
Alcohol etlico 95 % 300 ml
Agua destilada 200 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol.
Agregar el agua destilada a la mezcla anterior.
Guardar el reactivo refrigerado.
Al tubo marcado como RM, se le agrega 3 gotas del indicador (existen productos
comerciales como Rojo de Metilo).
Resultados:
o Color Amarillo: Negativo
o Color Rojo: Positivo

Recomendaciones
La peptona del medio puede afectar los resultados de la prueba, por eso es importante
realizar el control de calidad utilizando las cepas de control.

Prueba de Voges Proskauer (VP)
Indicador de Vogues Proskauer: existen productos comerciales como Vogues
Proskauer A y Vogues Proskauer B
A. -naftol al 5%.
B. Hidrxido de Potasio (KOH) al 40%
Al tubo marcado como VP, se le agrega 5 gotas del indicador A, en zona, luego se le
aade 5 gotas del indicador B, tambin en zona (No alterar el orden).
Resultados:
o Color rojo: Positivo
o No hay cambio de color: Negativo
Cuando un resultado es negativo debe incubarse 24 horas ms.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

113
113

Medio de gelatina nutritiva:
Prueba de licuefaccin de la gelatina
Preparar siguiendo las indicaciones del fabricante.
Distribuir aproximadamente de 4 ml a 5 ml por tubo.
2
, 15 minutos.
Enfriar en posicin vertical, ajustar las tapas y refrigerar a 4 10 C.
Conservar los tubos con gelatina refrigerados hasta el momento de su inoculacin.

Prueba de Indol
Medios y reactivos
Caldo de triptfano o de peptona o caldo de tritona.
- Preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
- Distribuir en tubos, aproximadamente 4 ml por tubo.
- Autoclavar a 121 C, 15 libras/pulg
2
, 15 minutos.
- Conservar refrigerado.

Reactivo de indol de Kovacs
- Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alcohol butlico) 150 ml
- P-dimetilamino-benzaldehido 10 g
- HCl concentrado 50 ml
Procedimiento
Disolver el aldehido en el alcohol.
Agregar el cido lentamente a la mezcla aldehido-alcohol.
Guardar en frascos oscuros y en refrigeracin.
Si el cultivo de 24 horas es negativo, deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.
Antes del empleo de los reactivos, deben ser controlados con cultivos positivos y negativos
conocidos, por ejemplo Escherichia coli y Klebsiella.
Conservar refrigerados los reactivos y hacer un control de calidad semanal.
Recomendaciones
El reactivo de Kovacs debe mantenerse refrigerado a 4 - 10 C en un frasco mbar con tapa
de vidrio. Si se deja a temperatura ambiente durante un tiempo, cambiar de color y se har
menos sensible.

Prueba de movilidad
Medio SIM
Se emplea medios semislidos que se obtienen comercialmente (Agar movilidad,
SIM, MIO).

Procedimiento
Preparar el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
2
, 15 minutos.
Distribuir aproximadamente 5 ml por tubo.
Solidificar el medio en posicin vertical y conservar refrigerado (4 - 10 C).

MEDIOS PARA HEMOCULTIVOS

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

114
114
MEDIO MONOFASICO
Materiales y medios:
Caldo Tripticasa Soya o Infusin cerebro corazn.
Polyanetol sulfonato de sodio (SPS)
Gelatina
Frascos de vidrio de 150 ml 0 125 ml.
Tapones de jebe.
Precintos.
Preparacin:
Preparar el caldo de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Agregar gelatina a una concentracin final de 1,2 %.
Agregar polietanol sulfonato de sodio (SPS) a una concentracin de 0.025 0.05 %,
mezclar.
Distribuir 90 ml en frascos de 150 ml y 45 ml en frascos de 125 ml.
Colocar el tapn de jebe y asegurarlo con cinta masking tape para evitar que debido a la
presin los tapones se salgan.
Se esteriliza por autoclave a 121 C a 15 lb de presin por 15 minutos.
Una vez fro retirar la cinta masking tape.
Asegurar los tapones de jebe y colocar precintos de seguridad. Realizar este procedimiento
en una cabina de flujo laminar o cerca de un mechero de Bunsen.
Se realiza el control de esterilidad: Incubar los medios a 35 37 C por 24 48 horas.

MEDIO BIFASICO

Materiales
Frascos de vidrio.
Tapones de jebe.
Precintos.
Fase Slida
Agar BHI o TSA
Agar agar:
Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante agregando agar agar en una
concentracin final de 1 %.
Fase Lquida
Caldo Tripticase Soya o Infusin cerebro corazn.
Polietanol sulfonato de sdio.
Gelatina.
Preparar el caldo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Agregar gelatina a una concentracin final de 1,2 %.
Agregar polietanol sulfonato de sodio (SPS) a una concentracin final de 0.025 0.05 %.
Distribuir 45 ml en frascos de 150 ml y 20 ml en frascos de 125 ml.

Preparacin
- Se reparte 25 ml de agar en los frascos y se esteriliza.
- Se deja en posicin inclinada.
- Agregar el caldo aspticamente, al medio solidificado.
- Colocar los tapones de jebe y los precintos de metal.
- Se controla la esterilidad del medio por una semana a 35 37 C.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

115
115
NOTA:
Todos los medios debern prepararse de acuerdo a las especificaciones tcnicas del
fabricante, deber tenerse muy en cuenta las cantidades, Ph. Esterilizacin, reparto del medio
preparado, controles y almacenaje correspondiente. Etc.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

116
116
ANEXO 4
Sistemas de identificacin multipruebas

Galera API 20E
La batera de pruebas API20E es un sistema de identificacin rpida para bacterias de la familia
Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram -. Bsicamente consta de 21 tests bioqumicos
estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser
rpido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20
microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica
distinta. La prueba nmero 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira.

Las pruebas de que consta la galera son las siguientes:
Prueba Reaccin / Enzimas
ONPG Beta-galactosidasa
ADH Arginina deshidrolasa
LDC Lisina descarboxilasa
ODC Ornitina descarboxilasa
CIT Utilizacin del citrato
H2S Produccin de H 2 S
URE Ureasa
TDA Triptfano desaminasa
IND Produccin de indol
VP Produccin de acetona (Voges-Proskauer)
GEL Gelatinasa
GLU Fermentacin/oxidacin de glucosa
MAN Fermentacin/oxidacin de manitol
INO Fermentacin/oxidacin de inositol
SOR Fermentacin/oxidacin de sorbitol
RHA Fermentacin/oxidacin de ramnosa
SAC Fermentacin/oxidacin de sacarosa
MEL Fermentacin/oxidacin de melobiosa
AMY Fermentacin/oxidacin de amigdalina
ARA Fermentacin/oxidacin de arabinosa
OX Citocromo oxidasa

A partir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensin en 5 mL de solucin
salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estril.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

117
117
Llenar con la suspensin de bacterias los tubos, no la cpula (cada pocillo tiene un tubo y una
cpula, parte aerobia), de todos los pocillos.

Llenar la cpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensin de bacterias.

Cubrir con parafina las cpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H
2
S para obtener
anaerobiosis.

Poner la tira en su propia cmara hmeda de incubacin. Previamente poner agua en los alvolos de
la cmara para proporcionar una atmsfera hmeda durante la incubacin.

Incubar a 37 C durante 18-24 h.

Tras la incubacin se anotan los resultados inmediatos, es decir, los que no requieren ser revelados.
Determinadas pruebas requieren ser reveladas, para el revelado se tienen que tener en cuenta dos
criterios:

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

118
118
Si la glucosa da negativo y los test positivos son dos o menos de dos, no hay que aadir
reactivos. Cuando esto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE, API OF, el API M
o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales.
Si la glucosa es positiva y/o tres o ms tests son positivos se revelan los test que requieren
reactivos:
TDA: Aadir una gota de FeCl
3
10 %.
VP: Aadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C
2
H
5
OH).
I ND: Aadir una gota de reactivo de Kovacs o de Dimetilamino-cinamaldehido.
Oxidasa: Aadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recin preparado.
Interpretacin
La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparacin de los colores de cada pocillo con los de
las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo (ms adelante se explicar con
detalle).
Prueba Reaccin / Enzimas Negativo Positivo
ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH Arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja
LDC Lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ODC Ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
CIT Utilizacin del citrato verde azul oscuro o turquesa
H2S Produccin de H 2 S
sin precipitado
negro
precipitado negro
URE Ureasa amarillo rojo o naranja
TDA Triptfano desaminasa amarillo marrn-rojo
IND Produccin de indol amarillo
color rosa o anillo rosa-
rojo
VP
Produccin de acetona (Voges-
Proskauer)
sin color rosa-rojo
GEL Gelatinasa sin difusin difusin de pigmento
GLU Fermentacin/oxidacin de glucosa azul o verde amarillo
MAN Fermentacin/oxidacin de manitol azul o verde amarillo
INO Fermentacin/oxidacin de inositol azul o verde amarillo
SOR Fermentacin/oxidacin de sorbitol azul o verde amarillo
RHA Fermentacin/oxidacin de ramnosa azul o verde amarillo
SAC Fermentacin/oxidacin de sacarosa azul o verde amarillo
MEL Fermentacin/oxidacin de melobiosa azul o verde amarillo
AMY Fermentacin/oxidacin de amigdalina azul o verde amarillo
ARA Fermentacin/oxidacin de arabinosa azul o verde amarillo
OX Citocromo oxidasa

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

119
119

Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numrico de 7 cifras. Los pocillos estn
separados en grupos o tripletes: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test nmero 21
corresponde al test de la oxidasa).
Para obtener el perfil numrico de 7 cifras, a cada pocillo se le dar el valor 0, 1, 2 4, de acuerdo a
los siguientes criterios:
Si la reaccin es negativa se pone 0.
Si la reaccin es positiva se pone 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el
segundo, 4 si es el tercero.
Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene
un cdigo de 7 cifras.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

120
120
Con este cdigo se busca en la tabla de identificacin la especie de que se trata, para realizar esta
operacin hay programas informticos.
Perfiles numricos.
0104140 Shigella flexneri
0104452 Salmonella paratyphi A
0104504 Pasteurella multocida
0104521 Yersinia enterocolitica
0140004 Pasteurella multocida
0144042 Shigella boydii
0206042 Acinetobacter calcoaceticus
0210004 Achromobacter sp.
0210004 Alcaligenes faecalis
0210004 Alcaligenes sp.
0314000 Proteus mirabilis
0504512 Salmonella paratyphi A
0676001 Proteus vulgaris
0776000 Proteus mirabilis
1000004 Pasteurella sp.
1014743 Klebsiella ozaenae
1104112 Shigella sonnei
1214012 Yersinia pseudotuberculosis
1214773 Klebsiella pneumoniae
2206004 Pseudomonas aeruginosa
2504752 Salmonella spp.
3005573 Enterobacter cloacae
3246527 Aeromonas hydrophilia
4004550 Salmonella cholerasuis
4004550 Salmonella typhi
4104100 Salmonella gallinarun
4357106 Vibrio parahemolyticus
4404112 Salmonella gallinarum
4404540 Salmonella tiphy
4504010 Salmonella pullorum
5004024 Pseudomonas cepacea
5044124 Vibrio cholerae
5046753 Serratia odorifera
5100100 Yersinia ruckeri
5104111 Hafnia alvei
5104542 Salmonella arizonae
5144572 Escherichia coli
5207323 Serratia rubidae
5255573 Klebsiella oxytoca
5346761 Serratia marcescens
5314173 Enterobacter gergoviae
5317761 Serratia marcescens
6004540 Salmonella typhi
6144204 Plesiomonas shigelloides
6704532 Salmonella spp
6704752 Salmonella gallinarum

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

121
121
7244126 Aeromonas hydrophila
7305773 Enterobacter cloacae
ANEXO 5.- Imgenes de Quistes y trofozoitos de parsitos intestinales

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

122
122
Anexo 6- Imgenes de Huevos y larvas de parsitos intestinales

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

123
123

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

124
124
ANEXO 7: GLOSARIO

Absceso: Acumulacin localizada de pus en un tejido u rgano.
Aerbico: Un organismo que requiere oxgeno o aire atmosfrico para su crecimiento y
reproduccin.
Aglutinacin: Reaccin por la que se provoca la agrupacin de partculas, bacterias y clulas
suspendidas en un medio lquido.
Aislamiento primario: Desarrollo inicial de microorganismos a partir de una muestra clnica.
Antimicrobiano: Agente biolgico o qumico que inhibe el crecimiento de microorganismos.
Asepsia: Desinfeccin de un tejido vivo o piel.
Bacteria: Microorganismo unicelular microscpico perteneciente a los procariotes que se
multiplica por fisin binaria y carece de clorofila. Se diferencian por la coloracin de Gram.
Bacteria Gram negativa: Aquellas bacterias que no retienen el colorante primario (violeta de
genciana o cristal violeta) en el mtodo de Gram son decoloradas por el alcohol y toman el
color del colorante contraste (safranina o fucsina) dando un color rojizo.
Bacteria Gram positiva: Aquellas bacterias que retienen el colorante primario del mtodo de
Gram, resisten la decoloracin por el alcohol y no son coloreadas por el colorante de contraste
reteniendo el color azul prpura inicial.
Bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la seguridad humana y
del ambiente frente a diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o
mecnicos.
BLEA ; Beta lactamasa de espectro ampliado, indica resistencia a todas las penicilinas y a
cefalosporinas de primera y segunda generacin, incluidas el aztreonam
BLEE: Beta lactamasa de espectro extendido, indica resistencia a todas las penicilinas y
cefalosporinas incluidas las de tercera y cuarta generacin.
Cepa bacteriana: Cultivo puro de bacterias formada por los descendientes de un solo
aislamiento.
Colonia: Crecimiento visible de microorganismos, generalmente en medios slidos, originado
por la multiplicacin de un solo organismo. Todos son la progenie de una nica bacteria
preexistente.
Coloracin Gram: Mtodo de tincin basado en la propiedad de retener o no el colorante
cristal violeta en la pared celular bacteriana debido a su composicin bioqumica despus de ser
sometido a un tratamiento de decoloracin.
Chorro medio de orina: Muestra de orina obtenida despus que el paciente deja discurrir
cierta cantidad inicial.
Desinfeccin: Destruccin de las formas vegetativas de las bacterias en objetos inanimados. Se
realiza con agentes qumicos en estado lquido o con agua a temperaturas superiores a 75 C.
Desinfectante: Agente qumico utilizado para el proceso de desinfeccin.
Establecimiento de salud: Hospital, clnica, centro de salud o lugar debidamente autorizado y
equipado para la atencin de pacientes.
Esterilizacin: Proceso validado que permite la eliminacin de toda forma de vida microbiana
incluyendo endosporas bacterianas. Puede conseguirse por medio de mtodos qumicos, fsicos
o gaseosos.
Fermentacin: Utilizacin de carbohidratos en forma anaerobia.
Hemlisis: Presencia de restos de eritrocitos lisados alrededor de una colonia desarrollada en
una placa de sangre de carnero.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

125
125
Hemlisis alfa: Las colonias estn rodeadas por una destruccin parcial de los eritrocitos y
prdida de algo de hemoglobina en el agar lo que resulta en una coloracin verde (hemlisis
incompleta).
Hemlisis beta: Las colonias estn rodeadas por una zona de hemlisis completa (clara,
transparente) debido a una destruccin total de los eritrocitos
Incubacin: Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su
desarrollo y multiplicacin.
Infeccin: Invasin y multiplicacin de microorganismos en un husped, pudiendo progresar
hacia una enfermedad. El trmino enfermedad infecciosa se aplica cuando aparecen signos y
sntomas como resultado de la infeccin.
Infeccin intrahospitalaria (IIH): Infeccin que se adquiere luego de 48 horas de permanecer
en el establecimiento de salud y que el paciente no portaba a su ingreso. Se consideran tambin
a aquellos procesos infecciosos que ocurren hasta 30 das luego del alta.
Inoculo: Alcuota de una muestra que es transferida a un medio de cultivo.
Limpieza: Es la remocin mecnica de toda materia extraa con el objeto de disminuir el
nmero de microorganismos. Se realiza a travs del arrastre mecnico, sin embargo no se
asegura la eliminacin de stos.
Medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento y
multiplicacin de las bacterias in vitro, que puede encontrarse en estado slido, semislido o
lquido.
Metabolismo: Proceso de degradacin y biosntesis enzimtica que tiene lugar dentro de una
clula y por medio del cual se mantienen las actividades nutricionales y funcionales.
Micraeroflico: Organismo que crece y se reproduce mejor en la presencia de una tensin del
5% de oxgeno, 10% de anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno.
Microorganismo viable: Es aquel que es capaz de reproducirse.
Oxacilinasa: Beta lactamasa que inhibe a la oxacilina, cuyo espectro se extiende a todas las
penicilinas incluidas las sintticas. Cuando se halla en los estafilococos se dice que son
Meticilino resistentes.
Oxidacin: Reaccin qumica que implica la prdida de electrones de los tomos. Mezcla de
una sustancia con el oxgeno y un aumento en la valencia.
Penicilinasa: Beta lactamasa que inactiva a la penicilina y penicilinas naturales, con excepcin
de penicilinas sintticas.
Reconstituir: Restablecer la forma original de una sustancia previamente alterada para su
conservacin y almacenamiento, mediante la combinacin con un lquido adecuado.
Registro: Documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los
resultados obtenidos.
Sepsis: Patologa compleja de respuesta sistmica con compromiso multiorgnico, secundaria a
la invasin del organismo por alguna bacteria u hongo.
Siembra primaria: Inoculacin de una muestra a un medio de cultivo simple, selectivo o de
enriquecimiento.
Subcultivo: Pasaje de bacterias viables derivadas de otro cultivo a un medio de cultivo nuevo.
UFC: Unidad formadora de colonia.

PRIMERA EDICION
Fecha de Aprobacin:
//
CODIGO:
Versin 01

126
126
BIBLIOGRAFIA

1. Manual de procedimientos de obtencin de muestras para el diagnstico bacteriolgico en infecciones
Intrahospitalarias. Instituto Nacional de Salud. Ministerio de Salud del Per. 2002 ISBN 9972 - 857 - 17 - 4
2. Medical Microbiology and Infection at a Glance. Stephen H. Guillespie, Kathleen Bamford. Edit Blackwell Science-
London . Ao 2000
3. Principles and practice of Infectious Disease . by Mandelll, Bennett & Doling. 6th edit Copryght 2005 Churhill
and Levingston And Imprint El Servier
4. Medical Microbiology. By Jawetz, Melnick, & Adelberg's, 24th Edition - 2007 by The McGraw-Hill Companies.
ISBN-13: 978-0-07147666-9
5. Manual de Bacteriologa. Por Norman rojas, Esteban chaves, Fernando garca. Universidad de Costa Rica. Facultad
de microbiologia. Ao 2006
6. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology / J. Vandepitte . . . [et al.]. Second edition Joint United Nations
Programme on HIV/AIDS World Health Organization - Geneva. 2003. ISBN 92 4 154545 3
7. Medical Microbiology by Fritz H. Kayser, M.D.y Alb. Kayser, Medical Microbiology 2005 Thieme ISBN 1-
58890-245-5
8. Microbiology 5th Edition Lansing M. Prescott 2002. ISBN: 0-07-282905-2 5 th ed. The McGrawHill
9. Norma tcnica de salud para el control de la tuberculosis / Ministerio de Salud. Direccin General de Salud de las
Personas. Estrategia Sanitaria Nacional de Prevencin y Control de la Tuberculosis -- Lima: Ministerio de Salud;
2006 272 p.; ilus.
10. Antimicrobial Susceptibility Testing: A Primer for Clinicians. Kristi M. Kuper, Pharm.D.; Deborah M. Boles, M.S.;
John F. Mohr, Pharm.D; Audrey Wanger, Ph.D.Posted:11/17/2009;Pharmacotherapy.2009;29(11):1326-1343
2009 Pharmacotherapy Publications
11. Biedenbach DJ, Jones RN, Erwin ME. Interpretive accuracy of the disk diffusion method for testing newer orally
administered cephalosporins against Morganella morganii. J Clin Microbiol 1993;31:2828-30.
12. Procedimientos en Microbiologa Clnica Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas
y Microbiologa Clnica Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantn cap. 39. Deteccin fenotpica de mecanismos
de resistencia en Gram positivos. 2011 Coordinadora: Mara Isabel Morosini Autores: Carmen Ardanuy, Emilia
Cercenado, Mara Isabel Morosini , Carmen Torres.
13. Procedimientos en Microbiologa Clnica Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas
y Microbiologa Clnica Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantn 38. Deteccin fenotpica de mecanismos de
resistencia en gramnegativos. 2011 Coordinador: Ferran Navarro Autores: Jorge Calvo, Rafael Cantn, Felipe
Fernndez Cuenca, Beatriz Mirelis, Ferran Navarro

MNP - MICROBIOLOGIA 22 Mayo 2014

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